CN106061509A - 编码端粒酶的dna疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的人类端粒酶反转录酶(hTERT)蛋白的序列。所述构建体可用于在受试者中引发针对过表达端粒酶的细胞、优选为异型增生细胞或肿瘤细胞的免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤疫苗接种领域。更具体来说，本发明提供了编码人类端粒酶反转录酶蛋白的无活性酶形式的核酸构建体。
背景技术
使用主动免疫疗法刺激肿瘤特异性T-细胞应答与其他癌症治疗形式相比具有几个理论上的优点。为了获得临床益处，基于T-细胞的免疫疗法必须刺激识别肿瘤特异性抗原的CD8和CD4肿瘤反应性T-细胞应答两者。因此，越来越多的注意力集中于从多个肿瘤相关抗原(TAA)鉴定I类和II类MHC表位(Cheever等，2009)。然而，在不同类型的癌症中，大多数被表征的肿瘤抗原的非均质表达限制了靶向这些抗原的癌症疫苗的广泛适用性。在过去的几年中，人类端粒酶反转录酶(hTERT)作为第一个真正的共同肿瘤抗原出现，并且作为癌症免疫疗法的通用靶点进行了积极研究。人类端粒酶反转录酶(hTERT)是在染色体末端合成端粒DNA的端粒酶的催化亚基。hTERT在大多数人类肿瘤(>85％)和事实上所有类型的癌症中过表达。此外，端粒酶活化已变成最重要的肿瘤逃避机制之一，以避开端粒依赖性细胞死亡途径。已确认，靶向不参与肿瘤生长的抗原的治疗策略可以引起在临床上更加恶化的失去抗原的肿瘤突变体的选择。因此，端粒酶活性的下调或丧失将严重影响肿瘤细胞的生长潜力。此外，端粒酶是癌细胞的相对特性，因为正常的身体细胞在它们的大部分生命期限中表达很少或不表达端粒酶，并且一般具有比肿瘤细胞中的端粒更长的端粒。所有这些发现证明hTERT有资格临床应用于抗癌免疫疗法。
已在几项抗癌疫苗试验中广泛使用，肽疫苗接种是与hTERT抗原相关的最先进的策略。然而，几种因素可能影响基于这种肽的疫苗策略的最终成功，例如(1)人白细胞抗原(HLA)限制，(2)肿瘤细胞中肽的自然加工，(3)在肿瘤细胞上失去抗原呈递，(4)抗原特异性T细胞的功能，以及(5)在疫苗接种后宿主中免疫应答的长期持续性。
使用肽疫苗、尤其是短肽获得的记忆应答非常低并且不持久。这些非最理想的结果可以部分地通过缺少CD4 T-细胞辅助来解释。此外，MHC/肽疫苗复合物在呈递细胞上的半衰期仅为几小时，随后肽就消失。然后树突细胞不再将肽呈递到淋巴细胞，因此变成致耐受性的。肽呈递的这种缺陷在某些情况下可能是有害的(Rosenberg等，2004)。
发明概述
本发明人现在开发了一种DNA疫苗策略，其不显示出肽(甚至是长肽)疫苗接种的限于hTERT的某些表位的缺点。具体来说，DNA疫苗接种避免了用于蛋白质生产和纯化的昂贵且复杂的程序。此外，编码hTERT蛋白的DNA疫苗可以独立于患者的HLA限制而诱导CTL和CD4辅助性T-细胞两者，同时是安全的并诱导更好的定量和定性免疫应答。
本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的人类端粒酶反转录酶(hTERT)蛋白的序列。
在优选实施方式中，所述hTERT蛋白可以在N-端与增强所述hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的蛋白例如泛素融合。
本发明的核酸构建体可用于在受试者中引发针对过表达端粒酶的细胞、优选为异型增生细胞或肿瘤细胞以及被肿瘤病毒感染的细胞的免疫应答，优选为细胞性免疫应答。
在本文中描述了一种用于在患者中预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向需要的患者给药所述核酸构建体。
这种治疗可以被称为主动性免疫疗法或治疗性疫苗接种，因为它引发针对肿瘤的免疫应答、特别是细胞毒性CD8 T-细胞应答，以及特异性CD4 T-细胞应答。
由于CD4和CD8 T-细胞全部组成成分两者受到hTERT上可用的表位刺激，因此获得广泛的细胞系免疫应答。与肽疫苗接种中相比，针对许多hTERT表位的CD4和CD8 T-细胞的数量更高。白介素的生产提高，进一步诱导CD4 T-细胞，特别是Th1细胞因子，允许CD8 T-细胞的最适生长和分化，这是抗肿瘤细胞的标志。
在本发明的另一方面，提供了包含源自于人类端粒酶反转录酶(hTERT)的序列的核酸构建体，其中所述源自于hTERT的序列
i)以任何顺序编码hTERT的所有或基本上所有的表位，并且
ii)编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的蛋白。
事实上，本发明人证明，这种核酸构建体，在本文中也被称为“改组(shuffled)”端粒酶构建体，也引发hTERT特异性体内免疫应答，特别是细胞毒性CD8 T-细胞应答。
附图说明
图1A INVAC-1质粒图谱
| 位置(碱基) | 序列 | 起源 |
| 1-3478 | NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI载体 | NTC |
| 3479-3484 | HindIII克隆位点：A.AGCTT | NTC/Invectys |
| 3485-6967 | Ubi-hTERT转入基因 | Invectys |
| 6968-6973 | XbaI克隆位点：T.CTAGA | Invectys/NTC |
| 6974-7120 | NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI载体 | NTC |
载体特点
eRNA11a RIG-I激动剂：7-532
trpA原核终止子：535-564
腺病毒血清型5VA RNAI(VA1)：568-761
引发体组装位点(PAS-BH)延伸原点：771-1055
pUC复制原点：1056-2070
蔗糖选择标记(RNA-OUT)：2087-2231
SV40增强子：2232-2451
CMV增强子：2452-2897
CMV启动子：2898-3017
非翻译前导序列(外显子1)：3018-3204
HTLV-1R：3089-3314
合成的基于兔β-球蛋白的3’内含子：3323-3429
外显子2(SR-蛋白质结合位点-Kozak)：3430-3478
包括HindIII-XbaI克隆位点的Ubi-hTERT转入基因(Invectys)：3479-6973
真核终止子：6980-7114
图1B INVAC-1的凝胶验证
INVAC-1表达载体通过限制性作图来验证。图案对应于预期的限制性图谱。
第1道：1kb序列梯
第2道：未消化的INVAC-1
第3道：用BglII/NotI消化的INVAC-1(3496、3262、220、142bp条带)
第4道：用NcoI消化的INVAC-1(4084、3036bp条带)
第5道：用HindIII/XbaI消化的INVAC-1(3631、3489bp条带)
图2A hTERT、INVAC-1和INVAC-1衍生物
野生型hTERT和由INVAC-1和INVAC-1衍生物编码的修饰的Ubi-hTERT蛋白之间的示意性比对：pUTD10Not(缩写为Δ10Not)，pUTD10Cog(缩写为Δ10Cog)和pUTD23Tyn(缩写为Δ23)。
序列特点：
VDD：缺失了催化位点内的867-869位氨基酸
DGLLLRL(SEQ ID NO：19)：另外缺失了860-867位氨基酸；VDD上游缺失
FLLVTPH(SEQ ID NO：20)：另外缺失了869-876位氨基酸；VDD下游缺失
IRR：另外缺失了857-859位氨基酸；DGLLLRLVDD(SEQ ID NO：21)上游：缺失
LTH：另外缺失了877-879位氨基酸；VDDFLLVTPH(SEQ ID NO：22)下游：缺失
Ubi：人类泛素序列(1-76位氨基酸)
V5:便于蛋白质检测的C-端V5标签
图2B INVAC-1衍生物的凝胶验证
pUTD10Not、pUTD10Cog和pUTD23Tyn表达载体(INVAC-1衍生物)通过限制性作图来验证。图案对应于预期的限制性图谱。
M道：1kb序列梯
第1道：pUTD10Cog(5348、3585bp条带)
第2道：pUTD10Not(5348、3585bp条带)
第3道：pUTD23Tyn(5348、3546bp条带)
图3 通过蛋白质印迹评估的野生型hTERT、INVAC-1和INVAC-1衍生物在不同细胞系中的体外表达
将野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)、空载体(pNTC8685-eRNA41H，没有外来编码序列的INVAC-1骨架)、INVAC-1和INVAC-1衍生构建体(pUTD10Not/Δ10Not、pUTD10Cog/Δ10Cog和pUTD23Tyn/Δ23)转染到HEK293T细胞中(A，C)。将野生型hTERT、pNTC8685-eRNA41H空载体和INVAC-1构建体转染到CrFK细胞中(B)。
在HEK293T细胞中在转染后18-96h(A，C)并且在CrFK细胞中在转染后24-72h(B)监测蛋白质表达。
细胞收获的时间标注在每一道的顶上。对于膜A、B、C来说(hTERT，INVAC-1)每道上样来自于细胞裂解液的15μg总蛋白，对于膜C来说(Δ10Not，Δ10Cog，Δ23)每道上样20μg总蛋白裂解液。hTERT使用兔抗hTERT单克隆抗体(hTERT，INVAC-1)或使用抗标签V5抗体(Δ10Not，Δ10Cog，Δ23)来检测。使用β-肌动蛋白蛋白检测作为上样对照，并使用小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体来检测。来自于CrFK细胞的hTERT蛋白(B)和来自于HEK293T细胞的INVAC-1衍生蛋白(C)的检测需要较长暴露时间。
图4 通过免疫荧光评估的hTERT和INVAC-1构建体在不同细胞系中的细胞内定位
将野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)、空载体(pNTC8685-eRNA41H，没有外来编码序列的INVAC-1骨架)和INVAC-1构建体转染到HEK293T(A)或CrFK细胞(D)中24h，并转染到HeLa(B)或QT6(C)细胞中24h和48h。
对细胞进行处理，以使用兔抗hTERT单克隆抗体和山羊Alexa Fluor抗兔第二抗体(绿色)进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色(蓝色)。未处理的细胞只用DAPI染色。在荧光显微镜(x63)上分析细胞。
图5 通过TRAP测定法评估的hTERT、INVAC-1和INVAC-1衍生物的端粒酶活性
将CrFK细胞用野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)、INVAC-1和INVAC-1衍生构建体转染。24小时后收集细胞，提取总细胞蛋白，并通过端粒重复序列扩增流程(TRAP)测定法评估端粒酶(反转录酶)活性。显示了INVAC-1(A，B)和INVAC-1衍生构建体(C，D)相比于野生型hTERT和未处理的CrFK细胞的吸光度测量值(OD450/690nm)和相对端粒酶活性(RTA；样品/阳性对照比率)(对于2.1μg总蛋白浓缩样品来说n＝3)，**：p＝0.0016，***：p<0,0001，非配对t-检验。
在用INVAC-1和INVAC-1衍生物转染的CrFK细胞中没有检测到端粒酶活性。
图6：电穿孔的影响：在INVAC-1的ID给药后诱导显著水平的分泌干扰素-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞
将7周龄C57BL/6雌性小鼠用100μg INVAC-1或1X PBS ID免疫接种(每组2-8只小鼠)。对于一半的动物，在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处进行电穿孔。在疫苗接种后14天，收获所有小鼠的脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到H2b MHC的两种hTERT肽(p429，p660)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T细胞的频率中值。使用Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验。*:p-值<0.05。EP＝电穿孔。
