ES2771862T3 - Una vacuna de ADN que codifica telomerasa - Google Patents

Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) que carece de actividad catalítica de telomerasa y de una señal de localización nucleolar, en donde la proteína hTERT se fusiona en el extremo N con ubiquitina o calreticulina.

Description

d e s c r ip c ió n

Una vacuna de ADN que codifica telomerasa

La presente invención se refiere al campo de la vacunación antitumoral. La invención proporciona más concretamente una construcción de ácido nucleico que codifica una forma enzimática inactiva de la proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana.

Antecedentes de la invención:

La estimulación de las respuestas de células T específicas de tumores con inmunoterapia activa tiene varias ventajas teóricas sobre otras formas de tratamiento del cáncer. Para obtener beneficios clínicos, la inmunoterapia basada en células T debe estimular respuestas de células T reactivas a tumores CD8 y CD4 que reconocen antígenos específicos de tumor. En consecuencia, la atención creciente se ha centrado en identificar epítopos de MHC de clase I y II de antígenos asociados a tumores múltiples (TAA) (Cheever, et al, 2009). Sin embargo, la expresión heterogénea de la mayoría de los antígenos tumorales caracterizados entre los diferentes tipos de cáncer limita la amplia aplicabilidad de las vacunas contra el cáncer que se dirigen a tales antígenos. Durante los últimos años, la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) se ha convertido en el primer antígeno tumoral común bonafide y se investiga activamente como diana universal para la inmunoterapia del cáncer. La transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) es la subunidad catalítica de la enzima telomerasa que sintetiza el ADN telomérico en los extremos cromosómicos. hTERT se expresa en exceso en la mayoría de los tumores humanos (> 85%) y prácticamente en todos los tipos de cáncer. Además, la activación de la telomerasa se ha convertido en uno de los mecanismos de escape tumoral más importantes para sortear las vías de muerte celular dependientes de los telómeros. Está bien establecido que las estrategias terapéuticas dirigidas a antígenos que no participan en el crecimiento tumoral pueden dar como resultado la selección de mutantes tumorales con pérdida de antígeno que son clínicamente progresivos. Por lo tanto, la regulación por disminución o la pérdida de la actividad telomerasa afectarán severamente el potencial de crecimiento de las células tumorales. Además, la telomerasa es relativamente específica de las células cancerosas ya que las células normales del organismo expresan poca o ninguna telomerasa durante la mayor parte de su vida útil y generalmente tienen telómeros más largos que los de las células tumorales. Todos estos hallazgos justifican las aplicaciones clínicas de hTERT para la inmunoterapia contra el cáncer.

La vacunación con péptidos, ampliamente utilizada en varios ensayos de vacunas contra el cáncer, es la estrategia más avanzada con respecto al antígeno hTERT. Sin embargo, varios factores podrían influir en el éxito óptimo de esta estrategia de vacuna basada en péptidos, tales como (1) la restricción del antígeno leucocitario humano (HLA), (2) el procesamiento natural de péptidos en las células tumorales, (3) la pérdida de la presentación del antígeno en las células tumorales, (4) la funcionalidad de las células T específicas de antígeno, y (5) la persistencia a largo plazo de las respuestas inmunitarias en el anfitrión después de la vacunación.

La respuesta de memoria obtenida con las vacunas peptídicas y especialmente con los péptidos cortos es muy baja y no es persistente. Estos resultados subóptimos se pueden explicar en parte por la ausencia de ayuda de células T CD4. Además, la semivida del complejo de MHC/vacuna de péptido en las células presentadoras es de solo unas pocas horas, a continuación, los péptidos desaparecen. Las células dendríticas ya no presentan péptidos a los linfocitos y, por lo tanto, se vuelven tolerogénicas. Este defecto en la presentación de péptidos puede ser perjudicial en algunos casos (Rosenberg et al., 2004).

Compendio de la invención:

Los autores de la presente invención han desarrollado una estrategia de vacuna de ADN que no muestra los inconvenientes de la vacunación con péptidos (incluso péptidos largos), restringida a ciertos epítopos de hTERT. En particular, la vacunación con ADN evita procedimientos costosos y complicados para la producción y purificación de proteínas. Además, una vacuna de ADN que codifica la proteína hTERT hace posible inducir células T auxiliares CTL y CD4 independientemente de la restricción de HLA del paciente, a la vez que es segura e induce una mejor respuesta inmunitaria cuantitativa y cualitativa.

La invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) que carece de la actividad catalítica de la telomerasa y de una señal de localización nucleolar, en donde la proteína hTERT se fusiona en el extremo N con una proteína que mejora el direccionamiento de la proteína hTERT al proteasoma, que puede ser ubiquitina o calreticulina.

La construcción de ácido nucleico de la invención es útil para desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferiblemente una respuesta inmunitaria celular, contra células que expresan en exceso la telomerasa, preferiblemente células de displasia o células tumorales, así como células infectadas con un oncovirus.

En la presente memoria se describe un método para prevenir o tratar un tumor en un paciente, cuyo método comprende administrar dicha construcción de ácido nucleico a un paciente que lo necesite.

Tal tratamiento se puede denominar inmunoterapia activa o vacunación terapéutica, ya que desencadena una respuesta inmunitaria contra el tumor, especialmente una respuesta de células T CD8 citotóxica, junto con una respuesta específica de células T CD4.

Se obtiene una respuesta inmunitaria celular amplia porque los repertorios de células T CD4 y CD8 son estimulados por los epítopos disponibles en hTERT. El número de células T CD4 y CD8 dirigidas contra muchos epítopos de hTERT es mayor que en la vacunación con péptidos. Se mejora la producción de interleucinas, además de la inducción de células T CD4, especialmente citocinas Th1, lo que permite un crecimiento y diferenciación óptimos de las células T CD8 con el sello distintivo de las células antitumorales.

Leyendas de las figuras

Figura 1A Mapa del plásmido INVAC-1

Características del vector

Agonista eRNA11a RIG-I: 7-532

Terminador procariótico trpA: 535-564

VA RNAI (VA1) de adenovirus serotipo 5: 568-761

Origen ampliado del sitio de ensamblaje primosomal (PAS-BH): 771-1055

Origen de replicación pUC: 1056-2070

Marcador de selección de sacarosa (RNA-OUT): 2087-2231

Potenciador de SV40: 2232-2451

Potenciador de CMV: 2452-2897

Promotor de CMV: 2898-3017

Líder sin traducir (exón 1): 3018-3204

HTLV-1 R: 3089-3314

Intrón 3' basado en p-globina de conejo sintética: 3323-3429

Exón 2 (sitios de unión a proteínas SR-Kozak): 3430-3478

Transgén Ubi-hTERT que incluyen sitios de clonación HindIII-XbaI-Invectys): 3479-6973

Terminador eucariótico: 6980-7114

Figura 1B Validación de gel para INVAC-1

El vector de expresión INVAC-1 se verificó por mapeo de restricción. El patrón corresponde al mapa de restricción esperado.

Calle 1: escalera de 1 kb

Calle 2: INVAC-1 sin digerir

Calle 3: INVAC-1 digerido con BglIl/Notl (bandas 3496, 3262, 220, 142 pb)

Calle 4: INVAC-1 digerido con NcoI (bandas de 4084, 3036 pb)

Calle 5: INVAC-1 digerido con HindIII/XbaI (3631, bandas de 3489 pb)

Figura 2A hTERT, INVAC-1 y derivados de INVAC-1.

Alineamiento esquemático entre proteínas hTERT de tipo salvaje y Ubi-hTERT modificadas codificadas por INVAC-1 y derivados de INVAC-1: pUTD10Not (abreviado como A10Not), pUTD10Cog (abreviado como A10Cog) y pUTD23Tyn (abreviado como A23).

Características de la secuencia:

VDD: Deleción de los aminoácidos 867-869 dentro del sitio catalítico.

DGLLLRL (SEQ ID NO: 19): Deleción adicional de los aminoácidos 860-867; deleción de VDD aguas arriba FLLVTPH (SEQ ID NO: 20): Deleción adicional de los aminoácidos 869-876; deleción de VDD aguas abajo IRR: Deleción adicional de los aminoácidos 857-859; DGLLLRLVDD aguas arriba (SEQ ID NO: 21): deleción LTH: Deleción adicional de los aminoácidos 877-879; VDDFLLVTPH aguas abajo (SEQ ID NO: 22): deleción Ubi: secuencia de ubiquitina humana (1-76 aminoácidos)

V5: Etiqueta C-terminal V5 para la detección conveniente de proteínas

Figura 2B Validación de gel para derivados de INVAC-1

Los vectores de expresión pUTD10Not, pUTD10Cog y pUTD23Tyn (derivados de INVAC-1) se verificaron mediante mapeo de restricción. Los patrones corresponden a los mapas de restricción esperados.

Calle M: escalera de 1 kb

Calle 1: pUTD10Cog (5348, bandas de 3585 pb)

Calle 2: pUTD10 Not (5348, bandas de 3585 pb)

Calle 3: pUTD23Tyn (5348, bandas de 3546 pb)

Figura 3 Expresión de hTERT de tipo salvaje, INVAC-1 y derivados de INVAC-1 in vitro en diferentes líneas celulares evaluadas por transferencia Western

HTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT), vector vacío (pNTC8685-eRNA41H, cadena principal de INVAC-1 sin secuencia codificante foránea), construcciones de INVAC-1 y derivadas de INVAC-1 (pUTD10Not/A10Not, pUTD10Cog/A10Cog y pUTD23Tyn/A23) se transfectaron en células HEK293T (A, C). La hTERT de tipo salvaje, el vector vacío pNTC8685-eRNA41 H y las construcciones de INVAC-1 se transfectaron en células CrFK (B).

La expresión de proteínas se controló durante 18-96 h después de la transfección en células HEK293T (A, C) y durante 24-72 h en células CrFK (B).

El tiempo de recolección de células se indica en la parte superior de cada calle. Se cargaron 15 gg de proteína total de productos lisados celulares por calle para las membranas A, B, C (hTERT, INVAC-1) y se cargaron 20 gg de productos lisados de proteína total por calle para las membranas C (A10Not, A10Cog, A23). Se detectó hTERT con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-hTERT (hTERT, INVAC-1) o con una anti-etiqueta V5 (A10Not, A10Cog, A23). La detección de proteína p-actina se utilizó como control de carga y se detectó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina. La detección de proteínas hTERT de células CrFK (B) y proteínas derivadas de INVAC-1 de células HEK293T (C) requirió un mayor tiempo de exposición.

Figura 4 Localización intracelular de construcciones de hTERT e INVAC-1 en diferentes líneas celulares evaluadas por inmunofluorescencia

La hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT), el vector vacío (pNTC8685-eRNA41H, la cadena principal de INVAC-1 sin secuencia codificante foránea) y las construcciones de INVAC-1 se transfectaron en células HEK293T (A) o CrFK (D) durante 24 h, y en células HeLa (B) o QT6 (C) durante 24h y 48h.

Las células se procesaron para la tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal de conejo antihTERT y un anti-anticuerpo secundario de conejo Alexa Fluor 488® de cabra (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las células no tratadas se tiñeron solo con DAPI. Las células se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (x63).

Figura 5 Actividad telomerasa de hTERT, INVAC-1 y derivados de INVAC-1 evaluados mediante ensayo TRAP

Las células CrFK se transfectaron con construcciones de hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT), INVAC-1 y derivados de INVAC-1. Veinticuatro horas después, se recolectaron las células, se extrajeron las proteínas celulares totales y se evaluó la actividad telomerasa (transcriptasa inversa) mediante el ensayo del Protocolo de Amplificación de Repetición Telomérica (TRAP). Se muestran las mediciones de absorbancia (DO450/690 nm) y la Actividad Telomerasa Relativa (RTA; razón muestra/control positivo) de construcciones de INVAC-1 (A, B) y derivadas de INVAC-1 (C, D) en comparación con hTERT de tipo salvaje y células CrFK sin tratar (n = 3 para 2,1 gg de muestras de concentración de proteína total), **: p = 0,0016, ***: p <0,0001, prueba t no pareada.

No se detectó actividad telomerasa en células CrFK transfectadas con INVAC-1 y derivados de INVAC-1.

Figura 6: Impacto de la electroporación para inducir niveles significativos de células T CD8 específicas para hTERT que secretan interferón-Y después de la administración ID de INVAC-1

Se inmunizaron ID ratones hembra C57BL/6 de siete semanas de edad (2-8 ratones por grupo) con 100 gg de INVAC-1 o 1X PBS. Para la mitad de los animales, se realizó una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con una reserva de 2 péptidos de hTERT restringidos a MHC H2b (p429, p660) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Análisis de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. *: valor p <0,05. EP = electroporación.

Figura 7: Evaluación de varias rutas de administración para la vacunación con INVAC-1 seguida de electroporación para inducir células T CD8 específicas de hTERT que secretan interferón ^y -

Se inmunizaron ratones HLA-B7 transgénicos de siete a diez semanas de edad a través de A) la vía ID o SC (3-8 ratones por grupo) y B) a través de la vía ID o IM (4-5 ratones por grupo) con 25 gg de INVAC-1 o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Catorce días después de la vacunación, se recogieron bazos A) o sangre periférica B) de todos los ratones. Los esplenocitos o las PBMC se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con una reserva de 3 péptidos específicos de hTERT restringidos al MHC HLA-B7 (p351, p1123 y p277) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos o PBMC. Prueba no paramétrica de Mann Whitney, *: valor p <0,05. Se estableció voluntariamente una línea sombreada a 10 células T CD8 específicas de hTERT que secretaban IFNy/200.000 esplenocitos como un umbral de corte que permitía la determinación de los animales que respondían.

Figura 8: Impacto de la dosis de la vacuna sobre la respuesta de células T CD8 específicas para hTERT después de una inmunización ID única con INVAC-1 y electroporación

Se inmunizaron ID ratones hembra C57BL/6 de siete semanas de edad A) con 12,5, 25, 50 o 100 gg de INVAC-1 o 1X PBS (4-6 ratones por grupo) y B) con 100, 200, 400, 800 o 1200 gg de INVAC-1 o 1X PBS (3-5 ratones por grupo). Se realizó una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con una reserva de 2 péptidos de hTERT restringidos al MHC H2b (p429, p660) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretaban IFNy/200.000 esplenocitos. Análisis de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. *: valor p <0,05, **: valor p <0,01. Se estableció voluntariamente una línea sombreada en 10 manchas/200.000 esplenocitos para permitir la determinación de los animales que respondían.

Figura 9: Impacto de un régimen de vacunación de cebado-refuerzo con INVAC-1 sobre células T CD8 específicas para hTERT que secretan interferón-Y

Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de siete a diez semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 25 gg de INVAC-1. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Veintiún días después, los ratones recibieron una inyección de refuerzo utilizando el mismo procedimiento. Se recogió sangre periférica antes de la primera inmunización, los días 7, 15 y 21 después del cebado y los días 9, 16 y 22 después del refuerzo.

Las PBMC se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado en una reserva de 3 péptidos específicos de hTERT restringidos al MHC HLA-B7 (p351, p1123 y p277) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Prueba no paramétrica de Mann-Whitney, *: valor p <0,05. Se estableció voluntariamente una línea sombreada en 10 puntos/200.000 esplenocitos para permitir la determinación de los animales que respondían.

Figura 10: Evaluación de la vacunación ID (inmunización única versus régimen de cebado/refuerzo) con INVAC-1, A10Not, A100og o A23 seguido de electroporación para inducir células T CD8 específicas para hTERT que secretan interferón y ­

A) Se inmunizaron ID ratones hembra C57BL/6 de siete semanas de edad (4 ratones por grupo) con 100 pg de INVAC-1, A10Not, A10Cog o A23 o 1X PBS. Se realizó una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. La mitad de los animales recibió una inyección de refuerzo veintiún días después de la primera vacunación utilizando el mismo procedimiento. Se recogieron los bazos de los ratones 14 días o 10 días después de la última inmunización, respectivamente, para los animales que recibieron una sola inyección o inyecciones de cebado y refuerzo. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con un grupo de 2 péptidos de hTERT restringidos al MHC H2b (p429, p660) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos para animales que recibieron una inyección única (CEBADO, puntos de color negro) o una inyección de cebado y refuerzo (PB, puntos de color blanco). Prueba no paramétrica de Mann Whitney, *: valor p <0,05. Se estableció voluntariamente un punto de corte en 10 células T CD8 específicas para hTERT que secretaban IFNy/200.000 esplenocitos (línea sombreada) para permitir la determinación de los animales que respondían. PB = post-refuerzo.

B) Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de siete a diez semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 100 pg de INVAC-1, A10Not, A10Cog o A23 o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Veintiún días después de la primera vacunación, los ratones recibieron una inyección de refuerzo utilizando el mismo procedimiento. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con una reserva de 3 péptidos específicos de hTERT restringidos al MHC HLA-B7 (p351, p1123 y p277) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos o PBL. Prueba no paramétrica de Mann Whitney, *: valor p <0,05. Se estableció voluntariamente un punto de corte en 10 manchas/200.000 esplenocitos para determinar la frecuencia de los animales que respondían (línea sombreada).

Figura 11: Amplitud de la respuesta de células T específicas para hTERT después de una o varias inmunizaciones ID seguidas de electroporación: Comparación entre las construcciones de INVAC-1, pNTC-hTERT y pNTC-hTERT-AVDD

Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de siete a 13 semanas de edad a través de la vía ID (6 ratones por grupo) con 25 pg de INVAC-1, hTERTAVDD (pNTC-hTERT-AVDD), hTERT (pNTC-hTERT) o vector vacío NTC (pNTC8685-eRNA41H). Cuarenta y ocho animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. La mitad de los animales recibió una inyección de refuerzo veintiún días después de la primera vacunación utilizando el mismo procedimiento. Los bazos de los ratones se cosecharon 14 días o 10 días después de la última inmunización, respectivamente, para los animales que recibieron una sola inyección o inyecciones de cebado y refuerzo.

Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado, con un conjunto de 269 péptidos purificados de hTERT (pureza> 70%, GenScript) divididos en 27 reservas de 9-10 péptidos solapantes de hTERT (péptidos de 15 unidades que se solapan en 11 aminoácidos), durante una estimulación nocturna (19 horas). Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT.

Para cada ratón, se calculó la mediana del número de manchas por triplicado y por condición de estimulación (medio o reserva de péptidos). La frecuencia (F) de las células T específicas para hTERT se calculó después de restar la mediana del número de manchas en pocillos estimulados con medio de la mediana del número de manchas en los pocillos estimulados con la reserva de péptidos. Los valores negativos se establecieron en 0 para análisis posteriores.

Este análisis se realizó para los animales que recibieron una sola vacuna (A) o una vacuna de cebado-refuerzo (B). (A y B) Para cada grupo de vacunación (IⁿV^a C-1, hTERTAVDD, hTERT, N^t C), se calculó una mediana (n = 6) de la frecuencia (F) de las células T específicas de telomerasa que secretaban IFNy/200.000 esplenocitos por condición de estimulación para obtener un valor por cada uno de las 27 reservas.

