ES2626261T3 - Método de quimioinmunoterapia - Google Patents

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ES2626261T3 ES06779508.8T ES06779508T ES2626261T3 ES 2626261 T3 ES2626261 T3 ES 2626261T3 ES 06779508 T ES06779508 T ES 06779508T ES 2626261 T3 ES2626261 T3 ES 2626261T3
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Richard Harrop
Michelle Kelleher
William Shingler
Susan Kingsman
Miles Carroll
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Abstract

Uso de un antígeno asociado a tumores 5T4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer, en el que dicho tratamiento o prevención comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o por separado, un agente o agentes quimioterapéuticos y el antígeno asociado a tumores 5T4, en el que el antígeno asociado a tumores 5T4 se administra cuando el sujeto tiene un recuento reducido de células Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapéutico.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de quimioinmunoterapia Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una terapia de combinacion para tratar a un individuo con un antigeno para provocar una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno junto con el tratamiento de ese individuo con un agente quimioterapeutico.
Antecedentes de la invencion
El tratamiento de pacientes con canceres avanzados es generalmente por quimioterapia. Sin embargo, para tumores solidos, en particular, es raramente curativa y se requieren vfas de terapia adicionales.
Los recientes progresos en inmunobiotecnologfa humana han abierto el campo de la inmunoterapia como un nuevo enfoque para el tratamiento del cancer. La inmunizacion espedfica contra un antigeno diana se ha conseguido en algunos pacientes con varias vacunas diferentes antineoplasicas, pero se desean respuestas a largo plazo mejoradas.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de regfmenes mejorados de terapia.
Como la quimioterapia tiene varios efectos perjudiciales observados sobre el sistema inmunitario, la quimioterapia y la inmunoterapia se consideran formas no relacionadas o, mas habitualmente, antagonistas de terapia. Esto es porque, la mayona de las quimioterapias eliminan las celulas diana por apoptosis y este modo de eliminacion celular se ha considerado inmunologicamente como no estimulador o capaz de producir tolerancia inmunitaria - un estado en que las celulas T ya no pueden responder al antfgeno presentado montando una respuesta inmunitaria. Ademas, un efecto secundario comun de las quimioterapias es la induccion de linfopenia, es decir, una reduccion en los linfocitos y esto se supone perjudicial para cualquier respuesta inmunitaria potencial.
El documento WO 02/38612 se refiere a un peptido 5T4 canino y menciona la terapia de combinacion.
El documento WO 00/29428 se refiere a vectores vmcos que expresan un acido nucleico que codifica el 5T4 y describe una terapia de combinacion que incluye terapia enzimatica/con profarmacos e inmunoterapia con 5T4.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere, en terminos generales, a un tratamiento de combinacion que comprende administrar un antfgeno, para provocar una respuesta inmunitaria espedfica para ese antfgeno, asf como un agente o agentes quimioterapeuticos. En particular, la presente invencion se basa en el sorprendente hallazgo de que el tratamiento para estimular una respuesta inmunitaria contra un antfgeno administrando un antfgeno se potencia por tratamiento con un agente o agentes quimioterapeuticos.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invencion, se proporciona el uso del antfgeno asociado a tumores 5T4 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion del cancer, donde dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o separada, un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, donde el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra cuando el sujeto tiene un recuento de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de la administracion del agente quimioterapeutico.
En un segundo aspecto de la invencion, se proporciona el uso de un agente o agentes quimioterapeuticos en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion del cancer, donde dicho tratamiento o prevencion, comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o separada, un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, donde el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra a un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
En un tercer aspecto de la invencion, se proporciona el antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer, donde dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o separada un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4 donde el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra cuando el sujeto tiene un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
En un cuarto aspecto de la invencion, se proporciona un agente o agentes quimioterapeuticos para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer, donde dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de
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forma secuencial o separada, el agente o agentes quimioterapeuticos y el antigeno asociado a tumores 5T4, donde el antigeno asociado a tumores 5T4 se administra a un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
Adecuadamente, para su uso en la presente invencion, se proporciona una composicion de los dos componentes para administracion separada o posterior en una forma tal como un kit.
Por "antigeno" se incluye un medio para proporcionar una protema o peptido antigenico a introducirse en un individuo. Como se describe en este documento, un antigeno puede proporcionarse a traves del suministro de un peptido o protema o a traves del suministro de un acido nucleico que codifica un peptido o protema.
Por "antigeno" en el contexto de la presente invencion tambien se entiende que incorpora un peptido antigenico derivado de un antigeno. En particular, el "antfgeno asociado a tumores" pretende abarcar un peptido derivado de un antfgeno asociado a tumores.
Un antfgeno tal como un antfgeno asociado a tumores puede proporcionarse para su uso como un medicamento de varias maneras diferentes. Puede administrarse como parte de un vector vmco. Varios vectores vmcos adecuados seran conocidos para los expertos en la materia e incluyen varios vectores descritos en este documento.
La vacuna TroVax® (TroVax es una marca registrada de Estados Unidos y la Comunidad Europea de Oxford Biomedica plc) comprende un vector vmco derivado de MVA que se ha modificado para expresar el antfgeno asociado a tumores, 5T4. En una realizacion, el antfgeno tumoral para su uso en la combinacion de la invencion es 5T4 y se proporciona por la vacuna TroVax®.
Los agentes quimioterapeuticos adecuados incluyen cualquier agente convencional. En una realizacion, el agente quimioterapeutico se selecciona de irinotecan, fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino. En otra realizacion, un "agente quimioterapeutico" puede incluir una combinacion de agentes quimioterapeuticos en una terapia tal como FOLFOX o IFL.
Por "simultanea " se entiende que dos agentes se administran de forma concurrente. Por "secuencial" se entiende que los dos agentes se administran uno despues del otro en un tramo de tiempo tal que ambos estan disponibles para actuar terapeuticamente dentro del mismo tramo de tiempo. El intervalo de tiempo optimo entre la administracion de los dos agentes variara dependiendo de la naturaleza precisa del metodo para suministrar el antfgeno tumoral.
El termino "separada" se usa para indicar que el hueco entre la administracion del primer agente y la del segundo es sustancial.
La quimioterapia se administra antes de la administracion del antfgeno. Adecuadamente, la quimioterapia se administra 10 semanas antes de la administracion del antfgeno, preferiblemente menos de 10 semanas y, mas preferiblemente, en aproximadamente 2 semanas antes de la administracion del antfgeno. En una realizacion preferida, la quimioterapia se administra 2 semanas antes de la administracion del antfgeno.
En una realizacion, el antfgeno se administra por anticipado del inicio de la quimioterapia y despues de nuevo despues de la quimioterapia. En otra realizacion, el antfgeno se administra durante la quimioterapia, asf como antes y/o despues de la quimioterapia.
En una realizacion, el antfgeno se administra al menos 24 horas, preferiblemente 48 horas despues de la quimioterapia. Preferiblemente, la administracion del antfgeno tiene lugar hasta 8 semanas, preferiblemente hasta 6 semanas, e incluso mas preferiblemente entre 4 y 6 semanas despues de la quimioterapia.
Por "recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+" se entiende un recuento de celulas Treg CD4+CD25+ que es inferior que el recuento de celulas Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar un agente que disminuye el recuento de celulas Treg CD4+CD25+, tal como un agente o agentes quimioterapeuticos u Ontak. El nivel de celulas Treg CD4+CD25+ es al menos un 15 %, preferiblemente al menos un 30 %, un 50 %, un 70 %, un 90 % inferior que el nivel de celulas Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente que disminuye el recuento de celulas Treg CD4+CD25+ (por ejemplo, un agente o agentes quimioterapeuticos u Ontak). Mucho mas preferiblemente, la vacunacion coincidira con el periodo en que la quimioterapia ha causado una reduccion maxima de las celulas Treg CD4+CD25+.
Adecuadamente, el uso en el tratamiento de un individuo comprende las etapas de:
a) administrar quimioterapia
b) administrar un antfgeno.
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En una realizacion, el uso comprende adicionalmente administrar un antfgeno antes de administrar la quimioterapia. En otra realizacion, el uso comprende adicionalmente administrar un antigeno durante el mismo tramo de tiempo que la administracion de la quimioterapia.
Adecuadamente, el uso en el tratamiento de un individuo comprende las etapas de:
a) administrar un antfgeno tumoral para provocar una respuesta antitumoral,
b) administrar quimioterapia
c) administrar un antfgeno tumoral.
En una realizacion, el uso comprende adicionalmente la etapa de determinar el recuento de celulas Treg CD4+CD25+. En otra realizacion, el uso comprende determinar el recuento de celulas Treg CD4+CD25+ o la funcion reducida de celulas Treg CD4+CD25+ antes y/o durante y/o despues de la quimioterapia.
Se describe un metodo de potenciacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno por tratamiento con quimioterapia antes y/o durante y/o despues de la sensibilizacion al antigeno.
Se describe un kit que comprende un medio para administrar un antfgeno en combinacion con un agente o agentes quimioterapeuticos para su administracion.
Otros aspectos de la presente invencion se presentan en las reivindicaciones adjuntas y en la siguiente descripcion y analisis. Estos aspectos se presentan en encabezados de seccion diferentes. Sin embargo, debe entenderse que los contenidos en dicho encabezado de seccion no estan necesariamente limitados a ese encabezado de seccion particular.
Descripcion detallada de la invencion Antigeno asociado a tumores (TAA)
En la presente invencion, el antigeno asociado a tumores es 5T4.
5T4
5T4 se ha caracterizado previamente, por ejemplo, en el documento WO89/07947. La secuencia de 5T4 humano aparece en GenBank en el n.° de acceso Z29083. El antigeno 5T4 puede provenir de diferentes especies, tal como 5T4 murino (documento WO00/29428), 5T4 canino (documento WO01/36486) o 5T4 felino. El antigeno tambien puede derivar de una variante de origen natural de 5T4 encontrada en una especie particular, preferiblemente un mamfero. Dicha variante puede estar codificada por un gen relacionado de la misma familia genica, por una variante alelica de un gen particular o representar una variante de corte y empalme alternativo del gen 5T4. 5T4 y su uso tambien se ha descrito en el documento EP1036091.
Un epftopo peptfdico derivado de 5T4 de una especie diferente o una variante de corte y empalme puede tener una secuencia diferente de aminoacidos del epftopo peptfdico 5T4 de tipo silvestre humano analogo. Sin embargo, siempre que el peptido retenga la misma especificidad de union cualitativa que el peptido humano (es decir, se une en el surco de union peptfdico de una molecula MHC del mismo haplotipo) entonces aun es un epftopo de acuerdo con la presente invencion.
Peptidos inmunogenicos derivados de antfgenos
"Antfgenos" incluye epftopos peptfdicos derivados de protemas antigenicas espedficas incluyendo antfgenos asociados a tumores. Los epftopos adecuados incluyen epftopos de celulas T. Adecuadamente, dichos peptidos son "peptidos inmunogenicos", es decir, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria antiantfgeno asociado a tumores. Dicha respuesta inmunitaria incluye una respuesta de celulas T citotoxicas para peptidos, asf como una respuesta de celulas T citotoxicas y/o respuesta de anticuerpos para antfgenos proteicos en general.
A este respecto, el termino "peptido" se usa en el sentido normal para indicar una serie de restos, tfpicamente L- aminoacidos, conectados uno al otro tfpicamente por enlaces peptfdicos entre los grupos a-amino y carboxilo de aminoacidos adyacentes. El termino incluye peptidos modificados y analogos peptfdicos sinteticos.
Un epftopo de celulas T es un peptido corto que puede derivar de un antfgeno proteico. Las celulas presentadoras de antfgeno pueden internalizar el antfgeno y procesarlo en fragmentos cortos que son capaces de unirse a moleculas mHc. La especificidad de la union del peptido al MHC depende de interacciones especfficas entre el peptido y el surco de union peptfdico de la molecula mHc particular.
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Los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase I (y se reconocen por celulas T CD8+) tienen habitualmente entre 6 y 12, mas habitualmente entre 8 y 12 aminoacidos u 8 y 10 aminoacidos de longitud. Tfpicamente, los peptidos son de 9 aminoacidos de longitud. El grupo amina aminoterminal del peptido hace contacto con un sitio invariable en un extremo del surco peptfdico y el grupo carboxilato en el extremo carboxi se une a un sitio invariable en el otro extremo del surco. Por tanto, tfpicamente, dichos peptidos tienen un extremo carboxi hidrofobo o basico y ausencia de prolina en el extremo aminoterminal. El peptido descansa en una conformacion extendida a lo largo del surco con contactos adicionales entre atomos de la cadena principal y cadenas laterales de aminoacidos conservados que revisten el surco. Las variaciones en la longitud del peptido se acomodan por una torsion en la estructura peptfdica, a menudo en restos de prolina o glicina.
Los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase II habitualmente son de al menos 10 aminoacidos, por ejemplo, de aproximadamente 13-18 aminoacidos de longitud y pueden ser mucho mas largos. Estos peptidos descansan en una conformacion extendida a lo largo del surco de union peptfdico de MHC II que esta abierto en ambos extremos. El peptido se mantiene en su lugar principalmente por contactos de atomos de la cadena principal con restos conservados que revisten el surco de union peptfdico.
Los peptidos antigenicos de la presente invencion pueden prepararse usando metodos qmmicos (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.). Por ejemplo, los peptidos pueden sintetizarse por tecnicas en fase solida (Roberge JY et al. (1995) Science 269: 202-204), escindirse de la resina y purificarse por cromatograffa ftquida de alto rendimiento preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, Nueva York nY). Puede conseguirse smtesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de peptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
El peptido como alternativa puede prepararse por medios recombinantes o por escision de un polipeptido mas largo. Por ejemplo, el peptido puede obtenerse por escision de una protema de longitud completa tal como 5T4 de longitud completa. La composicion de un peptido puede confirmarse por analisis de aminoacidos o secuenciacion (por ejemplo, el procedimiento de degradacion de Edman).
La expresion "epftopo peptfdico" abarca peptidos modificados. Por ejemplo, pueden mutarse los peptidos de antfgeno asociado a tumores por insercion, delecion o sustitucion de aminoacidos, siempre que se retenga la especificidad de union a MHC del peptido de antfgeno asociado a tumores de tipo silvestre. En una realizacion preferida, el epftopo modificado tiene mayor afinidad por el surco de union peptfdico. Preferiblemente, el peptido contiene 5 o menos mutaciones de la secuencia de tipo silvestre, mas preferiblemente 3 o menos, mucho mas preferiblemente 1 o 0 mutaciones.
Como alternativa (o adicionalmente) las modificaciones pueden hacerse sin cambiar la secuencia de aminoacidos del peptido. Por ejemplo, pueden incluirse D-aminoacidos u otros aminoacidos no naturales, puede remplazarse el enlace amida normal por ester o enlaces de estructura alquilo, sustituyentes N o C alquilo, modificaciones de cadena lateral y pueden incluirse limitaciones tales como puentes disulfuro y enlaces amida o ester de cadena lateral. Dichos cambios pueden producir mayor estabilidad in vivo del peptido y vida biologica mas larga.