图7：INVAC-1疫苗接种的各种不同给药途径的评估，在疫苗接种后通过电穿孔诱导分泌干扰素-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞
使用25μg INVAC-1或1X PBS，对7至10周龄的转基因HLA-B7小鼠通过A)ID或SC途径(每组3-8只小鼠)和B)ID或IM途径(每组4-5只小鼠)进行免疫接种。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处接受电穿孔。在疫苗接种后14天，收获所有小鼠的脾脏A)或外周血B)。对脾细胞或PBMC进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-B7 MHC的3种hTERT特异性肽(p351，p1123和p277)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞或PBMC中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T细胞的频率中值。使用Mann Whitney非参数检验，*：p-值<0.05。阴影线被自动设定在每200,000个脾细胞中10个分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞处作为截止阈值，以允许确定响应动物。
图8：疫苗剂量对使用INVAC-1的单次ID免疫接种和电穿孔后的hTERT特异性CD8T-细胞应答的影响
将7周龄的C57BL/6雌性小鼠A)用12.5、25、50或100μg INVAC-1或1X PBS(每组4-6只小鼠)和B)用100、200、400、800或1200μg INVAC-1或1X PBS(每组3-5只小鼠)进行ID免疫接种。在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点进行电穿孔。疫苗接种后14天，收获所有小鼠的脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到H2b MHC的两种hTERT肽(p429，p660)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。使用Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验。*：p-值<0.05，**：p-值<0.01。阴影线被自动设定在10个斑点/200,000个脾细胞，以允许确定响应动物。
图9：使用INVAC-1的初免-加强疫苗接种方案对分泌IFN-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞的影响
使用25μg INVAC-1，通过ID途径(每组5只小鼠)对7至10周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处接受电穿孔。21天后，小鼠使用同样的程序接受加强注射。在第一次免疫接种前、在初免后第7、15和21天以及在加强后第9、16和22天，收集外周血。
对PBMC进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-B7 MHC的3种hTERT肽(p351，p1123和p277)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。使用Mann Whitney非参数检验，*：p-值<0.05。阴影线被自动设定在10个斑点/200,000个脾细胞，以允许确定响应动物。
图10：使用INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog或Δ23的ID疫苗接种(单次免疫接种相比于初免-加强方案)随后进行电穿孔以诱导分泌IFN-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞的评估
A)用100μg INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog或Δ23或1X PBS对7周龄C57BL/6雌性小鼠进行ID免疫接种(每组4只小鼠)。在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点进行电穿孔。在第一次疫苗接种后21天，一半的动物使用相同的程序接受加强注射。对于接受单次或初免与加强注射的动物来说，分别在最后一次免疫接种后14天或10天收获小鼠脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到H2b MHC的两种hTERT肽(p429，p660)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。对于接受单次注射(初免，黑色点)或初免与加强注射(PB，白色点)的动物来说，结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。使用Mann Whitney非参数检验，*：p-值<0.05。截止值被自动设定在每200,000个脾细胞中10个分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T细胞(阴影线)，以允许确定响应动物。PB＝加强后。
B)使用100μg INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog或Δ23或1X PBS通过ID途径对7至10周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种(每组5只小鼠)。所有小鼠在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。在第一次疫苗接种后21天，小鼠使用相同的程序接受加强注射。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-B7 MHC的3种hTERT肽(p351，p1123和p277)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞或PBL中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。使用Mann Whitney非参数检验，*：p-值<0.05。截止值被自动设定在10个斑点/200,000个脾细胞，以便确定响应动物的频率(阴影线)。
图11：ID免疫接种然后电穿孔后hTERT特异性T-细胞应答的广度：INVAC-1、pNTC-hTERT和pNTC-hTERT-ΔVDD构建体之间的比较
使用25μg INVAC-1、hTERTΔVDD(pNTC-hTERT-ΔVDD)、hTERT(pNTC-hTERT)或空载体NTC(pNTC8685-eRNA41H)通过ID途径对7至13周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种(每组6只小鼠)。48只动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。一半的动物在第一次疫苗接种后21天使用相同的程序接受加强注射。对于接受单次或初免与加强注射的动物来说，分别在最后一次免疫接种后14天或10天收获小鼠脾脏。
对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中，使用一组269种从hTERT纯化的肽(纯度>70％，GenScript)，其被分成27种含有9-10种hTERT交叠肽(交叠11个氨基酸的15mer肽)的合并物，在过夜刺激(19小时)期间进行刺激，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。
对于每只小鼠来说，计算每三份平行实验和每种刺激条件(培养基或肽合并物)的斑点的中位数。然后在从肽合并物刺激的孔中的斑点中位数中减去培养基刺激的孔中的斑点中位数后，计算hTERT特异性T-细胞的频率(F)。为了后续分析，将负值设定到0。
对接受单次(A)或初免-加强(B)疫苗接种的动物进行该分析。(A和B)对于每个疫苗接种组(INVAC-1，hTERTΔVDD，hTERT，NTC)来说，计算每种刺激条件下每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的端粒酶特异性T-细胞的频率(F)的中值(n＝6)，以便为27种合并物中的每一种获得一个值。
(C)在用INVAC-1、hTERTΔVDD、hTERT或NTC疫苗接种后为27种合并物(269种纯化的肽)检测到的端粒酶特异性T-细胞的频率(F)的总中值之和。统计分析使用Prism 5软件，使用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn's校正来进行，p-值<0.05被认为是统计学显著的。
图12：INVAC-1 ID疫苗接种和电穿孔产生特异性细胞毒性CD8 T-细胞和Th1-CD4T-细胞的效力
A)使用25μg INVAC-1或1X PBS，通过ID途径对7至10周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种(每组5只小鼠)。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。在注射后第14天，将用限制到HLA-B7 MHC的单个hTERT肽(p351或p1123)脉冲或未被脉冲的同基因脾细胞用三种不同浓度的羧基荧光素-二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记：高浓度＝1μM(621)，中浓度＝0.5μM(987)，低浓度＝0.1μM(未脉冲的)。将相同数目的高、中或低浓度CFSE标记的细胞IV转移到接种疫苗的小鼠。在15-18小时后，通过流式细胞术确定脾脏中肽脉冲的细胞的消失。通过将接种疫苗的小鼠与对照小鼠中脉冲与未脉冲细胞的比率进行比较，来计算特异性裂解的百分率。数据表示在使用INVAC-1进行ID疫苗接种后，每只小鼠针对脾脏中的每种单独肽的特异性裂解的百分率。水平条显示了每种肽和每种免疫接种途径的平均裂解百分率。标准偏差也被作图(n＝10只个体动物/组)。统计分析使用Prism 5软件，使用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn's校正来进行，p-值<0.05被认为是统计学显著的。
B和C)使用25μg INVAC-1或1X PBS，通过ID途径对7至10周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行免疫接种(每组7-10只小鼠)。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。疫苗接种后14天，收获所有小鼠的脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并且B)将一半的脾细胞在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-DR1 MHC的3种hTERT特异性肽(p1029、p578和p904)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD4 T-细胞的频率中值。使用Mann Whitney非参数检验，***：p-值<0.001。
C)将另一半脾细胞用限制到HLA-DR1 MHC的3种hTERT特异性肽(p1029、p578和p904)的合并物刺激24h。从被刺激的细胞回收上清液并在CBA测定法中试验，以便评估由hTERT特异性CD4 T-细胞分泌的Th1/Th2和Th17细胞因子的浓度。结果是以pg/mL为单位的细胞因子浓度中值。使用Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验，*：p-值<0.05。
图13：在同基因HLA-A2/DR1转基因小鼠肿瘤模型中使用INVAC-1的治疗性或预防性ID疫苗接种并随后进行电穿孔的影响