(C) Suma de la mediana total de la frecuencia (F) de las células T específicas de telomerasa detectadas para las 27 reservas (269 péptidos purificados) después de la vacunación con INVAC-1, hTERTAVDD, hTERT o NTC. Los análisis estadísticos se realizaron con el soporte lógico Prism 5 utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con corrección de Dunn. El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Figura 12: Potencia de la vacunación ID con INVAC-1 y eleotroporaoión para generar células T CD8 citotóxicas específicas y células T Th1-CD4

A) Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de siete a 10 semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 25 gg de INVAC-1 o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. El día 14 después de la inyección, los esplenocitos singénicos, pulsados con péptidos de hTERT individuales restringidos al MHC HLA-B7 (p351 o p1123) o no pulsados, se marcaron con succinimidil éster diacetato de carboxiforesceína (CFSE) a tres concentraciones diferentes: alta = 1 gM (621), media = 0.5 gM (987) y baja = 0.1 gM (sin pulsar). El mismo número de células marcadas con CFSE alta, media o baja se transfirió IV a ratones vacunados. Después de 15-18 horas, se determinó la desaparición de las células pulsadas con péptidos en el bazo mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis específica se calculó comparando la proporción de células pulsadas con las células no pulsadas en ratones vacunados frente a los de control. Los datos representan el porcentaje de lisis específica para cada ratón contra cada péptido individual en el bazo después de la vacunación ID con lNVAC-1. Las barras horizontales muestran el porcentaje promedio de lisis por péptido y por ruta de inmunización. También se trazan las desviaciones típicas (n = 10 animales individuales/grupo). Los análisis estadísticos se realizaron con el soporte lógico Prism 5 utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con corrección de Dunn. El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

B y C) Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de siete a diez semanas de edad a través de la vía ID (7-10 ratones por grupo) con 25 gg de INVAC-1 o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y B) la mitad de ellos se estimularon por triplicado en un ensayo ELIspot para IFN-y con una reserva de 3 péptidos específicos de hTERT restringidos al MHC HLA-DR1 (p1029, p578 y p904) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD4 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Prueba no paramétrica de Mann Whitney, ***: valor p <0,001.

C) La segunda mitad de los esplenocitos se estimuló durante 24 h con una reserva de 3 péptidos específicos de hTERT restringidos al MHC HLA-DR1 (p1029, p578 y p904). Los sobrenadantes de las células estimuladas se recuperaron y se probaron en un ensayo CBA para evaluar la concentración de citocinas Th1/Th2 y Th17 secretadas por las células T CD4 específicas para hTERT. Los resultados son la mediana de las concentraciones de citocina en pg/ml. Análisis de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. *: valor p <0,05.

Figura 13: Impacto de una vacunación ID terapéutica o preventiva con INVAC-1 seguida de electroporación en un modelo tumoral de ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 singénicos.

A) Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de cinco a diez semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 100 gg de INVAC-1 o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Veintiún días después del cebado, los ratones recibieron una inyección de refuerzo siguiendo el mismo procedimiento. Un mes después del refuerzo, a los ratones se les inocularon a través de la vía SC 50.000 células tumorales Sarc-2 (fibrosarcoma de ratón). La mediana del volumen tumoral en cada grupo vacunado se muestra en diferentes días después del injerto de células tumorales. Se dibujó una línea sombreada a 500 mm3 para permitir el cálculo del retraso del crecimiento tumoral.

B) Se inocularon ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de 24 semanas de edad (10 ratones por grupo) a través de la vía SC con 20.000 células tumorales Sarc-2 (fibrosarcoma de ratón). Cuatro días después del injerto de células tumorales, los animales fueron inmunizados a través de la vía ID con 25 gg de INVAC-1 o un plásmido vacío (NTC, cadena principal de INVAC-1 sin secuencia de antígeno). Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. Veintiún y 35 días después del cebado, los ratones recibieron inyecciones de refuerzo utilizando el mismo procedimiento. La mediana del volumen tumoral en cada grupo vacunado se muestra en diferentes días después de la sensibilización. Se dibujó una línea sombreada a 500 mm3 para permitir el cálculo del retraso del crecimiento tumoral.

Figura 14: Potenciación de las respuestas inmunitarias celulares inducidas por INVAC-1 mediante GM-CSF y eficacia in vivo en un modelo de tumor de ratón transgénico para HLA-A2/DR1 singénico

A) Se inmunizaron ID ratones hembra C57BL/6 de siete semanas de edad (5 ratones por grupo) con 25 gg de INVAC-1, 25 gg de INVAC-1 y 0,5 gg de mGM-CSF o 1X PBS. La electroporación se realizó en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización con INVAC-1. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con un grupo de 2 péptidos de hTERT restringidos al MHC H2b (p429, p660) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Análisis de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. **: valor p <0,01.

B) Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de siete a diez semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 100 gg de INVAC-1, 100 gg de INVAC-1 y 5 gg de mGM-CSF. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización con INVAC-1. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon por triplicado con una reserva de 3 péptidos específicos para hTERT restringidos al MHC HLA-DR1 (p1029, p578 y p904) durante 24 horas. Los sobrenadantes de las células estimuladas se recuperaron y probaron en un ensayo CBA para evaluar la concentración de citocinas Th1/Th2 y Th17 secretadas por las células T CD4 específicas para hTERT. Los resultados son la mediana de la concentración de citocina en pg/ml. Análisis de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. *: valor p <0,05. **: valor p <0,01.

C) A ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de siete a diez semanas de edad (10 ratones por grupo) se les inocularon a través de la vía SC 20.000 células tumorales Sarc-2 (fibrosarcoma de ratón). Cuatro días después del injerto de células tumorales, los animales fueron inmunizados a través de la vía ID con 25 gg de INVAC-1 y 0,5 gg de mGM-CSF, un plásmido vacío (NTC, cadena principal de INVAC-1 sin secuencia de antígeno) y 0,5 gg de mGM-CSF o 1X PBS y 0,5 gg de mGM-CSF. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización con INVAC-1. Veintiún y 35 días después del cebado, los ratones recibieron inyecciones de refuerzo con el mismo protocolo. La mediana del volumen tumoral en cada grupo vacunado se muestra en diferentes días después del injerto de las células tumorales.

Se dibujó una línea sombreada a 500 mm3 para permitir el cálculo del retraso del crecimiento tumoral.

Figura 15: impacto de IL-12 para potenciar las respuestas de células T CD8 específicas para hTERT inducidas por ÍNVAC-1

Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 de siete a diez semanas de edad a través de la vía ID (5 ratones por grupo) con 100 gg de IN^v A^c -1, 100 gg de INVAC-1 y 1 ng de IL-12, 1X PBS o 1X PBS y 1 ng de IL-12. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización con INVAC-1. Catorce días después de la vacunación, se recogieron los bazos de todos los ratones. Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon por triplicado en un ensayo ELIspot para IFN-y con una reserva de 2 péptidos específicos de hTERT restringidos al HLA-A2 (UCP4.1 y UCP2.1) durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Se estableció una línea sombreada en 10 manchas/200.000 esplenocitos para permitir la determinación de los animales que respondían.

La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos completa del vector de expresión del plásmido INVAC-1 (7120 pb). Las características del vector se detallan en la leyenda de la Figura 1A. La proteína de fusión de hTERT codificada por INVAC-1 (1158 AA) comienza en la posición 3488 (ATG que codifica el aminoácido M) y termina en 6961 (GAC que codifica el aminoácido D). Se suprimieron los 47 primeros aminoácidos (1-47 AA) de la proteína INVAC-1/hTERT y se remplazaron por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). El sitio catalítico se inactivó mediante una deleción de 9 pb (entre los nucleótidos 6172-6173) que codificaba VDD (* en la secuencia) y que correspondía a AA 867-869 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; número de acceso NM_198253). La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones (véase también la Figura 1A) se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada. La Figura 17 muestra la secuencia del inserto que codifica la proteína de fusión ubiquitina-telomerasa humana (UbihTERT) D10Not. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). Se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 912-913 (* véase la secuencia), correspondiente a AA 860-869 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; número de acceso NM_198253). Esta deleción de 10 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática de TERT humana y la deleción de 7 AA adicionales aguas arriba de la secuencia VDD. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada.

La Figura 18 muestra la secuencia del inserto que codifica la proteína de fusión de ubiquitina-telomerasa humana (Ubi-hTERT) D10Cog. Se suprimiendo los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). Se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 919-920 (* véase la secuencia), correspondiente a AA 867-876 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; número de acceso NM_198253). Esta deleción de 10 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática de TERT humana y la deleción de 7 AA adicionales aguas abajo de la secuencia VDD. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; La segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada.

La Figura 19 muestra la secuencia del inserto que codifica la proteína de fusión de ubiquitina-telomerasa humana (Ubi-hTERT) D23Tyn. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). Se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 909-910 (* véase la secuencia), correspondiente a AA 857-879 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; número de acceso NM_198253). Esta deleción de 23 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática de TERT humana y la deleción de 10 AA adicionales aguas arriba y aguas abajo de la secuencia VDD. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; La segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada.

Figura 20 Mapas de plásmidos derivados con permutaciones al azar de INVAC-1

Figura 20A pUTScram: características del vector

Figura 20B püTinv: características del vector

Figura 21A Validación de gel para püTSoram

El vector de expresión pUTScram se verificó mediante mapeo de restricción. El patrón corresponde al mapa de restricción esperado.

Calle M: escalera de 1 kb

Calle 1: pUTScram digerido con HindIII/XbaI (bandas de 3576, 5342 pb)

Figura 21B Validación de gel para püTInv

El vector de expresión pUTInv se verificó mediante mapeo de restricción. El patrón corresponde al mapa de restricción esperado.

Calle M: escalera de 1 kb

Calle 1: pUTInv digerido con HindIII/XbaI (bandas de 3576, 5342 pb)

Figura 22 Construcciones de hTERT, INVAC-1, püTSoram y püTInv

Alineamiento esquemático entre proteínas hTERT de tipo salvaje y Ubi-hTERT modificada codificadas por INVAC-1 y derivados con permutaciones al azar de INVAC-1: pUTScram (Secuencia Aleatoria) y pUTInv (Secuencia Invertida).

La secuencia de hTERT modificada (AVDD) se dividió en diez fragmentos inmunogénicos: fragmento 1 (258 pb; Leu24 - Gly109), fragmento 2 (201 pb; Phe115 - Ala181), fragmento 3 (120 pb; Trp203 - Ala242), fragmento 4 (117 pb; Ser255 - Arg293), fragmento 5 (303 pb; Pro320-Thr420), fragmento 6 (312 pb; Ala423 - Val526), fragmento 7 (210 pb; Cys528 - Gln597), fragmento 8 (477 pb; Arg599 - Lys757), fragmento 9 (576 pb; Lys760 -Ile951), fragmento 10 (516 pb; Asn958 - Asp1129).

Características de secuencia:

VDD: Deleción de los aminoácidos 867-869 dentro del sitio catalítico.

Ubi: secuencia de ubiquitina humana (aminoácidos 1-76)

F (Phe): Residuo de fenilalanina de hTERT (AA47)

G (Gly): Residuo de glicina C-terminal de ubiquitina (AA76)

R (Arg): Arginina, primer aminoácido de la proteína INVAC-1 (AA 77)

N (Asn): Asparragina, primer aminoácido de la proteína hTERT artificial (Secuencia Aleatoria) codificada por pUTScram (AA 81)

C (Cys): Cisteína, primer aminoácido de la proteína hTERT artificial (Secuencia Invertida) codificada por pUTInv (AA 81)

V5: Etiqueta C-terminal V5 para la detección conveniente de proteínas

Figura 23 Expresión in vitro de hTERT de tipo salvaje, INVAC-1 y derivados con permutaciones al azar de INVAC-1, evaluada mediante transferencia Western

Se transfectaron hTERT de tipo salvaje, INVAC-1, pUTScram y pUTInv en células HEK293T. La expresión de proteínas se controló durante 18-96 h después de la transfección. (A y C) Se cargaron muestras de hTERT de tipo salvaje e INVAC-1 durante 18 h y 72 h a 15 pg de concentración de proteína total. Estas muestras se utilizaron como controles positivos de las expresiones de proteínas. Las proteínas (A) de Secuencia Aleatoria y (C) de Secuencia Invertida se cargaron a 20 pg de proteína total de productos lisados celulares por calle. Se detectó hTERT con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-hTERT (hTERT, INVAC-1) o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti­ etiqueta V5 (Secuencia Aleatoria, Secuencia Invertida). El tiempo de recolección de células se indica en la parte superior de cada calle. La proteína p-actina se utilizó como control de carga y se detectó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina. La detección de productos derivados con permutaciones al azar de INVAC-1 requirió un tiempo de exposición más largo que las proteínas hTERT de tipo salvaje e INVAC-1 (10 segundos a 30 minutos frente a menos de 1 segundo).

Las intensidades de la señal de proteína con permutaciones al azar se normalizaron a la señal de p-actina en la transferencia Western (A y C) utilizando el soporte lógico ImageJ. (B) Secuencia Aleatoria. (D) Secuencia Invertida. Se generaron gráficos de perfil de control de carga y bandas de proteínas para cada calle para obtener números arbitrarios correspondientes al área bajo el perfil de la curva. Se calcula una razón (densidad relativa) dividiendo el valor del área para cada muestra por el valor del área para el control de carga correspondiente.

Figura 24 Actividades telomerasa de hTERT, INVAC-1 y derivados con permutaciones al azar de INVAC-1 evaluadas mediante ensayo TRAP

Las células CrFK se transfectaron con construcciones de hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT), pUTScram y pUTInv. Veinticuatro horas después, se recolectaron las células, se extrajeron las proteínas celulares totales y se evaluó la actividad telomerasa (transcriptasa inversa) mediante el ensayo del Protocolo de Amplificación de Repetición Telomérica (TRAP). Se muestran las mediciones de absorbancia (DO450/690 nm) y la actividad telomerasa relativa (RTA; razón muestra/control positivo) de construcciones con permutaciones al azar (A y B, respectivamente) en comparación con hTERT de tipo salvaje y las células CrFK no tratadas (n = 3 para 2,1 pg de muestra de concentración de proteína total), se realizó una prueba t no pareada.

No se detectó actividad telomerasa en células CrFK transfectadas con las construcciones pUTScram y pUTInv. Figura 25: Evaluación de la vacunación ID con INVAC-1, pUTScram y pUTInv seguida de electroporación para inducir células T CD8 específicas para hTERT que secretan interferón y -Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de nueve a quince semanas de edad. a través de la vía ID (3-5 ratones por grupo) con 100 pg de INVAC-1, pUTScram, pUTInv o 1X PBS después de dos ciclos de inmunización (régimen de cebado/refuerzo). Se realizó una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de cada inmunización. Se recogieron los bazos de los ratones 10 días después de la segunda inmunización.

Los esplenocitos se purificaron con Ficoll y se estimularon en un ensayo ELIspot para IFN-y por triplicado con una reserva de 3 péptidos de hTERT específicos restringidos al MHC HLA-B7 (p277, p351 y p1123) o medio libre durante 19 horas. Las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Los resultados son la mediana de la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT que secretan IFNy/200.000 esplenocitos. Se realizó la prueba no paramétrica de Mann Whitney, *: valor p <0,05. Se estableció voluntariamente un punto de corte en 10 manchas/200.000 esplenocitos para determinar la frecuencia de los animales que respondían (línea sombreada).

Figura 26: Potencia de pUTScram y pUTInv para generar células T CD8 citotóxicas específicas para hTERT después de la vacunación ID y la electroporación

Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-B7 de quince semanas de edad. a través de la vía ID (4-6 ratones por grupo) con 100 pg de INVAC-1, pUTScram, pUTInv o 1X PBS. Todos los animales recibieron una electroporación en cada sitio de vacunación directamente después de la inmunización. El día 14 después de la inyección, los esplenocitos singénicos, pulsados con péptidos de hTERT individuales restringidos al MHC HLA-B7 (p351 o p1123) o no pulsados, se marcaron con succinimidil éster diacetato de carboxiforesceína (CFSE) a tres concentraciones diferentes: alta = 5 pM (351), media = 2 pM (1123) y baja = 0,2 pM (sin pulsar). Se inyectó una mezcla que contenía un número igual de células marcadas con CFSE de cada concentración a través de la vena retroorbital (IV) a los ratones vacunados. Después de 15-18 horas, se determinó la desaparición de las células pulsadas con péptidos en el bazo mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis específica se calculó comparando la proporción de células pulsadas con las pulsadas en ratones vacunados frente a los de control. Los datos representan el porcentaje de lisis específica para cada ratón contra cada péptido individual en el bazo después de la vacunación ID. Las barras horizontales muestran la mediana del porcentaje de lisis por péptido. Los análisis estadísticos se realizaron con el soporte lógico Prism 5 utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con corrección de Dunn. El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La Figura 27 muestra la delineación de los segmentos inmunogénicos de la secuencia de codones optimizados de Ubi-hTERT utilizada para construcciones derivadas con permutaciones al azar de INVAC-1. La primera línea es la secuencia de nucleótidos de codones optimizados de Ubi-hTERT (SEQ ID NO: 45) y la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 46). La secuencia de Ubi-hTERT se dividió en diez fragmentos que incluían las secuencias inmunogénicas. Estos fragmentos están delineados mediante símbolos (<...>). Las secuencias inmunogénicas se destacan en color gris. Las secuencias de hTERT entre fragmentos no inmunogénicos, que no están incluidas en las construcciones pUTScram y pUTInv, están subrayadas. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. Las anotaciones se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. (*) Indica la deleción de la secuencia VDD. "□": Codón de parada.

La Figura 28 muestra la secuencia completa de nucleótidos del inserto pUTScram (3555 pb). Las características del vector se detallan en la leyenda de la Figura 20. El inserto con permutaciones al azar Ubi-hTERT (Secuencia Aleatoria, 1184 AA) comienza en la posición 923 (ATG que codifica el aminoácido M) y termina en la posición 4474 (ACT que codifica el aminoácido T) de pUTScram. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de la proteína hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). El sitio catalítico se inactivó mediante una deleción de 9 pb que codificaba VDD (* en la secuencia) y correspondiente a AA 867-869 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; patente WO 2007/014740 e isoforma 1 de hTERT; Número de acceso NM_198253). La secuencia de hTERT se dividió en diez fragmentos inmunogénicos y se volvió a ensamblar en el siguiente orden específico: fragmento 7 (210 pb), fragmento 2 (201 pb), fragmento 6 (312 pb), fragmento 4 (117 pb), fragmento 9 (576 pb), fragmento 3 (120 pb), fragmento 1 (258 pb), fragmento 8 (477 pb), fragmento 10 (516 pb), fragmento 5 (303 pb). Estos 10 fragmentos estaban unidos por puentes con un conector 6xGly (conector G; 18 pb). Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal del inserto con permutaciones al azar de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 47); la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 48). Las anotaciones (véase también la Figura 20A) se proporciona o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada.

La Figura 29 muestra la secuencia completa de nucleótidos del inserto pUTInv (3555 pb). Las características del vector se detallan en la leyenda de la Figura 20. El inserto con permutaciones al azar de Ubi-hTERT (Secuencia Invertida, 1184 AA) comienza en la posición 923 (ATG que codifica el aminoácido M) y termina en la posición 4474 (ACT que codifica el aminoácido T) de pUTInv. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de la proteína hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido ubiquitina (76 AA). El sitio catalítico se inactivó mediante una deleción de 9 pb que codificaba VDD (* en la secuencia) y correspondiente a AA 867-869 de la telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; patente WO 2007/014740; Número de acceso NM_198253). La secuencia de hTERT se dividió en diez fragmentos inmunogénicos y se volvió a ensamblar en el siguiente orden específico: fragmento 10 (516 pb), fragmento 9 (576 pb), fragmento 8 (477 pb), fragmento 7 (210 pb), fragmento 6 (312 pb), fragmento 5 (303 pb), fragmento 4 (117 pb), fragmento 3 (120 pb), fragmento 2 (201 pb), fragmento 1 (258 pb). Estos 10 fragmentos estaban unidos por puentes con un conector 6xGly (conector G; 18 pb). Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal del inserto con permutaciones al azar de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 49); la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 50). Las anotaciones (véase también la Figura 20B) se proporcionan o bien encima o bien debajo de las secuencias. "□": Codón de parada.