Otras formas de modificacion inclrnan modificaciones postraduccionales tales como fosforilacion y glucosilacion de los peptidos. Los peptidos modificados de forma postraduccional inducen esencialmente la misma respuesta inmunitaria que otros peptidos de acuerdo con la invencion. Ciertas modificaciones podnan dar lugar a un aumento en la respuesta inmunitaria inducida mientras que otras disminuinan la respuesta. Otras modificaciones incluyen la adicion o eliminacion de un sitio de glucosilacion o fosforilacion para cambiar o modular la respuesta inmunitaria estimulada por estos peptidos.
La modificacion de epftopos puede realizarse basandose en predicciones de induccion de celulas T mas eficaz derivadas usando el programa "Peptide Binding Predictions" ideado por K. Parker (NIH) que puede encontrarse en
http://www-bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform (vease tambien Parker, K. C et al. 1994. J. Immunol. 152:163).
Un epftopo peptfdico antigenico "modificado" incluye peptidos que se han unido o asociado de otro modo a peptidos transportadores o adyuvantes, para aumentar su capacidad de provocar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, los peptidos pueden fusionarse a peptidos transportadores independientes TAP para un transporte eficaz a HLA e interaccion con moleculas HLA para potenciar los epftopos CTL (para una revision vease Yewdell et al., 1998 J Immunother 21:127-31; Fu et al., (1998) J Virol 72:1469-81).
En una realizacion adicional, los antfgenos o peptidos derivados de dichos antfgenos pueden fusionarse al antfgeno central de hepatitis B para potenciar las respuestas T auxiliares y de anticuerpos (Schodel et al., 1996 Intervirology 39:104-10).
Para ser un epftopo, el peptido debe ser capaz de unirse al surco de union peptfdico de una molecula MHC de clase I o II y reconocerse por una celula T.
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La presentacion en superficie celular de los peptidos derivados de un antfgeno dado no es aleatoria y tiende a estar dominada por una pequena cantidad de epftopos que aparecen de forma frecuente. La dominancia de un peptido particular dependera de muchos factores, tales como la afinidad relativa para la union a la molecula MHC, el punto espacio temporal de generacion dentro de la APC y la resistencia a la degradacion. La jerarqma del epftopo para un antigeno se cree que cambia con la progresion de una respuesta inmunitaria. Despues de una respuesta inmunitaria primaria a los peptidos inmunodominantes, puede suceder "propagacion" del epftopo a determinantes subdominantes (Lehmann et al. (1992) Nature 358:155-157).
Para cualquier antigeno dado, tambien pueden existir epftopos cnpticos. Los epftopos cnpticos son aquellos que pueden estimular una respuesta de celulas T cuando se administran como un peptido pero que no logran producir dicha respuesta cuando se administran como un antigeno completo. Puede ser que durante el procesamiento del antigeno en peptidos en la APC se destruya el epftopo cnptico.
El peptido para su uso en la invencion puede ser un epftopo inmunodominante, un epftopo subdominante o un epftopo cnptico.
Los epftopos para un antfgeno pueden identificarse midiendo una respuesta de celulas T a peptidos solapantes que abarcan una parte del antigeno cuando se presentan por APC. Dichos estudios habitualmente producen "conjuntos anidados" de peptidos y el epftopo mmimo para una lmea/clon de celula T particular puede evaluarse midiendo la respuesta a peptidos truncados.
El epftopo mmimo para un antigeno puede no ser el mejor epftopo para propositos practicos. Tambien puede ser que los aminoacidos que flanquean el epftopo mmimo sean necesarios para la union optima al MHC.
Los peptidos se ensayan en un sistema de presentacion de antigeno que comprende celulas presentadoras de antigeno y celulas T. Por ejemplo, el sistema de presentacion de antigeno puede ser una preparacion de esplenocitos murinos, una preparacion de celulas humanas de airftgdala o PBMC. Como alternativa, el sistema de presentacion de antfgeno puede comprender una lmea/clon de celula T particular y/o un tipo de celula presentadora de antigeno particular.
La activacion de celulas T puede medirse a traves de la proliferacion de celulas T (por ejemplo, usando incorporacion de 3H-timidina) o produccion de citoquinas. La activacion de celulas T CD4+ de tipo TH1 puede detectarse, por ejemplo, a traves de la produccion de IFNy que puede detectarse por tecnicas convencionales, tales como un ensayo ELISPOT.
Hebra de poliepftopo
Se ha descubierto que una manera particularmente eficaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un antigeno es por el uso de una hebra de poliepftopo, que contiene una pluralidad de epftopos antigenicos de uno o mas antigenos unidos juntos. Por ejemplo, para la malaria, se ha descrito una hebra de poliepftopo de epftopos peptfdicos de celulas T CD8 principalmente de malaria (P. falciparum) que tambien expresa epftopos de celulas T CD4 de toxoide tetanico y del antigeno micobacteriano de 38 kDa de diversas cepas de M. tuberculosis y M. bovis.
Por consiguiente, el antigeno asociado a tumores para su uso en la presente invencion puede ser una hebra de poliepftopo que comprende al menos un peptido de un antigeno asociado a tumores. Adecuadamente, una hebra de poliepftopo esta compuesta de al menos uno, dos, tres, cuatro o mas epftopos peptfdicos. La hebra tambien puede comprender otro epftopo que puede derivar de un antfgeno tal como el antigeno 5T4 o un epftopo de otro antfgeno - tal como otro TAA - o combinaciones de los mismos. Una hebra de poliepftopo puede comprender opcionalmente aminoacidos intermedios adicionales, entre los diferentes epftopos de antigeno tumoral. Adecuadamente, los epftopos se unen por secuencias adicionales que estan ausentes de la protema de longitud completa.
Penetradores celulares
La presente invencion tambien proporciona el uso de un antfgeno o un epftopo peptfdico del mismo, o una hebra de poliepftopo en asociacion con un penetrador celular.
Las celulas presentadoras de antfgeno (tales como celulas dendrfticas) pulsadas con peptidos han demostrado ser eficaces en la potenciacion de la inmunidad antitumoral (Celluzzi et al. (1996) J. Exp. Med. 183 283-287; Young et al. (1996) J. Exp. Med. 183 7-11). Se ha demostrado que es posible prolongar la presentacion de un peptido por celulas dendrfticas (y, por tanto, potenciar la inmunidad antitumoral) uniendolo a un peptido de penetracion celular (CPP) (Wang y Wang (2002) Nature Biotechnology 20 149-154).
Un penetrador celular puede ser cualquier entidad que potencie el suministro intracelular del peptido/hebra de poliepftopo a la celula presentadora de antfgeno. Por ejemplo, el penetrador celular puede ser un ftpido que, cuando esta asociado con el peptido, potencia su capacidad de cruzar la membrana plasmatica. Como alternativa, el penetrador celular puede ser un peptido. Se han identificado varios peptidos de penetracion celular (CPP) de
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protemas, incluyendo la protema Tat de VIH (Frankel y Pabo (1988) Cell 55 1189-1193), la protema VP22 de HSV (Elliott y O'Hare (1997) Cell 88 223-233) y el factor de crecimiento de fibroblastos (Lin et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 14255-14258).
La expresion "asociado con" pretende incluir enlace directo, por ejemplo, por un enlace covalente. Ejemplos de enlaces covalentes para union de aminoacidos incluyen puentes disulfuro y enlaces peptidicos. En una realizacion preferida, el peptido/hebra de poliepttopo y un CPP se unen por un enlace peptfdico para crear una protema de fusion.
La expresion tambien incluye enlace no covalente, tal como asociacion por enlace electrostatico, enlace de hidrogeno y fuerzas de van der Waals. El penetrador celular y el peptido/hebra de poliepttopo pueden asociarse sin union covalente o no covalente. Por ejemplo, el penetrador celular puede ser un lfpido que encapsula el peptido/hebra de poliepttopo (por ejemplo, un liposoma)
Composiciones para administrar andgenos asociados a tumores
Sistema de vector
Una secuencia de acido nucleico que codifica un antfgeno para su uso en la presente invencion puede suministrarse o administrarse a un mairnfero tal como un paciente humano mediante un sistema de vector.
Como se usa en este documento, un "vector" puede ser cualquier agente capaz de suministrar o mantener un acido nucleico en una celula hospedadora, e incluye vectores vmcos, plasmidos, acidos nucleicos desnudos, acidos nucleicos en complejo con polipeptido u otras moleculas y acidos nucleicos inmovilizados en partmulas en fase solida. Dichos vectores se describen en detalle a continuacion. Se entendera que la presente invencion, en su forma mas amplia no esta limitada a ningun vector espedfico para el suministro del acido nucleico que codifica el antigeno asociado a tumores.
Los acidos nucleicos que codifican antigenos, epftopos y hebras de poliepttopo de acuerdo con la presente invencion pueden suministrarse o administrarse por tecnicas vmicas o no vmicas.
Los sistemas de suministro no vmcos incluyen, aunque sin limitacion, metodos de transfeccion de ADN. En esta ocasion, la transfeccion incluye un proceso usando un vector no vmco para suministrar un gen que codifica un antigeno a una celula de mamffero diana.
Los metodos de transfeccion tfpicos incluyen electroporacion, biolfstica de acido nucleico, transfeccion mediada por lfpidos, transfeccion mediada por acido nucleico compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, por mediacion de agente cationico, anfffilos faciales cationicos (CFA) (Nature Biotechnology 1996 14; 556), cationes
multivalentes tales como espermina, lfpidos cationicos o polilisina, complejos de 1,2,-bis(oleoiloxi)-3-
(trimetilamonio)propano (DOTAP)-colesterol (Wolff y Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16: 421) y combinaciones de los mismos.
Los sistemas de suministro no vmcos tambien pueden incluir, aunque sin limitacion, sistemas de suministro
bacterianos. El uso de bacterias como agentes antineoplasicos y como agentes de suministro para farmacos
antineoplasicos se ha revisado en Expert Opin Biol Ther marzo de 2001; 1(2):291-300.
Las bacterias adecuadas incluyen, aunque sin limitacion, patogenos bacterianos y bacterias comensales no patogenicas. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse los generos adecuaos de Salmonella, Mycobacterium, Yersinia, Shigella, Listeria y Brucella. Los recientes avances en la patogenesis y biologfa molecular de estas bacterias ha permitido el desarrollo racional de portadores bacterianos nuevos y mejorados y sistemas de expresion genica mas eficaces. Estos avances han mejorado el rendimiento y versatilidad de estos sistemas de suministro.
Las bacterias pueden ser bacterias intracelulares invasivas que son capaces de transferir plasmidos de expresion eucariotas a celulas hospedadoras de marnffero in vitro e in vivo. La transferencia plasmfdica puede tener lugar cuando la bacteria recombinante muere dentro de la celula hospedadora, debido a atenuacion metabolica o induccion de autolisis. Como alternativa, pueden usarse antibioticos y tambien se ha observado transferencia espontanea, que indica que este fenomeno tambien podna suceder en condiciones fisiologicas. Se ha informado de transferencia plasmfdica para Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, S. typhi, Listeria monocytogenes y Escherichia coli recombinante, pero tambien pueden usarse otras bacterias invasivas.
Las bacterias pueden usarse para el suministro de vacunas de ADN. Dichas bacterias pueden entrar en el citosol de la celula hospedadora despues de fagocitosis, por ejemplo, Shigella y Listeria, o permanecen en el compartimento fagosomico - tal como Salmonella. Ambas localizaciones intracelulares pueden ser adecuadas para un suministro satisfactorio de vectores de vacuna de ADN.
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Los sistemas de suministro bacterianos pueden utilizar Mycobacterium en forma de cepas de Mycobacterium no patogenicas, sistemas de transferencia genetica en forma de vectores de clonacion o expresion y tecnologfa relacionadas para proporcionar productos que contienen, por ejemplo, adyuvantes de Mycobacterium inmunorreguladores no toxicos, antigenos exogenos inmunoestimulantes no toxicos espedficos para una diversidad de enfermedades y cantidades no toxicas de citoquinas que refuerzan la ruta TH1 (Tunis Med febrero de 2001; 79(2):65-81).
Las cepas de Salmonella - tales como cepas atenuadas - que comprenden deleciones genicas definidas, pueden usarse como sistemas de suministro adecuados - tal como el suministro de antigenos. Se han intentado varias estrategias para el suministro de estas cepas, que vanan desde sistemas de integracion basados en plasmidos a sistemas de integracion cromosomicos. A modo de ejemplo, Rosenkranz et al. Vaccine 2003, 21(7-8), 798-801 describen plasmidos de expresion eucariotas que codifican citoquinas y evaluaron su capacidad de modular las respuestas inmunitarias en diferentes modelos experimentales. Los plasmidos que codifican IL4 e IL18 de raton bajo el promotor de citomegalovirus se construyeron y transformaron en Salmonella enterica atenuada viva serovar Typhi cepa CVD 908-htrA, y Salmonella enterica serovar Typhimurium cepa SL3261.
El uso de Salmonella typhimurium atenuada como vector de suministro genico potencial se ha revisado en Anticancer Res 2002, 22(6A):3261-6.
Brucella abortus tambien puede usarse como sistema de suministro adecuado como se describe por Vemulapalli et al. Infect Immun (2000) 68(6):3290-6. Brucella abortus cepa RB51 es un mutante atenuado estable, rugoso ampliamente usado como vacuna viva para la brucelosis bovina. Esta cepa puede usarse como vector de suministro, por ejemplo, en el suministro de antfgenos protectores de otros patogenos intracelulares para los que se necesita la induccion de una fuerte respuesta inmunitaria de tipo TH1 para una proteccion eficaz.
Boyd et al. Eur J Cell Biol (2000) 79 (10) 659-71 describen el uso de Yersinia enterocolitica para el suministro de protemas en una amplia gama de tipos celulares. Y. Enterocolitica trasloca protemas de virulencia, llamadas efectores Yop, al citosol de celulas eucariotas. No se informo de lfmite a la gama de celulas eucariotas en que, Y. enterocolitica puede traslocar Yops. Los efectores Yop YopE, YopH y YopT eran cada uno citotoxico para los tipos de celulas adherentes ensayados, mostrando que no solamente Y. Enterocolitica no es selectiva en su traslocacion de efectores Yop particulares en cada tipo celular, sino tambien que la accion de estos efectores Yop no es espedfica de tipo celular. Para usar el sistema de traslocacion de Yersinia para amplias aplicaciones, se construyo una cepa de traslocacion de Y. Enterocolitica y un vector para el suministro de protemas heterologas en celulas eucariotas. Esta combinacion de cepa y vector carece de los efectores Yop traslocados y permite el suministro en celulas eucariotas de protemas heterologas fusionadas a la senal minima de secrecion/traslocacion N-terminal de YopE.
El documento US 5965381 describe una Yersinia recombinante para el suministro de protemas en celulas eucariotas. Dicha Yersinia es deficiente en la produccion de protemas efectoras funcionales, pero esta dotada de un sistema de secrecion y traslocacion funcional.
Las moleculas de adhesion celular son un gran grupo de moleculas implicadas en una diversidad de interacciones entre celulas y entre celulas y matriz extracelular (ECM) y se explotan por varios microorganismos patogenicos como receptores para la entrada en las celulas. Estas moleculas pueden usarse para dirigir y captar sistemas de suministro tanto de genes como de farmacos. Las moleculas de adhesion celular y su uso en transferencia genica, se ha revisado en Adv Drug Deliv Rev 15 de noviembre de 2000; 44(2-3):135-52.