A)使用100μg INVAC-1或1X PBS通过ID途径对5至10周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行免疫接种(每组5只小鼠)。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。在初免后21天，小鼠遵照相同的程序接受加强注射。在加强后1个月，使用50,000个Sarc-2肿瘤细胞(小鼠纤维肉瘤)通过SC途径对小鼠接种。示出了在肿瘤细胞移植后不同天时每个疫苗接种组中的肿瘤体积中值。在500mm3处画出阴影线，以允许计算肿瘤生长延迟。
B)使用20,000个Sarc-2肿瘤细胞(小鼠纤维肉瘤)通过SC途径对24周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行接种(每组10只小鼠)。在肿瘤细胞移植后4天，使用25μg INVAC-1或空质粒(NTC，没有抗原序列的INVAC-1骨架)通过ID途径对动物进行免疫接种。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。在初免后21和35天，小鼠使用相同的程序接受加强注射。示出了在激惹后不同天时每个疫苗接种组中的肿瘤体积中值。在500mm3处画出阴影线，以允许计算肿瘤生长延迟。
图14：INVAC-1诱导的细胞免疫应答被GM-CSF的强化和在同基因HLA-A2/DR1转基因小鼠肿瘤模型中的体内效能
A)用25μg INVAC-1、25μg INVAC-1和0.5μg mGM-CSF或1X PBS对7周龄的C57BL/6雌性小鼠进行ID免疫接种(每组5只小鼠)。在INVAC-1免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处进行电穿孔。疫苗接种后14天，从所有小鼠收获脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到H2b MHC的两种hTERT肽(p429，p660)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。使用Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验。**：p-值<0.01。
B)用100μg INVAC-1、100μg INVAC-1和5μg mGM-CSF通过ID途径对7至10周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行免疫接种(每组5只小鼠)。所有动物在INVAC-1免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处接受电穿孔。疫苗接种后14天，从所有小鼠收获脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并使用限制到HLA-DR1 MHC的3种hTERT特异性肽(p1029、p578和p904)的合并物刺激24小时，实验进行一式三份。从被刺激的细胞回收上清液，并在CBA测定法中试验，以便评估由hTERT特异性CD4 T-细胞分泌的Th1/Th2和Th17细胞因子的浓度。结果是以pg/mL为单位的细胞因子浓度中值。使用Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验，*：p-值<0.05。**：p-值<0.01。
C)使用20,000个Sarc-2肿瘤细胞(小鼠纤维肉瘤)通过SC途径对7至10周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行接种(每组10只小鼠)。在肿瘤细胞移植后4天，使用25μg INVAC-1和0.5μg mGM-CSF、空质粒(NTC，没有抗原序列的INVAC-1骨架)和0.5μg mGM-CSF或1X PBS和0.5μg mGM-CSF通过ID途径对动物进行免疫接种。所有动物在INVAC-1免疫接种后直接在每个疫苗接种位点接受电穿孔。在初免后21和35天，小鼠使用相同的程序接受加强注射。示出了在肿瘤细胞移植后不同天时每个疫苗接种组中的肿瘤体积中值。
在500mm3处画出阴影线，以允许计算肿瘤生长延迟。
图15：IL-12的影响：增强INVAC-1诱导的hTERT特异性CD8 T-细胞应答
用100μg INVAC-1、100μg INVAC-1和1ng IL-12、1X PBS或1X PBS和1ng IL-12通过ID途径对7至10周龄的转基因HLA-A2/DR1小鼠进行免疫接种(每组5只小鼠)。所有动物在INVAC-1免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处接受电穿孔。疫苗接种后14天，从所有小鼠收获脾脏。对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-A2的两种hTERT特异性肽(UCP4.1和UCP2.1)的合并物刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。将阴影线设定在10个斑点/200,000个脾细胞处，以允许确定响应动物。
图16示出了INVAC-1质粒表达载体的完整核苷酸序列(7120bp)。载体特点详述在图1A的图例说明中。INVAC-1编码的hTERT融合蛋白(1158 AA)始于3488位置处(编码M氨基酸的ATG)并止于6961位置处(编码D氨基酸的GAC)。INVAC-1/hTERT蛋白缺失了前47个氨基酸(1-47 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。通过编码VDD(序列中的*)并对应于野生型人类端粒酶(hTERT；登记号NM_198253)的AA 867-869的9bp的缺失，使催化位点失活。第一行是核苷酸序列；第二行是相应的氨基酸序列。在序列上方或下方给出了注释(也参见图1A)。“□”：终止密码子。
图17示出了编码D10Not人类泛素-端粒酶融合蛋白(Ubi-hTERT)的插入序列。hTERT缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在912-913位氨基酸之间引入了另一个缺失(*，参见序列)，其对应于野生型人类端粒酶(hTERT；登记号NM_198253)的AA 860-869。这10个氨基酸缺失包括引起人类TERT酶活性失活的3个氨基酸缺失(ΔVDD)和VDD序列上游的另外7个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。第一行是核苷酸序列；第二行是相应的氨基酸序列。在序列上方或下方给出了注释。“□”：终止密码子。
图18示出了编码D10Cog人类泛素-端粒酶融合蛋白(Ubi-hTERT)的插入序列。hTERT缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在919-920位氨基酸之间引入了另一个缺失(*，参见序列)，其对应于野生型人类端粒酶(hTERT；登记号NM_198253)的AA 867-876。这10个氨基酸缺失包括引起人类TERT酶活性失活的3个氨基酸缺失(ΔVDD)和VDD序列下游的另外7个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。第一行是核苷酸序列；第二行是相应的氨基酸序列。在序列上方或下方给出了注释。“□”：终止密码子。
图19示出了编码D23Tyn人类泛素-端粒酶融合蛋白(Ubi-hTERT)的插入序列。hTERT缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在909-910位氨基酸之间引入了另一个缺失(*，参见序列)，其对应于野生型人类端粒酶(hTERT；登记号NM_198253)的AA 857-879。这23个氨基酸缺失包括引起人类TERT酶活性失活的3个氨基酸缺失(ΔVDD)和VDD序列上游和下游的另外10个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。第一行是核苷酸序列；第二行是相应的氨基酸序列。在序列上方或下方给出了注释。“□”：终止密码子。
图20 INVAC-1改组的衍生质粒图谱
图20A pUTScram：载体特点
图20B pUTInv：载体特点
图21A pUTScram的凝胶验证
pUTScram表达载体通过限制性作图进行验证。所述图案对应于预期的限制性图谱。
道M：1kb序列梯
第1道：用HindIII/XbaI消化的pUTScram(3576、5342bp条带)
图21B pUTInv的凝胶验证
pUTInv表达载体通过限制性作图进行验证。所述图案对应于预期的限制性图谱。
道M：1kb序列梯
第1道：用HindIII/XbaI消化的pUTInv(3576、5342bp条带)
图22 hTERT、INVAC-1、pUTScram和pUTInv构建体
野生型hTERT与由INVAC-1和INVAC-1改组衍生物pUTScram(混杂的)和pUTInv(反向的)编码的修饰的Ubi-hTERT蛋白之间的示意性比对。
修饰的hTERT序列(ΔVDD)被分成10个免疫原性片段：片段1(258bp；Leu24-Gly109)，片段2(201bp；Phe115-Ala181)，片段3(120bp；Trp203-Ala242)，片段4(117bp；Ser255-Arg293)，片段5(303bp；Pro320-Thr420)，片段6(312bp；Ala423-Val526)，片段7(210bp；Cys528-Gln597)，片段8(477bp；Arg599-Lys757)，片段9(576bp；Lys760-Ile951)，片段10(516bp；Asn958-Asp1129).
序列特点：
VDD：催化位点内867-869位氨基酸的缺失
Ubi：人类泛素序列(1-76位氨基酸)
F(Phe)：hTERT的苯丙氨酸残基(AA47)
G(Gly)：泛素的C-端甘氨酸残基(AA76)
R(Arg)：精氨酸，INVAC-1蛋白的第一个氨基酸(AA 77)
N(Asn)：天冬酰胺，由pUTScram编码的人造hTERT蛋白(混杂的)的第一个氨基酸(AA 81)
C(Cys)：半胱氨酸，由pUTInv编码的人造hTERT蛋白(反向的)的第一个氨基酸(AA81)
V5：用于方便的蛋白质检测的C-端V5标签
图23通过蛋白质印迹评估的野生型hTERT、INVAC-1和INVAC-1改组衍生物的体外表达
将野生型hTERT、INVAC-1、pUTScram和pUTInv转染到HEK293T细胞中。在转染后监测蛋白质表达18-96h。(A和C)将18h和72h的野生型hTERT和INVAC-1样品以15μg的总蛋白浓度上样。这些样品被用作蛋白表达的阳性对照。(A)混杂的和(C)反向的蛋白从细胞裂解液以每道20μg的总蛋白上样。使用兔抗hTERT单克隆抗体(hTERT，INVAC-1)或小鼠抗标签V5单克隆抗体(混杂的，反向的)检测hTERT。细胞收获的时间注明在每条道的顶上。β-肌动蛋白被用作上样对照，并使用小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体检测。INVAC-1改组衍生产物的检测需要比野生型hTERT和INVAC-1蛋白更长的暴露时间(10秒至30分钟相比于不到1秒)。
使用ImageJ软件将改组蛋白的信号强度归一化至蛋白质印迹上的β-肌动蛋白信号(A和C)。(B)混杂的。(D)反向的。为每条道产生上样对照和蛋白质条带的轮廓图，以便获得对应于曲线轮廓下的面积的任意数字。通过用每个样品的面积值除以相应的上样对照的面积值来计算比率(相对密度)。
图24 通过TRAP测定法评估的hTERT、INVAC-1和INVAC-1改组衍生物的端粒酶活性
将CrFK细胞用野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)、pUTScram和pUTInv构建体转染。24小时后收集细胞，提取总细胞蛋白并通过端粒重复序列扩增流程(TRAP)测定法评估端粒酶(反转录酶)活性。显示了改组构建体(分别为A和B)相比于野生型hTERT和未处理的CrFK细胞的吸光度测量值(OD450/690nm)和相对端粒酶活性(RTA；样品/阳性对照比率)(对于2.1μg总蛋白浓缩样品来说n＝3)，进行非配对t-检验。
在用pUTScram和pUTInv构建体转染的CrFK细胞中没有检测到端粒酶活性。
图25：用INVAC-1、pUTScram和pUTInv进行ID疫苗接种随后电穿孔以诱导分泌干扰素-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞的评估