Descripción detallada de la invención:

Definiciones

El complejo de telomerasa consiste en un molde de ARN y componentes proteicos que incluyen una transcriptasa inversa, denominada "Transcriptasa inversa de la telomerasa" (TERT), que es el principal determinante de la actividad de telomerasa. A menos que se especifique lo contrario, en la presente memoria descriptiva, el término "telomerasa" se refiere a TERT, incluida la telomerasa humana de tipo salvaje, o variantes de la misma. Se conoce la telomerasa humana de tipo salvaje (o hTERT) (número de acceso GeneBank NM_198253), y tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (el ADNc se muestra como SEQ ID NO: 1)

La "actividad catalítica de la telomerasa" se refiere a la actividad de TERT como una transcriptasa inversa de telomerasa. El término "desprovista de actividad catalítica telomerasa" significa que la secuencia de ácido nucleico codifica una TERT mutante, que está inactiva.

En la presente invención, el término "variante" se refiere a variantes alélicas, variantes de empalme, mutantes naturales o artificiales, que son homólogos a la secuencia de referencia de hTERT. Dos secuencias de aminoácidos son "homólogas", "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando uno o más residuos de aminoácidos se reemplazan por un residuo biológicamente similar o cuando más de 80% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente 90%, preferiblemente más de aproximadamente 95%, son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineamiento utilizando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los programas conocidos en la técnica (BLAST, FASTA, etc.).

En la presente descripción "sustituido" o "modificado", incluyen aquellos aminoácidos que han sido alterados o modificados a partir de aminoácidos naturales.

Las variantes incluyen proteínas que tienen una secuencia que difiere de la proteína hTERT de tipo salvaje en una o varias mutaciones (es decir, sustituciones, deleciones, inserciones), más preferiblemente una o varias sustituciones de un solo punto. La variante puede comprender sustituciones conservativas.

El término "sustitución conservativa" como se emplea en la presente memoria denota el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, sin alterar la conformación y función general del péptido, incluyendo, pero sin limitarse a, el reemplazo de un aminoácido por uno que tenga propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, ácido, básico, forma, hidrófobo, aromático y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoácidos alcalinos hidrófilos y pueden ser intercambiables. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede reemplazarse por leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que pueden sustituirse entre sí, incluyen asparragina, glutamina, serina y treonina.

El término "polinucleótido aislado" se define como un polinucleótido eliminado del entorno en el que aparece naturalmente. Por ejemplo, una molécula de ADN natural presente en el genoma de una bacteria viva o como parte de un banco de genes no está aislada, pero la misma molécula separada de la parte restante del genoma bacteriano, como resultado de, por ejemplo, un evento de clonación (amplificación) está aislada. Típicamente, una molécula de ADN aislada está libre de regiones de ADN (p. ej., regiones codificantes) a las que está inmediatamente contigua en el extremo 5' o 3', en el genoma natural. Tales polinucleótidos aislados pueden ser parte de un vector o una composición y aún se pueden definir como aislados porque dicho vector o composición no forman parte del entorno natural de tal polinucleótido.

El término "inmunogénico" significa que la composición o construcción a la que se refiere es capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la administración. "Respuesta inmunitaria" en un sujeto se refiere al desarrollo de una respuesta inmunitaria innata y adaptativa, incluyendo una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral y celular a un antígeno. Una "respuesta inmunitaria humoral" se refiere a aquella que está mediada por anticuerpos. Una "respuesta inmunitaria celular" es aquella mediada por linfocitos T. Esto incluye la producción de citocinas, quimiocinas y moléculas similares producidas por las células T activadas, los glóbulos blancos o ambos. Las respuestas inmunitarias se pueden determinar utilizando inmunoensayos y ensayos de neutralización convencionales para la detección de la respuesta inmunitaria humoral, que son conocidos en la técnica.

En el contexto de la invención, la respuesta inmunitaria preferiblemente abarca la estimulación o proliferación de células T CD8 y/o células T CD4 citotóxicas y se puede determinar utilizando inmunoensayos tales como el ensayo ELIspot, el ensayo de citotoxicidad in vivo o ensayo de unión con secreción de citocinas.

Como se emplea en la presente memoria, el término "tratamiento" o "terapia" o "inmunoterapia" se refiere a cualquiera de alivio, mejora y/o eliminación, reducción y/o estabilización (p. ej., ausencia de progreso a etapas más avanzadas) de un síntoma, así como el retraso en la progresión del tumor o displasia, o de un síntoma de los mismos. Por lo tanto, el término incluye el logro de una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz observada en pacientes con cáncer.

Como se emplea en la presente memoria, el término "prevención" o "prevenir" se refiere al alivio, mejora y/o eliminación, reducción y/o estabilización (p. ej., ausencia de progreso a etapas más avanzadas) de un pródromo, es decir cualquier alteración o síntoma temprano (o conjunto de síntomas) que pueda indicar el inicio de una enfermedad antes de que aparezcan síntomas específicos.

Una célula que "expresa en exceso telomerasa" se refiere a una célula en un sujeto que, o bien expresa telomerasa, p. ej. tras mutación o infección, especialmente infección por un oncovirus, si bien generalmente no lo hace, en condiciones normales, o bien a una célula en un sujeto que expresa un mayor nivel de telomerasa (p. ej., tras mutación o infección), en comparación con las condiciones normales. Preferiblemente, la célula que expresa en exceso la telomerasa muestra un aumento de expresión de al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más.

El "paciente" o "sujeto" es típicamente un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano, de cualquier edad, sexo o gravedad de afección.

Construcciones de ácido nucleico

En la presente memoria se proporciona una construcción de ácido nucleico que está diseñada para permitir la vacunación en pacientes. La construcción de ácido nucleico codifica una telomerasa que carece de actividad catalítica telomerasa (que elimina su actividad inmortalizante) y carece de una señal de localización nucleolar (que impide su transferencia al nucleolo).

La construcción de ácido nucleico de la invención está en forma aislada.

El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, pero es preferiblemente ADN, más preferiblemente ADN de doble hebra. La construcción de ácido nucleico no es un ácido nucleico genómico natural, en particular no comprende intrones. Como primer bloqueo de seguridad, la secuencia de hTERT carece de actividad catalítica telomerasa. En una realización preferida, la secuencia que codifica hTERT contiene mutaciones que proporcionan la inactivación de la actividad catalítica de la proteína hTERT. El término "mutación" incluye una sustitución de uno o varios aminoácidos, una deleción de uno o varios aminoácidos y/o una inserción de uno o varios aminoácidos. En una realización particular, la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa por deleción de al menos un aminoácido. Preferiblemente, la secuencia muestra una deleción, preferiblemente una deleción de aminoácidos VDD, como se muestra en la Figura 2A. Preferiblemente, la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa por la única deleción de los aminoácidos 867-869 (VDD). En otra realización particular, la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa mediante una deleción adicional de 1 a 10, 11 o 12 aminoácidos aguas arriba y/o aguas abajo de los aminoácidos 867-869 (VDD).

Como segundo bloqueo de seguridad, la secuencia que codifica hTERT carece adicionalmente de la señal de localización nucleolar. Esta señal de localización nucleolar está correlacionada con la localización subcelular de hTERT y, por lo tanto, con su actividad enzimática. Preferiblemente, la proteína hTERT carece de una señal de localización nucleolar por deleción de al menos los aminoácidos 1-23, más preferiblemente por deleción de los aminoácidos 1-47.

Además de las modificaciones que proporcionan el primer y segundo bloqueos de seguridad, la proteína hTERT codificada por la construcción de ácido nucleico de la invención puede ser una secuencia de hTERT de tipo salvaje, o una secuencia variante.

En la lista de secuencias,

SEQ ID NO: 1 es el ADNc de hTERT de tipo salvaje;

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 3 es el ADNc de hTERT utilizado en el vector INVAC-1;

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 5 es el ADNc de hTERT utilizado en el vector pUTD10Not;

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 7 es el ADNc de hTERT utilizado en el vector pUTD10Cog;

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 9 es el ADNc de hTERT utilizado en el vector pUTD23Tyn;

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos correspondiente.

En una realización preferida, la invención emplea un ácido nucleico que codifica una proteína de SEQ ID NO: 4. Tal ácido nucleico puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 3.

En otra realización, la construcción de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 8 o 10, y preferiblemente comprende SEQ ID NO: 5, 7 o 9.

El ácido nucleico codifica adicionalmente una proteína que mejora el direccionamiento de la proteína hTERT al proteasoma (aumentando la presentación de clase I de los péptidos derivados). Más concretamente, la proteína hTERT se fusiona en el extremo N con tal proteína que mejora el direccionamiento de la proteína hTERT al proteasoma. Dicha proteína es ubiquitina o una proteína chaperona, concretamente calreticulina.

En la lista de secuencias

SEQ ID NO: 11 es la secuencia completa del plásmido INVAC-1 que incluye el ADNc de Ubi-hTERT codificada por INVAC-1;

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos correspondiente de Ubi-hTERT codificada por INVAC-1;

SEQ ID NO: 13 es el ADNc del inserto pUTD10Not;

SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 15 es el ADNc del inserto pUTD10Cog;

SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos correspondiente;

SEQ ID NO: 17 es el ADNc del inserto pUTD23Tyn;

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos correspondiente.

En una realización concreta, la construcción de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. Más concretamente, la construcción de ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 11 o los nucleótidos 3488 a 6961 de SEQ ID NO: 11.

En otra realización, la construcción de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, 16 o 18, y preferiblemente comprende SEQ ID NO: 13, 15 o 17.

AhTERT se refiere a la hTERT con los aminoácidos VDD 867-869 suprimidos.

Construcciones genéticas, composiciones inmunogénicas y administración.

Preferiblemente, el ácido nucleico es una construcción genética que comprende una secuencia de polinucleótidos como se define en la presente memoria, y secuencias reguladoras (tales como uno o varios promotores, potenciadores, terminadores adecuados, etc.) que permiten la expresión (p. ej., transcripción y traducción) del producto proteico en la célula anfitriona u organismo anfitrión.

Las construcciones genéticas de la invención pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN de doble hebra. Las construcciones genéticas de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula anfitriona u organismo anfitrión previstos, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula anfitriona prevista o en una forma adecuada para la replicación, mantenimiento y/o herencia independientes en el organismo anfitrión previsto. Por ejemplo, las construcciones genéticas de la invención pueden estar en forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir, un vector que puede proporcionar expresión in vitro y/o in vivo (p. ej., en una célula anfitriona, organismo anfitrión y/o sistema de expresión adecuados).

En un aspecto preferido pero no limitante, una construcción genética de la invención comprende i) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado operablemente a ii) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también iii) uno o más elementos adicionales de construcciones genéticas tales como secuencias 3'- o 5'-UTR, secuencias líder, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes informadores, y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficacia de) la transformación o la integración.

En una realización concreta, la construcción genética se puede preparar digiriendo el polímero de ácido nucleico con una endonucleasa de restricción y clonando en un plásmido que contiene un promotor tal como el promotor de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) o el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico TERT se insertan en un plásmido de expresión NTC8685-eRNA41H (véase la Figura 1A).

Otros vectores incluyen vectores retrovirales, vectores de lentivirus, vectores de adenovirus, vectores de virus vaccinia, vectores de virus de viruela, vectores de virus de sarampión y vectores asociados a adenovirus.

Se pueden preparar composiciones que comprenden dicho ácido nucleico o vector. Las composiciones son inmunogénicas. Pueden comprender un portador o excipientes que son adecuados para la administración en seres humanos o mamíferos (es decir, no tóxicos y, si fuera necesario, estériles). Tales excipientes incluyen diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos que sirven como vehículos farmacéuticos, agentes isotónicos, estabilizadores o cualquier coadyuvante. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina, entre otros. Cualquier coadyuvante conocido en la técnica se puede utilizar en la composición de la vacuna, incluidos los coadyuvantes con una base oleosa tales como coadyuvante completo de Freund y coadyuvante incompleto de Freund, coadyuvantes con una base de micolato, lipopolisacáridos bacterianos (LPS), peptidoglicanos, proteoglicanos, hidróxido de aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (tales como el migliol), aceites vegetales (tales como aceite de araquis), polioles Pluronic®.

El ácido nucleico o la composición se pueden administrar directamente o se pueden empaquetar en liposomas o aplicar como recubrimiento sobre partículas de oro coloidal antes de la administración. Los mecanismos para empaquetar vacunas de ADN en liposomas son conocidas en la técnica, por ejemplo, de Murray, 1991. De manera similar, los mecanismos para aplicar como recubrimiento ADN desnudo sobre partículas de oro son ilustradas por Yang, 1992, y los mecanismos para la expresión de proteínas utilizando vectores virales se encuentran en Adolph.

1996.

Para la inmunización genética, las composiciones de vacuna se administran preferiblemente por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, en los tumores o en cualquier tipo de órganos linfoides mediante inyección o mediante bombardeo de partículas impulsadas por gas, y se suministran en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria en el organismo anfitrión. En una realización preferida de la presente invención, la administración comprende una etapa de electroporación, también designada en la presente memoria mediante el término "electrotransferencia", además de la etapa de inyección (como describen Mir 2008, Sardesai y Weiner 2011).

Las composiciones también se pueden administrar ex vivo a células linfoides o mieloides mediante transfección liposómica, bombardeo de partículas o transducción viral (incluidas las técnicas de co-cultivo). Las células tratadas se reintroducen a continuación en el sujeto que se vaya a inmunizar.

Si bien se entenderá que la cantidad de material necesaria dependerá de la inmunogenicidad de cada construcción individual y no se puede predecir a priori, el procedimiento de determinación de la dosificación apropiada para cualquier construcción dada es sencillo. Específicamente, se administra una serie de dosificaciones de tamaño creciente, comenzando en aproximadamente 5 a 30 gg, o preferiblemente 20-25 gg, hasta aproximadamente 500 gg a aproximadamente 5 mg, preferiblemente hasta 500-1500 gg, 500-1200 gg, o 500-1000 gg, por ejemplo, a la especie correspondiente y se observa la respuesta inmunitaria resultante, por ejemplo, detectando la respuesta inmunitaria celular mediante un ensayo Elispot para IFNy (como se describe en la sección experimental), detectando las respuestas CTL utilizando un ensayo de lisis in vivo o un ensayo de liberación de cromo o detectando la respuesta Th (célula T auxiliar) utilizando un ensayo de liberación de citocinas.

En una realización preferida, el régimen de vacunación comprende de una a tres inyecciones, preferiblemente repetidas tres o cuatro semanas después.

En una realización concreta, el programa de vacunación puede estar compuesto por una o dos inyecciones seguidas tres o cuatro semanas después por al menos un ciclo de tres a cinco inyecciones.

En otra realización, una dosis de cebador consiste en una a tres inyecciones, seguidas de al menos una dosis de refuerzo cada año, o cada dos o años, por ejemplo.

Estos son solo ejemplos, y cualquier otro régimen de vacunación está incluido en la presente memoria.

Prevención ^o tratamiento de tumores.

El ácido nucleico o la composición inmunogénica como se describe anteriormente es útil en un método para prevenir o tratar un tumor en un paciente.

Se describe un método para prevenir o tratar un tumor en un paciente, cuyo método comprende administrar una cantidad eficaz de dicho ácido nucleico o composición inmunogénica en un paciente que lo necesite. Dicho ácido nucleico o composición inmunogénica se administra en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el paciente.

El tumor puede ser cualquier proliferación no deseada de células, en particular un tumor benigno o un tumor maligno, especialmente un cáncer.

El cáncer puede estar en cualquier etapa de desarrollo, incluida la etapa metastásica. El cáncer puede ser crónico o no crónico (agudo).

En una realización concreta, el tumor es un cáncer sólido o un carcinoma. Los ejemplos incluyen melanoma, tumor cerebral tal como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoma y carcinomas de vejiga, mama, cuello uterino, colon, pulmón, especialmente cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), páncreas, próstata, cáncer de cabeza y cuello, o cáncer de estómago.

En otra realización, el tumor puede ser un tumor líquido, p. ej. un tumor hematopoyético o leucemia, tal como una leucemia linfocítica crónica o aguda, leucemia mieloide crónica o aguda, linfoma que incluye enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, mieloma maligno.

En una realización concreta, el tratamiento según la invención se puede combinar con terapia convencional, que incluye quimioterapia, radioterapia o cirugía. También podrían ser útiles las combinaciones con moléculas inmunomoduladoras coadyuvantes tales como GM-CSF o una citocina tal como IL-2 o IL-12.

Las Figuras y Ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.

Ejemplo I

Abreviaturas

AA: Aminoácido, APC: Célula Presentadora de Antígeno, pb: Par de bases, CTL: Linfocito T citotóxico, CMV:

Citomegalovirus ADN Ácido desoxirribonucleico, EP: Electroporación, HTLV-1: Virus linfotrópico T humano tipo I, HTERT: transcriptasa inversa de la telomerasa humana, ID: Intradérmica, IM: Intramuscular, IV: Intravenosa, LTR:

Repeticiones Terminales Largas, NoLS: Secuencia de Localización Nucleolar, PBMC: Células Mononucleares de Sangre Periférica, RIG-I: Gen 1 inducible por Ácido Retinoico, ARN Ácido ribonucleico, RT: Temperatura ambiente, RTA: Actividad Relativa de Telomerasa, SC: Subcutánea, TRAP: Protocolo de Amplificación de Repetición Telomérica, TERT: Transcriptasa inversa de la telomerasa, Ubi: Ubiquitina VDD: Valina-Ácido Aspártico-Ácido Aspártico.

Materiales y Métodos

Vectores de ADN plasmídico

INVAC-1

INVAC-1 es un vector de expresión plasmídico de 7120 pb que codifica una construcción de fusión de ubiquitinatelomerasa humana de 1158 AA (Ubi-hTERT) correspondiente a una proteína de aproximadamente 127,4 kDa (Figuras 1A y 16). Puesto que se pretende que INVAC-1 sea utilizado en seres humanos, la actividad enzimática de la transcriptasa inversa de la telomerasa se ha desactivado por razones de seguridad. De hecho, la secuencia TERT humana codificada por INVAC-1 se modificó en el sitio catalítico mediante una deleción de 9 pb que codifica tres aminoácidos valina-ácido aspártico-ácido aspártico (867-869 AA), abreviado a VDD en el código de una letra (Figura 2A). Además, la porción N-terminal de 47 AA de la proteína, que incluye la secuencia de localización nucleolar (NoLS) requerida para la localización subcelular de telomerasa (Yang, 2002), fue reemplazada por la secuencia codificante de ubiquitina (Ubi) (1-76 AA).

El transgén Ubi-hTERT se inserta en un esqueleto de vector validado por NTC (Nature Technology Corporation, Lincoln, Nebraska) que combina genes sintéticos cuidadosamente diseñados para una producción bacteriana de alto rendimiento, una mayor expresión en células de mamíferos y, en consecuencia, respuestas inmunitarias eficaces.

La expresión del gen diana es impulsada por un intrón-promotor quimérico optimizado (intrón sintético SV40-CMV-HTLV-1 R) compuesto por un promotor CMV y el inicio del exón 1, una secuencia HTLV-I R que contiene el sitio aceptor de empalme 5', un sitio aceptor 3' sintético basado en el intrón de p-globina de conejo, un potenciador de empalme del exón 2 que comprende un sitio de unión a proteína rica en serina-arginina (SR) para mejorar la exportación de ARN (Lavigueur et al., 1993) y una secuencia de Kozak del exón 2 aguas arriba del codón de inicio para el gen de interés. El ADN entre el codón de parada y el terminador está limitado para reducir la posibilidad de expresión de péptidos crípticos o alteración de la expresión mediada por microARN no deseada.