El sistema de suministro de pistola genica tambien puede usarse para el suministro de ADN, que es un metodo altamente fiable en comparacion con la inoculacion intramuscular (Jpn J Pharmacol julio de 2000; 83(3):167-74).
Los sistemas de suministro vmco incluyen, aunque sin limitacion, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores de virus del herpes, vectores de retrovirus, vectores de lentivirus o vectores de baculovirus, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), poxvirus tales como: virus de la viruela de los canarios (Taylor et al. 1995 Vaccine 13:539-549), entomopoxvirus (Li Y et al. 1998 XIIth International Poxvirus Symposium pag. 144. Resumen), viruela del pinguino (Standard et al. J Gen Virol. 1998 79:1637-46), alfavirus y vectores de ADN basados en alfavirus.
Los ejemplos de retrovirus incluyen, aunque sin limitacion: virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus del tumor mamario de raton (MMTV), virus del sarcoma de Rous (RSV), virus del sarcoma de Fujinami (FuSV), virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), virus del sarcoma murino de Moloney (Mo- MSV), virus de la leucemia murina de Abelson (A-MLV), virus 29 de la mielocitomatosis aviar (MC29) y virus de la eritroblastosis aviar (AEV).
Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pag. 758-763).
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Los lentivirus pueden dividirse en grupos de primates y no de primates. Ejemplos de lentivirus de primates incluyen, aunque sin limitacion: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del smdrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) humano y el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV). El grupo de lentivirus no de primates incluye el virus visna/maedi (VMV) prototipo de "virus lento", asf como el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) relacionado, el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) y el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) mas recientemente descrito y el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV).
Una distincion entre la familia de lentivirus y otros tipos de retrovirus es que los lentivirus tienen la capacidad de infectar celulas tanto en division como no en division (Lewis et al. 1992 EMBO. J 11: 3053-3058; Lewis y Emerman 1994 J. Virol. 68: 510-516). En contraste, otros retrovirus - tales como MLV - son incapaces de infectar celulas que no estan en division tales como las que componen, por ejemplo, el musculo, el cerebro, el pulmon y el tejido hepatico.
El vector para su uso en la presente invencion puede configurarse como un vector dividido por intrones. Un vector dividido por intrones se describe en las solicitudes de patente PCT WO 99/15683 y WO 99/15684.
Si las caractensticas de los adenovirus se combinan con la estabilidad genetica de los retrovirus/lentivirus, entonces puede usarse esencialmente el adenovirus para transducir celulas diana para que lleguen a ser celulas productoras de retrovirus transitorias que podnan infectar de forma estable celulas adyacentes. Dichas celulas productoras de retrovirus modificadas para expresar el antigeno 5T4 pueden implantarse en organismos tales como animales o seres humanos para su uso en el tratamiento de la angiogenesis y/o el cancer.
El vector para su uso en la presente invencion puede configurarse como un vector pseudotipado.
En el diseno de vectores retrovmcos, puede ser deseable modificar partmulas con diferentes especificidades de celula diana para el virus nativo, para posibilitar el suministro de material genetico a una gama expandida o alterada de tipos celulares. Una manera para conseguir esto es modificando la protema de envuelta vmca para alterar su especificidad. Otro enfoque es introducir una protema de envuelta heterologa en la partmula de vector para remplazar o anadir la protema de envuelta nativa del virus.
El termino pseudotipado significa incorporar al menos una parte o sustituir una parte o remplazar todo un gen env de un genoma vmco con un gen env heterologo, por ejemplo, un gen env de otro virus. El pseudotipado no es un fenomeno nuevo y pueden encontrarse algunos ejemplos en el documento WO 99/61639, el documento WO-A- 98/05759, el documento WO-A-98/05754, el documento WO-A-97/17457, el documento WO-A-96/09400, el documento WO-A-91/00047 y en Mebatsion et al. 1997 Cell 90, 841-847.
El pseudotipado puede mejorar la estabilidad del vector retrovmco y la eficacia de transduccion. Se ha descrito un pseudotipo de virus de leucemia murina empaquetado con virus de la coriomeningitis linfodtica (LCMV) (Miletic et al. (1999) J. Virol. 73:6114-6116) y se ha demostrado que es estable durante ultracentrifugacion y capaz de infectar varias lmeas celulares de diferentes especies.
Vectores de poxvirus
Los antfgenos tales como TAA son debilmente inmunogenicos, reconociendose como "propios" por el sistema inmunitario y, por tanto, tolerados en gran medida. El uso de vectores de poxvirus a veces es capaz de causar que los antfgenos se presenten de modo que esta tolerancia pueda superarse al menos en parte (especialmente si se delecionan los genes de evasion inmunitaria - vease a continuacion) posibilitando, por tanto, que un hospedador genere una respuesta inmunitaria.
Los vectores de poxvirus son preferidos para su uso en la presente invencion. Los virus de la viruela se modifican para la expresion genica recombinante y para el uso como vacunas vivas recombinantes. Esto implica el uso de tecnicas recombinantes para introducir acidos nucleicos que codifican antfgenos foraneos en el genoma del virus de la viruela. Si el acido nucleico se integra en un sitio en el ADN vmco que es no esencial para el ciclo vital del virus, es posible que el virus de la viruela recombinante recien producido sea infeccioso, es decir, infecte celulas foraneas y, por tanto, exprese la secuencia de ADN integrada. El virus de la viruela recombinante preparado de esta manera puede usarse como vacunas vivas para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades patologicas e infecciosas.
La expresion del peptido o peptidos antigenicos en virus de la viruela recombinantes, tales como virus vaccinia, requiere el ligamiento de promotores de vaccinia al acido nucleico que codifico el peptido o peptidos 5T4. Los vectores plasmfdicos (tambien llamados vectores de insercion), se han construido para insertar acidos nucleicos en virus vaccinia a traves de recombinacion homologa entre las secuencias vmcas que flanquean el acido nucleico en un plasmido donante y la secuencia homologa presente en el virus precursor (Mackett et al. 1982 PNAS 79: 74157419). Un tipo de vector de insercion esta compuesto de: (a) un promotor de virus vaccinia que incluye el sitio de inicio de la transcripcion; (b) varios sitios de clonacion de endonucleasas de restriccion unicas localizados en direccion 3' desde el sitio de inicio de la transcripcion para la insercion de acido nucleico; (c) secuencias no esenciales del virus vaccinia (tal como el gen de la timidina quinasa (TK)) que flanquean el promotor y los sitios de
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clonacion que dirigen la insercion del acido nucleico en la region no esencial homologa del genoma vmco; y (d) un origen bacteriano de replicacion y un marcador de resistencia a antibioticos para dar replicacion y seleccion en E. coli. Los ejemplos de dichos vectores se describen por Mackett (Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857-864).
El plasmido aislado que contiene el acido nucleico a insertar se transfecta en un cultivo celular, por ejemplo, fibroblastos de embrion de pollo, junto con el virus precursor, por ejemplo, poxvirus. La recombinacion entre el ADN homologo de viruela en el plasmido y el genoma vmco respectivamente produce virus de la viruela recombinante modificado por la presencia de la construccion de promotor-gen en su genoma, en un sitio que no afecta a la viabilidad del virus. Como se indica anteriormente, el acido nucleico se inserta en una region (region de insercion) en el virus que no afecta a la viabilidad del virus del virus recombinante resultante. Dichas regiones pueden identificarse facilmente en un virus por, por ejemplo, ensayo aleatorio de segmentos de ADN vmco para regiones que permiten la formacion recombinante sin afectar de forma importante a la viabilidad del virus del recombinante. Una region que puede usarse facilmente y esta presente en muchos virus es el gen de la timidina quinasa (TK). Por ejemplo, el gen TK se ha encontrado en todos los genomas de virus de la viruela examinados [leporipoxvirus: Upton, et al. J. Virology 60:920 (1986) (virus del fibroma de Shope); capripoxvirus: Gershon, et al. J. Gen. Virol. 70:525 (1989) (oveja-1 de Kenia); ortopoxvirus: Weir, et al. J. Virol 46:530 (1983) (vaccinia); Esposito, et al. Virology 135:561 (l984) (virus de la viruela del mono); Hruby, et al. PNAS, 80:3411 (1983) (vaccinia); Kilpatrick, et al. Virology 143:399 (1985) (virus del tumor de mono de Yaba); avipoxvirus: Binns, et al. J. Gen. Virol 69:1275 (1988) (viruela aviar); Boyle, et al. Virology 156:355 (1987) (viruela aviar); Schnitzlein, et al. J. Virological Method, 20:341 (1988) (viruela aviar, viruela de la codorniz); entomopoxvirus (Lytvyn, et al. J. Gen. Virol 73:3235-3240 (1992)].
En vaccinia, ademas de la region TK, otras regiones de insercion incluyen, por ejemplo, HindIII M.
En la viruela aviar, ademas de la region TK otras regiones de insercion incluyen, por ejemplo, BamHI J [Jenkins, et al. AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998 (1991)] el fragmento EcoRl-HindIII, el fragmento BamHI, el fragmento EcoRV-HindIII, el fragmento BamHI y el fragmento HindIII expuesto en la solicitud EPO n.° 0 308 220 A1. [Calvert, et al. J. of Virol 67:3069-3076 (1993); Taylor, et al. Vaccine 6:497-503 (1988); Spehner, et al. (1990) y Boursnell, et al. J. of Gen. Virol 71:621-628 (1990)].
En la viruela porcina, los sitios de insercion preferidos incluyen region del gen de la timidina quinasa.
Un promotor puede seleccionarse facilmente dependiendo del hospedador y el tipo de celula diana. Por ejemplo, en virus de la viruela, deben usarse promotores del virus de la viruela, tal como el 7.5K de vaccinia o 40K o C1 de viruela aviar. Tambien pueden usarse construcciones artificiales que contienen secuencias apropiadas de viruela. Tambien pueden usarse elementos potenciadores en combinacion para aumentar el nivel de expresion. Ademas, el uso de promotores inducibles, que tambien es bien conocido en la tecnica, es preferido en algunas realizaciones.
La expresion del gen foraneo puede detectarse por ensayos enzimaticos o inmunologicos (por ejemplo, inmunoprecipitacion, radioinmunoensayo o inmunotransferencia). Las glucoprotemas de membrana de origen natural producidas a partir de celulas infectadas con vaccinia recombinante se glucosilan y pueden transportarse a la superficie celular. Pueden obtenerse altos niveles de expresion usando promotores fuertes.
Otros requisitos para los vectores vmcos para su uso en vacunas incluyen buena inmunogenicidad y seguridad. MVA es una cepa de vaccinia con la replicacion alterada con un buen registro de seguridad. La mayona de tipos celulares y tejidos humanos normales, MVA no se replica. La replicacion de MVA se observa en unos pocos tipos celulares transformados tales como celulas BHK21. Carroll et al. (1997) han demostrado que el MVA recombinante es igual de bueno que los vectores vaccinia recombinantes convencionales para generar una respuesta de celulas T CD8+ protectora y es una alternativa eficaz al virus vaccinia competente en la replicacion habitualmente usado. Las cepas de virus vaccinia derivadas de MVA o cepas desarrolladas independientemente que tienen las caractensticas de MVA que hacen que MVA sea particularmente adecuado para su uso en una vacuna, tambien son adecuadas para su uso en la presente invencion.
Preferiblemente, el vector es un vector de virus vaccinia tal como MVA o NYVAC. El mas preferido es el virus de Ankara modificado con la cepa vaccinia (MVA, Modified Vaccinia Ankara) o una cepa derivada del mismo. Las alternativas a vectores de vaccinia incluyen vectores de viruela aviar tales como viruela aviar o viruela del canario conocidos como ALVAC y cepas derivadas de los mismos que pueden infectar y expresar protemas recombinantes en celulas humanas, pero son incapaces de replicarse.
En un aspecto de la presente invencion, se deleciona al menos un gen de evasion inmunitaria del vector del virus de la viruela.
Los virus, especialmente los virus grandes tales como virus de la viruela que tienen una gran capacidad codificante y, por tanto, pueden codificar una diversidad de genes, han desarrollado varias tecnicas para evadir el sistema inmunitario de sus hospedadores. Por ejemplo, son capaces de evadir las defensas no espedficas tales como el complemento, los interferones y la respuesta inflamatoria, asf como interferir o bloquear la funcion de las citoquinas.
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Varios de estos polipeptidos de evasion inmunitaria se han delecionado de MVA, con la excepcion de la protema de resistencia a interferon en la region terminal izquierda.
Los virus de la viruela, en general, son virus ADN grandes que establecen infecciones agudas, en lugar de latentes. Codifican muchas protemas antigenicas de modo que la variacion antigenica es diffcil, dependiendo por tanto de la evasion inmunitaria activa para protegerse a sf mismos del sistema inmunitario de mai^ero. Poseen varios genes que codifican polipeptidos que son responsables de interferir con varios aspectos del sistema inmunitario: alteran la accion del interferon, interfieren con el complemento, la actividad de citoquinas, las respuestas inflamatorias y el reconocimiento de CTL (para una revision Smith et al., (1997) Immunol Rev 159:137-154). La eliminacion de estas protemas es beneficiosa en promover la capacidad de los inmunogenos debiles codificados en un vector de virus de la viruela de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Un gen o polipeptido de evasion inmunitaria es un gen, o su producto, que ayuda al virus a evadirse del sistema inmunitario de mairnfero. Preferiblemente, el gen o producto genico interfiere con el trabajo del sistema inmunitario, al menos a un nivel. Esto puede conseguirse de varias maneras, tal como interfiriendo en las rutas de senalizacion proporcionando competidores para las moleculas de senalizacion, proporcionando mimeticos del receptor soluble de citoquinas y similares.
Los genes de evasion inmunitaria incluyen, aunque sin limitacion, los siguientes:
Genes de evasion de interferon. Vaccinia posee al menos tres genes que interfieren con la accion de IFN. El gen E3L expresa un polipeptido de 25 kDa que compite con la protema quinasa P1 por la union a ARNbc, un evento que conduce a activacion de P1, fosforilacion de eIF2a y fallo resultante del ensamblaje del complejo de inicio de la traduccion. Esta ruta habitualmente es sensible a activacion de IFN, por tanto, esta impedida por la expresion de E3L, permitiendo de ese modo que el inicio de la traduccion prosiga sin impedimentos.
El gen K3L expresa un polipeptido de 10,5 kDa que tambien interfiere con la actividad de P1, ya que es efectivamente un mimetico de eIF2a y actua como competidor para la protema quinasa P1. Su modo de accion es, por tanto, similar a E3L.
Se predice que el gen A18R codifica una helicasa, que parece interferir con la ruta de 2',5'-oligoadenilato que, a su vez, es sensible a IFN. 2',5'-A activa la RNasa L, que actua previniendo la traduccion vmca. La expresion de A18R parece reducir los niveles de 2',5'-A en celulas infectadas.
Complemento. Se sabe que el producto del gen B5R de vaccinia esta altamente relacionado con el factor H, un regulador de la ruta alternativa del complemento. Esta ruta puede activarse por el antfgeno en solitario, a diferencia de la ruta clasica. El producto del gen B5R, por tanto, puede interferir con la ruta alternativa del complemento.