在两个免疫接种循环(初免-加强方案)后，使用100μg INVAC-1、pUTScram、pUTInv或1X PBS通过ID途径对9至15周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种(每组3-5只小鼠)。在每次免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处进行电穿孔。在第二次免疫接种后10天收获小鼠脾脏。
对脾细胞进行Ficoll纯化，并在IFN-γELIspot测定法中使用限制到HLA-B7 MHC的3种特异性hTERT肽(p277、p351和p1123)的合并物或游离培养基刺激19小时，实验进行一式三份。斑点使用生物素偶联的检测抗体，然后使用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示。结果是每200,000个脾细胞中分泌IFNγ的hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值。进行Mann Whitney非参数检验，*：p-值<0.05。截止值被自动设定在10个斑点/200,000个脾细胞，以便确定响应动物的频率(阴影线)。
图26：pUTScram和pUTInv在ID疫苗接种和电穿孔后产生hTERT特异性细胞毒性CD8T-细胞的效力
使用100μg INVAC-1、pUTScram、pUTInv或1X PBS，通过ID途径对15周龄的转基因HLA-B7小鼠进行免疫接种(每组4-6只小鼠)。所有动物在免疫接种后直接在每个疫苗接种位点处接受电穿孔。在注射后第14天，将用限制到HLA-B7 MHC的单个hTERT肽(p351或p1123)脉冲或未被脉冲的同基因脾细胞用三种不同浓度的羧基荧光素-二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记：高浓度＝5μM(351)，中浓度＝2μM(1123)，低浓度＝0.2μM(未脉冲的)。将含有相等数量的来自于每种浓度的CFSE标记的细胞的混合物通过眶后静脉(IV)注入到接种疫苗的小鼠。在15-18小时后，通过流式细胞术确定脾脏中肽脉冲的细胞的消失。通过将接种疫苗的小鼠与对照小鼠中脉冲与未脉冲细胞的比率进行比较，来计算特异性裂解的百分率。数据表示在ID疫苗接种后每只小鼠针对脾脏中的每种单独肽的特异性裂解的百分率。水平条显示了每种肽的裂解百分率中值。统计分析使用Prism 5软件，使用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn's校正来进行，p-值<0.05被认为是统计学显著的。
图27示出了用于INVAC-1改组衍生构建体的Ubi-hTERT的密码子优化的序列的免疫原性区段的轮廓图。第一行是Ubi-hTERT的密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)，第二行是相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)。Ubi-hTERT序列被分成10个包括免疫原性序列的片段。这些片段用符号(<...>)勾画轮廓。免疫原性序列用灰色突出。未包括在pUTScram和pUTInv构建体中的非免疫原性的片段间hTERT序列被下划线。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。在序列上方或下方给出了注释。(*)指示VDD序列缺失。“□”：终止密码子。
图28示出了pUTScram插入片段的完整核苷酸序列(3555bp)。载体特点详细描述在图20的图例说明中。Ubi-hTERT改组插入片段(混杂的，1184 AA)始于pUTScram的923位(编码M氨基酸的ATG)并止于4474位(编码T氨基酸的ACT)。hTERT蛋白缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。通过编码VDD(序列中的*)并对应于野生型人类端粒酶(hTERT；专利WO 2007/014740和hTERT同工型1登记号NM_198253)的AA 867-869的9bp的缺失，使催化位点失活。hTERT序列被分成10个免疫原性片段并以下述特定顺序重新组装：片段7(210bp)，片段2(201bp)，片段6(312bp)，片段4(117bp)，片段9(576bp)，片段3(120bp)，片段1(258bp)，片段8(477bp)，片段10(516bp)，片段5(303bp)。这10个片段用6xGly连接物(G连接物；18bp)桥接。Ubi-hTERT改组插入片段的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。第一行是核苷酸序列(SEQ ID NO：47)；第二行是相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。在序列上方或下方给出了注释(也参见图20A)。“□”：终止密码子。
图29示出了pUTInv插入片段的完整核苷酸序列(3555bp)。载体特点详细描述在图20的图例说明中。Ubi-hTERT改组插入片段(反向的，1184 AA)始于pUTInv的923位(编码M氨基酸的ATG)并止于4474位(编码T氨基酸的ACT)。hTERT蛋白缺失了前23个氨基酸(1-23AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。通过编码VDD(序列中的*)并对应于野生型人类端粒酶(hTERT；专利WO 2007/014740；登记号NM_198253)的AA 867-869的9bp的缺失，使催化位点失活。hTERT序列被分成10个免疫原性片段并以下述特定顺序重新组装：片段10(516bp)，片段9(576bp)，片段8(477bp)，片段7(210bp)，片段6(312bp)，片段5(303bp)，片段4(117bp)，片段3(120bp)，片段2(201bp)，片段1(258bp)。这10个片段用6xGly连接物(G连接物；18bp)桥接。Ubi-hTERT改组插入片段的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签。第一行是核苷酸序列(SEQ ID NO：49)；第二行是相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。在序列上方或下方给出了注释(也参见图20B)。“□”：终止密码子。
发明详述
定义
端粒酶复合体由RNA模板和蛋白质组分构成，所述蛋白质组分包括被称为“端粒酶反转录酶”(TERT)的反转录酶，它是端粒酶活性的主要决定者。除非另有规定，否则在本申请书中，术语“端粒酶”是指TERT，包括野生型人类端粒酶或其变体。野生型人类端粒酶(或hTERT)是已知的(GeneBank登记号NM_198253)，并具有氨基酸序列SEQ ID NO：2(cDNA被显示为SEQ ID NO：1)。
“端粒酶催化活性”是指TERT作为端粒酶反转录酶的活性。术语“不具有端粒酶催化活性”意味着核酸序列编码无活性的突变体TERT。
在本发明中，术语“变体”是指与参比的hTERT序列同源的等位基因变体、剪接变体、天然或人造突变体。两个氨基酸序列，当一个或多个氨基酸残基被生物学上相似的残基替换时或当超过80％的氨基酸是一致的或超过约90％、优选地超过约95％的氨基酸是相似的(功能上一致的)时，是“同源的”、“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，相似或同源的序列使用例如GCG(Genetics Computer Group,GCG包程序手册,版本7,Madison,Wisconsin)pileup程序或本领域中已知的任何程序(BLAST、FASTA等)通过比对来鉴定。
在本发明中，“替换”或“修饰”包括已从天然存在的氨基酸被改变或修饰的那些氨基酸。
变体包括其序列与野生型hTERT蛋白相差一个或几个突变(即替换、缺失、插入)、更优选为一个或几个单点替换的蛋白质。变体可以包含保守替换。当在本文中使用时，术语“保守替换”是指将一个氨基酸用另一个氨基酸代替，而不改变所述肽的总体构象和功能，包括但不限于将氨基酸用具有相似性质(例如极性、氢键成键潜力、酸性、碱性、形状、疏水性、芳香性等)的氨基酸代替。具有相似性质的氨基酸在本领域中是公知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水碱性氨基酸并且可以互换。同样地，异亮氨酸这种疏水氨基酸，可以用亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替换。可以彼此替换的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
术语“分离的多核苷酸”被定义为从其天然存在的环境中取出的多核苷酸。例如，存在于活细菌的基因组中或作为基因库的一部分存在的天然存在的DNA分子不是分离的，但作为例如克隆事件(扩增)的结果而与细菌基因组的其余部分分开的同一分子是分离的。通常，分离的DNA分子不含在天然存在的基因组中与其在5’或3’末端紧邻的DNA区域(例如编码区)。这些分离的多核苷酸可以是载体或组合物的一部分并且仍被定义为分离的，因为这种载体或组合物不是这些多核苷酸的天然环境的一部分。
术语“免疫原性的”意味着它所指称的组合物或构建体在给药后能够诱导免疫应答。受试者中的“免疫应答”是指发生针对抗原的先天性和适应性免疫应答，包括体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答。“体液免疫应答”是指由抗体介导的免疫应答。“细胞免疫应答”是由T-淋巴细胞介导的免疫应答。它包括由活化的T-细胞、白细胞或两者产生的细胞因子、趋化因子和类似分子的生产。免疫应答可以使用本领域中已知的用于检测体液免疫应答的标准免疫测定法和中和测定法来确定。
在本发明的情形中，免疫应答优选地涵盖细胞毒性CD8 T-细胞和/或CD4 T-细胞的刺激或增殖，并且可以使用免疫测定法例如ELIspot测定法、体内细胞毒性测定法或细胞因子分泌结合测定法来确定。
当在本文中使用时，术语“治疗”或“疗法”或“免疫疗法”是指症状的任何减轻、改善和/或消除、减少和/或稳定化(例如不能发展到更高级阶段)，以及肿瘤或异型增生或其症状的进展延迟。因此，这些术语包括在癌症患者中观察到的高效抗肿瘤免疫应答的实现。
当在本文中使用时，术语“预防”是指前驱症状，即在特定症状出现之前可能指示疾病开始的任何变化或早期症状(或一组症状)的减轻、改善和/或消除、减少和/或稳定化(例如不能发展到更晚期阶段)。
“过表达端粒酶”的细胞是指受试者中的细胞，其在例如突变或感染、特别是被肿瘤病毒感染后表达端粒酶，而它在正常条件下通常不这样，或者是指受试者中的细胞，其(例如在突变或感染后)与正常条件相比表达更高水平的端粒酶。优选地，过表达端粒酶的细胞表现出表达提高至少5％、至少10％、至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
“患者”或“受试者”通常是任何年龄、性别或病症严重性的哺乳动物受试者，优选为人类受试者。
核酸构建体
本文中提供了一种被设计成允许在患者中接种疫苗的核酸构建体。所述核酸构建体编码不具有端粒酶催化活性(这废止了它的永生化活性)并且不具有核仁定位信号(这阻止它向核仁的转移)的端粒酶。
本发明的核酸构建体采取分离的形式。
所述核酸可以是DNA或RNA，但优选为DNA，更优选为双链DNA。
所述核酸构建体不是天然存在的基因组核酸，特别是它不包含内含子。
作为第一保险锁，所述hTERT序列不具有端粒酶催化活性。在优选实施方式中，编码hTERT的序列含有提供hTERT蛋白的催化活性的失活的突变。术语“突变”包括一个或几个氨基酸的替换、一个或几个氨基酸的缺失和/或一个或几个氨基酸的插入。在特定实施方式中，所述hTERT蛋白通过缺失至少一个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
优选地，所述序列显示出缺失，优选为图2A中所示的氨基酸VDD的缺失。优选地，所述hTERT蛋白通过仅缺失867-869位氨基酸(VDD)而不具有端粒酶催化活性。在另一个特定实施方式中，所述hTERT蛋白通过进一步缺失867-869位氨基酸(VDD)上游和/或下游的1至10、11或12个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
作为第二保险锁，编码hTERT的序列还不具有核仁定位信号。该核仁定位信号与hTERT的亚细胞定位并因此与它的酶活性相关。优选地，所述hTERT蛋白通过缺失至少1-23位氨基酸，更优选地通过缺失1-47位氨基酸而不具有核仁定位信号。