Para mejorar las respuestas inmunitarias celulares, el vector codifica un agonista de ARN de doble hebra transcrito con ARN polimerasa III del activador de respuesta inmunitaria innata del gen-1 (RIG-I) inducible por ácido retinoico.

No se conoce ninguna característica de virulencia asociada con este vector. El plásmido no se replica en las células diana eucarióticas. El propio esqueleto vector no contiene secuencias codificantes de proteínas y no se han identificado marcos de lectura abiertos que codifiquen proteínas alternativas en el esqueleto del vector, por lo tanto, no hay un gen de resistencia a antibióticos. La selección de plásmidos se realiza por medio de un marcador seleccionable de sacarosa libre de antibióticos (RNA-OUT).

Síntesis y clonación de genes

El gen Ubi-hTERT fue sintetizado de novo a través de un procedimiento de ensamblaje de oligonucleótidos de 40 unidades solapantes (GeneCust, Luxemburgo). Se realizaron varios cambios de bases conservativos para eliminar los sitios de restricción y atenuar las secuencias ricas en GC. El inserto se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) utilizando sitios de clonación HindIII-XbaI y se verificó mediante secuenciación.

Subclonación del inserto Ubi-hTERT en el vector de clonación NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI

El inserto de ubiquitina-telomerasa se clonó en el vector de expresión NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI diseñado mediante NTC. Sin embargo, su mejor vector apropiado NTC8685-eRNA41 H (ref. NTC-DV8685-41HLV) no tenía sitios de restricción compatibles con el inserto Ubi-hTERT. Por consiguiente, este vector se digirió con Sail y BglII y se ligó a un oligonucleótido sintético de doble hebra que incluye sitios de restricción apropiados para subclonar UbihTERT, es decir, HindIII-XbaI:

Salí HindIII Smal Xbal BglII

GTCGACAAGCTTCCCGGGTCTAGAAGATCT (SEQ ID NO: 23)

Este nuevo vector (NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI) que ahora incluye el policonector anterior se verificó mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación utilizando cebadores pVAC5' (GCTTTTCTGCCAGGTGCTGA SEQ ID NO: 24) y pVAC3' (GCCAGAAGTCAGATGCTCAA SEQ ID NO: 25) que se reasocian con secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio policonector respectivamente.

El vector NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI hecho a medida se digirió con HindIII y XbaI y el vector de 3631 pb se purificó en gel a partir del conector de 12 pb. La construcción pcDNA3.1-Ubi-hTERT se digirió con HindIII y XbaI y el inserto Ubi-hTERT de 3489 pb se transfirió mediante ligadura en el aceptor NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI para crear NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT (INVAC-1) (Figura 1A). El producto de ligación se transformó en el anfitrión de selección libre de antibióticos NTC4862 (DH5a attA::P5/66/6-RNA-IN- SacB, catR) (ref. NTC-DVU-CC1). El vector resultante se verificó mediante digestión con enzimas de restricción (Figura 1B): BglII/NotI = 3496, 3262, 220, bandas de 142 pb; NcoI = 4084, bandas de 3036 pb; HindIII/XbaI = 3631, bandas de 3489 pb, y los términos del inserto Ubi-hTERT se verificó mediante secuenciación de ADN con cebadores pVAC5' y pVAC3'. No se identificó ninguna alteración de nucleótidos.

Producción de plásmidos

INVAC-1 fue producido por primera vez por NTC en condiciones de calidad de grado de investigación. El ADN plasmídico se transformó en células E. coli NTC4862 utilizando electroporación. Las células se colocaron en placas y se propagaron en medios con sacarosa al 6% según lo recomendado por el fabricante (Manual de Instrucciones de NTC, junio de 2011). Después de la extracción, el ADN plasmídico se resuspendió en PBS 1X sin endotoxina a una concentración final de 2 mg/ml.

Posteriormente, INVAC-1 fue fabricado por Eurogentec (Bélgica) para el aumento a escala de GLP y GMP, y la producción de GMP. La secuenciación completa del plásmido INVAC-1 se llevó a cabo en este punto.

Derivados de INVAC-1

Todas las construcciones derivadas de INVAC-1 son plásmidos de ADN de doble hebra de aproximadamente 8,9 kb que codifican proteínas de fusión de ubiquitina-telomerasa humanas que son enzimáticamente inactivas (Figura 2A). Los transgenes Ubi-hTERT se insertaron en el vector pcDNA3.1(+) (5,4 kb) de Invitrogen derivado de pcDNA3.0 que fue diseñado para un alto nivel de expresiones transitorias y estables en células de mamífero. Este vector contiene el promotor de citomegalovirus humano inmediato-temprano (CMV-IE) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BHG-poliA) como secuencia de terminación.

püTDIüNot (abreviado como AlüNot)

La secuencia codificante de hTERT se encuentra entre el nucleótido 923 y 4492 pb de la cadena principal del plásmido pcDNA3.1. pUTD10Not codifica una proteína de fusión de ubiquitina-telomerasa humana de 1189 AA (A10Not) correspondiente a aproximadamente 130,8 kDa de peso molecular (Figura 2A). Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). En el dominio del sitio catalítico, se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 912-913 (marca *; Figura 17), correspondiente a AA 860-869 (DGLLLRLVDD_ SEQ ID NO: 21) de hTERT de tipo salvaje (número de acceso NM_198253). Esta deleción de 10 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática de hTERT y la eliminación de 7 AA adicionales aguas arriba de la secuencia VDD. Catorce aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5 (Figura 2A). püTDIüCog (abreviado como AlüCog)

La secuencia codificante de hTERT se encuentra entre el nucleótido 923 y 4492 pb de la cadena principal del plásmido pcDNA3.1. pUTD10Cog codifica una proteína de fusión de ubiquitina-telomerasa humana de 1189 AA (A10Cog) correspondiente a aproximadamente 130,8 kDa de peso molecular (Figura 2A). Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). En el dominio del sitio catalítico, se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 919-920 (marca *; Figura 18), correspondiente a AA 867-876 (VDDFLLVTPH_ SEQ ID NO: 22) de hTERT de tipo salvaje (número de acceso NM_198253). Esta deleción de 10 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática de hTERT y la deleción de 7 AA adicionales aguas abajo de la secuencia VDD. Catorce aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican para la etiqueta epitópica V5 (Figura 2A).

püTD23Tyn (abreviado como A23)

La secuencia codificante de hTERT se encuentra entre el nucleótido 923 y 4453 pb de la cadena principal del plásmido pcDNA3.1. pUTD23Tyn codifica una proteína de fusión ubiquitina-telomerasa humana de 1176 AA (A23) correspondiente a aproximadamente 129,4 kDa de peso molecular (Figura 2A). Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). En el dominio del sitio catalítico, se introdujo una deleción adicional entre los aminoácidos 909-910 (marca *; Figura 19), correspondiente a AA 857-879 (IRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTH_ SEQ ID NO: 26) de hTERT de tipo salvaje (número de acceso NM_198253). Esta deleción de 23 aminoácidos incluye la deleción de 3 AA (AVDD) que da como resultado la inactivación de la actividad enzimática hTERT y la deleción de 10 AA adicionales aguas arriba y 10 AA aguas abajo de la secuencia VDD. Catorce aminoácidos en la secuencia C-terminal de Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5 (Figura 2A).

Síntesis y clonación de genes

Los genes se sintetizaron de novo como construcciones de fusión de ubiquitina-telomerasa a través de un procedimiento o de ensamblaje de oligonucleótidos de 40 unidades solapantes (GeneCust, Luxemburgo). La síntesis génica incluyó sitios de restricción flanqueantes únicos HindIII/XbaI para permitir la subclonación del gen en el sistema de expresión deseado. Los genes sintetizados se clonaron entre los sitios de restricción HindIII y XbaI del vector de expresión pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Las secuencias de los plásmidos se verificaron mediante secuenciación utilizando cebadores PEGFP-N5' CGGTGGGAGGTCTATATAAG (SEQ ID NO: 27) y BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC (SEQ ID NO: 28).

Producción de plásmidos

Todos los derivados de INVAC-1 fueron transformados y producidos en células E. coli 5-alfa (fhuA2A (argF-lacZ) U169 phoA glnV44 080 A (lacZ) M15 gyrA96 recA1 re1A1 endA1 thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, EE.UU., ref. 60602-2) por RD Biotech (Besangon, Francia). Se prepararon provisiones de partida concentradas de plásmido gigaprep sin endotoxina (2 mg/ml) resuspendidas en 1X PBS estéril. Los vectores se verificaron mediante mapeo de restricción (HindIII-XbaI; Figura 2B).

pTRIP-OMV-hTERT

pTRIP-CMV-hTERT codifica la proteína TERT humana (hTERT) de tipo salvaje 1132 AA (correspondiente a aproximadamente 124,5 kDa) con actividad catalítica. Este plásmido se utilizó como control positivo para ensayos in vitro. La construcción se describió por primera vez en la solicitud de patente WO 2007/014740. El pTRIP-CMV-hTERT se construyó subclonando primero un inserto de hTERT EcoRI-SalI derivado del plásmido pBABE-hygrohTERT (amablemente proporcionado por el Dr. Robert Weinberg) en el vector pSP73 (Promega Life Science, Wisconsin, EE.UU.) para generar la construcción pSPhTERT. A continuación se insertó un fragmento BglN-SalI en el vector derivado de retrovirus pTRIP-CMV cortado con BamHI y XhoI para crear pTRIP-CMV-hTERT. La expresión de hTERT es impulsada por el promotor de citomegalovirus humano (CMV).

El plásmido pTRIP-CMV-hTERT fue transformado y producido en células E. coli 5-alfa (fhuA2A (argF-lacZ) U169 phoA glnV44080 A (lacZ) M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, EE.UU., ref. 60602-2) por RD Biotech (Besangon, Francia).

Se preparó una provisión de partida concentrada de plásmido gigaprep libre de endotoxina de 2 mg/ml resuspendida en 1X PBS estéril. El vector producido se verificó por digestión con enzimas de restricción (EcoRI BamHI = bandas de 10286 2720 886 pb).

pNTC-hTERT

pNTC-hTERT codifica la proteína TERT humana de tipo salvaje 1132 AA (hTERT) con actividad catalítica (SEQ ID NO: 2). Este plásmido se utilizó para investigar la amplitud de las respuestas de células T específicas para hTERT in vivo en comparación con la construcción INVAC-1.

El inserto hTERT de tipo salvaje se sintetizó de novo con sitios de clonación HindIII-XbaI a través de un procedimiento de ensamblaje de oligonucleótidos solapantes (GenScript, EE.UU.). La construcción sintética (3417 pb) se clonó en pUC57 (2710 pb) mediante sitios HindIII y XbaI y a continuación se verificó mediante secuenciación utilizando cebadores M13/pUC (-20) y M13/pUC (-26) y mapeo de restricción (HindIII/XbaI). En consecuencia, el inserto hTERT se subclonó mediante NTC en el vector de clonación NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI como se describió anteriormente (véase la construcción INVAC-1). El vector resultante pNTC-hTERT se verificó mediante digestión con enzimas de restricción (XmaI = bandas de 4375, 2041, 506, 120 pb; BamHI/XmnI = bandas de 6887, 155 pb; HindIII/XbaI = bandas de 3631, 3411 pb) y secuenciación de ADN utilizando cebadores pVAC5', pVAC3' y hTERTseq (5' GGCAAGTCCTACGTCCAGTG 3', SEQ ID NO: 44).

El plásmido pNTC-hTERT fue producido por NTC en condiciones de calidad de grado de investigación como se describió anteriormente para el plásmido INVAC-1.

pNTC-hTERT-AVÜÜ

pNTC-hTERT-AVDD codifica la secuencia de TERT humana de 1129 AA (hTERT) modificada en el sitio catalítico mediante una deleción de 9 pb que codifica Valina - Ácido Aspártico - Ácido Aspártico (AVDD; 867-869 AA). Este plásmido se utilizó para investigar la amplitud de las respuestas de células T específicas para hTERT in vivo en comparación con la construcción INVAC-1.

La secuencia de ADN de hTERT-AVDD es idéntica a la hTERT de tipo salvaje, excepto por una deleción de 3 aminoácidos (AVDD). Se sintetizó un inserto de ADN de 167 pb que incluye el fragmento BamHI/XmnI de 152 pb de hTERT, pero con la deleción AVDD y sitios de restricción EcoRV adicionales de novo mediante GenScript. Este fragmento sintético se clonó en el vector pUC57 (2710 pb) utilizando sitios de clonación EcoRV. El gen sintetizado se verificó mediante secuenciación utilizando cebadores M13/pUC (-20) y M13/pUC (-26) y productos de la digestión con enzimas de restricción (BamHI/NdeI). Este vector se digirió a continuación utilizando sitios BamHI/XmnI y el fragmento AVDD-BamHI/XmnI se clonó en la región hTERT predigerida con BamHI/XmnI del vector pNTC-hTERT (bandas de 6887, 155 pb). El vector resultante pNTC-hTERT-AVDD se verificó mediante digestión con enzimas de restricción (XmaI = bandas de 4375, 2032, 506, 120 pb; BamHI/XmnI = bandas de 6887, 146 pb; HindIII/XbaI = bandas de 3631, 3402 pb) y secuenciación de ADN utilizando cebadores pVAC5', pVAC3' y hTERTseq (5' GGCAAGTCCTACGTCCAGTG 3' SEQ ID NO: 44).

pNTC-hTERT-AVDD fue producido por NTC como se describió anteriormente para las construcciones de INVAC-1 y pNTC-hTERT.

Cultivos celulares y transfeooiones transitorias para ensayos de transferencia Western y TRAP

Se cultivaron líneas celulares CrFK (riñón felino de Crandell Rees), HEK293T (riñón embrionario humano) y HeLa (adenocarcinoma cervical humano de Henrietta Lacks) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (PAA, Velizy-Villacoublay, Francia) y penicilina/estreptomicina al 1% (Life Technologies, Saint-Aubin, Francia).

La línea celular QT6 (fibrosarcoma japonés de codorniz) se cultivó en F10 de Ham (Eurobio, Courtaboeuf, Francia) con un suplemento de suero de ternera fetal inactivado por calor (PAA) al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% (Life Technologies), suero de pollo al 1% (PAA), L-glutamina 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.), caldo de triptosa al 0,5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.).

Las células se cultivaron como monocapas en matraces de 75 cm2 a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. Las células se cultivaron hasta 70-80% de confluencia el día de la transfección. Para ensayos de transferencia Western, se sembraron 5x105 células en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se incubaron durante 24 h. Para los ensayos TRAP, se sembraron 7x105 células en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se incubaron durante 24 h.

Las construcciones de INVAC-1 y derivadas de INVAC-1 se transfectaron en células diana utilizando el reactivo de transfección de polímero catiónico jetPrime de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Polyplus-transfection Inc., Francia). Las células transfectadas con el plásmido pTRIP-CMV-hTERT se utilizaron como control positivo y las células no transfectadas o las células transfectadas con plásmido vacío pNTC8685-eRNA41 H como control negativo. Los medios de transfección se eliminaron 4 horas más tarde y se reemplazaron por 2 ml de medio de cultivo DMEM. Después del tiempo apropiado de transfección: 18-96 horas para los ensayos de transferencia Western y 24 horas para los ensayos TRAP, las células se recolectaron y analizaron para determinar la expresión y actividad de la telomerasa.

Transferencia Western

Para los análisis de transferencia Western, se lisaron células CrFK y HEK293T transfectadas sobre hielo durante 10­ 20 minutos en tampón RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) con un suplemento de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostic, Indianápolis, EE.UU.). Los productos lisados se aclararon por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recogieron los sobrenadantes y se midió la concentración de proteína utilizando el ensayo colorimétrico de Bradford. Las muestras de proteínas se desnaturalizaron 5 minutos a 95°C, se separaron en geles Bis-Tris al 4-12% de Nu-PAGE® Novex (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y se electrotransfirieron sobre membranas de PVDF (pila de transferencia iBlot®, Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) utilizando el dispositivo iBlot® (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Para determinar el peso molecular se utilizaron Protein Ladder Novex® Sharp Prestained Ladder (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Las membranas se cortaron aproximadamente a 60 kDa y se bloquearon con 1X PBS, Tween®20 al 0,05%, leche al 3%. La parte superior de la membrana se sondeó con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-hTERT (Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluido a 1/2000 en tampón de bloqueo o un anticuerpo monoclonal de ratón anti-V5 (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) diluido a 1/5000. La parte inferior de la membrana se sondeó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina (Sigma Aldrich SARL, Saint-Quentin Fallavier, Francia) diluido a 1/5000. Finalmente, las proteínas relevantes se visualizaron mediante tinción con el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) secundario apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente - anti-anticuerpo de ratón ligado a HRP (GE Healthcare, Vélizy, Francia) diluido a 1/5000 o anti-anticuerpo de conejo ligado a HRP (Cell Signaling, Danvers, EE.UU.) diluido a 1/1000 en tampón de bloqueo. Las señales de inmunotransferencia se detectaron mediante un ensayo de quimioluminiscencia mejorado utilizando el kit de reactivo de sustrato quimioluminiscente HRP ECL. Las películas y el casete correspondiente se adquirieron a GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido).

Ensayo TRAP

La actividad de la telomerasa se evaluó mediante el enfoque del Protocolo de Amplificación de Repetición Telomérica (TRAP) (Kim et al. 1994) utilizando el kit TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS (Roche Diagnostic GmbH Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección como se describió anteriormente, se cosecharon células CrFK. Las células se lavaron con 1X PBS, seguido de centrifugación a 1.600 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las células se resuspendieron en 0,2 ml de tampón de lisis y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Los productos lisados se aclararon por centrifugación a 14.000 rpm, 20 min a 4-8°C. Se recogieron los sobrenadantes y se midió la concentración de proteína utilizando el ensayo colorimétrico de Bradford. Los sobrenadantes se utilizaron para la elongación mediada por telomerasa de secuencias teloméricas y los productos se amplificaron por PCR utilizando cebadores biotinilados. Cada sobrenadante celular se dividió previamente en dos partes alícuotas antes de realizar el ensayo: una se utilizó para preparar un control negativo por inactivación por calor de la telomerasa durante 10 minutos a 85°C, la otra se utilizó para evaluar la elongación mediada por telomerasa de secuencias teloméricas. Además, se amplificó simultáneamente un patrón interno de 216 pb de longitud, presente en la mezcla de reacción, para excluir resultados falsos negativos debido a los inhibidores de la ADN-polimerasa Taq que pudieran estar presentes en los lisados. Se utilizó tampón de lisis como control negativo. Todas las mezclas de reacción se incubaron 20 minutos a 25°C y a continuación 5 minutos a 94°C. Los productos de telomerasa se amplificaron en 30 ciclos de PCR: 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, 72°C durante 90 segundos, terminaron en 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos y se mantuvieron a 4°C.

Se incubaron 2,5 pL de productos de amplificación por PCR durante 10 minutos a rt con el reactivo de desnaturalización proporcionado en el kit. Después de la incubación, se añadieron 100 pL de tampón de hibridación por pocillo. Cada solución se mezcló y se transfirieron 100 pL a una microplaca previamente recubierta con estreptavidina y se incubaron durante 2 horas a 37°C con agitación suave (300 rpm). A continuación, los pocillos se lavaron con un tampón de lavado y se incubaron con un anticuerpo ligado a peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-digoxigenina (1/50) durante 30 minutos a rt. El sustrato de HRP (TMB) se añadió a continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente para la medición colorimétrica. La reacción se detuvo con el reactivo de parada de ELISA.