El gen C21L esta relacionado, a su vez, con la protema de union a C4b en seres humanos e interactua con celulas que albergan C4b sobre la superficie para evitar la union al receptor del complemento CR1.
Receptores solubles de citoquinas. El producto del gen WR B15R de vaccinia (B16R en la cepa de vaccinia Copenhagen) esta relacionado con IL1-R.
La ORF SalF19R, del gen WR, A53R en la cepa de vaccinia Copenhagen, codifica un receptor de TNF. Sin embargo, en el virus de tipo silvestre se cree que estos dos genes son inactivos debido a la fragmentacion de las ORF.
Se cree que el gen B8R codifica un receptor soluble de IFNy, proporcionando al virus otro mecanismo mas de evasion de IFN.
Inflamacion. Se cree que varios genes estan implicados en la prevencion de las respuestas inflamatorias a infeccion vmca. Estos incluyen A44L, K2L, B13R y B22R.
En un aspecto de la presente invencion, la mayona de los genes de evasion inmunitaria se delecionan del vector del virus de la viruela recombinante. Preferiblemente, todos los genes de evasion inmunitaria se delecionan. Por tanto, en un aspecto de la presente invencion, el vector del virus de la viruela recombinante es un vector MVA recombinante en que se ha alterado o delecionado el gen de la protema de resistencia a interferon K3L.
Se prefieren virus de la viruela que no son peligrosos para el sujeto pretendido. Por tanto, por ejemplo, para su uso en seres humanos, se prefieren virus de la viruela que estan restringidos al rango de hospedador, tales como los virus de la viruela aviar o atenuados de otro modo, tales como cepas atenuadas de vaccinia (incluyendo NYVAC y MVA). Son mucho mas preferidas las cepas del virus vaccinia atenuado, aunque las cepas no de vaccinia se emplean habitualmente en sujetos con inmunidad preexistente a viruela.
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Se introduce una construccion que contiene al menos un acido nucleico que codifica uno o mas epftopos del antigeno asociado a tumores flanqueados por secuencias de ADN de MVA adyacentes a una delecion de origen natural, por ejemplo, delecion II, dentro del genoma de MVA, en celulas infectadas con MVA, para permitir la recombinacion homologa.
Una vez se ha introducido la construccion en la celula eucariota y se ha combinado el ADN del epttopo del antfgeno asociado a tumores con el ADN vmco, el virus de vaccinia recombinante deseado puede aislarse, preferiblemente con la ayuda de un marcador (Nakano et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596 [1982], Franke et al. Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti et al. Mol. Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi et al. Virology 97-105 [1986]).
La construccion a insertar puede ser lineal o circular. Se prefiere un ADN circular como especialmente un plasmido. La construccion contiene secuencias que flanquean el lado izquierdo y derecho de una delecion de origen natural, por ejemplo, la delecion II, dentro del genoma de MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. y Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27). La secuencia de ADN foraneo se inserta entre las secuencias que flanquean la delecion de origen natural.
Para la expresion de al menos un acido nucleico, es necesario que haya secuencias reguladoras, que son necesarias para la transcripcion del acido nucleico, presentes en direccion 5' del acido nucleico. Dichas secuencias reguladoras son conocidas para los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, las del gen de 11 kDa de vaccinia que se describen en el documento EP-A-198.328 y las del gen de 7,5 kDa (documento EP-A-110.385).
La construccion puede introducirse en las celulas infectadas por MVA por transfeccion, por ejemplo, mediante precipitacion con fosfato calcico (Graham et al. Virol. 52, 456-467 [1973; Wigler et al. Cell 777-785 [1979] mediante electroporacion (Neumann et al. EMBO J. 1, 841-845 [1982]), por microinyeccion (Graessmann et al. Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), mediante liposomas (Straubinger et al. Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), mediante esferoblastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) o por otros metodos conocidos para los expertos en la materia. Se prefiere la transfeccion mediante liposomas.
Los vectores recombinantes para su uso en la presente invencion pueden tener tropismo por un tipo celular espedfico en el mairnfero. A modo de ejemplo, los vectores recombinantes de la presente invencion pueden modificarse para infectar APC profesionales tales como celulas dendnticas y macrofagos. Se sabe que las celulas dendnticas son las que orquestan la respuesta inmunitaria satisfactoria especialmente la respuesta mediada por celulas. Se ha demostrado que el tratamiento ex vivo de las celulas dendnticas con antfgeno o vectores vmcos que contienen dicho antfgeno diana, inducira respuestas inmunitarias eficaces cuando se infunde en animales o seres humanos singenicos (vease, Nestle FO, et al. Vaccination of melanoma patients with peptide - or tumor lysate - pulsed dendritic cells, Nat Med. Marzo de 1998; 4(3):328-32 y Kim CJ, et al. Dendritic cells infected with poxviruses encoding MART-1/Melan A sensitize T lymphocytes in vitro. J Immunother. Julio de 1997; 20(4):276-86). Los vectores recombinantes tambien pueden infectar celulas tumorales. Como alternativa, los vectores recombinantes son capaces de infectar cualquier celula en el mai^ero.
Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de suministro ex vivo, que incluyen, aunque sin limitacion, metodos de transfeccion de ADN tales como electroporacion, biolfstica de ADN, transfeccion mediada por lfpidos y transfeccion mediada por ADN compactado.
El vector puede ser un vector de ADN plasmfdico. Como se usa en este documento, "plasmido" se refiere a elementos concretos que se usan para introducir ADN heterologo en celulas para la expresion o replicacion del mismo. La seleccion y uso de dichos vehfculos pertenece a las habilidades de la tecnica.
Adecuadamente, el sistema de vector para la administracion del antfgeno asociado a tumores es la vacuna TroVax®, una vacuna contra el cancer en desarrollo clmico para el suministro de 5T4 usando un vector de virus vaccinia atenuado (MVA). TroVax® actualmente se esta evaluando en ensayos clmicos en fase II en pacientes con cancer colorrectal, renal y de prostata en fase final. Los ensayos usando TroVax se describen, por ejemplo, en el documento PCT/GB2005/000026. Ademas, tambien se conciben variaciones o modificaciones basadas en TroVax para administrar antfgenos asociados a tumores.
Celulas pulsadas
La presente invencion tambien proporciona la administracion de un antfgeno usando celulas pulsadas con antfgeno asociado a tumores o peptidos.
Preferiblemente, las celulas a pulsarse son capaces de expresar moleculas MHC de clase I o clase II.
Las moleculas MHC de clase I pueden expresarse en casi todos los tipos celulares, pero la expresion de moleculas MHC de clase II esta limitada a las llamadas celulas presentadoras de antfgeno (APC) "profesionales"; celulas B, celulas dendnticas y macrofagos. Sin embargo, la expresion de MHC de clase II puede inducirse en otros tipos celulares por tratamiento con IFNy.
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La expresion de moleculas MHC de clase I o MHC de clase II tambien puede conseguirse por ingeniena genetica (es decir, proporcionar un gen que codifica la molecula MHC relevante a la celula a pulsar). Este enfoque tiene la ventaja de que puede elegirse uno o mas haplotipos apropiados de MHC que se unen espedficamente al peptido o peptidos.
Preferiblemente, la celula a pulsarse es una celula presentadora de antigenos, es decir, una celula que, en una respuesta inmunitaria normal, es capaz de procesar un antfgeno y presentarlo en la superficie celular junto con una molecula MHC. Las celulas presentadoras de antigeno incluyen celulas B, macrofagos y celulas dendnticas. En una realizacion especialmente preferida, la celula es una celula dendntica.
Preferiblemente, la celula es capaz de expresar una molecula MHC que se une a un peptido de acuerdo con el primer aspecto de la invencion en su surco de union peptidico. Por ejemplo, la celula puede expresar uno de los siguientes elementos de restriccion de HLA: B8, Cw7 o A2 (para MHC de clase I).
Los protocolos de pulsacion con peptidos son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Redchenko y Rickinson (1999) J. Virol. 334-342; Nestle et al. (1998) Nat. Med. 4 328-332; Tjandrawan et al. (1998) J. Immunotherapy 21 149-157). Por ejemplo, en un protocolo convencional para cargar celulas dendnticas con peptidos, las celulas se incuban con peptido a 50 pg/ml con p-2 microglobulina a 3 pg/ml durante dos horas en medio sin suero. El peptido no unido despues se retira por lavado.
La celula pulsada de la invencion puede usarse como vacuna, por ejemplo, para estimular una respuesta inmunitaria profilactica o terapeutica contra un antfgeno asociado a tumores espedfico.
La presente invencion, por lo tanto, tambien proporciona un metodo para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una celula pulsada con peptido a un sujeto que lo necesita en combinacion con un agente quimioterapeutico.
Acido nucleico
El antfgeno para su uso en la composicion o medicamento o para su administracion en una combinacion de acuerdo con la invencion se proporciona a traves de una molecula de acido nucleico que codifica dicho antfgeno asociado a tumores.
Un "acido nucleico", como se menciona en este documento, puede ser ADN o ARN, de origen natural o sintetico o cualquier combinacion de los mismos. Los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion se limitan solamente en que cumplen la funcion de codificar un peptido de antfgeno asociado a tumores de tal manera que pueda traducirse por la maquinaria de celulas de un organismo hospedador. Por tanto, los acidos nucleicos naturales pueden modificarse, por ejemplo, para aumentar la estabilidad de los mismos. El ADN y/o ARN, pero especialmente el ARN, puede modificarse para mejorar la resistencia a nucleasas de los miembros. Por ejemplo, las modificaciones conocidas para los ribonucleotidos incluyen 2'-O-metilo, 2'-fluoro, 2'-NH y 2'-O-alilo. Los acidos nucleicos modificados de acuerdo con la invencion pueden comprender modificaciones qrnmicas que se han hecho para aumentar la estabilidad in vivo del acido nucleico, potenciar o mediar el suministro del mismo o reducir la tasa de eliminacion del organismo. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones qrnmicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o base de una secuencia de ARN dada. Vease, por ejemplo, el documento WO 92/03568; el documento U.S. 5.118.672; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12:5138; Guschlbauer et al., (1977) Nucleic Acids Res. 4:1933; Schibaharu et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:4403; Pieken et al., (1991) Science 253:314.
Los acidos nucleicos que codifican antfgenos adecuados o un peptido derivado de los mismos seran conocidos para los expertos en la materia o pueden obtenerse usando metodos que son convencionales para los expertos en la materia. Por ejemplo, un ADN para su uso en la presente invencion se puede obtener por smtesis qmmica, usando reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o escision directa de un polinucleotido mas largo, tal como la secuencia codificante completa del antfgeno asociado a tumores o un fragmento de la misma.
Los acidos nucleicos que codifican antfgenos adecuados y peptidos o hebras de poliepftopo derivadas de los mismos pueden tener codones optimizados. La optimizacion de codones se ha descrito previamente en el documento WO 99/41397 y en el documento WO01/79518. Diferentes celulas difieren en su uso de codones particulares. Esta desviacion de codones corresponde a una desviacion en la abundancia relativa de ARNt particulares en el tipo celular. Alterando los codones en la secuencia de modo que esten adaptados para coincidir con la abundancia relativa de los ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresion proteica. De la misma manera, es posible disminuir la expresion eligiendo deliberadamente codones para los que los ARNt correspondientes se sabe que son infrecuentes en el tipo celular particular. Por tanto, hay un grado adicional de control traduccional disponible. Se conocen las tablas de uso de codones en la tecnica para muchas celulas de mairnfero, asf como para una diversidad de otros organismos.
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Variantes/fragmentos/homologos/derivados
La presente invencion abarca el uso de secuencias de nucleotidos y aminoacidos que codifican antigenos y variantes, homologos, derivados y fragmentos de los mismos.
El termino "variante" se usa para indicar un polipeptido o secuencia de nucleotidos de origen natural que difiere de una secuencia de tipo silvestre.
El termino "fragmento" indica que un polipeptido o secuencia de nucleotidos comprende una fraccion de una secuencia objeto. Preferiblemente, la secuencia comprende al menos un 50 %, mas preferiblemente al menos un 65 %, mas preferiblemente al menos un 80 %, mas preferiblemente al menos un 90 %, mucho mas preferiblemente al menos un 90 % de la secuencia objeto. Si el fragmento es un fragmento de un aminoacido entonces preferiblemente los fragmentos son de 6-12 aminoacidos de longitud. Mas preferiblemente, los fragmentos son de 8, 9 o 10 aminoacidos de longitud.
El termino "homologo" significa una entidad que tiene una cierta homologfa con las secuencias de aminoacidos objeto y las secuencias de nucleotidos objeto. En esta ocasion, el termino "homologfa" puede equipararse a "identidad".
En el presente contexto, se acepta que una secuencia homologa incluye una secuencia de aminoacidos, que puede ser al menos un 75, 85 o 90 % identica, preferiblemente al menos un 95 o un 98 % identica a la secuencia objeto. Tfpicamente, los homologos comprenderan la misma actividad que la secuencia de aminoacidos objeto. Aunque la homologfa tambien puede considerarse en terminos de similitud (es decir, restos de aminoacido que tienen propiedades/funciones qrnmicas similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.
En el presente contexto, se acepta que una secuencia homologa incluye una secuencia de nucleotidos, que puede ser al menos un 75, 85 o 90 % identica, preferiblemente al menos un 95 o un 98 % identica a la secuencia objeto. Tfpicamente, los homologos comprenderan la misma actividad que la secuencia objeto. Aunque la homologfa tambien puede considerarse en terminos de similitud (es decir, restos de aminoacido que tienen propiedades/funciones qrnmicas similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.
Los metodos para determinar la identidad de secuencia son conocidos para los expertos en la materia.
Un homologo adecuado de 5T4 se describe en el documento GB 0615655.8.
Vacuna/composicion farmaceutica
La presente invencion usa una vacuna/composicion farmaceutica que comprende un antfgeno, un epttopo peptfdico derivado de un antfgeno asociado a tumores, una hebra de poliepttopo, una secuencia de acido nucleico, un sistema de vector y/o una celula como se describe anteriormente para su uso en combinacion con un agente o agentes quimioterapeuticos.
Para administrar el antfgeno o derivados como se describe anteriormente, la vacuna puede prepararse como un inyectable, como solucion lfquida o suspension, tambien puede prepararse una forma solida adecuada para su disolucion o suspension en, lfquido antes de su inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse o la protema puede encapsularse en liposomas. Los ingredientes inmunogenicos activos a menudo se mezclan con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos.
Ademas, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y/o adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficaces incluyen, aunque sin limitacion: hidroxido de aluminio, N- acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, mencionada como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, mencionada como MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extrafdos de bacterias, monofosforil lfpido A, dimicolato de trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsion de escualeno al 2 %/Tween 80.
Los ejemplos adicionales de adyuvantes y otros agentes incluyen hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio y potasio (alumbre), sulfato de berilio, sflice, caolm, carbono, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, muramil dipeptido, endotoxina bacteriana, lfpido X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis, polirribonucleotidos, alginato sodico, lanolina, lisolecitina, vitamina A, saponina, liposomas, levamisol, DEAE-dextrano, copolfmeros bloqueados u otros adyuvantes sinteticos. Dichos adyuvantes
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estan disponibles en el merado en diversas fuentes, por ejemplo, Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) o adyuvante incomplete o adyuvante complete de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Tfpicamente, se usan adyuvantes tales como Amphigen (aceite en agua), Alhydrogel (hidroxido de aluminio) o una mezcla de Amphigen y Alhydrogel. Solamente el hidroxido de aluminio esta aprobado para uso en seres humanos.