除了提供所述第一和第二保险锁的修饰之外，由本发明的核酸构建体编码的hTERT蛋白可以是野生型hTERT序列或变体序列。
在序列表中，
SEQ ID NO：1是野生型hTERT的cDNA；
SEQ ID NO：2是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3是在INVAC-1载体中使用的hTERT的cDNA；
SEQ ID NO：4是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5是在pUTD10Not载体中使用的hTERT的cDNA；
SEQ ID NO：6是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7是在pUTD10Cog载体中使用的hTERT的cDNA；
SEQ ID NO：8是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9是在pUTD23Tyn载体中使用的hTERT的cDNA；
SEQ ID NO：10是相应的氨基酸序列。
在优选实施方式中，本发明利用了编码SEQ ID NO：4的蛋白质的核酸。
这种核酸可以包含序列SEQ ID NO：3。
在另一个实施方式中，所述核酸构建体编码氨基酸序列SEQ ID NO：6、8或10，并优选地包含SEQ ID NO：5、7或9。
在优选实施方式中，所述核酸还可以编码增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址(增加衍生肽的I类呈递)的蛋白。更具体来说，所述hTERT蛋白可以在N-端与这种增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的蛋白融合。所述蛋白优选地可以是泛素，或者它可以是任何伴侣蛋白例如钙网蛋白。
在序列表中，
SEQ ID NO：11是包括由INVAC-1编码的Ubi-hTERT的cDNA的INVAC-1质粒的全长序列；
SEQ ID NO：12是由INVAC-1编码的Ubi-hTERT的相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：13是pUTD10Not插入片段的cDNA；
SEQ ID NO：14是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：15是pUTD10Cog插入片段的cDNA；
SEQ ID NO：16是相应的氨基酸序列；
SEQ ID NO：17是pUTD23Tyn插入片段的cDNA；
SEQ ID NO：18是相应的氨基酸序列。
在特定实施方式中，所述核酸构建体编码氨基酸序列SEQ ID NO：12。
更具体来说，所述核酸构建体可以包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：11的3488至6961位核苷酸。
在另一个实施方式中，所述核酸构建体编码氨基酸序列SEQ ID NO：14、16或18，并且优选地包含SEQ ID NO：13、15或17。
在另一个实施方式中，提供了包含源自于人类端粒酶反转录酶(hTERT)的序列的核酸构建体，其中所述源自于hTERT的序列
i)以任何顺序编码hTERT的所有或基本上所有的表位，并且
ii)编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的蛋白。
本发明的核酸构建体采取分离的形式。
所述核酸可以是DNA或RNA，但优选为DNA，更优选为双链DNA。所述核酸构建体不是天然存在的基因组核酸，特别是它不包含内含子。
在整个本说明书中，这些构建体被称为“改组构建体”或“多表位构建体”。
术语“hTERT的表位”是指hTERT的作为抗原决定簇的任何氨基酸片段，即它被免疫系统的细胞识别并且具有免疫原性，即它可以引发免疫应答。优选地，它可以特异性地被抗hTERT T-细胞识别。hTERT的几个免疫原性表位序列已被描述。对于I类MHC限制的hTERT表位参见例如国际专利申请WO07014740。一些其他表位序列在本文中描述(参见图27以及下面的表20)。
这些“改组构建体”能够引发针对hTERT的特异性免疫应答，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别野生型表位。
这些“改组构建体”都不与全长hTERT的编码序列一致。
术语“基本上所有的表位”意味着所述核酸构建体编码的蛋白质包含野生型hTERT的至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％或至少95％的表位。
编码所述多个表位的多核苷酸单元可以以任何顺序连续地重新排列，即第一个多核苷酸单元的3’末端直接连接到第二个多核苷酸单元的5’末端(以此类推)，产生编码专门由连续的表位构成的肽序列的多核苷酸。或者，所述多个表位可以被单氨基酸间隔物或肽间隔物分隔开，即意味着不同的多核苷酸单元被编码一个或几个氨基酸的相应的一个或几个密码子分隔开。通常，免疫原性hTERT片段可以被大约4至6个Gly氨基酸分隔开。
表位被重新安排的顺序可以由本领域技术人员按照下述判据来确定：某些顺序可能便于多核苷酸的转录和/或翻译，可能便于得到的表达的多表位在内质网(ER)中的运输，特别是如果三维构象影响性质的话，以及可能便于几个表位或类似物中的多表位的加工并避免交叠表位的加工。在优选实施方式中，hTERT的从24位氨基酸至1132位氨基酸的所有或基本上所有的免疫原性表位由所述核酸构建体编码，尽管采取任何顺序。
下面的表示出了可以在“改组构建体”中重新排列的免疫原性序列：
因此，本发明提供了一种多表位核酸构建体，其以任何顺序包含被显示为SEQ IDNO：61至97的所有或基本上所有的免疫原性序列。
所述序列不具有端粒酶催化活性。在优选实施方式中，带有hTERT催化活性的片段含有提供了催化活性的失活的突变。术语“突变”包括一个或几个氨基酸的替换、一个或几个氨基酸的缺失和/或一个或几个氨基酸的插入。在特定实施方式中，所述蛋白通过缺失至少一个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
优选地，所述序列表现出缺失，优选为图22中所示的氨基酸VDD的缺失。优选地，所述hTERT蛋白通过只缺失867-869位氨基酸(VDD)而不具有端粒酶催化活性。在另一个特定实施方式中，所述蛋白通过进一步缺失hTERT的867-869位氨基酸(VDD)上游和/或下游的1至10、11或12个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
所述序列也不具有核仁定位信号。该核仁定位信号与hTERT的亚细胞定位并因此与它的酶活性相关。优选地，所述蛋白通过缺失至少1-23位氨基酸，更优选地通过缺失hTERT的1-47位氨基酸而不具有核仁定位信号。
在优选实施方式中，所述核酸还可以编码增强蛋白向蛋白酶体寻址(增加衍生肽的I类呈递)的蛋白。更具体来说，所述蛋白可以在N-端与这种增强蛋白向蛋白酶体寻址的蛋白融合。所述蛋白优选地可以是泛素，或者它可以是任何伴侣蛋白，例如钙网蛋白。
ΔhTERT是指缺失了867-869位氨基酸VDD的hTERT。
具体的核酸构建体以任何顺序包含编码ΔhTERT的Leu24至Gly109的片段1(SEQID NO：51)、编码ΔhTERT的Phe115至Ala181的片段2(SEQ ID NO：52)、编码ΔhTERT的Trp203至Ala242的片段3(SEQ ID NO：53)、编码ΔhTERT的Ser255至Arg293的片段4(SEQ IDNO：54)、编码ΔhTERT的Pro320至Thr420的片段5(SEQ ID NO：55)、编码ΔhTERT的Ala423至Val526的片段6(SEQ ID NO：56)、编码ΔhTERT的Cys528至Gln597的片段7(SEQ ID NO：57)、编码ΔhTERT的Arg599至Lys757的片段8(SEQ ID NO：58)、编码ΔhTERT的Lys760至Ile951的片段9(SEQ ID NO：59)、编码ΔhTERT的Asn958至Asp1129的片段10(SEQ ID NO：60)。
优选的构建体编码SEQ ID NO：48(在本文中也被称为“混杂的”)，其也显示在图28上。
另一个优选的构建体编码SEQ ID NO：50(在本文中也被称为“反向的”)，其也显示在图29上。
遗传构建体、免疫原性组合物和给药
优选地，所述核酸是一种遗传构建体，其包含本文中所定义的多核苷酸序列，以及允许蛋白质产物在宿主细胞或宿主生物体中表达(例如转录和翻译)的调控序列(例如适合的启动子、增强子、终止子等)。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选为双链DNA。本发明的遗传构建体也可以采取适合于转化目标宿主细胞或宿主生物体的形式，采取适合于整合到目标宿主细胞的基因组DNA中的形式，或采取适合于在目标宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以采取载体的形式，例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。具体来说，所述载体可以是表达载体，即能够在体外和/或体内(例如在适合的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)提供表达的载体。
在优选但非限制性情况下，本发明的遗传构建体包含i)至少一种本发明的核酸；其可操作连接到ii)一个或多个调控元件，例如启动子和任选适合的终止子；并且任选地还包含iii)遗传构建体的一个或多个其他元件，例如3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报告基因和/或可以促进或提高转化或整合(的效率)的元件。
在特定实施方式中，所述遗传构建体可以如下制备：将核酸聚合物用限制性内切酶消化，并克隆到含有启动子例如SV40启动子、细胞肥大病毒(CMV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子的质粒中。在优选实施方式中，将TERT核酸序列插入到NTC8685-eRNA41H表达质粒中(参见图1A)。
其他载体包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体、麻疹病毒载体和腺病毒相关载体。
可以制备包含所述核酸或载体的组合物。所述组合物是免疫原性的。它们可以包含适合于在人类或哺乳动物中给药的(即无毒并且如有必要无菌的)载体或赋形剂。这样的赋形剂包括充当药物介质的液体、半固体或固体稀释剂、等渗剂、稳定剂或任何佐剂。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。本领域中已知的任何佐剂可以使用在疫苗组合物中，包括基于油的佐剂例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖、蛋白聚糖、氢氧化铝、皂角苷、DEAE-葡聚糖、中性油类(例如miglyol)、植物油(例如花生油)、多元醇。
所述核酸或组合物可以直接给药，或者它们可以在给药前包装在脂质体中或包衣在胶体金粒子上。用于将DNA疫苗包装到脂质体中的技术在本领域中是已知的，例如从Murray，1991。同样地，用于将裸露的DNA包衣到金粒子上的技术在Yang，1992中教示，并且使用病毒载体表达蛋白的技术可以在Adolph，1996中找到。
对于遗传免疫接种来说，优选地将疫苗组合物通过注射或通过气体驱动的粒子轰击真皮内、皮下、肌肉内给药到肿瘤中或任何类型的淋巴器官中，并且疫苗组合物以有效地在宿主生物体中刺激免疫应答的量递送。在本发明的优选实施方式中，除了注射步骤之外，给药还包括电穿孔步骤，其在本文中也用术语“电转移”指称(如Mir 2008，Sardesai和Weiner 2011中所述)。
所述组合物也可以使用脂质体转染、粒子轰击或病毒转导(包括共培养技术)离体给药到淋巴细胞或髓系细胞。然后将处理过的细胞重新导回到待免疫接种的受试者中。
尽管应该理解所需材料的量取决于每种个体构建体的免疫原性并且不能先验预测，但对于任何给定的构建体来说确定适合剂量的方法是简单明了的。具体来说，将例如始于约5到30μg或优选地20-25μg直至约500μg到约5mg、优选地直至500-1500μg、500-1200μg或500-1000μg的一系列大小逐渐增加的剂量给药到相应物种，并观察产生的免疫应答，例如通过IFNγElispot测定法(如实验部分中所述)检测细胞免疫应答，使用体内裂解测定法或铬释放测定法检测CTL应答，或使用细胞因子释放测定法检测Th(辅助性T-细胞)应答。