El nivel de actividad de telomerasa en cada muestra se determinó comparando la señal de la muestra con la señal obtenida utilizando una cantidad conocida de molde de control positivo (ADN molde con la misma secuencia que un producto de telomerasa con ocho repeticiones teloméricas). Los valores de absorbancia fueron referidos mediante la lectura de A450 frente a blanco (longitud de onda de referencia A690 nm). La actividad relativa de la telomerasa (RTA) se obtuvo utilizando la siguiente fórmula:

RTA = [(As-As0)]/As,is]/[(Ats8-Ats8,0)/Ats8,is] x 100

dónde:

As es la absorbancia de la muestra,

As0, absorbancia de la muestra tratada térmicamente,

As,is, absorbancia del patrón interno (IS) de la muestra,

Ats8, absorbancia del molde de control (TS8),

A^ts8,0, absorbancia del tampón de lisis,

A^ts8,^is, absorbancia del patrón interno (IS) del molde de control (TS8).

inmunofluoresoenoia

Se sembraron células CrFK, HEK293T, HeLa y QT6 en portaobjetos de cámara Lab-Tek® de 8 pocillos (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) a 2x104 células/pocillo en 200 pL de medio de cultivo y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de CO2. Al día siguiente, se desechó el medio de cultivo y se añadieron 200 pl de medio de nueva aportación. Se añadieron 10 pL de una solución de mezcla que contenía 0,2 pg de INVAC-1, pTRIP-CMV-hTERT o el plásmido de control vacío pNTC8685-eRNA41H y 0,5 pL de Fugene HD (Promega France, Charbonnieres-lesbains, France) en OptiMEM (Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) a la cámara correspondiente. Se utilizaron 2x104 células no tratadas por cámara como control negativo. Los portaobjetos de cámara se incubaron durante 24 y 48 horas a 37°C, 5% de CO2. Las células transfectadas se lavaron cuidadosamente con 1X PBS y se añadieron 200 pL de PFA al 2% a cada pocillo durante 10 minutos a 4°C para fijar y permeabilizar las células. A continuación, los pocillos se lavaron dos veces con 1X PBS con Tween®20 al 0,05% y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 200 pL de solución de bloqueo (Triton X100 al 0,5%; Sigma-Aldrich, BSA al 3%; Sigma-Aldrich, suero de cabra al 10%; Invitrogen, en 1X PBS con Tween®20 al 0,05%). El anticuerpo monoclonal de conejo anti-hTERT primario (Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluido a 1/100 en tampón de bloqueo se aplicó sobre las células durante 1,5 horas a temperatura ambiente bajo agitación. Después de tres lavados en 1X PBS con Tween®20 al 0,05%, se aplicó un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo-Alexa Fluor 488® (Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) diluido en solución de bloqueo (1/500) durante 45 minutos a temperatura ambiente bajo agitación. Los pocillos se lavaron tres veces con 1X PBS con Tween®20 al 0,05% y se montaron en medio de montaje VECTASHIELD® que contenía DAPI (Vector Laboratories, Cambridgeshire, Reino Unido). Los cubreobjetos se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia (Axio Observer Z1, Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena, Alemania) equipado con un sistema de procesamiento y análisis de imágenes (Axiovision, Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena, Alemania).

Ratones

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (6-8 semanas de edad) de los laboratorios Janvier (Saint-Berthevin, Francia).

Se utilizaron dos cepas de ratones transgénicos: HLA-B*0702 y HLA-A2/DR1.

Los ratones transgénicos para HLA-B*0702 expresan los dominios a1-a2 de HLA-B*0702 humano de la molécula y el dominio a3 murino de la molécula H2D. Estos ratones no expresan las moléculas H2-Db y H2-Kb (Rohrlich et al., 2003).

Los ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 expresan los dominios a1-a2 de HLA-A*0201 humano, el dominio a3 murino de la molécula H2D y la p2-microglobulina humana. Por otra parte, estos ratones transgénicos expresan las moléculas HLA-DRB1*0101 y H^lA-DRA*0101 humanas. Estos tienen los genes H2-Db, H2-Kb e IAb murinos inactivados (Pajot et al., 2004).

Ambas cepas de ratones transgénicos se utilizaron entre las 6 y las 10 semanas de edad y fueron suministradas por el Instituto Pasteur de París. Los animales fueron alojados en la instalación de animales libres de patógenos específicos del Instituto Pasteur (Animal Facilities Lwoff núm. 22, número de acuerdo B 75 15-07). Antes de las inmunizaciones intradérmicas (ID), intramusculares (IM) o subcutáneas (SC) o la inyección intravenosa (IV), los ratones se anestesiaron con una solución mixta de xilacina al 2% (Rompun, Bayer Santé, Loos, Francia) y ketamina al 8% (Imalgen 1000, Merial, Lyon, Francia) en 1X solución salina tamponada con fosfato (1X PBS, Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) a través de la ruta intraperitoneal (IP) según el peso individual del animal y la duración de la anestesia. Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con la buena práctica animal y cumplieron con la experimentación local con animales (Directiva 2010/63/UE).

Péptidos hTERT

Los péptidos de hTERT restringidos a HLA-B*0702, HLA-A*0201 o HLA-DR se describieron previamente (véanse las referencias en la Tabla 1). Los péptidos de hTERT restringidos a H2-Db y H2-Kb fueron determinados mediante predicción de epítopos in silico para unir moléculas de MHC de clase I de ratón utilizando cuatro algoritmos disponibles en línea: Syfpeithi (http://www.syfpeithi.de/), Bimas (http://www-bimas.cit.nih.gov/), NetMHCpan y SMM (http://tools.immuneepitope.org/main/). Todos los péptidos sintéticos se adquirieron liofilizados (>90% de pureza) de Proimmune (Oxford, Reino Unido). Los péptidos liofilizados se disolvieron en agua estéril a 2 mg/ml y se almacenaron a -20°C antes de su uso. Los detalles de las secuencias peptídicas y la restricción de MHC se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: péptidos de hTERT y restricción de MHC

Biblioteca de péptidos de hTERT

Los péptidos de hTERT liofilizados (pureza >70%) se adquirieron de GenScript (EE.UU.). Este conjunto está compuesto por 269 péptidos de 15 AA con solapamiento de 11 AA y recuperación de la secuencia proteica completa de hTERT de INVAC-1. Cada péptido se resuspendió en agua destilada a 2 mg/ml antes de su uso de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y se mantuvo congelado a -20°C antes de su uso. Se utilizaron veintisiete reservas de 9-10 péptidos solapantes de hTERT (Tabla 2) para escrutar la amplitud de la respuesta de células T específicas para hTERT en un ensayo ELISPOT con IFNy.

Tabla 2: Reservas de péptidos solapantes de hTERT

Línea celular tumoral

La línea celular tumoral Sarc-2 utilizada para evaluar el efecto antitumoral mediado por INVAC-1 se obtuvo de un fibrosarcoma espontáneo de un ratón HLA-A2/DR3. La masa tumoral se disoció en condiciones estériles y se generó una suspensión celular primaria. Se demostró que la línea celular expresaba la molécula HLA-A*0201. Las células se cultivaron en medio RPMI glutamax (Life Technologies) con un suplemento de FBS al 10% (Life Technologies) y penicilina/estreptomicina al 1%.

Inmunización de ratón y procedimiento de electroporación in vivo

La inmunización intradérmica (ID) se realizó en la parte inferior del flanco del ratón con jeringas de insulina y agujas específicas (U-100, 29GX1/2"-0,33x12 mm, Terumo, Bélgica) después del afeitado. No se observó eritema después del afeitado, durante y después de los procedimientos de inmunización. Se realizó inmunización intramuscular (IM) en el músculo tibialis cranealis anterior, utilizando también jeringas de insulina y agujas específicas U-100. La inmunización subcutánea (SC) se realizó en la base de la cola, también con jeringas de insulina y agujas específicas U-100. Cada animal recibió una inyección de plásmido de cebado IM, ID o SC (INVAC-1, NTC, pUTD10Not, pUTD10Cog o pUTD23Tyn) correspondiente a 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 o 1200 pg de ADN o 1X PBS, dependiendo del experimento. Según el régimen de vacunación, los ratones podrían recibir una segunda o tercera inyección similar de ADN o 1X PBS.

La electroporación de ADN in vivo se realizó utilizando el sistema y el soporte lógico de electroporación CLINIPORATOR® 2 (IGEA, Italia) equipado con electrodos de placa (P-30-8G, IGEA). Inmediatamente después de la vacunación ID o SC, se realizó un pliegue de la piel en el sitio de inyección, completamente cubierto con gel conductor (Labo FH, gel de contacto azul, NM Médical, Francia) y se colocó entre los electrodos de la placa. Se aplicaron dos pulsos de diferentes voltajes (HV-LV): HV: 1250 V/cm, 1 Hz, 100 ps; 1 pulso, 1000 ms de descanso; LV: 180 V/cm, 1 Hz, 400 ms, 1 pulso. Directamente después de la inyección IM, cada músculo se cubrió por completo con gel conductor y se colocó entre los electrodos de la placa. Se aplicaron dos pulsos de diferentes voltajes (HV-LV): HV: 750 V/cm, 1 Hz, 100 ps; 1 pulso, 1000 ms de descanso; LV: 100 V/cm, 1 Hz, 400 ms, 1 pulso. En ciertos experimentos, 18 horas antes de la vacunación de ADN o concomitantemente a la administración de INVAC-1, se inyectaron a los ratones ID 0,5 pg de GM-CSF murino o 1 ng de IL-12 murina en un volumen final de 25 pl/flanco. Ambas citocinas se adquirieron compraron de Miltenyi (Alemania).

Ensayo ELispot

Se tomaron bazos de ratones inmunizados y se machacaron, y las suspensiones celulares se filtraron a través de una malla de nailon de 70 mm (Cell Strainer, BD Biosciences, Francia) para aislar los esplenocitos. La sangre de ratones inmunizados se recogió mediante punción retroorbital bajo anestesia para aislar células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC). Los esplenocitos o PBMC se purificaron utilizando Ficoll (medio de separación de linfocitos, Eurobio, Francia). Los linfocitos purificados con Ficoll de sangre o bazo se numeraron utilizando el contador Cellometer® Auto T4 Plus (Ozyme, Francia).

Las microplacas de PVDF ELIspot (kit IFN^y Elispot, Diaclone, Abcyss, Francia, ref. 862.031.010P) se recubrieron durante la noche con anticuerpo de captura (anti-IFN-Y de ratón) y se bloquearon con 1X PBS-leche al 2%. Se añadieron suspensiones celulares a las placas por triplicado a 2 x 105 células/pocillo y se estimularon con 5 pg/ml de péptidos derivados de hTERT restringidos para HLA o H2 con medio de cultivo sin suero o con PMA-ionomicina (respectivamente 0,1 pM y 1 pM). Después de 19 horas, se revelaron manchas con el anticuerpo de detección conjugado con biotina seguido de estreptavidina-AP y solución de sustrato BCIP/NBT. Las manchas se contaron utilizando el contador y el soporte lógico Immunospot ELIspot (CTL, Alemania). Cuando se analizan los datos de ELIspot, un animal vacunado se considera un respondedor si la frecuencia de las manchas, correspondiente a las células T CD8 o CD4 específicas para hTERT, es superior al valor de corte de 10 manchas.

Ensayo de citotoxicidad in vivo

Para la preparación de las células diana, los esplenocitos de ratones HLA-B7 no sometidos a tratamiento previo se marcaron con una solución de PBS 1X que contenía concentraciones altas (5 pM), medias (1 pM) o bajas (0,2 pM) de CFSE (kit trazador de células CFDA-SE Vybrant); Life Technologies, Saint-Aubin, Francia). Los esplenocitos no sometidos a tratamiento previo marcados con CFSE 5 y 1 pM se pulsaron respectivamente con 2 péptidos HLA-B7 diferentes, 1123 y 351 a 5 pg/ml durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los esplenocitos de baja marca de CFSE se dejaron sin pulsar. Cada ratón previamente vacunado con INVAC-1 o 1X PBS recibió, el día 14 después del cebado o el día 10 después de la inyección de refuerzo, 107 células marcadas con CFSE de una mezcla que contenía un número igual de células de cada fracción a través de la vena retroorbital. Después de 15-18 horas, las suspensiones unicelulares de bazos se analizaron por citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo MACSQUANT® (Miltenyi, Alemania).

La desaparición de las células pulsadas con péptidos se determinó comparando la proporción de poblaciones pulsadas (intensidad de fluorescencia de CFSE alta/media) con las no pulsadas (intensidad de fluorescencia de CFSE baja) en ratones inmunizados con INVAC-1 frente ratones de control (1X PBS). El porcentaje de destrucción específica por animal de prueba se estableció de acuerdo con la siguiente fórmula:

[1 -[media (CFSEbajaPBS/CFSEalta/mediaPBS)/(CFSEbajapDNA/CFSEalta/mediapDNA)]] X 100.

Ensayo de unión a oitoeinas (CBA)

Se cultivaron 24 h a 37°C esplenocitos (6x105 células) de ratones HLA-A2/DR1 vacunados con péptidos derivados de hTERT restringidos para HLA-DR (578, 904 y 1029) a 5 gg/ml. Los sobrenadantes del cultivo de citocinas se recuperaron y se mantuvieron congelados a -20°C hasta la prueba. Se utilizó un kit comercialmente disponible, el kit Cytometric Beads Array para Th1/Th2/Th17 de ratón (CBA, BD biosciences) para cuantificar, respectivamente, la concentración de IL-2, IFNy, TNFa, IL-4, IL-6, IL-17a e IL-10. El inmunoensayo CBA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La adquisición de citometría de flujo se realizó utilizando el citómetro de flujo FACScan LSRII (BD Biosciences); los análisis se realizaron con el soporte lógico FCAP Array TM versión 3.0 (BD Biosciences).

Efecto antitumoral in vivo

Para los experimentos de vacunación terapéutica, a ratones HLA-A2/DR1 de 24 semanas se les injertaron subcutáneamente 2104 células Sarc-2 en el flanco abdominal derecho. A continuación, los animales se inmunizaron con vacunas de ADN vía ruta ID seguido de electroporación como se describió anteriormente los días 4, 21 y 35 después del injerto. Cada 2 a 3 días, se realizó el seguimiento del crecimiento tumoral utilizando un calibre. El peso del ratón también se controló cada 2 a 3 días. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 2000 mm3. Se siguieron las pautas para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer, especialmente para el seguimiento de los signos clínicos que requerían una intervención inmediata (Workman et al. 2010, BJC). El volumen tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula: (L*12)/2. Los resultados se expresan en mm3 (L = longitud; l = anchura).

Para la vacunación profiláctica, los ratones HLA-A2/DR1 de 5-10 semanas de edad se vacunaron dos veces (días 0 y 21) como se describió anteriormente. Treinta y dos días después de la última inmunización, a los animales se les injertaron subcutáneamente 5104 células Sarc-2. Se realizó el seguimiento del peso de los ratones y el crecimiento tumoral cada 2 a 3 días como se describió anteriormente. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron los 2000 mm3.

El criterio de retraso del crecimiento tumoral (TGD) se utilizó para evaluar la eficacia de la vacuna. Este compara el tiempo para alcanzar un volumen tumoral definido (500 mm3) en grupos de control y tratados.

Análisis estadístico y manejo de datos.

El soporte lógico Prism-5 se utilizó para el manejo de datos, el análisis y las representaciones gráficas. Los datos se representan como la media ± desviación típica o como la mediana. Los análisis estadísticos de los ensayos ELISpot se realizaron utilizando un análisis no paramétrico de Mann Whitney y/o Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. La significación se estableció en el valor p <0,05.

Resultados

Caracterización y análisis de secuencia del ADN plasmídico de INVAC-1

El transgén Ubi-hTERT se insertó con éxito en pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI como se muestra mediante mapeo de restricción utilizando diversas endonucleasas de restricción (Figuras 1A y 1B). El vector resultante pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT (INVAC-1) también fue secuenciado parcialmente en las uniones utilizando cebadores pVAC5' y pVAC3'. Las secuencias confirmaron que el procedimiento de clonación se había logrado satisfactoriamente.

La secuenciación completa del plásmido INVAC-1 se realizó en el material plasmídico de Master Cell Bank (SEQ ID NO: 11 y Figura 16). El resultado coincidió con la secuencia esperada, excepto para una base. De hecho, esta secuenciación completa identificó una mutación silenciosa (G6064C; glicina GGG a glicina GGC) en comparación con el gen de la telomerasa humana archivado en las bases de datos (número de acceso NM_198253). Esta mutación silenciosa podría considerarse como una firma adicional de INVAC-1 ya que este cambio de base destruye un sitio único BamHI (GGATCC a GCATCC) presente en el gen de la telomerasa de tipo salvaje.

Caracterización y análisis de secuencia de construcciones derivadas de INVAC-1

Se sintetizaron y clonaron tres plásmidos de ADN derivado de INVAC-1 que expresaban diferentes proteínas de fusión Ubi-hTERT (Figura 2A). Todos los transgenes de Ubi-hTERT se ligaron con éxito en el vector de expresión pcDNA3.1(+) de Invitrogen como se muestra por digestión HindIII y XbaI y electroforesis (Figura 2B). Los insertos y las uniones se secuenciaron utilizando cebadores PEGFP-N5' y BGH que coinciden con la secuencia del vector que flanquea el inserto de ADN. Los resultados de la secuencia confirmaron que los transgenes se habían clonado correctamente (SEQ ID NO: 13, 15, 17 y Figuras 17 a 19).

INVAC-1 y las proteínas derivadas de INVAC-1 se expresan correctamente in vitro y son degradadas por la ruta del proteasoma

Se realizó un ensayo de transferencia Western para proporcionar información sobre la expresión global de hTERT de tipo salvaje, INVAC-1 y proteínas derivadas de INVAC-1 después de 18 h a 96 h de transfección transitoria in vitro en líneas celulares HEK293T y CrFK. Las bandas de la proteína hTERT de tipo salvaje correspondieron al tamaño de la hTERT no modificada a 124,5 kDa (Figuras 3A y 3B, parte izquierda de la Figura). La expresión de la proteína hTERT de tipo salvaje pareció ser estable a lo largo del tiempo, especialmente en las células HEK293T. Por el contrario, INVAC-1 (Figuras 3A y 3B, parte derecha de la Figura y Figura 3C, parte superior de la Figura) y proteínas derivadas de INVAC-1 (Figura 3C, parte inferior de la Figura) se degradaron rápidamente con el tiempo. A diferencia de la hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT), la construcción INVAC-1 produjo dos bandas distintas: una banda superior débil que correspondía a la proteína de fusión Ubi-hTERT en el tamaño previsto de 127,4 kDa y una banda inferior que correspondía a la proteína hTERT codificada por INVAC-1 que carecía del polipéptido ubiquitina (119 kDa). Estas dos formas de proteína hTERT codificada por INVAC-1 se detectaron en ambas líneas celulares, HEK293T y CrFK (Figuras 3A y 3B). Se observó el mismo patrón para las construcciones derivadas de INVAC-1, A10Not, A10Cog y A23 (Figura 3C). En conjunto, la expresión más débil de INVAC-1 y las proteínas derivadas de INVAC-1 en comparación con la hTERT de tipo salvaje, sus patrones de expresión y su cinética de desaparición con el tiempo sugieren que estas proteínas se degradaban rápidamente por la ruta del proteasoma dependiente de ubiquitina de acuerdo con el modelo propuesto para la degradación de las proteínas de fusión de ubiquitina (Bachmair, 1986). La rápida aparición de la banda de INVAC-1 de 119 kDa indica que la mayoría de la proteína fue escindida co-traduccionalmente o casi por proteasas de procesamiento específicas de ubiquitina en la unión Ubi-hTERT. En consecuencia, la proteína entró en una ruta de degradación rápida dependiente del proteasoma de acuerdo con la llamada regla del extremo N para la degradación de proteínas (Tasaki, 2012; Varshavsky, 1996).