La proporcion de inmunogeno y adyuvante puede variarse sobre un amplio intervalo siempre que ambos esten presentes en cantidades eficaces. Por ejemplo, el hidroxido de aluminio puede estar presente en una cantidad de aproximadamente un 0,5 % de la mezcla de vacuna (base de A^Oa). Convenientemente, las vacunas se formulan para que contengan una concentracion final de inmunogeno en el intervalo de 0,2 a 200 pg/ml, preferiblemente de 5 a 50 pg/ml, muchos mas preferiblemente de 15 pg/ml.
Despues de la formulacion, la vacuna puede incorporarse en un recipiente esteril que despues se precinta y almacena a baja temperatura, por ejemplo, 4 °C o puede secarse por congelacion. La liofilizacion permite el almacenamiento a largo plazo en una forma estabilizada.
La vacuna puede administrarse de una manera conveniente tal como por via oral, intravenosa (cuando es soluble en agua), intramuscular, subcutanea, intranasal, intradermica o por supositorio o por implante (por ejemplo, usando moleculas de liberacion lenta).
Las vacunas se administran convencionalmente por via parenteral, por inyeccion, por ejemplo, de forma subcutanea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administracion incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehteulos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de un 0,5 % a un 10 %, preferiblemente de un 1 % a un 2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen de un 10 % a un 95 % de ingrediente activo, preferiblemente de un 25 % a un 70 %. Cuando la composicion de vacuna se liofiliza, el material liofilizado puede reconstituirse antes de su administracion, por ejemplo, como una suspension. La reconstitucion se logra preferiblemente en tampon.
Las capsulas, comprimidos y pfldoras para administracion oral a un paciente pueden proporcionarse con un recubrimiento enterico que comprende, por ejemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa o hidroxipropilmetilcelulosa.
Los peptidos y polipeptidos pueden formularse en la vacuna como formas neutras o salinas. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acidos (formadas con los grupos amino libres del peptido) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acido clorhfdrico o fosforico, o acidos organicos tales como acido acetico, oxalico, tartarico o maleico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden obtenerse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxido de sodio, potasio, amonio, calcio o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina y procama.
Los peptidos 5T4 pueden administrase con moleculas coestimuladoras tales como las implicadas en la interaccion entre los pares de receptor-ligando expresados sobre la superficie de las celulas presentadoras de antfgeno y las celulas T. Dichas moleculas coestimuladoras pueden administrarse por administracion de la molecula proteica o del acido nucleico correspondiente que codifica la molecula proteica. Las moleculas coestimuladoras adecuadas incluyen CD40, B7-1, B7-2, CD54, miembros de la familia IcAm (por ejemplo, ICAM-1, -2, o -3), CD58, ligandos de SLAM, polipeptidos que se unen al antfgeno estable al calor, polipeptidos que se unen a miembros de la familia del receptor de TNF (por ejemplo, 4-1BBL, TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3, OX40L, TRAF-5, CD70) y CD154. Los peptidos tambien pueden administrarse en combinacion con quimioquinas o citoquinas estimuladoras incluyendo, por ejemplo, IL2, IL3, IL4, SCF, IL6, IL7, IL12, IL15, IL16, IL18, G-CSF, GM-CSF, IL1-alfa, IL11, MIP-11, LIF, ligando de c-kit, trombopoyetina y ligando de flt3, TNF-a e interferones tales como IFNa o IFNy. Las quimioquinas tambien pueden usarse en combinacion con el antfgeno o los peptidos, tales como CCL3 o cCL5 o pueden fusionarse con los peptidos de la invencion (por ejemplo, CXCL10 y CCL7). Cuando el antfgeno o los peptidos se administran administrando un acido nucleico que codifica el peptido, la molecula coestimuladora tambien puede administrarse administrando el acido nucleico correspondiente que codifica la molecula coestimuladora.
Por ejemplo, el tratamiento con anti-CTLA-4, anti-CD25, anti-CD4, la protema de fusion IL13Ra2-Fc, y combinaciones de las mismas (tal como anti-CTLA-4 y anti-CD25) han demostrado regular positivamente las respuestas inmunitarias antitumorales y senan adecuados para usarse en combinacion con los peptidos de la presente invencion. El inhibidor de celulas T reguladoras (Treg) Ontak (conjugado de IL2 y toxina difterica DAB389IL2) tambien ha demostrado potenciar la capacidad antitumoral mediada por vacuna, por tanto, los inhibidores de Treg tambien son adecuados para su uso con las vacunas de la presente invencion.
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Reg^menes heterologos de vacunacion
Los regfmenes de administracion de vacunas/composiciones farmaceuticas de acuerdo con la presente invencion pueden determinarse por ensayo de eficacia convencional. Son especialmente preferidos, sin embargo, los regfmenes que incluyen etapas de sensibilizacion y refuerzo sucesivas. Se observa que dichos regfmenes consiguen una ruptura de la tolerancia inmunitaria y la induccion de respuestas de celulas T (vease, Schneider et al., 1998 Nat Med 4:397-402), asf como la induccion de respuestas de celulas B y anticuerpos.
Los regfmenes de sensibilizacion-refuerzo pueden ser homologos (donde la misma composicion se administra en dosis posteriores) o heterologos (donde las composiciones de sensibilizacion y refuerzo son diferentes). Por ejemplo, la composicion de sensibilizacion puede ser un vector no vftico (tal como un plasmido) que codifica un antigeno asociado a tumores y la composicion de refuerzo puede ser un vector vmco (tal como un vector de virus de la viruela) que codifica un antfgeno asociado a tumores, donde cualquiera de los dos o ambos "antigenos asociados a tumores" son un epftopo o hebra de poliepftopo de la presente invencion.
Metodos profilacticos/terapeuticos
Se describe el uso de una combinacion de acuerdo con la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para su uso en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad.
Se describe un metodo para tratar y/o prevenir una enfermedad en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una combinacion de acuerdo con la presente invencion.
Como se usa en este documento, los terminos "tratamiento", "tratar" y "terapia" incluyen efectos curativos, efectos paliativos, efectos de alivio, prevencion de la progresion, efectos profilacticos y cualquier efecto que mejore la supervivencia de un paciente.
Cuando la vacuna es o comprende un epftopo peptfdico de clase I, la respuesta inmunitaria provocada puede implicar la activacion de linfocitos T citotoxicos espedficos de 5T4. Cuando la vacuna es o comprende un epftopo de clase II la respuesta inmunitaria provocada puede implicar la activacion de celulas Th1 y/o Th2.
De forma ventajosa, la respuesta es una respuesta inmunoterapeutica antitumoral que es eficaz para inhibir, detener o revertir el desarrollo de un tumor en un sujeto.
Agentes quimioterapeuticos
Los "agentes quimioterapeuticos" para su uso en la combinacion de la presente invencion son aquellos agentes que son agentes adecuados para terapias antineoplasicas o antitumorales.
Los agentes quimioterapeuticos adecuados incluyen compuestos convencionales usados en quimioterapia, agentes intercalantes y compuestos que contienen platino, por ejemplo. Los agente adecuados incluyen, aunque sin limitacion, acido retinoico todo-trans, actimida, azacitidina, azatioprina, bleomicina, carboplatino, capecitabina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, irinotecan, lenalidomida, leucovorina, mecloretamina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, revlimid, temozolomida, teniposido, tioguanina, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.
En una realizacion, un agente quimioterapeutico para su uso en la combinacion del presente agente puede ser, en sf mismo, una combinacion de diferentes agentes quimioterapeuticos. Las combinaciones adecuadas incluyen FOLFOX e IFL. FOLFOX es una combinacion que incluye 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, y oxaliplatino. El tratamiento IFL incluye irinotecan, 5-FU, y leucovorina.
En una realizacion, el agente quimioterapeutico es ciclofosfamida. En esta realizacion, la ciclofosfamida puede administrarse preferiblemente en una forma de baja dosis. Se ha observado que la ciclofosfamida de baja dosis potencia una respuesta antitumoral en un enfoque de inmunoterapia de transferencia celular adoptiva (vease, Dudley et al. J. Clin. Oncol. (2005) 23, 2346-2357).
En otra realizacion, la composicion puede comprender adicionalmente un inhibidor de quinasa, para un uso separado, simultaneo o combinado en el tratamiento de tumores. Los inhibidores de quinasa adecuados incluyen aquellos que han demostrado poseer actividad antitumoral, tal como gefitinib (Iressa) y erlotinib (Tarceva) y estos podnan usarse en combinacion con los peptidos. Los inhibidores de receptores tirosina quinasa, tales como malato de sunitinib y sorafenib que han demostrado ser eficaces en el tratamiento de carcinoma de celulas renales tambien son adecuados para usarse en la composicion.
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Otras terapias de combinacion
La invencion se refiere adicionalmente al uso de moleculas dirigidas a antfgeno tumoral, tales como anticuerpos anti- antigeno tumoral, por ejemplo, scFv anti-5T4. Las moleculas dirigidas a antigeno tumoral tambien incluyen receptores de celulas T (TCR), incluyendo los TCR sinteticos descritos en el documento WO 2004/033695 y el documento WO 99/60119. Estos anticuerpos pueden usarse para (i) abordar 5T4 natural o exogeno in situ y/o (ii) suministrar moleculas inmunopotenciadoras, tales como B7.1, a 5T4 natural o exogeno in situ (Carroll et al. (1998) J Natl Cancer Inst 90(24):1881-7). Esto potencia la inmunogenicidad de 5T4 en el sujeto.
La presente invencion tambien puede usarse con la transferencia adoptiva de linfocitos de infiltracion tumoral aislados de pacientes (Dudley et al. J. Clin. Oncol. (2005) 23:2346-2357).
Enfermedades
Las enfermedades que pueden tratarse y/o prevenirse de acuerdo con la invencion incluyen cualquiera de aquellas en que una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno puede contribuir a esa prevencion y/o tratamiento.
En particular, la enfermedad (que se puede prevenir/tratar usando una combinacion de acuerdo con la presente invencion) es un cancer. Mas particularmente, la enfermedad puede ser un carcinoma de, por ejemplo, mama, pulmon, estomago, pancreas, endometrio, cuello del utero, colorrectal, rinon o prostata, asf como melanoma.
Por ejemplo, el documento WO89/07947 describe un cribado inmunohistoqmmico de tejidos neoplasicos usando un anticuerpo monoclonal anti-5T4. Por tanto, como el antigeno asociado a tumores es 5T4, la enfermedad es un cancer que puede demostrar ser positivo a 5T4 por ensayo de diagnostico (tal como con un anticuerpo anti-5T4), por ejemplo: un carcinoma invasivo de la ampolla de Vater, mama, colon, endometrio, pancreas o estomago; un carcinoma escamoso de la vejiga, cuello del utero, pulmon o esofago; un adenoma tubulovelloso del colon; un tumor muleriano mixto maligno del endometrio; un carcinoma de celulas claras del rinon; un cancer pulmonar (no microdtico indiferenciado, carcinoma de gigantocitos, carcinoma broncoalveolar, leiomiosarcoma metastasico); un cancer de ovario (un tumor de Brenner, cistadenocarcinoma, teratoma solido); un cancer de testfculo (seminoma, teratoma qmstico maduro); un fibrosarcoma de tejido blando; un teratoma (tumores anaplasicos de celulas germinales) o un cancer trofoblastico (coriocarcinoma (por ejemplo, en el utero, el pulmon o el cerebro), tumor del sitio placentario, mola hidatiforme).
Dosificacion y administracion
Administracion y recuento de celulas Treg CD4+CD25+
Los antfgenos y vacunas de la presente invencion se administran a un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+. Preferiblemente, la cronologfa optima de vacunacion coincidina con el periodo en que el agente que reduce el recuento de celulas Treg CD4+CD25+, tal como un agente o agentes quimioterapeuticos u Ontak, ha causado una disminucion/reduccion maxima de la funcion de las Treg.
Determinacion del recuento de celulas Treg CD4+CD25+
El grado de reduccion puede determinarse por analisis de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) aisladas de la sangre del paciente recogida en periodos de 24 horas despues de una dosis de quimioterapia, hasta la siguiente dosis de quimioterapia o durante hasta 6 semanas despues de la ultima administracion de quimioterapia. Las celulas Treg son un subconjunto espedfico de celulas T CD4+ que expresa CD25 a niveles mayores que las celulas CD4 negativas; y, por tanto, los niveles de Treg se evaluan determinando el porcentaje de todas las celulas T CD4+ que son CD4+CD25+. Por lo tanto, los niveles de celulas T (Treg) CD4+CD25+hi. Por lo tanto, los niveles de celulas T (Treg) CD4+CD25+hi respecto a los niveles totales de celulas T CD4+ se determinaran antes y despues de la administracion del agente reductor de Treg.
En el caso de ciclofosfamida, la reduccion maxima de Treg CD4+CD25+ sucedfa cuatro dfas despues de la administracion de CY (Lutsiak et al. 2005 Blood 105:2862-2868).
Los niveles de otros tipos de celulas T reguladoras, tales como celulas TH3 que producen TNF-p, celulas Tr1 que producen IL10 y celulas T CD8+CD28-, pueden determinarse por secrecion de citoquinas, tincion de algunos marcadores de superficie celular y la capacidad de suprimir respuestas inmunitarias (Marshall et al., 2004. Blood. 103:1755-1762; Wei et al., 2005. Cancer Res 65: 5020-6; Leong et al., 2006 Immunol. Lett. 15:229-236; para revisiones, vease Levings y Roncarlo, 2005. CTMI 292:303-326; Huehn, Siegmund y Hamann, 2005. CITR 293:89114; Faria y Weiner, 2005 Immunol. Rev. 206:232-259; Weiner, 2001 Immunol. Rev. 182:207-214; Weiner et al., 2001. Microbes infect. 3:947-954; Roncarlo et al., 2001 Immunol. Rev. 182:68-79).
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Ciclos de quimioterapia
Es evidente para los expertos en la materia que las composiciones y usos de la presente invencion pueden adaptarse para los agentes quimioterapeuticos espedficos y antigenos usados en la invencion sin experimentacion excesiva. En particular, un agente o agentes quimioterapeuticos usados en la presente invencion podnan requerir una administracion y pauta de dosificacion espedficas. Estas pautas de administracion y dosificacion podnan variar para un diferente agente quimioterapeutico. En lmeas generales, un agente o agentes quimioterapeuticos podnan administrate a cortos intervalos frecuentes (por ejemplo, cada 1 o 2 horas) seguidos por periodos mas largos sin administracion (por ejemplo, intervalos de 2 semanas). Esta sucesion de administracion y ausencia de administracion constituye un ciclo de quimioterapia. Un tratamiento de quimioterapia podna consistir en varios ciclos dependiendo del agente usado. El periodo entre ciclos de quimioterapia constituye el periodo de reposo. Un periodo de reposo vana entre diferentes agentes quimioterapeuticos y tratamientos. Se dan ejemplos de dichos agentes quimioterapeuticos y los periodos de reposo recomendados en la siguiente tabla.