在优选实施方式中，疫苗接种方案包含1至3次注射，优选地在3或4周后重复。
在特定实施方式中，疫苗接种日程安排可以如下构成：1或2次注射，随后在3或4周后进行至少一个循环的3至5次注射。
在另一个实施方式中，初免给药由1至3次注射构成，随后例如每年或每两年或多年进行至少一次加强给药。
这些仅仅是示例，并且任何其他疫苗接种方案被涵盖在本文中。
肿瘤的预防或治疗
如上所述的核酸或免疫原性组合物可用于在患者中预防或治疗肿瘤的方法中。
描述了在患者中预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包括在需要的患者中给药有效量的所述核酸或免疫原性组合物。所述核酸或免疫原性组合物以足以在所述患者中诱导免疫应答的量给药。
所述肿瘤可以是任何不想要的细胞增殖，尤其是良性肿瘤或恶性肿瘤，特别是癌症。
所述癌症可以处于任何发展阶段，包括转移阶段。所述癌症可以是慢性或非慢性(急性)的。
在特定实施方式中，肿瘤是实体肿瘤或癌。实例包括黑素瘤、脑肿瘤例如成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和星形细胞瘤，以及膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌或胃癌。
在另一个实施方式中，所述肿瘤可以是液体肿瘤，例如造血系肿瘤或白血病，例如慢性或急性淋巴细胞白血病、慢性或急性髓性白血病、淋巴瘤包括霍奇金病、多发性骨髓瘤、恶性骨髓瘤。
在特定实施方式中，本发明的治疗可以与常规疗法包括化疗、放疗或手术相结合。与辅助性免疫调节分子例如GM-CSF或细胞因子如IL-2或IL-12的组合，可能也是有用的。
附图和实施例说明本发明但不限制其范围。
实施例1
缩写：
AA：氨基酸，APC：抗原呈递细胞，bp：碱基对，CTL：细胞毒性T-淋巴细胞，CMV：细胞肥大病毒，DNA：脱氧核糖核酸，EP：电穿孔，HTLV-1：人类T-淋巴细胞病毒I型，hTERT：人类端粒酶反转录酶，ID：真皮内，IM：肌肉内，IV：静脉内，LTRs：长末端重复序列，NoLS：核仁定位序列，PBMC：外周血单核细胞，RIG-I：视黄酸诱导基因1，RNA：核糖核酸，RT：室温，RTA：相对端粒酶活性，SC：皮下，TRAP：端粒重复序列扩增流程，TERT：端粒酶反转录酶，Ubi：泛素，VDD：缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸
材料和方法
质粒DNA载体
INVAC-1
INVAC-1是7120bp的质粒表达载体，其编码1158个氨基酸的人类泛素-端粒酶融合构建体(Ubi-hTERT)，对应于约127.4kDa的蛋白(图1A和16)。由于INVAC-1旨在用于人类中，因此出于安全原因已将端粒酶反转录酶活性失活。事实上，由INVAC-1编码的人类TERT序列在催化位点中通过编码三个氨基酸缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(867-869 AA)的9bp的缺失进行修饰，所述三个氨基酸用单字母编码缩写为VDD(图2A)。此外，包括端粒酶亚细胞定位所需的核仁定位序列(NoLS)的蛋白N-端部分的47个氨基酸(Yang，2002)，被泛素(Ubi)编码序列(1-76 AA)替换。
将Ubi-hTERT转入基因插入到NTC验证过的载体骨架(Nature TechnologyCorporation,LiNcoIn,Nebraska)中，所述载体骨架合并有仔细设计的用于高得率细菌生产的合成基因，提高了在哺乳动物细胞中的表达并因此引起有效的免疫应答。
靶基因表达从优化的嵌合启动子-内含子(SV40-CMV-HTLV-1R合成内含子)驱动，所述嵌合启动子-内含子由CMV启动子和外显子1的起点和HTLV-1R序列构成，所述HTLV-1R序列含有5’剪接受体位点、基于兔β-球蛋白内含子的合成的3’受体位点、包含富含丝氨酸-精氨酸(SR)的蛋白质结合位点以提高RNA输出的外显子2剪接增强子(Lavigueur等，1993)以及目的基因起始密码子上游的外显子2Kozak序列。终止密码子与终止子之间的DNA受到限制，以降低隐蔽肽表达或不想要的microRNA介导的表达改变的可能性。
为了提高细胞免疫应答，所述载体编码视黄酸诱导基因-1(RIG-I)先天性免疫应答激活剂的RNA聚合酶III转录的双链RNA激动剂。
不存在与该载体相关的已知毒性特点。所述质粒在真核靶细胞中不复制。所述载体骨架本身不含蛋白质编码序列，并且在所述载体骨架中没有鉴定到可替选的编码蛋白质的开放阅读框，因此没有抗生素抗性基因。质粒选择利用无抗生素的蔗糖选择性标记(RNA-OUT)来进行。
基因合成和克隆
Ubi-hTERT基因通过交叠的40mer寡核苷酸组装过程从头合成(GeneCust，Luxembourg)。制造了几个保守碱基改变以消除限制性位点并弱化富含GC的序列。使用HindIII-XbaI克隆位点将插入片段克隆到表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen,Carlsbad,USA)中，并通过测序进行验证。
Ubi-hTERT插入片段在克隆载体NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI中的亚克隆
将泛素-端粒酶插入片段克隆到由NTC设计的NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI表达载体中。然而，它们的最适合的载体NTC8685-eRNA41H(参考NTC-DV8685-41HLV)不具有与Ubi-hTERT插入片段相容的限制性位点。因此，将该载体用SalI和BglII消化并连接到合成的双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含适用于亚克隆Ubi-hTERT的限制性位点，即HindIII-XbaI：
SalI HindIII SmaI XbaI BglII
GTCGACAAGCTTCCCGGGTCTAGAAGATCT(SEQ ID NO:23)
通过限制性消化和测序来验证现在包括上述多接头的新载体(NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI)，所述测序使用分别退火到多接头位点上游和下游序列的pVAC5’(GCTTTTCTGCCAGGTGCTGA SEQ ID NO：24)和pVAC3’(GCCAGAAGTCAGATGCTCAA SEQ ID NO：25)引物。
将定制的NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI载体用HindIII和XbaI消化，对3631bp载体进行凝胶纯化以与12bp连接物分开。将pcDNA3.1-Ubi-hTERT构建体用HindIII和XbaI消化，并通过连接到NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI受体中将3489bp的Ubi-hTERT插入片段转移，以产生NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT(INVAC-1)(图1A)。将连接产物转化到无抗生素选择宿主NTC4862(DH5αattλ::P5/6 6/6-RNA-IN-SacB，catR)中(参考NTC-DVU-CC1)。得到的载体通过限制性消化进行验证(图1B)：BglII/NotI＝3496,3262,220,142bp条带；NcoI＝4084,3036bp条带；HindIII/XbaI＝3631,3489bp条带，并且Ubi-hTERT插入片段的末端使用pVAC5’和pVAC3’引物通过DNA测序来验证。没有鉴定到核苷酸改变。
质粒生产
INVAC-1首先由NTC在研究级质量条件下生产。使用电穿孔将质粒DNA转化到NTC4862大肠杆菌细胞中。按照制造商推荐(NTC Instruction Manual,June 2011)，将细胞在6％蔗糖培养基上铺板并繁殖。在提取后，将质粒DNA以2mg/ml的终浓度重悬浮在无内毒素的1X PBS中。
INVAC-1随后由Eurogentec(Belgium)制造，用于GLP和GMP规模放大和GMP生产。此时进行INVAC-1质粒的全长测序。
INVAC-1衍生物
所有INVAC-1衍生构建体都是约8.9kb的双链DNA质粒，其编码无酶活性的人类泛素-端粒酶融合蛋白(图2A)。将Ubi-hTERT转入基因插入到源自于pcDNA3.0的InvitrogenpcDNA3.1(+)载体(5.4kb)中，所述pcDNA3.0被设计用于在哺乳动物细胞中高水平的稳定和瞬时表达。这个载体含有人类细胞肥大病毒立即早期(CMV-IE)启动子和作为末端序列的牛生长激素多腺苷化(BHG-polyA)信号。
pUTD10Not(缩写为Δ10Not)
hTERT编码序列位于pcDNA3.1质粒骨架的923与4492bp核苷酸之间。pUTD10Not编码1189个氨基酸的人类泛素-端粒酶融合蛋白(Δ10Not)，其对应于约130.8kDa的分子量(图2A)。hTERT缺失掉前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在催化位点结构域中，在912-913位氨基酸之间(*号；图17)引入另外的缺失，其对应于野生型hTERT(登记号NM_198253)的AA 860-869(DGLLLRLVDD_SEQ ID NO：21)。该10个氨基酸的缺失包括引起hTERT酶活性的失活的3个氨基酸的缺失(ΔVDD)和VDD序列上游的另外7个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签(图2A)。
pUTD10Cog(缩写为Δ10Cog)
hTERT编码序列位于pcDNA3.1质粒骨架的923与4492bp核苷酸之间。pUTD10Cog编码1189个氨基酸的人类泛素-端粒酶融合蛋白(Δ10Cog)，其对应于约130.8kDa的分子量(图2A)。hTERT缺失掉前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在催化位点结构域中，在919-920位氨基酸之间(*号；图18)引入另外的缺失，其对应于野生型hTERT(登记号NM_198253)的AA 867-876(VDDFLLVTPH_SEQ ID NO：22)。该10个氨基酸的缺失包括引起hTERT酶活性的失活的3个氨基酸的缺失(ΔVDD)和VDD序列下游的另外7个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签(图2A)。
pUTD23Tyn(缩写为Δ23)
hTERT编码序列位于pcDNA3.1质粒骨架的923与4453bp核苷酸之间。pUTD23Tyn编码1176个氨基酸的人类泛素-端粒酶融合蛋白(Δ23)，其对应于约129.4kDa的分子量(图2A)。hTERT缺失掉前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。在催化位点结构域中，在909-910位氨基酸之间(*号；图19)引入另外的缺失，其对应于野生型hTERT(登记号NM_198253)的AA 857-879(IRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTH_SEQ ID NO：26)。该23个氨基酸的缺失包括引起hTERT酶活性的失活的3个氨基酸的缺失(ΔVDD)和另外的VDD序列上游的10个氨基酸和下游的10个氨基酸的缺失。Ubi-hTERT的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签(图2A)。
基因合成和克隆
所述基因通过交叠的40mer寡核苷酸组装过程，作为泛素-端粒酶融合构建体从头合成(GeneCust，Luxembourg)。基因合成包括独一无二的侧翼限制性位点HindIII/XbaI，以允许将基因亚克隆到所需表达系统中。将合成的基因克隆到pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen,Carlsbad,USA)的HindIII和XbaI限制性位点之间。质粒的序列使用PEGFP-N5’CGGTGGGAGGTCTATATAAG(SEQ ID NO：27)和BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC(SEQ ID NO：28)引物，通过测序来验证。