Estos resultados validan el patrón de expresión in vitro y la identidad de las proteínas de fusión Ubi-hTERT codificadas por INVAC-1 y derivados de INVAC-1. El polipéptido de ubiquitina fusionado con las proteínas derivadas de hTERT desempeñó su papel al mejorar la degradación de las proteínas de acuerdo con la regla del extremo N. De acuerdo con esta regla del extremo N, la hTERT se convirtió en una proteína inestable rápidamente degradada por el sistema del proteasoma implicado en la producción de péptidos para la presentación de antígenos por moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Cadima-Couto, 2009; Michalek et al, 1993). Por lo tanto, estos datos indican que las construcciones de fusión Ubi-hTERT que experimentan una mejora de la degradación en células de cultivo de tejidos de mamíferos, también podrían degradarse rápidamente in vivo y podrían inducir eficazmente respuestas de células T CD8+ más altas que hTERT de tipo salvaje.

La proteína INVAC-1 tiene una distribución citoplasmática predominante y un patrón de exclusión nucleolar.

Con la idea de deslocalizar la proteína hTERT derivada de INVAC-1 para mejorar su degradación, se eliminó la señal de localización nucleolar (porción N-terminal de hTERT). Por lo tanto, la localización celular de hTERT codificada por INVAC-1 se evaluó mediante análisis de inmunofluorescencia después de la transfección en líneas celulares CrFK, HEK293, HeLa, QT6 (Figura 4).

Se demostró que la hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT) se localizaba predominantemente en el núcleo y el nucleolo en las células HEK293T transfectadas a las 24 h (Figura 4A). En contraste, la proteína INVAC-1 se distribuyó entre el núcleo y el citoplasma con, ante todo, un patrón claro de exclusión nucleolar (Figura 4A). La transfección transitoria de los plásmidos hTERT de tipo salvaje (pTRIP-CMV-hTERT) e INVAC-1 en células HeLa mostró patrones de localización similares a las 24 y 48 horas de la transfección para ambas proteínas (Figura 4B). La débil señal de fluorescencia anti-hTERT que se pudo observar en las células HEK293T y HeLa después de la transfección del vector con cadena principal vacía pNTC8685-eRNA41H probablemente se debió a la reactividad cruzada con hTERT endógena

Para superar el fondo de fluorescencia no específico debido a la expresión de la proteína hTERT endógena, se utilizaron líneas celulares no humanas, fibrosarcoma de codorniz QT6 y células de riñón felino CrFK para la inmunotinción. No se observó señal de fondo en ambas líneas celulares después de la transfección transitoria con el vector de cadena principal vacía pNTC8685-eRNA41H (Figuras 4C y D). Como se esperaba, la proteína hTERT de tipo salvaje exógena (pTRIP-CMV-hTERT) se detectó principalmente en el núcleo y el nucleolo de ambas líneas celulares (Figuras 4C y D). La proteína INVAC-1, como ya se observó en las células HEK293T y HeLa, tenía una distribución nuclear y citoplasmática en las células CrFK a las 24 h (Figura 4D). Curiosamente, la expresión de INVAC-1 en células QT6 a las 24 y 48 h solo fue citoplasmática, lo que sugiere que la eliminación de la señal de localización nucleolar alteró drásticamente la distribución de la proteína en esta línea celular.

Tomados en conjunto, estos resultados mostraron que la proteína hTERT derivada de INVAC-1 tiene una distribución subcelular modificada en comparación con la hTERT de tipo salvaje en diferentes líneas celulares. Esta alteración puede ser una ventaja para mejorar la degradación proteasómica de la proteína a péptidos para la presentación de MHC de clase I para generar respuestas inmunitarias celulares específicas (Andersson y Barry, 2004).

La transfección de células QT6 y CrFK (sin antecedentes de hTERT no específicos) con derivados de INVAC-1 (pUTD10Not, pUTD10Cog y pUTD23Tyn) confirmó un patrón de exclusión nucleolar de estas proteínas derivadas de hTERT (datos no mostrados). Su distribución subcelular fue principalmente citoplasmática en comparación con la hTERT de tipo salvaje.

INVAC-1 y Ios derivados de INVAC-1 no tienen actividad enzimátiea

La telomerasa humana juega un papel crítico en el crecimiento tumoral al participar en la inmortalización y prevenir la senescencia de las células tumorales. Por lo tanto, el uso de la telomerasa de tipo salvaje como producto de vacuna puede generar problemas de seguridad.

Se realizó un ensayo TRAP para evaluar la actividad de la telomerasa de las construcciones Ubi-hTERT en la línea celular CrFK negativa para telomerasa. La actividad de la telomerasa solo se detectó en células CrFK transfectadas con hTERT de tipo salvaje utilizando el plásmido pTRIP-CMV-hTERT. No se detectó actividad telomerasa en células CrFK transfectadas con INVAC-1 o derivados de INVAC-1 (Figura 5).

Como se muestra en las Figuras 5A y 5C, los datos de absorbancia sin procesar demostraron que el nivel de actividad telomerasa de INVAC-1 y derivados de INVAC-1 es comparable al nivel de células no tratadas.

Los datos de la actividad telomerasa relativa (RTA) (Figuras 5B y 5D) que representan resultados completamente analizados teniendo en cuenta la especificidad del ensayo mediante el uso de varios controles negativos, incluidas muestras inactivadas por calor, muestran que INVAC-1 y los derivados de INVAC-1 están completamente desprovistos de cualquier actividad de telomerasa.

Todas las muestras tratadas con el control de patrón de amplificación interno (IS) fueron altamente positivas confirmando la ausencia de inhibidores de ADN polimerasa Taq en muestras de producto lisado de CrFK y, por lo tanto, enfatizando nuevamente la especificidad del ensayo.

En conclusión, estos resultados confirmaron que INVAC-1 y los derivados de INVAC-1 no tienen actividad enzimática. Por lo tanto, con respecto a la actividad telomerasa, no existe ningún problema de seguridad para la utilización de INVAC-1 en seres humanos.

La electroporación es ventajosa para inducir niveles significativos de células T CD8 específicas para hTERT que secretan interferón-Y después de la administración ID de INVAC-1

La intensidad de las respuestas de células T CD8 específicas para hTERT se evaluó en ratones C57BL/6 previamente inmunizados con INVAC-1 a través de la vía intradérmica seguida o no de electroporación cutánea (Figura 6). Catorce días después de la inyección, se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de las respuestas inmunitarias inducidas a través de un ensayo ELISPOT para IFN-y utilizando péptidos de hTERT restringidos a H2. Una diferencia significativa en la frecuencia de las células T CD8 IFNy+ se observó entre el grupo de ratones que recibieron una electroporación después de la inyección ID de INVAC-1 y el grupo que no lo hizo (p< 0,05). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la electroporación es ventajosa para inducir niveles significativos de respuestas de células T CD8 específicas para hTERT después de la vacunación ID con INVAC-1.

La vacunación con INVAC-1 a través de diferentes vías de administración seguidas de electroporación induce células T CD8 específico de hTERT que secretan interferón ^y - La ruta de vacunación ID parece ser la mejor vía

Las vacunas convencionales se administran comúnmente a través de la vía SC o IM. Sin embargo, la vía intradérmica de inmunización ahora está recuperando interés en el campo de la vacunación (Combadiere y Liard, 2011). En consecuencia, la vía ID se probó para la administración de INVAC-1 y se comparó con las vías SC e IM convencionales.

En un primer conjunto de experimentos, se inmunizaron diferentes grupos de ratones transgénicos para HLA-B7 con INVAC-1 a través de la vía ID o SC seguido inmediatamente de electroporación (Figura 7A). Catorce días después de la vacunación/electroporación, se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de la respuesta inmunitaria inducida en el bazo a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a HLA-B7. En un segundo conjunto de experimentos, un grupo de ratones transgénicos para HLA-B7 se inmunizó con INVAC-1 a través de la vía ID y el otro a través de la vía IM seguido inmediatamente de electroporación (Figura 7B). Se realizó un seguimiento de la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en PBMC a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a HLA-B7. Se estableció que la vacunación con INVAC-1 seguida de electroporación fue capaz de inducir respuestas de células T CD8 específicas para hTERT en ratones HLA-B7 cualquiera que fuera la vía de vacunación utilizada (Figura 7A y 7B).

Por otra parte, como se muestra en la Figura 7A, el número de animales que respondían fue mayor en el grupo de ratones vacunados a través de la vía ID en comparación con el grupo vacunado a través de la vía SC, con 6 de 8 frente a 3 de 8 respondedores respectivamente. También se observó una diferencia significativa en la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT entre el grupo de ratones vacunados ID en comparación con los animales vacunados IM (p<0,05) (Figura 7B).

Ambos experimentos demostraron que la vía ID de vacunación era más eficaz que las vías IM y SC para la inducción mediada por INVAC-1 de células T CD8 específicas para hTERT. Se obtuvieron datos similares utilizando otros modelos de ratón es decir ratones HLA-A2-DR1 (datos no mostrados). En consecuencia, todos los estudios de inmunogenicidad posteriores realizados con INVAC-1 se diseñaron con una administración ID de la vacuna seguida de electroporación.

impacto de la dosis de la vacuna sobre la respuesta de células T CD8 específicas para hTERT después de una única inmunización ID con INVAC-1 y electroporación

Otro parámetro importante que se debía probar fue el impacto de la dosis de la vacuna sobre las respuestas de células T CD8 específicas para hTERT. Se inmunizaron ratones C57BL/6 a través de la vía ID seguido de electroporación en ambos flancos inferiores con dosis crecientes de INVAC-1. El volumen de la vacuna se mantuvo constante a 50 pl/sitio. Los animales fueron vacunados en 2 o 4 sitios dependiendo de la dosis final de vacuna recibida. Catorce días después de la vacunación/electroporación, se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de las respuestas inmunitarias celulares específicas a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a H2.

En un primer conjunto de experimentos, los ratones C57BL/6 recibieron una inyección ID única de INVAC-1/electroporación con dosis que oscilaban de 12,5 pg a 100 pg (Figura 8A). Se observó una diferencia significativa en la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en el grupo de animales vacunados con 100 pg de INVAC-1 en comparación con los animales de control vacunados con PBS (p<0,01) (Figura 8A). También se observó que la mediana del número de células T CD8 específicas para hTERT aumentó en proporción a la dosis de vacuna recibida (de 12,5 pg a 100 pg). El número de animales que respondían también aumentó junto con la dosis de la vacuna con 4 de 6 respondedores respectivamente para la dosis de 12,5 pg, 4 de 5 para la dosis de 25 pg y 6 de 6 respondedores para las dosis de 50 y 100 pg.

En una segunda serie de experimentos, los ratones C57BL/6 recibieron una inyección ID única de INVAC-1/electroporación con dosis que oscilaban de 100 pg a 1200 pg (Figura 8B). Se observó una diferencia significativa en la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en el grupo de animales vacunados con 800 pg de INVAC-1 administrado a 4 mg/ml en comparación con los animales de control vacunados con PBS (p<0,05) (Figura 8B). Se observó que la mediana del número de células T CD8 específicas para hTERT aumentó proporcionalmente a la dosis de vacuna recibida de 100 pg a 800 pg y que esta mediana del número disminuyó al inyectar 1200 pg. El número de animales que respondían aumentó con la dosis de la vacuna con 4 de 5 respondedores para la dosis de 100 pg, 5 de 5 o 4 de 4 respondedores para las dosis superiores a 200 pg, respectivamente. Para la dosis de 1200 pg, incluso si todos los animales fueran respondedores, todavía habría 2 de 5 animales con un nivel de respuestas específicas cercano al valor de corte.

En conclusión, para el criterio de células T CD8 específicas de vacuna en ratones C57BL/6, se observó una respuesta a la dosis como consecuencia de la administración de diferentes cantidades de INVAC-1. Curiosamente, no se observaron signos de toxicidad de la vacuna en animales a los que se habían inyectado las dosis más altas de vacuna (800 y 1200 pg) en comparación con los ratones de control (control del peso corporal y autopsia macroscópica en el sacrificio). Se obtuvieron datos similares en ratones transgénicos para HLA-B7 (datos no mostrados).

Se recomienda un régimen de cebado-refuerzo para la vacunación con INVAC-1 para aumentar el nivel de respuesta de células T CD8 específicas para hTERT

La mayoría de los protocolos de vacunación recomendados para las vacunas convencionales (BCG, sarampión, influenza...) incluyen un régimen de cebado/refuerzo para mejorar la frecuencia de las respuestas inmunitarias específicas de la vacuna. En consecuencia, el impacto de un régimen de cebado/refuerzo sobre la generación de respuestas de células T CD8 específicas para hTERT se probó para la vacunación con INVAC-1 ID y electroporación. Con este objetivo, los ratones transgénicos para HLA-B7 se inmunizaron ID con INVAC-1 y los sitios de vacunación cutánea se sometieron a electroporación directamente después de la administración de la vacuna. Veintiún días después de la primera inmunización, los ratones recibieron una segunda inyección de INVAC-1 utilizando el mismo procedimiento de vacunación. En diferentes momentos después de las inmunizaciones de cebado y refuerzo, se recolectó sangre periférica para controlar las respuestas de células T CD8 específicas para hTERT a través de un ensayo ELISPOT para IFN-y utilizando péptidos de hTERT restringidos a HLA-B7 (Figura 9). Se observó un pico de respuesta de células T CD8 específicas para hTERT a los 14 días después del cebado. Sin embargo, la mediana de la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en el grupo de animales vacunados fue relativamente baja (11,3 puntos/200.000 PBMC) y hubo 2 de 5 animales que no respondieron a la vacuna. Después del refuerzo, se observó un pico de células T CD8 específicas para hTERT el día 10 después de la inyección. La mediana de la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en el grupo de animales vacunados en este momento (D31 post-cebado, D10 post-refuerzo) fue significativamente diferente de la mediana de la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT en muestras preinmunes (p<0,05). Hubo 4 de 5 respondedores después del refuerzo.

En conclusión, se recomienda un régimen de vacunación de cebado/refuerzo para la vacunación ID con INVAC-1/electroporación debido a que en primer lugar permite aumentar la frecuencia de las células T CD8 específicas para hTERT que circulan en la sangre (células T efectoras) y, en segundo lugar, acorta el tiempo necesario para alcanzar el pico de la respuesta inmunitaria celular específica, que es un parámetro importante en el contexto de una vacunación contra el cáncer.

La vacunación ID con construcciones AlüNot, AlüCog o A23 seguida de electroporacién también induce una respuesta de células T CD8 específicas para hTERT. Se recomienda un régimen de vacunación de cebado/refuerzo para aumentar la frecuencia de las células T CD8 específicas de la vacuna.

Junto con el desarrollo de INVAC-1, se diseñaron otras 3 construcciones de plásmidos de ADN (derivados de INVAC-1): A10Not (pUTD10Not), A10Cog (pUTD10Cog) o A23 (pUTD23Tyn). Se diseñaron tres deleciones en el sitio catalítico de la enzima hTERT. Oscilaron entre 10 y 23 residuos de aminoácidos y abarcaron el trío crucial de residuos de valina-ácido aspártico-ácido aspártico (Val-Asp-Asp o VDD en el código de una letra) (Figura 2A). Estas construcciones fueron diseñadas para mostrar que cualquier deleción que elimine la actividad de la enzima podría conservar la inmunogenicidad.

Para confirmar esta hipótesis, se inmunizaron ratones C57BL/6 a través de la vía ID seguido de electroporación con INVAC-1, A10Not, A10Cog, A23 o PBS (Figura 10A). La mitad de los animales recibió una segunda inyección de ADN o PBS 21 días después de la primera inmunización utilizando el mismo procedimiento. Los animales fueron sacrificados catorce días (grupo de ratones que recibieron una sola inyección) o diez días (grupo de ratones que recibieron 2 inyecciones) después de la última vacunación/electroporación. Se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de la respuesta inducida de células T CD8 a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a H2 (reserva de 4 péptidos).

Para los animales que recibieron una única inyección de ADN, se observó una diferencia significativa en la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT solo en el grupo de ratones vacunados con 100 pg de INVAC-1 en comparación con los animales de control vacunados con PBS (p<0,05) (Figura 10A, puntos oscuros). Al analizar la frecuencia de los respondedores, hubo 3 de 4 respondedores en el grupo de ratones vacunados con INVAC-1 y A10Cog. Sin embargo, para A10Cog, los animales respondieron poco con respuestas de células T CD8 específicas para hTERT inferiores a 50/200.000 esplenocitos. Solo hubo 1 de 4 respondedores en el grupo de animales vacunados con A23 y ningún respondedor con animales tratados con A10Not. Para los animales que recibieron dos vacunas (Figura 10A, puntos de color blanco), se observó una mediana de la frecuencia significativa de células T CD8 secretoras de IFN-y específicas para hTERT en el bazo de los ratones inmunizados con INVAC-1, A10Not y A10Cog en comparación con los ratones de control a los que se había inyectado PBS (p<0,001). Solo hubo 2 de los 4 animales que respondían en el grupo de ratones vacunados con A23, lo que no fue estadísticamente significativo. En conclusión, después de una o dos rondas de vacunación, las construcciones de INVAC-1 y derivadas de INVAC-1 permitieron la inducción de células T CD8 específicas para hTERT, siendo INVAC-1 la más inmunogénica en ratones C57BL/6.

En un segundo conjunto de experimentos, los ratones transgénicos para HLA-B7 se vacunaron ID con INVAC-1, A10Not, A10Cog, ^a 23 o PBS (Figura 10B) seguido de electroporación y recibieron una segunda inyección 21 días después de la primera utilizando el mismo procedimiento. Se recogieron los bazos 10 días después de la última inyección y se controló la respuesta inducida de células T CD8 a través de un ensayo ELISPOT para IFN-y utilizando péptidos de hTERT restringidos a B7. Como se muestra en la Figura 10B, se observó una mediana de la frecuencia significativa de células T CD8 secretoras de IFN-y específicas para hTERT en el bazo de los ratones inmunizados con INVAC-1, A10Not, A10Cog y A23 en comparación con los ratones de control a los que se había inyectado PBS (p<0,001).

Como se muestra para INVAC-1, los 3 derivados de INVAC-1 A10Not, A10Cog y A23 también fueron capaces de inducir células T CD8 específicas para hTERT in vivo después de la vacunación ID y la electroporación en dos cepas de ratones diferentes. También se recomendó un régimen de vacunación de cebado/refuerzo para que los derivados de INVAC-1 alcanzaran niveles significativos de respuestas de células T CD8 específicas para hTERT. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que INVAC-1 es la construcción que permite la inducción de la mejor respuesta de células T CD8 específicas para hTERT. Esto probablemente se deba a la diferencia observada en los niveles de expresión de la proteína AhTERT después de la transfección del plásmido como se muestra mediante transferencia Western (Figura 3).