Clase de farmaco
Farmaco Dosificacion y via habitual
Farmacos alquilantes
Mecloretamina (mostaza de nitrogeno) Clorambucilo (Leukeran) Ciclofosfamida (Cytokxan) Melfalan (Alkeran) Ifosfamida (ifex) 6 mg / m2 IV 4 -10 mb / dfa po 600 mg / m2 /IV 50 - 200 mg / m2 po 1 mg / kg po q 4 sem 2-4 g / m2 / dfa IV X 3-5 dfas q 3-4 sem
Antimetabolitos Antagonista de folato
Metotrexato 2,5 - 5,0 mg / dfa po 25 -50 mg / 1 dosis / sem po 100 - 10,000 mg / m2 IV (con rescate)
Antagonista de purina Antagonista de pirimidina
6-Mercaptopurina 5-Fluorouracilo Citarabina Gemcitabina (Gemzar) 100 mg / m2/ dfa po 300 - 1000 / m2 IV o infusion continua 100 mg / m2 IV infusion continua 1200 g / m2 / sem IV
Veneno del huso (de plantas) Vincas
Vinblastina (Velban) Vincristina (Oncovin) Vinorelbina (Navelbine) Paclitaxel (Taxol) Docetaxel (Taxotere) 0,1 - 0,2 mg / kg IV q 7 -10 dias 1,4 mg / m2 / sem IV 20 mg / m2 / sem IV 135 mg - 200 g / ml IV q 3 sem 100 g / m2 IV q 3 sem
Podofilotoxinas
Etoposido (VePesid) 100 mg / m2 / dfa IV durante 3 - 5 dfas 100 mg / dfa po
Irinotecan (Camptosar) Topotecan (Hycamtin) durante 14 dfas / mo 100 - 125 g / m2 IV sem IV 1,5 g / m2 IV al dfa x 5 dfas q 3 - 4 sem
Antibioticos
Doxorrubicina (Adriamicina) Bleomicina (Blenoxane) Mitomicina 40 - 75 mg / m2 rapidamente IV o 30 mg / m / dfa durante 3 dfas por IV continua 6 -15 U / m2 sc o IV habitualmente 10 a 12 mg / m2, lentamente IV
Nitrosoureas
Carmustina (BiCNU) Lomustina (CeeNU) 150 - 200 mg / m2 IV q 6 sem 100 - 130 mg / m2 po q 6 sem
lones organicos
Cisplatino (Platinol) Carboplatino (Paraplatino) 60 - 100 mg / m2 IV o 20 mg / m2 IV al dfa x 5 dfas 300 g / m2 o area diana bajo la curva de 5 - 6 IV q 3 sem
Se entiende que un tratamiento, que consiste en varios ciclos y periodos de reposo definidos podna variar tambien entre diferentes pacientes. Ademas, dicho tratamiento podna variar para diferentes combinaciones y mezclas de agente quimioterapeutico. Un experto en la materia seleccionara la cantidad adecuada de ciclos y periodos de reposo para cada paciente y agente quimioterapeutico o combinacion de agente quimioterapeutico.
Los regfmenes de administracion de antfgeno y agente o agentes quimioterapeuticos de acuerdo con la presente invencion se adaptan al agente espedfico y combinaciones de agentes usadas. Se entiende que un tratamiento completo que emplea las composiciones y usos de la presente invencion podna abarcar varios ciclos de quimioterapia diferentes. Se entiende adicionalmente que los patrones de tratamiento podnan repetirse cualquier cantidad de veces segun lo necesario. En particular, las composiciones y usos de la presente invencion cubren la administracion de vacunas antes y/o durante y/o despues de la administracion de un agente quimioterapeutico, un ciclo quimioterapeutico o un tratamiento quimioterapeutico completo de varios ciclos de acuerdo con la combinacion de agente quimioterapeutico/vacuna elegida. Se entiende adicionalmente que las composiciones y usos de acuerdo con la presente invencion se usan dentro de un regimen de tratamiento que incluye tambien otros tratamientos tales como cirugfa y/o radioterapia.
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Preferiblemente, el antigeno se administrana durante periodos de reposo dentro o despues de los ciclos de quimioterapia. La cronologfa podna optimizarse midiendo la reduccion de los niveles de Treg o la funcion de Treg durante cada tratamiento quimioterapeutico.
Dosificacion
Un experto en la materia puede determinar facilmente una dosis apropiada de una de las presentes composiciones a administrar a un sujeto sin experimentacion excesiva. Tfpicamente, un medico determinara la dosificacion real que debera ser la mas adecuada para un paciente individual y dependera de una diversidad de factores incluyendo la actividad del compuesto espedfico empleado, la estabilidad metabolica y duracion de la accion de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general, genero, dieta, modo y tiempo de administracion, tasa de excrecion, combinacion de farmacos, la gravedad de la afeccion particular y la terapia en curso individual. Las dosificaciones descritas en este documento son ejemplares del caso promedio. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se justifican intervalos de dosificacion superiores o inferiores, y estan dentro del alcance de esta invencion.
Por ejemplo, se establecen dosis adecuadas para la administracion de los regfmenes terapeuticos FOLFOX e IFL en la seccion de ejemplos en este documento. Ademas, los regfmenes adecuados para la administracion de estos regfmenes en combinacion con la administracion de un antfgeno tumoral se exponen en ese documento.
La invencion se describe adicionalmente, con fines ilustrativos solamente, en los siguientes ejemplos en que se hace referencia a las siguientes figuras.
La figura 1 muestra un diagrama del regimen de vacunacion y control descrito en la seccion de ejemplos.
Figura 2: TV2-FOLFOX: Dimensiones del tumor en todo el curso temporal del ensayo clmico. La figura ilustra la suma de las lesiones tumorales diana para pacientes evaluables en tres puntos temporales de exploracion TC (antes de vacunacion con TroVax (seleccion) y en las semanas 14 y X+8).
Figura 3: TV2-IFL: Dimensiones del tumor en todo el curso temporal del ensayo clmico. La figura ilustra la suma de las lesiones tumorales diana en tres puntos temporales: antes de la vacunacion con TroVax (seleccion) y en las semanas X y X+14.
La figura 4a muestra las respuestas de 5T4 en TV2-IFL, la fig. 4b muestra las respuestas 5T4 en TV2-FOLFOX, la fig. 4c muestra las respuestas MVA en TV2-IFL, la fig. 4d muestra las respuestas MVA en TV2-FOLFOX, la fig. 4e muestra las respuestas TT en TV2-IFL y la fig. 4f muestra las respuestas tT en TV2-FOLFOX.
Figura 5: Porcentajes de Treg CD4+CD25+ (cuadrante a mano derecha) para el paciente TV2-016 en diversos puntos temporales durante el ensayo TV2. Los resultados se muestran como el porcentaje de celulas T CD4+.
Figura 6: Confirmacion del fenotipo Treg CD4+CD25+ por tincion para la expresion intracelular de FoxP3. Se sincronizaron las celulas T CD4+ (A) y se averiguo su expresion de CD25 (B). Se seleccionaros las que expresan CD25+hi estableciendo un cuadrante estricto (B; cuadrante derecho superior). Las celulas en este cuadrante a mano derecha se sincronizaron y eran las que mas expresaban FoxP3 (C; cuadrante a mano derecha superior).
Figura 7. El porcentaje medio de Treg CD4+CD25+ dentro de la poblacion de celulas T CD4+ para pacientes de TV2- IFK (negro n=7) y de FOLFOX (gris n=6).
Ejemplos
Sumario
Estos ejemplos resumen la cinetica de las respuestas inmunitarias detectadas en ensayos tanto TV2 IFL como FOLFOX e investigan las relaciones entre las respuestas clmicas e inmunologicas.
Respuestas inmunitarias, y cinetica
Todos los pacientes evaluables en los ensayos clmicos tanto TV2 IFL (n=12) como FOLFOX (n=11) generaron respuestas inmunitarias celulares espedficas de 5T4 y/o humorales como se detalla a continuacion:
Ensayo (n.° de pacientes evaluables)
N.° de pacientes que muestras respuestas inmunitarias espedficas de 5T4
ELISA
Proliferacion ELISPOT Cualquier ensayo
IFL (n = 12)
10 (83 %) 10 (83 %) 11 (92 %) 12 (100 %)
FOLFOX (n = 11)
10 (91 %) 10 (91 %) 10 (91 %) 11 (100 %)
• En ambos ensayos, los tttulos medios de anticuerpo aumentaron despues de cada una de las 6 vacunaciones (en comparacion con el punto temporal de muestreo previo).
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• En el ensayo FOLFOX, los tftulos medios de anticuerpo durante quimioterapia (semanas 4-19) fueron comparables con los posteriores a quimioterapia (semanas X+2 - X+10). Sin embargo, en el ensayo IFL, los tftulos medios de anticuerpo durante quimioterapia fueron significativamente inferiores que los posteriores a quimioterapia, lo que sugiere que el regimen de quimioterapia IFL puede afectar a las respuestas de anticuerpo.
• En ambos ensayos, el mayor tftulo medio de anticuerpo se produjo en la semana X+8, es decir, despues de la 6.a inmunizacion.
• Las respuestas medias proliferativas de 5T4 mostraron poco o ningun aumento despues de cualquiera de las 6 vacunaciones, aunque los pacientes individuales mostraron aumentos.
• En ambos ensayos, las repuestas proliferativas fueron mayores despues de completarse la quimioterapia en comparacion con durante la quimioterapia.
• En ambos ensayos, las respuestas proliferativas espedficas de 5T4 mostraron un aumento significativo entre las semanas 19 y X+2; este no fue el caso para las respuestas MVA o TT, lo que sugiere que ambos regfmenes de quimioterapia afectan a la deteccion de las respuestas proliferativas contra un autoantigeno, pero no contra antigenos foraneos ex vivo.
• En general, los pacientes incluidos en los ensayos TV2 generaron respuestas inmunitarias celulares espedficas de 5T4 y humorales de mayor magnitud y longevidad que las observadas en un ensayo previo (TV1) en que los pacientes reclutados en un ensayo de monoterapia con TroVax® se habfan tratado previamente con quimioterapia en algun momento antes de que se administrara TroVax.
Respuestas ctfnicas
Se investigaron las posibles tendencias relacionadas con las respuestas inmunitarias espedficas de 5T4 con la respuesta clrnica clasificando la magnitud de la respuesta inmunitaria de cada paciente junto con su respuesta tumoral presentada.
• TV2-FOLFOX: Los datos presentados indican que los altos tftulos de anticuerpos espedficos de 5T4 y las respuestas ELISPOT (pero no proliferativas) estan asociadas mas frecuentemente con respuestas completas y parciales que con enfermedad estable o progresiva.
Esta observacion es constante cuando las respuestas se analizan sobre el curso temporal de control completo, durante y despues de la quimioterapia. Si se integran los datos tanto de ELISA como de ELISPOT y la magnitud de las respuestas combinadas se tabulan junto con las respuestas clrnicas, los valores mayores se agrupan mas frecuentemente con respuestas tumorales positivas (CR + PR). Los pacientes clasificados como SD o PD a 14 sem o X+8 sem tienen los valores combinados mas bajos. La combinacion de los datos de ELISA y ELISPOT, producen tendencias mas fuertes que cada ensayo analizado individualmente.
• TV2-IFL: Se produdan fuertes respuestas inmunitarias en el ensayo IFL principalmente despues de completarse la quimioterapia. Se evaluara el beneficio clrnico controlando la supervivencia y haciendo comparaciones entre las respuestas inmunologicas y se investigara la supervivencia global una vez los datos esten disponibles.
Analisis de datos: Analisis de cinetica de respuesta inmunitaria
a. En cada ensayo, se han analizado solamente los datos de pacientes evaluables (segun protocolo).
b. Todos los datos se presentan de una manera similar. Se tabulan las respuestas espedficas de antfgeno para cada paciente evaluable en cada punto temporal analizado. Ademas, las respuestas inmunitarias medias espedficas de antfgeno se tabulan sobre una base de poblacion para cada ensayo en:
1. Cada punto temporal
2. Antes de la vacunacion (semanas -2 y 0)
3. Durante la quimioterapia (semanas 4-19)
4. Despues de quimioterapia (semanas X+2 a X+14 (IFL) o X+10 (FOLFOX))
Debe indicarse que se produjeron 2 inyecciones de TroVax durante la quimioterapia y 2 despues de completarse la quimioterapia. Ademas, el periodo de tiempo de 15 semanas durante la quimioterapia incluye 6 puntos temporales de recogida de muestras de sangre. Despues de completarse la quimioterapia, los pacientes IFL se controlaron durante 14 semanas que tambien incluye 6 puntos temporales de muestreo. Los pacientes FOLFOX se controlan durante 10 semanas despues de completarse la quimioterapia y esto comprende 5 puntos temporales de muestreo.
c. Se tabula el aumento factorial en la respuesta inmunitaria despues de cada vacunacion. Ademas, tambien se indica el aumento factorial entre las semanas 19 y X+2 (es decir, el final de la quimioterapia y despues de completarse la quimioterapia).
Analisis de datos: Analisis de correlaciones entre la respuesta inmunitaria y la respuesta tumoral
Se han determinado las respuestas inmunitarias medias espedficas de 5T4 para todos los pacientes evaluables para cada uno de los 3 ensayos centrales de inmunocontrol (ELISA, proliferacion y ELISPOT). Las respuestas se
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han clasificado en orden ascendente y se han comparado frente a las respuestas tumorales respectivas (algunas exploraciones TC son excepcionales). Las respuestas inmunitarias medias espedficas de 5T4 se determinaron durante 3 periodos de tiempo: (i) sobre todos los puntos temporales despues de TroVax, es decir, desde la semana 2 hasta la semana X+10 para pacientes FOLFOX y desde la semana 2 hasta X+14 para paciente IFL, (ii) sobre todos los puntos temporales despues de TroVax que se producen durante el periodo de quimioterapia (semanas 419) y (iii) sobre todos los puntos temporales despues de TroVax que se producen despues de completarse la quimioterapia (semanas X+2 a X+10 para FOLFOX o X+14 para IFL).
Ademas, se integraron las respuestas de ELISPOT espedfica de 5T4, de proliferacion y de anticuerpos y se compararon frente a las respuestas clmicas presentadas.
Para conseguir esto, cada paciente evaluable simplemente se valoro respecto a la magnitud de la mayor respuesta inmunitaria detectada. Por ejemplo, al paciente con el mayor tftulo medio de anticuerpo contra 5T4 en todo el periodo de control seleccionado (es decir, todos los puntos temporales despues de TroVax, durante la quimioterapia, despues de la quimioterapia) se le dio un valor del 100 %, todos los demas pacientes se valoraron con un porcentaje de la mayor respuesta. Para integrar los ensayos, simplemente se sumaros los valores por ensayo para cada paciente. Dicho analisis no tiene en consideracion la magnitud de las respuestas inmunitarias de los pacientes, sino que da un "peso" igual a todos los ensayos.