质粒生产
由RD Biotech(Besancon,France)将所有INVAC-1衍生物转化到大肠杆菌5-α细胞(fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1thi-1 hsdR17)(Lucigen Corporation,Middleton,USA，参见60602-2)中并在其中进行生产。制备重悬浮在1X无菌PBS中的浓缩的无内毒素大量制备质粒储液(2mg/mL)。所述载体通过限制性作图来验证(HindIII-XbaI；图2B)。
pTRIP-CMV-hTERT
pTRIP-CMV-hTERT编码1132个氨基酸(对应于约124.5kDa)的具有催化活性的野生型人类TERT(hTERT)蛋白。该质粒作为阳性对照用于体外测定法。所述构建体首次描述在专利申请WO2007/014740中。pTRIP-CMV-hTERT如下构建：首先将源自于pBABE-hygro-hTERT质粒(由Dr.Robert Weinberg善意提供)的EcoRI-SalI hTERT插入片段亚克隆到pSP73载体(Promega Life Science,Wisconsin,USA)中，以产生pSPhTERT构建体。然后将BglII-SalI片段插入到用BamHI和XhoI切开的pTRIP-CMV反转录病毒衍生载体中，以产生pTRIP-CMV-hTERT。hTERT表达由人类细胞肥大病毒(CMV)启动子驱动。
由RD Biotech(Besancon,France)将pTRIP-CMV-hTERT质粒转化到大肠杆菌5-α细胞(fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1endA1 thi-1 hsdR17)(Lucigen Corporation,Middleton,USA，参见60602-2)中并在其中进行生产。
制备重悬浮在1X无菌PBS中的2mg/mL的浓缩的无内毒素大量制备质粒储液。产生的载体通过限制性酶消化来验证(EcoRI+BamHI＝10286+2720+886bp条带)。
pNTC-hTERT
pNTC-hTERT编码1132个氨基酸的具有催化活性的野生型人类TERT(hTERT)蛋白(SEQ.ID NO：2)。该质粒被用于调查与INVAC-1构建体相比体内hTERT特异性T-细胞应答的广度。
通过交叠寡核苷酸组装过程从头合成具有HindIII-XbaI克隆位点的野生型hTERT插入片段(GenScript,USA)。将合成的构建体(3417bp)通过HindIII和XbaI位点克隆到pUC57(2710bp)中，然后使用M13/pUC(-20)和M13/pUC(-26)引物通过测序并通过限制性作图(HindIII/XbaI)进行验证。随后，由NTC将hTERT插入片段亚克隆到如上所述的克隆载体NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI(参见INVAC-1构建体)中。得到的载体pNTC-hTERT通过限制性消化(XmaI＝4375,2041,506,120bp条带；BamHI/XmnI＝6887,155bp条带；HindIII/XbaI＝3631,3411bp条带)和使用pVAC5’、pVAC3’和hTERTseq(5’GGCAAGTCCTACGTCCAGTG3’，SEQ ID NO：44)引物的DNA测序进行验证。
pNTC-hTERT质粒由NTC在如前对INVAC-1质粒所描述的研究级质量条件下生产。
pNTC-hTERT-ΔVDD
pNTC-hTERT-ΔVDD编码1129个氨基酸的人类TERT(hTERT)序列，其在催化位点中通过编码缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸的9bp的缺失(ΔVDD；867-869 AA)进行修饰。该质粒被用于调查与INVAC-1构建体相比体内hTERT特异性T-细胞应答的广度。
除了3个氨基酸的缺失(ΔVDD)之外，hTERT-ΔVDD的DNA序列与野生型hTERT一致。由GenScript从头合成167bp的DNA插入片段，其包括hTERT的152bp BamHI/XmnI片段，但具有ΔVDD缺失和附加的EcoRV限制性位点。使用EcoRV克隆位点将该合成的片段克隆到pUC57载体(2710bp)中。合成的基因使用M13/pUC(-20)和M13/pUC(-26)引物通过测序并通过限制性消化(BamHI/NdeI)进行验证。然后使用BamHI/XmnI位点对该载体进行消化，并将ΔVDD-BamHI/XmnI片段克隆到pNTC-hTERT载体的BamHI/XmnI预先消化的hTERT区域(6887,155bp条带)中。得到的载体pNTC-hTERT-ΔVDD通过限制性消化(XmaI＝4375,2032,506,120bp条带；BamHI/XmnI＝6887,146bp条带；HindIII/XbaI＝3631,3402bp条带)和使用pVAC5’、pVAC3’和hTERTseq(5’GGCAAGTCCTACGTCCAGTG 3’SEQ ID NO：44)引物的DNA测序进行验证。
pNTC-hTERT-ΔVDD由NTC如前对INVAC-1和pNTC-hTERT构建体所述进行生产。
用于蛋白质印迹和TRAP测定法的细胞培养和瞬时转染
CrFK(Crandell Rees猫肾)、HEK293T(人类胚胎肾)和HeLa(Henrietta Lacks'-人类宫颈腺癌)细胞系培养在增补有10％热失活胎牛血清(PAA，Velizy-Villacoublay，France)和1％青霉素/链霉素(Life Technologies,Saint-Aubin,France)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。
QT6(日本鹌鹑纤维肉瘤)细胞系培养在增补有10％热失活胎牛血清(PAA)、1％青霉素/链霉素(Life Technologies)、1％鸡血清(PAA)、10mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)和0.5％胰蛋白胨肉汤(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)的Ham's F10(Eurobio,Courtaboeuf,France)中。将细胞在37℃和含有5％CO2的加湿气氛下，在75cm2培养瓶中生长成单层。将细胞生长到在转染当天70-80％合生。对于蛋白质印迹分析来说，将5x105个细胞接种在6孔组织培养板中并温育24h。对于TRAP测定法来说，将7xl05个细胞接种在6孔组织培养板中并温育24h。
使用jetPrime阳离子型聚合物转染试剂，按照制造商的说明书(Polyplus-transfection Inc.,France)将INVAC-1和INVAC-1衍生构建体转染到靶细胞中。将用pTRIP-CMV-hTERT质粒转染的细胞用作阳性对照，并将未转染的细胞或pNTC8685-eRNA41H空质粒转染的细胞用作阴性对照。4小时后除去转染培养基并用2mL DMEM培养基替换。在转染适合的时间后——对于蛋白质印迹分析来说18-96小时和对于TRAP测定法来说24小时，收获细胞并分析端粒酶的表达和活性。
蛋白质印迹
对于蛋白质印迹分析来说，将转染的CrFK和HEK293T细胞在增补有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostic,Indianapolis,USA)的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)中在冰上裂解10-20分钟。将裂解液通过在4℃下以14,000rpm离心15分钟进行澄清。收获上清液并使用Bradford比色测定法测量蛋白质浓度。将蛋白质样品在95℃变性5分钟，在Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Carlsbad,USA)上分离，并使用装置(Invitrogen,Carlsbad,USA)电转印到PVDF膜(transfer stack,Invitrogen,Carlsbad,USA)上。使用Sharp预染色蛋白质梯(Invitrogen,Carlsbad,USA)来确定分子量。在60kDa处附近切下膜，并用1X PBS，0.05％3％奶粉封闭。将膜的上部用在封闭缓冲液中以1/2000稀释的兔抗hTERT单克隆抗体(Abeam,Cambridge,UK)或以1/5000稀释的小鼠抗V5单克隆抗体(Invitrogen,Carlsbad,USA)探测。将膜的下部用以1/5000稀释的小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma Aldrich SARL,Saint-Quentin Fallavier,France)探测。最后，通过用适合的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体——在封闭缓冲液中1/5000稀释的HRP偶联的抗小鼠抗体(GE Healthcare,Velizy,France)或1/1000稀释的HRP偶联的抗兔抗体(Cell Signaling,Danvers,USA)在室温染色1h，使相关蛋白可视化。免疫印迹信号使用ECL HRP化学发光底物试剂盒，通过增强化学发光来检测。底片和相应的胶卷盒购自GE Healthcare(Buckinghamshire,UK)。
TRAP测定法
端粒酶活性通过端粒重复序列扩增流程(TRAP)方法(Kim等，1994)，使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAPLUS试剂盒(Roche Diagnostic GmbH Mannheim,Germany)，按照制造商的说明书来评估。在如上所述转染后24小时，收获CrFK细胞。将细胞用1X PBS清洗，然后在4℃下以1,600rpm离心5分钟。将细胞重悬浮在0.2ml裂解缓冲液中，并在冰上温育30分钟。通过在4-8℃下以14,000rpm离心20分钟来澄清裂解液。收获上清液并使用Bradford比色测定法测量蛋白质浓度。将上清液用于端粒序列的端粒酶介导的延伸，并使用生物素标记的引物通过PCR扩增产物。将每个细胞上清液先分成两份等分试样，然后进行测定：一份用于通过在85℃下将端粒酶热失活10分钟来制备阴性对照，另一份被用于评估端粒序列的端粒酶介导的延伸。此外，同时扩增存在于反应混合物中的216bp长的内部标准品，以排除由于可能存在于裂解液中的Taq DNA聚合酶抑制剂造成的假阴性结果。使用裂解缓冲液作为阴性对照。将所有反应混合物在25℃温育20分钟，然后在94℃温育5分钟。在30个PCR循环中扩增端粒酶产物：94℃30秒，50℃30秒，72℃90秒，结束时进行72℃10分钟的1个循环，并保持在4℃。
将2.5μL PCR扩增产物与试剂盒中提供的变性试剂在RT下温育10分钟。温育后，每孔加入100μL杂交缓冲液。将每种溶液混合，将100μL转移到链亲合素预包被的微孔板，并在37℃和轻柔搅动(300rpm)下温育2小时。然后将孔用清洗缓冲液清洗，并与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗地高辛抗体(1/50)在RT下温育30分钟。然后在RT下加入HRP底物(TMB)15分钟，用于比色法测量。使用ELISA终止试剂终止反应。
通过将来自于样品的信号与使用已知量的阳性对照模板(与具有8个端粒重复序列的端粒酶产物具有相同序列的模板DNA)获得的信号进行比较，确定每个样品中的端粒酶活性水平。吸收值用针对空白的A450读数来报告(参比波长A690nm)。使用下述公式获得相对端粒酶活性(RTA)：
RTA＝[(AS-AS0)]/AS,IS]/[(ATS8-ATS8,0)/ATS8,IS]x100
其中：
AS是样品的吸收值，
AS0，热处理过的样品的吸收值，
AS,IS，样品的内部标准品(IS)的吸收值，
ATS8，对照模板(TS8)的吸收值，
ATS8,0，裂解缓冲液的吸收值，
ATS8,IS，对照模板(TS8)的内部标准品(IS)的吸收值。
免疫荧光