La amplitud de la respuesta de células T específicas para hTERT después de la vacunación o vacunaciones ID seguidas de electroporación es diferente según la construcción del plásmido hTERT utilizada para la vacunación (INVAC-1, pNTC-hTERT o pNTC-hTERT-AVDD)

Se ha evaluado el impacto de las modificaciones de la secuencia de hTERT diseñadas dentro de la construcción INVAC-1, es decir, (1) la deleción de la señal de localización nucleolar, (2) la adición de la secuencia de ubiquitina y (3) la deleción dentro del sitio catalítico, sobre el repertorio de la respuesta inmunitaria de células T contra hTERT. Las respuestas inmunitarias celulares específicas para hTERT de INVAC-1 se escrutaron después de una o varias inmunizaciones ID/una o varias electroporaciones con INVAC-1 y se compararon con las respuestas inducidas por un ADN que codifica la secuencia de tipo nativo/salvaje de la TERT humana (pNTC-hTERT) y un ADN que codifica la secuencia de hTERT de la que se había eliminado solamente la región VDD (pNTC-hTERT-AVDD). Los animales de control recibieron una o varias inyecciones ID de 25 pg de vector vacío pNTC seguido de electroporación.

Una primera serie de ratones transgénicos para HLA-B7 recibió una inyección única de cualquiera de las 4 construcciones utilizando el protocolo de vacunación descrito anteriormente (25 pg/ratón). Una segunda serie de animales recibió una inyección de cebado y un refuerzo 21 días después de la primera vacunación con cualquiera de las 4 construcciones utilizando el protocolo de vacunación descrito anteriormente (25 pg/ratón).

Catorce días después de una inyección única o 10 días después del refuerzo, se analizaron los esplenocitos de ratones vacunados y de control en un ensayo ELIspot para IFNy utilizando 269 péptidos de 15 AA solapantes de 11 AA y recuperando la secuencia de proteínas completa de hTERT (27 reservas compuestas de 10 péptidos cada una).

La inmunización con INVAC-1 indujo un gran repertorio de células T contra numerosos epítopos de hTERT ya que después del cebado, se reconocieron aproximadamente 12 reservas de péptidos (Figura 11A). Estos datos sugieren que se expresaron un mínimo de 12 epítopos restringidos a HLA-B7 después del procesamiento sobre la superficie de las células dendríticas con una densidad de complejos de péptidos del MHC que permitían la inducción de una fuerte respuesta de células T. Estos importantes resultados muestran la capacidad de INVAC-1 para el procesamiento y la expresión de numerosos péptidos de hTERT sobre la superficie de las APC. La diferencia obtenida con las otras construcciones (hTERT y hTERTAVDD) valida las características de optimización realizadas en INVAC-1, lo que lleva al aumento de la amplitud del repertorio de células T contra hTERT. Además, estos resultados resaltan la ventaja de la vacunación de ADN frente a la inmunización peptídica.

En este estudio se confirmó la ventaja de un segundo ciclo de inmunización (cebado-refuerzo) con INVAC-1 en ratones transgénicos. El repertorio de células T in vivo se mejoró a medida que se revelaron al menos 5 nuevos epítopos (Figura 11B). Se reconoció un total de al menos 17 epítopos después del refuerzo. Estos datos confirman que varias inyecciones en el paciente serán beneficiosas para obtener una mejor respuesta antitumoral.

Al analizar estos datos globalmente al hacer la suma de la mediana total de la frecuencia de células T específicas detectadas para las 27 reservas de péptidos, no se observaron diferencias importantes después de uno (cebado) o dos (cebado-refuerzo) ciclos de inmunizaciones entre las tres construcciones de hTERT (Figura 11C). Esto sugiere que las modificaciones realizadas en hTERT de INVAC-1 no tuvieron impacto sobre la amplitud de la respuesta inmunitaria, a pesar de que se observó una respuesta inmunitaria mediada por células T significativamente mayor después del refuerzo con INVAC-1.

En conclusión, la vacunación con INVAC-1 medió un gran repertorio de respuesta inmunitaria de células T contra numerosos epítopos de hTERT diferentes de construcciones de hTERT de tipo salvaje y hTERTAVDD en términos de péptidos/epítopos reconocidos por las células T.

La vacunación ID con INVAC-1 seguida de electroporación induce respuestas de células T específicas para hTERT con el sello distintivo de una respuesta inmunitaria anticancerosa: células T CD8 citotóxicas y células T CD4 Th1

Entre las células inmunitarias que son relevantes en las respuestas inmunitarias antitumorales, los linfocitos T CD8 citotóxicos (CTL) y las células T CD4 Th1 se han identificado como las células efectoras más potentes (Vesely et al., 2011) (Braumuller et al., 2013).

En una primera etapa, se investigó la actividad citotóxica de las células T CD8 específicas para hTERT in vivo después de la vacunación ID/electroporación con INVAC-1. De hecho, esta actividad es necesaria para destruir las células tumorales. Para medir la resistencia citolítica in vivo de la respuesta de las células T CD8+ específicas para hTERT provocada por la inmunización con INVAC-1, se realizó un ensayo de citotoxicidad in vivo utilizando esplenocitos pulsados con péptidos marcados con succinimidil éster diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) como células diana. A ratones transgénicos para HLA-B7 que recibieron una vacunación con cebado o cebado/refuerzo con INVAC-1 (o PBS como control) a través de la vía ID como se describió anteriormente, se les inyectaron por vía intravenosa 7106 células diana. Las células diana eran esplenocitos de ratones congénicos no sometidos a tratamiento previo, marcados independientemente con 3 concentraciones diferentes de CFSE y pulsadas con un péptido hTERT restringido a HLA-B7 (p351, péptido inmunodominante o p1123, péptido subdominante) o no pulsadas como control interno. Después de 15-18 horas, se recogieron las células del bazo y la desaparición de las células pulsadas con péptidos en ratones inmunizados frente a ratones de control se cuantificó por citometría de flujo.

Los resultados muestran que todos los ratones desarrollaron CTL específicos contra el péptido inmunodominante p351 después de una sola inyección (Figura 12A, puntos de color blanco) con una mediana de lisis específica de 35%. Un tercio de los animales desarrollaron CTL específicos contra el péptido subdominante p1123 (Figura 12A, puntos de color negro). Se puede esperar que múltiples ciclos de inyección permitirían aumentar el número de animales que desarrollan una lisis CTL específica contra el péptido subdominante 1123.

Recientemente se ha descrito que una respuesta de células T CD4 específicas para hTERT puede estar asociada con una mejor respuesta a la quimioterapia en pacientes con CPNM (Godet et al., 2012). Por lo tanto, se investigó la presencia de una respuesta de células T CD4 específicas para hTERT después de la inyección de INVAC-1 ID. Con este objetivo, los ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 se inmunizaron ID con INVAC-1 seguido de electroporación y se realizó un seguimiento de la respuesta de células T CD4 específicas para hTERT en el bazo 14 días después de la vacunación a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a DR1. Como se muestra en la Figura 12B, se observó una mediana de la frecuencia significativa de células T CD4 secretoras de IFN-y específicas para hTERT en el bazo de los ratones vacunados ID en comparación con los ratones de control a los que se había inyectado PBS (p<0,001).

Se ha enfatizado que la inmunidad Th1 tenía un claro efecto positivo sobre la eliminación de células cancerosas in vivo (Braumuller et al., 2013). De hecho, las células Th1 CD4+ producen varias citocinas (tales como IFN-y, TNF-a e IL-2) esenciales para la inducción de inmunidad celular contra tumores. En consecuencia, después de la vacunación con INVAC-1 ID, se investigaron las diferentes citocinas secretadas por las células T CD4 específicas para hTERT. Con este objetivo, se estimularon los esplenocitos de ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 vacunados con INVAC-1 in vitro durante 24 horas con una reserva de péptidos de hTERT o se dejaron sin estimular. Los sobrenadantes se recuperaron y analizaron en un Ensayo de Unión a Citocinas (CBA) para evaluar la concentración de citocinas Th1, Th2 y Th17 secretadas por las células T CD4 específicas para hTERT.

Como se muestra en la Figura 12C, se detectaron concentraciones significativas de citocinas Th1 IL-2, TNFa e IFNy en sobrenadantes de esplenocitos recuperados de ratones vacunados con INVAC-1 en comparación con sobrenadantes de ratones de control (p<0.05).

Por lo tanto, la vacunación ID/electroporación con INVAC-1 puede promover la expansión de células T CD8 específicas para hTERT que exhiben una actividad citotóxica in vivo junto con células T CD4 específicas con un perfil Th1. Ambos tipos de respuesta son el sello distintivo de una respuesta inmunitaria anticancerosa favorable. La vacunación ID terapéutica y preventiva con INVAC-1 seguida de electroporacién retrasan el crecimiento tumoral después de la inoculación de tumor singénico a ratones transgénicos para HLA-A2/DR1

Hasta este punto, los resultados han demostrado que una inyección ID de INVAC-1 seguida de electroporación fue capaz de inducir células T CD8 citotóxicas y células T CD4 Th 1 en ratones. La siguiente etapa consistió en evaluar a continuación la protección de los ratones HLA-A2/DR1 transgénicos conferida por la vacunación con INVAC-1 ID y electroporación después de la inoculación de células tumorales Sarc-2 (fibrosarcoma). En un primer intento, los ratones HLA-A2/DR1 transgénicos se vacunaron ID con INVAC-1 seguido de electroporación en una estrategia de cebado/refuerzo o se vacunaron simuladamente con PBS. Un mes después de la vacunación preventiva, los ratones fueron sensibilizados a través de la vía SC con 50.000 células Sarc-2. El volumen tumoral se midió cada 2-3 días. La Figura 13A muestra la cinética de la mediana del volumen del tumor después de la sensibilización según el tratamiento de los ratones. A continuación, se calculó el retraso del crecimiento tumoral (TGD) a 500 mm3. Este criterio permite medir el efecto del tratamiento de una vacuna sobre el crecimiento tumoral al comparar el tiempo para alcanzar un volumen tumoral definido en los grupos de control y tratados. Se observó un retraso en el crecimiento tumoral de once días entre el grupo de ratones vacunados con INVAC-1 y el grupo de animales que recibieron PBS. Por lo tanto, la vacunación preventiva con INVAC-1 fue responsable de una desaceleración en el crecimiento tumoral. Debido a que la inoculación del tumor se realizó un mes después de la última vacunación, los efectos antitumorales podrían atribuirse en cierta medida a la presencia de células T de memoria específicas para hTERT.

En una segunda serie de experimentos, a los ratones transgénicos se les injertaron 20.000 células Sarc-2 y se vacunaron ID con INVAC-1 seguido de electroporación 4 días después de la inoculación celular (Figura 13B). Los animales de control recibieron una inyección ID de un plásmido "vacío" (NTC) que tenía la misma cadena principal que INVAC-1 pero que no codificaba ningún antígeno tumoral. Se realizaron dos vacunaciones de refuerzo con el mismo procedimiento 21 y 35 días después del injerto tumoral. Se calculó el retraso del crecimiento tumoral a 500 mm3. Se observó un retraso del crecimiento tumoral de 4 días entre el grupo de ratones vacunados con INVAC-1 y el grupo de animales que recibieron el plásmido vacío NTC. En conclusión, la vacunación terapéutica con INVAC-1 permitió una desaceleración relativamente débil, aunque observada repetidamente, sobre el crecimiento tumoral. La administración de GM-CSF murino junto con la vacunación ID con INVAC-1/electroporación mejora la intensidad y la calidad de la respuesta inmunitaria celular específica de hTERT y retrasa el crecimiento tumoral después de una sensibilización con tumor singénico en ratones transgénicos para HLA-A2/DR1. Se han utilizado diferentes citocinas hasta ahora como inmunomoduladores para facilitar el reconocimiento de antígeno y la expansión de células T en estudios de vacunación contra el cáncer tanto en modelos animales como en seres humanos. Una de las citocinas más frecuentemente utilizadas es el GM-CSF (Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macrófagos). Se sabe que esta citocina ayuda a la maduración de las Células Presentadoras de Antígenos y favorece las respuestas inmunitarias celulares Th1 (Parmiani et al., 2007). Con respecto al papel principal desempeñado por GM-CSF en el contexto de las vacunas antitumorales, se probó el impacto de la adición de GM-CSF murino (mGM-CSF) sobre las respuestas de células T específicas para hTERT después de la vacunación con INVAC-1 ID y la electroporación. Con este objetivo, los ratones C57BL/6 recibieron una inyección ID de mGM-CSF 18 horas antes de ser vacunados con INVAC-1 a través de la vía ID seguida de electroporación (Figura 14A). Otro grupo de ratones se vacunó ID con INVAC-1/electroporación sin adición de mGM-CSF. Los animales de control fueron vacunados simuladamente con PBS y electroporación. Catorce días después de la inyección, se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de las respuestas inmunitarias inducidas a través de un ensayo ELISPOT para IFN-y utilizando péptidos de hTERT restringidos a H2. Se observó una diferencia significativa en la frecuencia de células T CD8 IFNy+ entre el grupo de ratones que recibieron mGM-CSF antes de la inyección ID de INVAC-1 y el grupo que no lo hizo (p <0,001). Por lo tanto, la adición de mGM-CSF permitió un aumento importante en la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT. Una segunda etapa consistió en investigar el impacto de este inmunodulador sobre la calidad de las células T CD4 específicas para hTERT, y especialmente sobre la generación de células T específicas de Th1. Con este objetivo, se estimularon los esplenocitos de ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 vacunados con INVAC-1 o INVAC-1/mGM-CSF in vitro durante 24 horas con una reserva de péptidos de hTERT restringidos a DR1 o se dejaron son estimular. Los sobrenadantes se recuperaron y analizaron en un Ensayo de Unión a Citocinas (CBA) para evaluar la concentración de citocinas Th1, Th2 y Th17 secretadas por las células T CD4 específicas para hTERT. Como se muestra en la Figura 14B, se detectaron concentraciones significativas de citocinas Th1 IL-2, TNFa e IFNy en sobrenadantes de esplenocitos recuperados de ratones vacunados con INVAC-1/mGM-CSF en comparación con los sobrenadantes de ratones vacunados solo con INVAC-1. Al añadir mGM-CSF, hubo un aumento importante en la concentración de TNFa (p <0,01), IFN^y (p <0,05) e IL-2 (p <0,05) que son citocinas antitumorales Th1.

Posteriormente, se estudió la combinación mGM-CSF/INVAC-1 en el modelo de tumor animal Sarc-2 para evaluar si mGM-CSF podría potenciar los efectos antitumorales.

Con este objetivo, se injertaron a ratones transgénicos para HLA-A2/DR1 20.000 células Sarc-2 y se vacunaron ID con INVAC-1 y mGM-CSF seguido de electroporación 4 días después del injerto celular (Figura 14C). Los animales de control recibieron una inyección ID de un plásmido vacío (NTC) y mGM-CSF o PBS y mGM-CSF. Se realizaron dos vacunaciones de refuerzo con el mismo procedimiento 21 y 35 días después del injerto tumoral. Se calculó retraso del crecimiento tumoral (TGD) a 500 mm3. Se observó un TGD de 14 días entre el grupo de ratones vacunados con INVAC-1/mGM-CSF y el grupo de animales que recibieron NTC/mGM-CSF; se observó TGD de 10 días entre el grupo INVAC-1/mGM-CSF y el grupo PBS/mGM-CSF. Estos resultados demuestran que una vacunación terapéutica con INVAC-1 combinado con mGM-CSF permitió una desaceleración en el crecimiento tumoral.

La administración de IL-12 murina junto con la vacunación ID con INVAC-1/electroporación mejora la intensidad de la respuesta de células T CD8 específicas para hTERT

También se investigó el impacto de la citocina IL-12 sobre la respuesta de células T CD8 específicas para hTERT después de la vacunación con INVAC-1 ID y la electroporación. Con este objetivo, los ratones HLA-A2/DR1 recibieron una inyección ID de IL-12 junto con la administración ID de INVAC-1 seguido de electroporación (Figura 15). Otro grupo de ratones se vacunó ID con INVAC-1/electroporación sin adición de IL-12. Los animales de control se vacunaron simuladamente con PBS e IL-12 o PBS solo seguido de electroporación. Catorce días después de la inyección, se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de las respuestas inmunitarias inducidas a través de un ensayo ELISPOT para IFN-^y utilizando péptidos de hTERT restringidos a A2. La frecuencia de respuesta de los ratones se incrementó al añadir IL-12. De hecho, hubo 2 de 5 y 4 de 5 animales que respondían para el grupo vacunado con INVAC-1 y el grupo vacunado con INVAC-1/IL-12 respectivamente.

Ejemplo II

Abreviaturas

AA: Aminoácidos, pb: Pares de bases, CTL: Linfocitos T citotóxicos, CMV: Citomegalovirus, ADN: Ácido desoxirribonucleico, EP: Electroporación, ID: Intradérmico, NoLS: Secuencia de localización nucleolar, ARN: Ácido ribonucleico, RTA: Actividad telomerasa relativa, TRAP: Protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas, TERT: Transcriptasa inversa de telomerasa, Ubi: Ubiquitina, VDD: Valina-ácido aspártico-ácido aspártico.

Materiales y métodos

Vectores de ADN plasmídico

INVAC-1

La construcción INVAC-1 ya se describió en el Ejemplo I.

Derivados permutados al azar de INVAC-1

Las construcciones pUTScram y pUTInv son plásmidos de ADN de doble hebra de aproximadamente 8,9 kb que codifican proteínas de fusión basadas en ubiquitina-telomerasa humanas que son enzimáticamente inactivas. Los transgenes de Secuencia Aleatoria “Scrambled” y de Secuencia Invertida “Inverted” se insertaron en el vector Invitrogen pcDNA3.1(+) (5,4 kb) derivado de pcDNA3.0 que se diseñó para un alto nivel de expresión estable y transitoria en células de mamífero. La expresión transgénica es impulsada por el promotor inmediato-temprano de citomegalovirus (CMV) humano para permitir una expresión eficaz de alto nivel en una amplia gama de células de mamífero. El vector contiene múltiples sitios de clonación (MCS) para facilitar la clonación. La terminación eficaz de la transcripción es impulsada por la señal de poliadenilación de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH).

pUTScram (denominado de Secuencia Aleatoria)

El inserto de hTERT Ubi-Scrambled (de secuencia aleatoria, 1184 AA) comienza en la posición 923 y termina en la posición 4474 del plásmido pUTScram (Figura 20A). pUTScram codifica una construcción de fusión basada en ubiquitina-telomerasa humana (De secuencia aleatoria) de 1184 AA que corresponde a una proteína de aproximadamente 130,2 kDa. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de la proteína hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido ubiquitina (76 AA). El sitio catalítico se inactivó mediante una deleción de 9 pb que codificaba VDD (marca *; Figura 28) y correspondiente a AA 867-869 de telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; patente WO 2007/014740 y e isoforma 1 de hTERT con Número de acceso NM_198253). La secuencia de hTERT se dividió en diez fragmentos inmunogénicos y se volvió a montar en el siguiente orden específico: fragmento 7 (210 pb), fragmento 2 (201 pb), fragmento 6 (312 pb), fragmento 4 (117 pb), fragmento 9 (576 pb), fragmento 3 (120 pb), fragmento 1 (258 pb), fragmento 8 (477 pb), fragmento 10 (516 pb), fragmento 5 (303 pb). Estos 10 fragmentos están unidos por puentes con un conector 6xGly (conector G; 18 pb). En consecuencia, se eliminaron 76 AA no inmunogénicos (228 pb) de la secuencia de hTERT. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal del inserto permutado al azar Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5 (Figura 22).

pUTInv (denominado de secuencia invertida)

El inserto de hTERT Ubi-inverted (Secuencia Invertida, 1184 AA) comienza en la posición 923 y termina en la posición 4474 del plásmido pUTInv (Figura 20B). pUTInv codifica una construcción de fusión basada en ubiquitinatelomerasa humana (Secuencia Invertida) de 1184 AA correspondiente a una proteína de aproximadamente 130,2 kDa. Se suprimieron los 23 primeros aminoácidos (1-23 AA) de la proteína hTERT que fueron reemplazados por un polipéptido de ubiquitina (76 AA). El sitio catalítico se inactivó mediante una deleción de 9 pb que codificaba VDD (marca *; Figura 29) y correspondiente a los AA 867-869 de telomerasa humana de tipo salvaje (hTERT; patente WO 2007/014740; Número de acceso NM_198253). La secuencia de hTERT se dividió en diez fragmentos inmunogénicos y se volvió a montar en el siguiente orden específico: fragmento 10 (516 pb), fragmento 9 (576 pb), fragmento 8 (477 pb), fragmento 7 (210 pb), fragmento 6 (312 pb), fragmento 5 (303 pb), fragmento 4 (117 pb), fragmento 3 (120 pb), fragmento 2 (201 pb), fragmento 1 (258 pb). Estos 10 fragmentos se unieron con un conector 6xGly (conector G; 18 pb). En consecuencia, se eliminaron 76 AA no inmunogénicos (228 pb) de la secuencia de hTERT. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal del inserto permutado al azar Ubi-hTERT codifican la etiqueta epitópica V5 (Figura 22).