Metodos y protocolos
TroVax + FOLFOX
Se realizo un ensayo clmico en fase II para un estudio abierto de TroVax proporcionado junto con 5- fluorouracilo/leucovorina/oxaliplatino (FOLFOX) para determinar la seguridad y la inmunogenicidad antes, durante y despues de la quimioterapia.
a) Diseno del estudio
Esta es una administracion al descubierto de hasta seis inyecciones de TroVax junto con una pauta convencional de 5-FU/oxaliplatino/leucovorina en pacientes con cancer colorrectal avanzado. Se incluyo un total de 15 pacientes para obtener 10 pacientes evaluables. El regimen de dosificacion es dos inyecciones, proporcionadas antes de la quimioterapia, dos durante la quimioterapia (asumiendo que dure hasta 6 meses) y dos inyecciones despues de que la quimioterapia hubiera terminado. Los pacientes podfan estar en el estudio durante un maximo de 40 semanas para evaluar la tolerabilidad del regimen de tratamiento, la induccion de la inmunidad humoral y celular contra el antfgeno de superficie celular 5T4 y la respuesta inmunitaria contra el vector.
b) Tratamiento TroVax
Los pacientes se inmunizan con una unica inyeccion intramuscular de TroVax 10x en la semanas 0, 2, 11, 17 y 2 y 6 semanas despues de la ultima dosis de quimioterapia.
Oxaliplatino/5-FU/leucovorina
Los pacientes comienzan la quimioterapia en la semana 4. La quimioterapia se proporciona a intervalos de 2 semanas durante 12 semanas (6 ciclos, semanas 4, 6, 8, 10, 12, 14). Se hace una evaluacion de la respuesta en la semana despues de completarse el ciclo 6 (semana 14; exploracion TC/RM). Se administran ciclos adicionales de quimioterapia (hasta un maximo de 6 ciclos, semanas 16, 18, 20, 22, 24, 26) si se considera de interes para el paciente por el investigador.
c) Tratamientos simultaneos
La quimioterapia con 5-FU/leucovorina se proporciona por el regimen de Gramont modificado (MdG) junto con oxaliplatino (OxMdG).
El regimen convencional dado en el Leeds Teaching Hospitals NHS Trust es el siguiente:
1. Infusion de dos horas de leucovorina de 175 mg (o 350 mg de acido folmico racemico) en 250 ml de dextrosa al 5 %.
2. Infusion de dos horas de oxaliplatino a 85 mg/m2 en 250 ml de dextrosa al 5 %.
3. Inyeccion en embolada de 5 minutos de 5-fluorouracilo a 400 mg/m2.
4. Infusion de 46 horas de 5-fluorouracilo a 2400 mg/m2 proporcionada a traves de una bomba Baxter LV5.
Se proporcionan antimimeticos, incluyendo antagonistas intravenosos de 5HT-3 y dexametasona, antes de cada ciclo de quimioterapia. Se proporciona a los pacientes terapia antiemetica oral, que consiste en un curso de 3 dfas
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de dosis en reduccion de dexametasona y domperidona, segun lo necesario. Toda la terapia antiemetica necesaria se registra en el CRF.
TroVax + IFL
a) Plan de tratamiento y metodos
A los pacientes que cumplen los criterios de entrada se les invita a entrar en el estudio. Despues de dar un consentimiento completamente informado, a los pacientes se les somete a un examen ffsico para documentar la salud general para continuar con el ensayo. Si es posible, se obtiene tejido para la determinacion del estado de 5T4. En ese momento, se documentan las metastasis y/o las recidivas locales usando exploraciones TC relevantes y se comprueba el nivel del antfgeno superficial CEA (5 ml) en la sangre. Se extrae sangre para examen hematologico y bioqmmica clmica (10 ml), exploracion de hormonas de la pituitaria (ACTH, TSH, LH, FSH; 10 ml), ensayo de autoanticuerpos (10 ml) e inmunologico (anticuerpos contra 5T4 y vector, respuestas celulares contra 5T4 y otros antigenos; 100 ml). Esta exploracion no debe producirse mas de dos semanas antes de que comience la pauta de inmunizacion.
En la semana 0 y la semana 2, los pacientes se inmunizan con una unica inyeccion intramuscular de TroVax. Antes de ambas inyecciones, se extrae de nuevo sangre para la medicion de CEA y el ensayo inmunologico (100 ml).
Los pacientes comienzan la quimioterapia en la semana 4. La quimioterapia continua a intervalos de dos semanas durante hasta 12 meses si los pacientes responden, aunque seis meses es la duracion comun del tratamiento. Se obtiene sangre antes de la dosis de quimioterapia en las semanas 4 y 6 para el ensayo de CEA e inmunologico (100 ml). Se obtiene sangre para el analisis hematologico (5 ml) antes de cada dosis de quimioterapia.
Se proporcionan inyecciones adicionales de TroVax en las semanas 11 y 17 (es decir, en el intervalo entre las dosis de quimioterapia). Se extrae sangre para el ensayo de CEA e inmunologico (100 ml) antes de cada una de estas inyecciones y dos semanas despues (semanas 13 y 19).
La quimioterapia entonces continua durante tanto tiempo como el medico del paciente decida que es apropiado. Al final de la quimioterapia, se obtiene una exploracion TC que vuelve a estadificar la enfermedad. Dos semanas despues de que finalice la quimioterapia (semanas X+2), se proporciona de nuevo TroVax por una unica inyeccion intramuscular. Antes de la inyeccion y 2 semanas despues de la misma (semanas X+4), se obtiene sangre para el ensayo de CEA e inmunologico (100 ml). Se proporciona una inyeccion final cuatro semanas despues de la inyeccion previa (semanas X+6). Antes de esta inyeccion y dos (semanas X+8) y cuatro semanas (semanas X+10) despues de la misma, se obtiene sangre para el ensayo de CEA e inmunologico (100 ml). Se realiza una visita de seguimiento final cuatro semanas despues (semanas X+14).
b) Tratamientos simultaneos
Regimen de Gramont: Los pacientes reciben leucovorina (200 mg/m2Ma) como una infusion intravenosa de dos horas, seguida por 5-FU con un bolo intravenoso a 400 mg/m2/dfa y despues como una infusion continua de 22 horas a 600 mg/m2Ma, repetida en 2 dfas consecutivos. Se administra irinotecan (180 mg/m2; infusion intravenosa de 30 minutos) en el dfa 1, simultaneamente con la administracion de leucovorina. Este ciclo se repite cada 2 semanas.
De Gramont modificado: Los pacientes reciben leucovorina y 5-FU en bolo en el dfa 1, seguido por 5-FU en infusion durante 46 horas.
A los pacientes incluidos en este ensayo no se les puede proporcionar ningun otro tratamiento antineoplasico mientras dure el ensayo. Una necesidad de dicho tratamiento exige la eliminacion del paciente del ensayo.
Se prescriben medicaciones pretendidas para aliviar los smtomas a discrecion del investigador y se registran en el cuaderno de recogida de datos (CRF). Los pacientes tambien deben mantener un registro de cualquier medicina sin receta consumida y estas deben anotarse en el CRF.
Inmunocontrol
Los ensayos usados para emprender el inmunocontrol pueden dividirse en los que miden respuestas celulares o humorales y se enumeran a continuacion:
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Medicion de respuestas celulares
1. Ensayo de proliferacion
Este ensayo se realiza usando PBMC procesadas de sangre fresca y establecidas en el dfa de la toma de muestras de sangre.
El ensayo de proliferacion se basa en la capacidad de las celulas inmunitarias (principalmente celulas T CD4+) de responder a protemas espedficas. Una de las maneras en que una celula T respondera despues de la interaccion con su protema diana, es por rapida division celular. La respuesta a dichos estimulos puede medirse simplemente contando la cantidad de celulas presentes en un cultivo antes y despues de la adicion de un agente estimulante. Sin embargo, esto puede ser laborioso y diffcil ya que las celulas respondedoras pueden constituir solamente una pequena proporcion de la poblacion de celulas totales. En la practica, por lo tanto, cualquier division celular potenciada se mide por la incorporacion de 3H-timidina en ADN celular, un proceso que esta muy relacionado con cambios subyacentes en la cantidad de celulas. Las respuestas proliferativas inducidas por una protema de ensayo pueden compararse con las inducidas por el medio en solitario (sin control de estimulacion). Los datos se transforman para producir un mdice de estimulacion (S.I.) que se define como: "CPM medias de PBMC incubadas con antigeno de ensayo dividido por las CPM medias de PBMC incubadas con medio en solitario". Esta medida relativa de actividad celular se utiliza ampliamente para posibilitar las comparaciones entre muestras tomadas durante estudios longitudinales (por ejemplo, pacientes incluidos en ensayos clmicos) y para manipular las diferencias en la proliferacion de fondo con el medio en solitario.
La preparacion de plasma y PBMC a partir de sangre completa y la medicion de las respuestas proliferativas espedficas de antfgeno en muestras clmicas, fue de acuerdo con tecnicas convencionales usando un recolector de celulas y TopCount. Los metodos se describen, por ejemplo, en Braybrooke JP, Slade A, Deplanque G, et al.: Phase I study of MetXia-P450 gene therapy and oral cyclophosphamide for patients with advanced breast cancer or melanoma. Clin Cancer Res 11:1512-1520, 2005 y Harrop R, Ryan mG, Golding H, et al.: Monitoring of human immunological responses to vaccinia virus. Methods Mol Biol 269:243-266, 2004.
2. ELISPOT
El ensayo de inmunotransferencia ligado a enzimas (ELISPOT) se describio hace mas de 13 anos para la deteccion de celulas inmunitarias espedficas a nivel de celula individual. El ensayo ELISPOT se usa para una amplia gama de aplicaciones incluyendo el control de las respuestas celulares en pacientes con cancer que experimentan tratamiento inmunoterapeutico. El ensayo ELISPOT de IFNy muestra un alto nivel de sensibilidad que permite la deteccion de <10 celulas respondedoras por millon de PBMC. Con este ensayo es posible detectar celulas T de memoria que responden funcionalmente a un estfmulo antigenico a traves de la secrecion de la citoquina IFNy. Ademas, el ensayo ELISPOT de IFNy no requiere el uso de celulas frescas o sustancias radiactivas, haciendo que sea una tecnica mas simple y mas transferible que otros ensayos tales como el ensayo de liberacion de cromo que se ha usado tradicionalmente en ensayos de vacuna para medir las respuestas de celulas T.
Una ventaja importante del ELISPOT de IFNy es que es una medicion directa de una respuesta inmunitaria mediada por celulas TH1. Por tanto, es util para controlar la eficacia de una vacuna para inducir inmunidad mediada por celulas. Pueden ensayarse PBMC recien recogidas o congeladas para la evaluacion en el ELISPOT de IFNy. Esta es una ventaja distintiva en el analisis de muestras tomadas de pacientes en multiples puntos temporales durante todo el programa del ensayo clmico. El uso de PBMC congeladas posibilita formar lotes de las muestras y, por tanto, reduce la variabilidad global del ensayo. Ademas, la disponibilidad de muestras de ensayo congeladas significa que pueden repetirse los ensayos.
Las PBMC se siembran en placas en pocillos recubiertos y se incuban durante una noche a 37 °C, CO2 al 5 % con el antfgeno apropiado. Despues de aproximadamente 6 horas de cocultivo, las celulas de memoria espedficas para el antfgeno empiezan a secretar IFNy que se captura, a su vez, por el antfgeno unido a membrana. Por tanto, la union de IFNy sucede en el entorno inmediato que rodea la celula que secreta la citoquina. Despues de aproximadamente 20 horas, las celulas se retiran por lavado. Posteriormente, el ensayo utiliza dos anticuerpos espedficos de citoquina de alta afinidad dirigidos contra diferentes epftopos sobre la misma molecula de citoquina. Se generan manchas con una reaccion colorimetrica en que se escinde el sustrato soluble, dejando un precipitado insoluble en el sitio de la reaccion. La mancha resultante representa una huella de la celula productora de citoquina original. La cantidad de manchas es una medicion directa de la frecuencia de celulas T productoras de citoquina y la cantidad de manchas aumenta de forma proporcional con la potencia de la respuesta inmunitaria. Las celulas T CD8+, las celulas T CD4+ auxiliares y las celulas NK activadas secretan esta citoquina. La comparacion de la frecuencia de celulas T espedficas de antfgeno antes, durante y despues de un ciclo de inmunizacion debe reflejar la inmunogenicidad relativa de la vacuna que se esta evaluando.
La preparacion de plasma y PBMC a partir de sangre completa y la medicion de las respuestas inmunitarias celulares contra vectores en muestras de ensayo clmico se realizaron por ELISPOT usando un lector de placa ELISPOT automatizado siguiendo protocolos convencionales como se describe, por ejemplo, en Braybrooke JP,
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Slade A, Deplanque G, et al.: Phase I study of MetXia-P450 gene therapy and oral cyclophosphamide for patients with advanced breast cancer or melanoma. Clin Cancer Res 11:1512-1520, 2005. Harrop R, Ryan MG, Golding H, et al.: Monitoring of human immunological responses to vaccinia virus. Methods Mol Biol 269:243-266, 2004.
Medicion de repuestas humorales (ELISA)
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se basa en la capacidad de los anticuerpos de unirse a su protema diana de una manera altamente espedfica. El analisis de repuestas de anticuerpos espedficos de antigeno por ELISA es una tecnica ampliamente utilizada y bien establecida. El ensayo puede usarse para proporcionar una medida relativa de las concentraciones de anticuerpos espedficos de antigeno en suero (u otros fluidos). Una de las muchas aplicaciones de la tecnica es controlar los niveles de anticuerpos despues de una vacunacion para determinar si el tratamiento aumenta la concentracion del anticuerpo de interes.
Para medir la respuesta de anticuerpos espedficos de antigeno, la protema diana se une a la superficie de una placa ELISA de 96 pocillos. Despues de una etapa de bloqueo (para minimizar la union no espedfica de los anticuerpos directamente al plastico), se anade plasma a la placa y se incuba a temperatura ambiente. Cada pocillo entonces se lava para minimizar adicionalmente la union no espedfica de los anticuerpos. Se anade un anticuerpo secundario, espedfico para la especie del suero de ensayo (por ejemplo, antihumano), a cada pocillo. El anticuerpo secundario se conjuga a una enzima (por ejemplo, peroxidasa) que, tras la incubacion con un sustrato cromogenico (por ejemplo, OPD) cataliza su conversion en un producto soluble coloreado que puede cuantificarse usando un espectrofotometro. Generalmente, cuanto mayor sea el cambio de color mayor sera la concentracion del anticuerpo presente en el suero de ensayo.
La preparacion de plasma y PBMC a partir de sangre completa y la medicion de los titulos de anticuerpos espedficos de antigeno, se realizo por ELISA siguiendo tecnicas convencionales y usando un lector de placa Dynex MRX para ensayos inmunologicos junto con un lavador de placas Dynex de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se describen metodos adecuados, por ejemplo, en Braybrooke JP, Slade A, Deplanque G, et al.: Phase I study of MetXia-P450 gene therapy and oral cyclophosphamide for patients with advanced breast cancer or melanoma. Clin Cancer Res 11:1512-1520, 2005. Harrop R, Ryan mG, Golding H, et al.: Monitoring of human immunological responses to vaccinia virus. Methods Mol Biol 269:243-266, 2004.