Síntesis y clonación genes

Los genes fueron sintetizado de novo como construcciones de fusión basadas en ubiquitina-telomerasa a través de un procedimiento de ensamblaje de oligonucleótidos de 40 unidades solapantes (GeneCust, Luxemburgo). Se realizaron varios cambios de bases conservativos para eliminar los sitios de restricción y atenuar las secuencias ricas en GC. La síntesis génica incluyó sitios de restricción flanqueantes únicos HindIII/XbaI para permitir la subclonación del gen en el sistema de expresión deseado. Los genes sintetizados se clonaron entre los sitios de restricción HindIII y XbaI del vector de expresión pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Las secuencias de los plásmidos se verificaron mediante secuenciación utilizando cebadores PEGFP-N5' CGGTGGGAGGTCTATATAAG (SEQ ID NO: 27) y BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC (SEQ ID NO: 28).

Producción de plásmidos

Estos derivados permutados al azar de INVAC-1 sintetizados por GeneCust se transformaron y produjeron en células E. coli 5-alfa (fhuA2A (argF-lacZ) U169 phoA glnV44 080 A (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, EE.UU., ref. 60602-2) por RD Biotech (Besangon, Francia). Las células se colocaron en placa y se propagaron en medio de caldo Lenox que contenía ampicilina (Núm. EU04000D, Euromedex). Después de la extracción y purificación, se prepararon provisiones de partida concentradas de plásmido gigaprep sin endotoxina (2 mg/ml) resuspendidas en 1X PBS estéril. Los vectores se verificaron mediante mapeo de restricción (HindIII-XbaI; Figura 21).

pTRIP-CMV-hTERT

Este plásmido de ADN ya se describió en el Ejemplo I.

Cultivos celulares y transfeooiones transitorias para ensayos de transferencia Western y TRAP Se cultivaron líneas celulares CrFK (riñón felino de Crandell Rees) y HEK293T (riñón embrionario humano) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (PAA, Velizy-Villacoublay, Francia) y penicilina/estreptomicina al 1% (Life Technologies, Saint-Aubin, Francia). Las células se cultivaron como monocapas en matraces de 75 cm2 a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. Las células se cultivaron hasta 70-80% de confluencia el día de la transfección. Para los ensayos de transferencia Western, se sembraron 5x105 células en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se incubaron durante 24 h. Para ensayos TRAP, se sembraron 7x105 células en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se incubaron durante 24 h.

Las construcciones pUTScram y pUTInv de INVAC-1 se transfectaron en células diana utilizando el reactivo de transfección de polímero catiónico jetPrime de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Polyplus-transfection Inc., Francia). Las células transfectadas con el plásmido pTRIP-CMV-hTERT se utilizaron como control positivo y las células no transfectadas como control negativo. Los medios de transfección se eliminaron 4 horas más tarde y se reemplazaron por 2 ml de medio de cultivo DMEM. Después del tiempo apropiado de transfección - 18-96 horas para los ensayos de transferencia Western y 24 horas para los ensayos de TRAP, las células se recolectaron y analizaron para determinar la expresión y actividad de la telomerasa.

Transferencia Western

Los análisis de transferencia Western se realizaron utilizando células HEK293T transfectadas. El procedimiento de transferencia Western es el que se ha descrito en el Ejemplo I.

Ensayo TRAP

Este procedimiento es el que se ha descrito en el Ejemplo I.

Ratones

En estos experimentos se utilizó la cepa de ratón transgénico HLA-B*0702.

Los ratones transgénicos para HLA-B*0702 expresan los dominios a1-a2 de HLA-B*0702 humanos de la molécula y el dominio a3 murino de la molécula H2D. Estos ratones no expresan las moléculas H2-Db y H2-Kb (Rohrlich, Cardinaud et al. 2003).

Los ratones se utilizaron entre las 9 y 15 semanas de edad y fueron suministrados por el Instituto Pasteur de París. Los animales fueron alojados en la instalación de animales libres de patógenos específicos del Instituto Pasteur (Animal Facilities Lwoff Núm. 22, número de acuerdo B 75 15-07). Antes de la inyección intradérmica (ID) o intravenosa (IV), los ratones fueron anestesiados con una solución mixta de xilazina al 2% (Rompun, Bayer Santé, Loos, Francia) y ketamina al 8% (Imalgen 1000, Merial, Lyon, Francia) en 1X Solución Salina Tamponada con Fosfato (IX PBS, Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) a través de la vía intraperitoneal (IP) según el peso individual del animal y la duración de la anestesia. Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con la buena práctica animal y cumplieron con la experimentación local con animales (Directiva 2010/63/UE).

Péptidos de hTERT

Los péptidos de hTERT restringidos a HLA-B*0702, se describieron previamente en el Ejemplo I. Los péptidos liofilizados se disolvieron en agua estéril a 2 mg/ml y se almacenaron a -20°C antes de su uso.

Inmunización de ratones y procedimiento de electroporación in vivo

La inmunización intradérmica (ID) se realizó en la parte inferior del flanco del ratón con jeringas de insulina y agujas específicas (U-100, 29GX1/2"-0,33x12 mm, Terumo, Bélgica) después del afeitado. No se observó eritema después del afeitado, durante y después de los procedimientos de inmunización. Cada animal recibió una inyección ID de cebado de plásmido (INVAC-1, pUTScram o pUTInv) con 100 pg de ADN o 1X PBS. Según el régimen de vacunación, los ratones podrían recibir una segunda inyección similar de ADN o 1X PBS.

La electroporación de ADN in vivo se realizó utilizando el sistema y el soporte lógico de electroporación CLINIPORATOR® 2 (IGEA, Italia) equipado con electrodos de placa (P-30-8G, Ig Ea ). Inmediatamente después de la vacunación ID, se realizó un pliegue de la piel en el sitio de inyección, se cubrió completamente con gel conductor (Labo FH, gel de contacto azul, NM Medical, Francia) y se colocó entre los electrodos de la placa. Se aplicaron dos pulsos de diferentes voltajes (HV-LV): HV: 1250 V/cm, 1 Hz, 100 ps; 1 pulso, 1000 ms de descanso; LV: 180 V/cm, 1 Hz, 400 ms, 1 pulso.

Ensayo ELÍSpot

El ensayo ELISpot se realizó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo I. Solo se utilizó una reserva de tres péptidos de hTERT específicos restringidos a HLA-B*0702 (p277, p351 y p1123) en el Ejemplo II.

Ensayo de eitotoxieidad in vivo

El ensayo de lisis in vivo se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo I. Solo se utilizaron dos péptidos de hTERT específicos restringidos a HLA-B*0702 (p351 y p1123) respectivamente como péptidos inmunodominantes y subdominantes en el Ejemplo II.

Análisis estadístico y manejo de datos.

Se utilizó el soporte lógico GraphPad Prism 5 para el manejo de datos, el análisis y las representaciones gráficas. Los datos se representan como la media ± desviación típica o como la mediana. Los análisis estadísticos de los ensayos ELISpot se realizaron utilizando un análisis no paramétrico de Mann Whitney y/o Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. La significación se estableció en el valor p <0,05.

Resultados

Caracterización y análisis de secuencia del ADN plasmídico de INVAC-1

La caracterización y el análisis de secuencia del ADN plasmídico de INVAC-1 ya se describieron en el Ejemplo I. Caracterización y análisis de secuencia de construcciones derivadas por permutaciones al azar de INVAC-1 (pUTScram y puTínv)

Se sintetizaron y clonaron dos genes derivados por permutaciones al azar de INVAC-1 (Figura 20). Estas construcciones se basaron en la secuencia de nucleótidos de INVAC-1 descrita en el Ejemplo I y la secuencia de aminoácidos de hTERT de tipo salvaje descrita en la solicitud de patente internacional WO 2007/014740.

La optimización de codones se realizó para la expresión de alto nivel en células de mamífero (Figura 27). Los transgenes permutados al azar Ubi-hTERT de secuencia aleatoria y de secuencia invertida se ligaron con éxito en el vector de expresión de Invitrogen pcDNA3.1(+) como se muestra por digestión con HindIII y XbaI y electroforesis (Figura 21). Los insertos y las uniones se secuenciaron utilizando los cebadores PEGFP-N5' y BGH que coincidían con la secuencia del vector que flanqueaba el inserto de ADN. Los resultados de la secuencia confirmaron que los transgenes se habían clonado correctamente (Figuras 28 y 29).

Las proteínas derivadas con permutaciones al azar de INVAC-1 se expresan correctamente in vitro y se degradan por la ruta del proteasoma

Se realizó el ensayo de transferencia Western para proporcionar información sobre la expresión global de las proteínas hTERT de tipo salvaje, INVAC-1, pUTScram y pUTInv después de 18 h a 96 h de transfección transitoria in vitro en líneas celulares HEK293T. Las bandas de proteína hTERT de tipo salvaje correspondían al tamaño de la hTERT no modificada en 124,5 kDa (Figuras 23A y 23C, parte izquierda de las Figuras). En el Ejemplo I, se ha demostrado que las proteínas INVAC-1 se degradan rápidamente con el tiempo en sentido contrario a las proteínas hTERT de tipo salvaje expresadas a un nivel estable. Se detectaron bandas específicas para proteínas con permutaciones al azar de Secuencia Aleatoria o de Secuencia Invertida con el tiempo (Figuras 23A y 23C, parte derecha de las Figuras). Para ambas, estas bandas se observaron a un tamaño menor (<110 kDa) que el tamaño pronosticado para las proteínas completas (130,2 kDa). Estas formas de proteínas de Secuencia Aleatoria y de Secuencia Invertida correspondían a los productos degradados. De hecho, los productos no degradados de expresión de Secuencia Aleatoria y de Secuencia Invertida no fueron detectables en el análisis de transferencia Western. Estas construcciones produjeron, respectivamente, de 1 a 3 bandas específicas lo que sugieren una degradación rápida de estas proteínas inmediatamente después de la producción. En cuanto a INVAC-1, se demostró el mismo patrón de degradación con el tiempo para los productos degradados de Secuencia Aleatoria después de la normalización al control de carga de p-actina (análisis ImageJ; Figura 23B). Los productos degradados de Secuencia Invertida tienen un patrón más similar a las otras proteínas derivadas de INVAC-1 (Figuras 23C, 23D y Figura 3C: pUTD10Not, pUTD10Cog y pUTD23Tyn, véase el Ejemplo I).

Los derivados con permutaciones al azar de INVAC-1 tienen una distribución citoplasmática predominante y un patrón de exclusión nucleolar

Como se demostró para INVAC-1 y derivados INVAC-1 (pUTD10Not, pUTD10Cog y pUTD23Tyn, véase el Ejemplo I), las proteínas con permutaciones al azar de Secuencia Aleatoria y de Secuencia Invertida codificadas por pUTScram y pUTInv se distribuyeron entre el núcleo y el citoplasma con un patrón de exclusión nucleolar (datos no mostrados).

L^os derivados con permutaciones al azar de INVAC-1 no tienen actividad enzimática

Se realizó un ensayo TRAP para evaluar la actividad telomerasa de las construcciones con permutaciones al azar de Ubi-hTERT en la línea celular CrFK negativa para telomerasa. La actividad telomerasa solo se detectó en células CrFK transfectadas con hTERT de tipo salvaje utilizando el plásmido pTRIP-CMV-hTERT.

Como se muestra en la Figura 24A, los datos de absorbancia sin procesar demostraron que el nivel de actividad telomerasa de las proteínas de Secuencia Aleatoria y de Secuencia Invertida es comparable al nivel de las células no tratadas. Los datos de la Actividad Telomerasa Relativa (RTA) (Figura 24B) que representan resultados completamente analizados teniendo en cuenta la especificidad del ensayo mediante el uso de varios controles negativos, incluidas las muestras inactivadas por calor, confirmaron que estas proteínas con permutaciones al azar están completamente desprovistas de cualquier actividad telomerasa.

Las construcciones de hTERT con permutaciones al azar inducen una respuesta de células T CD8 específicas para hTERT

Las construcciones pUTScram y pUTInv se diseñaron para inducir la presentación de antígenos de múltiples epítopos de hTERT aumentando el alcance de las características de INVAC-1. Se evaluó la comparación de inmunogenicidad de pUTScram, pUTInv e INVAC-1 en ratones HLA-B7 inmunizados ID con las diferentes construcciones seguido de electroporación cutánea después de dos ciclos de inmunización (régimen de cebado/refuerzo). Los animales fueron sacrificados diez días después de la segunda vacunación/electroporación. Se recogieron los bazos de los ratones y se realizó un seguimiento de la respuesta de células T CD8 inducida a través de un ensayo ELISPOT para IFN-y utilizando péptidos de hTERT restringidos a HLA-B7 MHC clase I (reserva de 3 péptidos p277, p351 y p1123). Se observó una diferencia significativa en la frecuencia de células T CD8 específicas para hTERT en ratones vacunados con INVAC-1, pUTScram (Secuencia Aleatoria) y pUTInv (Secuencia Invertida) en comparación con los animales de control (Figura 25).

Estos resultados demuestran que las construcciones artificiales con permutaciones al azar de hTERT, pUTScram (Secuencia Aleatoria) y pUTInv (Secuencia Invertida), fueron capaces de inducir niveles altos significativos de respuestas de células T CD8 específicas para hTERT después de dos ciclos de inmunización como lo hizo INVAC-1. De hecho, como se demostró previamente para INVAC-1, la ventaja de un régimen de vacunación de cebado/refuerzo es reforzar selectivamente las células T específicas activadas previamente y ampliar la presentación del epítopo para generar células T específicas secundarias de hTERT que impliquen nuevos TCR específicos.

La vacunación con construcciones artificiales de hTERT con permutaciones al azar pUTScram y pUTInv inducen células T CD8 específicas para hTERT citotóxicas in vivo

Entre las células inmunitarias que son relevantes en las respuestas inmunitarias antitumorales, los linfocitos T CD8 citotóxicos (CTL) y las células T CD4 Th1 se han identificado como las células efectoras más potentes (Vesely, Kershaw et al. 2011) (Braumuller, Wieder et al. 2013)

Se investigó la actividad citotóxica de las células T CD8 específicas para hTERT in vivo después de la vacunación ID/electroporación con INVAC-1, pUTScram y pUTInv. Para medir la resistencia citolítica in vivo de la respuesta de células T CD8 específica de hTERT+ provocada por la inmunización con ADN, se realizó un ensayo de citotoxicidad in vivo utilizando esplenocitos marcados con pulsos de péptidos y succinimidil éster diacetato carboxifluoresceína (CFSE) como células diana. A ratones transgénicos para HLA-B7 que recibieron una vacuna con construcciones de ADN (o PBS como control) a través de la vía ID, como se describió anteriormente, se les inyectaron por vía intravenosa 107 células diana. Las células diana eran esplenocitos de ratones congénicos no sometidos a tratamiento previo marcados independientemente con 3 concentraciones diferentes de CFSE y pulsadas con un péptido hTERT restringido a HLA-B7 (p351, péptido inmunodominante o p1123, péptido subdominante) o sin pulsar como control interno. Después de 15-18 horas, se recogieron bazos de ratones inmunizados y se analizaron las suspensiones de esplenocitos mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis específica se evaluó comparando la proporción de células marcadas con CFSE pulsado a no pulsado en ratones vacunados versus ratones control. Los resultados muestran que todos los ratones inmunizados con las diferentes construcciones desarrollaron linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de hTERT después de una inmunización.

Como se esperaba, la citotoxicidad contra el péptido inmunodominante p351 fue mayor que contra el péptido subdominante p1123 para los tres grupos (Figura 26).

La inmunización con INVAC-1 y pUTInv condujo a una lisis específica de células diana portadoras de epítopos inmuno-dominantes de telomerasa (p351) de 37% y 35%, respectivamente (Figura 26, puntos de color negro). En comparación, la inmunización con pUTScram condujo a una lisis específica de 20%. Dos ratones de cinco inmunizados con INVAC-1 y uno de seis con pUTScram desarrollaron CTL específicos contra el péptido subdominante p1123 (Figura 26, puntos de color gris).

Como se indicó anteriormente, se puede esperar que múltiples ciclos de inyección permitan aumentar el número de animales que desarrollan una lisis por CTL específica contra péptidos inmunodominantes y subdominantes. De hecho, los resultados anteriores (véase el Ejemplo I) demostraron que una segunda inmunización amplía el abanico de respuestas inmunitarias contra los epítopos subdominantes.

En conclusión, como INVAC-1, la inmunización artificial mediada por hTERT con permutaciones al azar de Secuencia Aleatoria o de Secuencia Invertida puede generar células T CD8 específicas para hTERT que exhiben actividad citolítica in vivo.

Referencias

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Claims (15)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) que carece de actividad catalítica de telomerasa y de una señal de localización nucleolar, en donde la proteína hTERT se fusiona en el extremo N con ubiquitina o calreticulina.

2. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia que codifica la proteína hTERT contiene una mutación que proporciona la inactivación de la actividad catalítica de la proteína TERT.

3. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa por deleción de al menos un aminoácido.

4. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa por deleción de los aminoácidos 867-869 (VDD).

5. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde la proteína hTERT carece de actividad catalítica telomerasa por una deleción adicional de 1 a 12 aminoácidos aguas arriba y/o aguas abajo de los aminoácidos 867-869 (VDD).

6. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína hTERT carece de una señal de localización nucleolar por deleción de al menos los aminoácidos 1-23.

7. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde la proteína hTERT carece de una señal de localización nucleolar por deleción de los aminoácidos 1-47.

8. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína que potencia el direccionamiento de la proteína hTERT al proteasoma es ubiquitina.

9. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína que potencia el direccionamiento de la proteína hTERT al proteasoma es calreticulina.

10. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es un ADN, preferiblemente un plásmido de ADN.

11. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10, que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

12. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 11, que comprende SEQ ID NO: 11 o los nucleótidos 3488 a 6961 de SEQ ID NO: 11.

13. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 10, que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16 o 18, y preferiblemente comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13, 15 o 17.

14. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso en la activación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, contra células que expresan en exceso la telomerasa, preferiblemente células de displasia, células tumorales o células infectadas por un oncovirus.

15. La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la prevención o el tratamiento de un tumor en un paciente.