Controles de ensayo
Para la medicion de las respuestas de anticuerpos por ELISA, se usa plasma humano combinado recuperado de 5 donantes sanos como control negativo. Como control positivo, se usa el plasma recuperado de pacientes incluidos en ensayos clmicos previos (paciente TV1-102 (10 sem) o paciente BC2-102 de ensayos clmicos TV1 o BC2 respectivamente). Se incluyen plasmas tanto de control negativo como de control positivo en todas las placas de ensayo y se aplican criterios de aceptacion "apto/no apto" a cada placa.
Criterios de aceptacion/metodos estadfsticos a usar.
Los criterios de aceptacion de ensayo y la manipulacion de datos son los siguientes. Una respuesta inmunitaria positiva debido a vacunacion se define por separado para cada ensayo como se detalla a continuacion:
ELISA
El tftulo de anticuerpos se define como la mayor dilucion de plasma en que la densidad optica media (D.O.) del plasma de ensayo es >2 veces la D.O. media del control negativo (suero humano normal; NHS) a la misma dilucion.
Se informara una respuesta de anticuerpos espedficos de 5T4 positiva inducida por vacunacion si:
a. El tftulo de anticuerpos en comparacion con NHS es >10 y
b. El tftulo de anticuerpos despues de la inyeccion es >2 veces el tftulo de anticuerpos determinado en ambos puntos temporales previos a la inyeccion.
Ensayo de proliferacion
Los resultados de los ensayos de proliferacion se presentaran como un mdice de estimulacion (S.I.) que se define como:
S.I. = Incorporacion de 3H-timidina por PBMC cultivadas con antigeno de ensayo Incorporacion de 3H-timidina por PBMC cultivadas con medio en solitario
Se informara una respuesta proliferativa 5T4 positiva inducida por vacunacion si:
a. El mdice de estimulacion (S.I.) para el antigeno 5T4 (protema o peptido) es >2 y
b. El C.V de replicas que contiene el antigeno 5T4 es <100 % y
5
10
15
20
25
30
35
40
c. El S.I. inducido por el antfgeno 5T4 despues de la inmunizacion es >2 veces mayor que el S.I. mayor inducido por el antigeno en cualquiera de los puntos temporales previos a la inyeccion.
ELISPOT
Se informara una respuesta ELISPOT de 5T4 positiva inducida por vacunacion si:
a. La media de unidades formadoras de manchas (SFU)/pocillo en respuesta a un antigeno 5T4 (protema o peptido) es >3 veces la media de SFU/pocillo en pocillos que contiene medio en solitario y
b. La media de SFU por pocillo en respuesta a un antigeno 5T4 es >10 y
c. La frecuencia de precursores espedficos de antfgeno 5T4 (cantidad de celulas espedficas de antigeno por 106 PBMC totales), despues de la inmunizacion es >2 veces la frecuencia de precursor en cualquiera de los puntos temporales previos a la inyeccion.
Resultados
1. TV2-FOLFOX
1.1 Ensayo clmico y datos de los pacientes
Se reclutaron diecisiete pacientes en el ensayo TV2-FOLFOX de los cuales 11 llegaron a ser evaluables para evaluacion de las repuestas inmunologicas (Tabla 1)
Tabla 1: Datos clmicos. Los 17 pacientes ITT (intencion de tratar) se incluyen en la tabla. Los pacientes evaluables (n=11) se indican por sombreado (datos de supervivencia actuales hasta la fecha). Clave: WD = Retirada del paciente, por lo tanto, sin resultado disponible; N/A = Medicion tomada pero no actualmente disponible.___________
ID de Paciente
Vivo/Muerto Respuesta tumoral Suma de lesiones diana Supervivencia (semanas desde la semana 0)
14 sem
X+8 sem Seleccion 14 sem X+8 sem
101
Vivo PR PR 26 Demasiado pequena 8 91
102
Muerto CR CR 51 0 0 58
103
Vivo PR PR 243 153 137 78
104
Vivo SD PD 50 44 20 70
105
Muerto PR SD 80 38 53
106
Vivo NE NE 69 NE NE 67
107
Vivo PR PD 25 16 63
108
Vivo CR CR 101 N/A 61
109
Muerto WD 0 WD WD WD 5
110
Vivo WD 0 WD WD WD 60
111
Muerto WD NE WD WD WD 9
112
Muerto NE NE ND 150 N/A 41
113
Vivo PD PD 86 42 54
114
Vivo r.r.CR?? 0 51 0 52
115
Muerto NE 0 122 N/A 37
116
Vivo PR 0 43 24 50
117
Vivo SD 0 154 135 50
La fig. 2 muestra TV2-FOLFOX: Dimensiones del tumor durante todo el curso de tiempo del ensayo clmico. La figura ilustra la suma de las lesiones tumorales diana para los pacientes evaluables en 3 puntos temporales de exploracion TC (antes de la vacunacion con TroVax (seleccion) y a las semanas 14 y X+8).
De los 11 pacientes evaluables, todos mostraron una reduccion en la carga tumoral en la semana 14. Las exploraciones TC estan solamente disponibles para 4 pacientes en la semana X+8, todos los cuales mostraron disminuciones adicionales en la carga tumoral en comparacion con la semana 14.
1.2 Respuestas inmunologicas
1.2.1 Respuestas de anticuerpos
Se ilustran en la tabla 2 los tttulos de anticuerpos espedficos de 5T4 para cada paciente evaluable a traves de todo el curso temporal de control.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 2: Respuestas de anticuerpos espedficos de 5T4. Los resultados se expresan como un tftulo de anticuerpos espedficos de 5T4 (la mayor dilucion de suero a la que una muestra de ensayo tiene una D.O. media (490 nm) >2 veces la de una muestra de control negativo (suero humano normal; NHS)) en cada punto temporal de muestreo. Los resultados tabulados en negrita que tienen >10 representan respuestas de anticuerpos positivas. Los tftulos medios se presentan para todos los pacientes en cada punto temporal y tambien en multiples puntos temporales previos a la vacunacion, durante la quimioterapia y despues de la quimioterapia. Ademas, el aumento factorial en el tftulo medio de anticuerpos en comparacion con el punto temporal previo se muestra despues de cada vacunacion.
Tabla 2
Paciente
Tftulo de anticuerpos espedficos de 5T4 en puntos temporales (semanas) posterior a la inmunizacion primaria
-2
0 2 4 6 11 13 17 19 X+2 X+4 X+6 X+8 X+10
101
<10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
102
<10 <10 10 1280 80 40 40 20 40 20 80 80 80 80
103
<10 <10 <10 80 20 <10 <10 <10 20 <10 20 20 320 320
104
<10 <10 <10 <10 <10 <10 10 <10 10 <10 <10 <10 40 20
105
<10 <10 <10 40 10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 160 80
107
<10 <10 <10 160 1280 160 160 80 320 <10 160 160 1280 160
108
<10 <10 <10 40 40 <10 1280 320 320 20 640 160 640 1280
113
<10 <10 <10 160 <10 <10 20 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
114
<10 <10 20 320 160 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 10
116
<10 <10 10 20 20 <10 10 <10 80 <10 80 40 80 40
117
<10 <10 <10 10 10 <10 10 <10 40 <10 20 <10 160 80
Tftulo medio
<10 <10 3,6 207 147,3 18,2 139,1 38,2 75,5 3,6 90,9 42 250,9 188,2
Factor t
52 7,7 2 0,05 23 3,7
Tftulo medio
<10 3,6 102,6 115,1
Sobre el curso completo de tiempo de inmunocontrol posterior a TroVax, el tftulo medio de anticuerpos espedficos de 5T4 fue 100. La mayona de los pacientes se seroconvirtieron en la semana 4 (es decir, despues de 2 vacunaciones con TroVax). Los tftulos medios de anticuerpos en el ensayo FOLFOX eran altos durante la quimioterapia (tftulo medio de 103), disminuyeron despues de completarse la quimioterapia (entre las semanas 19 y X+2) y aumentaron moderadamente despues de completarse la quimioterapia (tftulo medio de 115). Se observaron aumentos en el tftulo medio de anticuerpos despues de cada una de las 6 vacunaciones.
1.2.2 Respuestas proliferativas
Las tablas 3a-b detallan las respuestas proliferativas espedficas de antfgeno para cada paciente evaluable a traves de todo el curso temporal de control. Las respuestas a 5T4 (3a) y MVA (3b) se han analizado. 5T4 representa el antfgeno clave contra el que se espera inducir una potente y duradera repuesta inmunitaria. Como vector usado para suministrar 5T4, MVA representa un "control interno" muy util sobre el que pueden "comparar" las respuestas. Se espera que los pacientes generen fuertes respuestas inmunitarias contra mVa (un patogeno complejo y foraneo) y dichas respuestas pueden compararse, tanto en terminos de su magnitud como de cinetica, con las inducidas contra 5T4.
Tablas 3a-b: Resumen de las respuestas proliferativas de PBMC recuperadas de pacientes despues de reestimulacion in vitro con 5T4 (a) y MVA (b). Los resultados se expresan como un mdice de estimulacion (proliferacion inducida por medio en solitario por la proliferacion inducida por antfgeno de ensayo). Un mdice de estimulacion >2 (indicado por texto en negrita) se considera una respuesta positiva en ese punto temporal. Las respuestas proliferativas que son positivas (S.I. >2) y al menos 2 veces mayores que las respuestas previas a la inyeccion (semana -2 o 0) se indican en negrita.
Tabla 3a: TV2-FOLFOX: Respuestas proliferativas a 5T4
Paciente
Puntos temporales de muestreo (semanas)
-2
0 2 4 6 11 13 17 19 X+2 X+4 X+6 X+8 X+10
101
23,4 9,4 12 3,5 17 29,1 2 1,7 1,9 4,4 1,9 0,8 2,7 1,1
102
10,4 2,9 0,3 2,1 4,4 11 20,7 5,2 0,72 2,45 6,05 1,99 6,97 6,21
103
4,7 2,1 2,5 6,3 6,2 1,8 0,6 2,7 2,05 3,31 7,25 4,86 2,15 2,57
104
1,6 0,6 0,6 0,4 1 1,16 0,64 1,13 0,41 7,11 2,90 1,10 16,10 0,24
105
2,3 0,9 1,6 3,4 1,2 0,9 1,2 2,41 1,33 8,67 9,75 13,53 17,34 0,60
107
2,6 1 1,3 1,5 0,96 0,53 7,27 4,49 1,78 7,60 13,63 24,55 16,47 26,93
108
0,7 3,8 0,3 0,90 5,02 0,41 2,57 5,00 7,85 1,46 6,35 1,39 11,93 5,39
113
0,57 2,11 1,25 0,75 9,95 5,33 9,52 4,19 3,54 2,23 8,48 12,66 7,91 52,68
114
3,50 1,71 0,39 2,11 1,08 4,26 1,66 0,81 4,09 9,18 26,66 5,76 10,17 51,99
116
0,38 0,39 11,41 4,21 5,92 9,71 0,66 5,84 3,10 23,67 7,36 11,56 0,78 18,66
Paciente
Puntos temporales de muestreo (semanas)
-2
0 2 4 6 11 13 17 19 X+2 X+4 X+6 X+8 X+10
117
2,65 1,52 1,68 6,86 9,93 8,38 0,65 2,09 3,95 5,57 12,71 18,35 25,99 19,53
S.I. medio
4,8 2,4 3 2,9 5,7 6,6 4,3 3,2 2,8 6,9 9,4 8,8 10,8 16,9
Factor t
1,2 0,97 0,7 0,9 2,5 1,4 1,2
S.I. medio
3,6 4,3 10,5

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Uso de un antigeno asociado a tumores 5T4 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion del cancer, en el que dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o por separado, un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, en el que el antigeno asociado a tumores 5T4 se administra cuando el sujeto tiene un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
  2. 2. Uso de un agente o agentes quimioterapeuticos en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion del cancer, en el que dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o por separado, un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra a un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior que el recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
  3. 3. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra como parte de un vector vmco.
  4. 4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se proporciona por un vector vmco derivado del virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) que se ha modificado para que exprese el antfgeno asociado a tumores 5T4.
  5. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente o agentes quimioterapeuticos se seleccionan de irinotecan, fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino.
  6. 6. Antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer, en el que dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o por separado, un agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra cuando el sujeto tiene un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
  7. 7. El antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se presenta por un vector de expresion vmco.
  8. 8. El antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se proporciona por un vector vmco derivado del virus de vaccinia modificado de Ankara (MVA) que se ha modificado para que exprese el antfgeno asociado a tumores 5T4.
  9. 9. El antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el agente o agentes quimioterapeuticos se seleccionan de irinotecan, fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino.
  10. 10. Un agente o agentes quimioterapeuticos para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer, en el que dicho tratamiento o prevencion comprende administrar a un sujeto, de forma secuencial o por separado, el agente o agentes quimioterapeuticos y el antfgeno asociado a tumores 5T4, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra a un recuento reducido de celulas Treg CD4+CD25+ de al menos un 15 % inferior al recuento de Treg CD4+CD25+ determinado antes de administrar el agente quimioterapeutico.
  11. 11. El agente o agentes quimioterapeuticos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se administra como parte de un vector vmco.
  12. 12. El agente o agentes quimioterapeuticos para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se proporciona por un vector vmco derivado del virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) que se ha modificado para que exprese el antfgeno asociado a tumores 5T4.
  13. 13. El agente o agentes quimioterapeuticos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el agente o agentes quimioterapeuticos se seleccionan de irinotecan, fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino.
  14. 14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se suministra hasta 6 semanas despues de la administracion del agente o agentes quimioterapeuticos.
  15. 15. El antfgeno asociado a tumores 5T4 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el antfgeno asociado a tumores 5T4 se suministra hasta 6 semanas despues de la administracion del agente o agentes quimioterapeuticos.
  16. 16. El agente o agentes quimioterapeuticos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el antigeno asociado a tumores 5T4 se suministra hasta 6 semanas despues de la administracion del agente o agentes quimioterapeuticos.
    imagen1
    T
    0 2
    -2 0 2
    17
    X+2
    X+6
    Puntos tempo rales de vacunacion y toma de muestras (semanas)
    4 6 11 13 17 19 X
    4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
    i'i u; iii 4 ■
    X+2 X+4 X+6 X+8 X+10 X+14
    5 6 7 m:i 9 16 111 12
    l-.vJ ......i + . __j . Lu
    Ciclos de quimioterapia con IFL/FOLFOX
    Exploracion TC
    Exploracion TC
    If
    imagen2
    imagen3
    Exploracion TC
    (IFL)
    imagen4
    Exploracion TC
    Exploracion TC (IFL)
    imagen5
    imagen6
    Figura 1
    imagen7
    —♦—101
    -•—102
    ■ 103 —— 104
    Seleccion
    X semanas
    Punto temporal
    X+14 semanas
    Figura 2
    300
    -*-105
    103
    Seeccion
    14 semanas
    X+8 semanas
    Punto temporal
    Figura 3
    imagen8
    cn
    imagen9
    imagen10
    ^ 19 semanas ^
    1,06 •i’V
    l
    W’ - V" ' IS1 O'
    OpS fUH 33#
    imagen11
    SS^K W-
    oq'
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    imagen12
    imagen13
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