将CrFK、HEK293T、HeLa和QT6细胞以2x104个细胞/孔接种在8孔腔室玻片(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)上的200μL培养基中，并在37℃、5％CO2下温育过夜。第二天，舍弃培养基并加入200μL新鲜培养基。向相应腔室加入10μL在OptiMEM(LifeTechnologies,Saint-Aubin,France)中含有0.2μg INVAC-1、pTRIP-CMV-hTERT或对照空质粒pNTC8685-eRNA41H和0.5μL Fugene HD(Promega France,Charbonnieres-les-bains,France)的混合物溶液。使用每个腔室2x104个未处理的细胞作为阴性对照。将腔室玻片在37℃、5％CO2下温育24和48小时。将转染的细胞用1X PBS小心地清洗，向每个孔加入200μL2％PFA，4℃下10分钟，以便固定细胞并使其通透化。然后，将孔用1X PBS 0.05％清洗两次，并与200μL封闭溶液(0.5％Triton X100；Sigma-Aldrich，3％BSA；Sigma-Aldrich，10％山羊血清；Invitrogen，在1X PBS 0.05％中)在室温下温育30分钟。将在阻断缓冲液中以1/100稀释的兔抗hTERT第一单克隆抗体(Abcam,Cambridge,UK)施加在细胞上，在室温和搅动下1.5小时。在1X PBS 0.05％中清洗三次后，施加在封闭溶液中稀释(1/500)的山羊抗兔-Alexa Fluor第二抗体(LifeTechnologies,Saint-Aubin,France)，在室温和搅动下45分钟。将孔用1X PBS 0.05％清洗三次，并在含有DAPI的固定介质(Vectorlaboratories,Cambridgeshire,UK)中固定。将盖玻片在装备有图像处理和分析系统(Axiovision,Carl Zeiss Microimaging GmbH,Jena,Germany)的荧光显微镜(Axioobserver Z1,Carl Zeiss Microimaging GmbH,Jena,Germany)下进行分析。
小鼠
雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自Janvier laboratories(Saint-Berthevin,France)。
使用了两个转基因小鼠株系：HLA-B*0702和HLA-A2/DR1。
HLA-B*0702转基因小鼠表达人类HLA-B*0702分子的α1-α2结构域和鼠类H2D分子的α3结构域。这些小鼠不表达H2-Db和H2-Kb分子(Rohrlich等，2003)。
HLA-A2/DR1转基因小鼠表达人类HLA-A*0201的α1-α2结构域、鼠类H2D分子的α3结构域和人类β2-微球蛋白。此外，这些转基因小鼠表达人类HLA-DRB1*0101和HLA-DRA*0101分子。它们被敲除了鼠类H2-Db、H2-Kb和IAb基因(Pajot等，2004)。
两个转基因小鼠株系都在6至10周龄之间使用，并由巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute)供应。动物被饲养在巴斯德研究所的无特定病原体动物房(AnimalFacilities Lwoff n°22，协议号B 75 15-07)。在真皮内(ID)、肌肉内(IM)或皮下(SC)免疫接种或静脉内(IV)注射之前，将小鼠根据各个动物的体重和麻醉持续时间，用2％甲苯噻嗪(Rompun,Bayer Sante,Loos,France)和8％氯胺酮(Imalgen 1000,Merial,Lyon,France)在1X磷酸盐缓冲盐水(1X PBS,Life Technologies,Saint-Aubin,France)中的混合溶液，通过腹膜内途径(IP)进行麻醉。所有动物严格按照良好动物规范操作，并遵照当地动物实验管理指令(Directive 2010/63/UE)。
hTERT肽
限制到HLA-B*0702、HLA-A*0201或HLA-DR的hTERT肽在前面描述(参见表1中的参考内容)。为了结合MHC I类分子，使用四种可以在线使用的算法通过计算机表位预测来确定限制到H2-Db和H2-Kb的hTERT肽：Syfpeithi(http://www.syfpeithi.de/)，Bimas(http://www-bimas.cit.nih.gov/)，NetMHCpan和SMM(http:// tools.immuneepitope.org/main/)。所有合成的肽以冻干形式(>90％纯度)购自Proimmune(Oxford,United Kingdom)。在使用前将冷冻干燥的肽以2mg/mL溶解在无菌水中并储存在-20℃。肽序列和MHC限制的详细情况示出在表1中。
表1.hTERT肽和MHC限制
hTERT肽文库
冷冻干燥的hTERT肽(纯度>70％)购自GenScript(USA)。这组肽由269种交叠11个氨基酸并重新覆盖INVAC-1hTERT的整个蛋白序列的15个氨基酸的肽构成。在使用前，按照供应商的推荐将每种肽以2mg/mL重悬浮在蒸馏水中，并保持冷冻在-20℃下。使用27个9-10种hTERT交叠肽的合并物(表2)，在IFNγELISPOT测定法中筛选hTERT特异性T-细胞应答的广度。
表2：hTERT交叠肽的合并物
肿瘤细胞系
用于评估由INVAC-1介导的抗肿瘤效应的Sarc-2肿瘤细胞系从HLA-A2/DR3小鼠的自发纤维肉瘤获得。将肿瘤块在无菌条件下解离并产生原代细胞悬液。所述细胞系显示出表达HLA-A*0201分子。细胞在增补有10％FBS(Life Technologies)和1％青霉素/链霉素的RPMI glutamax培养基(Life Technologies)中培养。
小鼠免疫接种和体内电穿孔程序
真皮内(ID)免疫接种在小鼠侧面下部，在剃毛后使用胰岛素注射器和特定针头(U-100，29GX1/2”-0.33x12mm,Terumo,Belgium)进行。在剃毛后、免疫接种程序期间和之后没有观察到红斑。肌肉内免疫接种(IM)在胫骨上部前侧肌肉(anterior tibialiscranialis muscle)中，也使用胰岛素注射器和特定针头U-100进行。皮下免疫接种(SC)在尾的基部处，也使用胰岛素注射器和特定针头U-100进行。取决于实验，每只动物接受对应于12.5、25、50、100、200、400、800或1200μg DNA的质粒(INVAC-1、NTC、pUTD10Not、pUTD10Cog或pUTD23Tyn)或1X PBS的初免IM、ID或SC注射。根据疫苗接种方案，小鼠可以接受相似的第二或第三次DNA或1X PBS注射。
体内DNA电穿孔使用装备有平板电极(P-30-8G,IGEA)的2电穿孔系统和软件(IGEA,Italy)来进行。紧接ID或SC疫苗接种之后，在注射位点处制造皮肤皱襞，用导电凝胶(Labo FH，蓝色接触凝胶，NM Medical,France)完全覆盖，并置于平板电极之间。施加两种不同电压的脉冲(HV-LV)：HV：1250V/cm，1Hz，100μs；1个脉冲，1000ms中断；LV：180V/cm，1Hz，400ms，1个脉冲。紧接IM注射之后，将每个肌肉用导电凝胶完全覆盖并置于平板电极之间。施加两种不同电压的脉冲(HV-LV)：HV：750V/cm，1Hz，100μs；1个脉冲，1000ms中断；LV：100V/cm，1Hz，400ms，1个脉冲。
在某些实验中，在DNA疫苗接种之前18小时或伴随INVAC-1的给药，用0.5μg鼠类GM-CSF或1ng鼠类IL-12以25μl/侧的终体积ID注射小鼠。两种细胞因子都购自Miltenyi(Germany)。
ELispot测定法
从免疫接种的小鼠获取脾脏并捣碎，将细胞悬液通过70mm尼龙筛网(CellStrainer,BD Biosciences,France)过滤以分离脾细胞。在麻醉下通过眶后穿刺从免疫接种的小鼠收集血液，以便分离外周血单核细胞(PBMC)。将脾细胞或PBMC用Ficoll(淋巴细胞分离介质，Eurobio,France)纯化。使用Auto T4Plus计数器(Ozyme,France)对来自于血液或脾脏的Ficoll纯化的淋巴细胞进行计数。
将ELIspot PVDF微孔板(IFNγElispot kit,Diaclone,Abcyss,France，参考862.031.010P)用捕获抗体(抗小鼠IFN-γ抗体)包被过夜并用1X PBS-2％奶粉封闭。以2x105细胞/孔的量向板一式三份添加细胞悬液，并用5μg/ml的HLA或H2限制的hTERT衍生肽和无血清培养基或PMA-离子霉素(分别为0.1μM和1μM)刺激。19小时后，用生物素偶联的检测抗体，然后用链亲合素-AP和BCIP/NBT底物溶液来揭示斑点。斑点使用ImmunospotELIspot计数器和软件(CTL,Germany)来计数。当分析ELIspot数据时，如果对应于hTERT特异性CD8或CD4 T-细胞的斑点的频率高于10个斑点的截止值，则接种疫苗的动物被认为是响应者。
体内细胞毒性测定法
对于靶细胞制备来说，将来自于未接触过抗原的HLA-B7小鼠的脾细胞用含有高(5μM)、中(1μM)或低(0.2μM)浓度CFSE(Vybrant CFDA-SE细胞示踪试剂盒；LifeTechnologies,Saint-Aubin,France)的1X PBS溶液标记。将用5和1μM CFSE标记的未接触过抗原的脾细胞在室温下分别用两种不同的HLA-B7肽1123和351，以5μg/mL脉冲1.5小时。将低CFSE标记的脾细胞留置不进行脉冲。先前用INVAC-1或1X PBS疫苗接种的每只小鼠，在初免后第14天或加强注射后第10天，通过眶后静脉接受107个CFSE标记的细胞的混合物，所述混合物含有相等数量的来自于每种级份的细胞。在15-18小时后，使用流式细胞仪(Miltenyi,Germany)通过流式细胞术分析来自于脾脏的单细胞悬液。
通过将INVAC-1免疫接种的小鼠和对照(1X PBS)小鼠中脉冲过的(高/中CFSE荧光强度)与未脉冲过的(低CFSE荧光强度)群体的比率进行比较，来确定肽脉冲过的细胞的消失。按照下面的公式确立每个试验动物的特异性杀死的百分率：
[1-[(CFSE低PBS/CFSE高/中PBS)/(CFSE低pDNA/CFSE高/中pDNA)的平均值]]x100。
细胞因子结合测定法(CBA)
将来自于疫苗接种的HLA-A2/DR1小鼠脾细胞(6x105个细胞)与5μg/mL的HLA-DR限制的hTERT衍生肽(578、904和1029)在37℃培养24h。回收细胞因子培养上清液并将其保持冷冻在-20℃直至试验。使用可商购的试剂盒小鼠Th1/Th2/Th17细胞测量珠子阵列(CBA,BDbiosciences)试剂盒分别定量IL-2、IFNγ、TNFα、IL-4、IL-6、IL-17a和IL-10的浓度。CBA免疫测定法按照制造商的说明书进行。流式细胞术采集使用FACScan LSRII流式细胞仪(BDBiosciences)进行；分析使用FCAP Array TM软件3.0版(BD Biosciences)来进行。
体内抗肿瘤效果
对于治疗性疫苗接种实验来说，将24周龄的HLA-A2/DR1小鼠用2.104个Sarc-2细胞在右腹侧上皮下移植。然后在移植后第4、21和35天，如上所述通过ID途径将动物用DNA疫苗免疫接种，随后进行电穿孔。每2至3天，使用卡尺监测肿瘤生长。小鼠的体重也每2到3天进行监测。当肿瘤达到2000mm3时将小鼠安乐死。遵从癌症研究中动物的福利和使用指导纲要，特别是对于使立即干预成为必要的临床征兆的监测来说(Workman等，2010,BJC)。肿瘤体积使用下述公式来计算：(L*l2)/2。结果以mm3为单位表示(L＝长度；l＝宽度)。
对于预防性疫苗接种来说，如上所述将5-10周龄的HLA-A2/DR1小鼠接种疫苗两次(第0和21天)。在最后一次免疫接种后32天，将动物用5.104个Sarc-2细胞皮下移植。如上所述每2至3天监测小鼠的体重和肿瘤生长。当肿瘤达到2000mm3时将小鼠安乐死。
使用肿瘤生长延迟(TGD)判据来评估疫苗效能。它比较在对照和治疗组中达到规定肿瘤体积(500mm3)的时间。
统计分析和数据处理
将Prism-5软件用于数据处理、分析和图示。数据被表示成平均值±标准偏差或中值。ELISpot测定法的统计分析使用Mann Whitney非参数和/或Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验来进行。显著性被设定在p-值<0.05。
结果
INVAC-1质粒DNA的表征和序列分析
如使用各种不同限制性内切核酸酶的限制性作图(图1A&1B)所示，Ubi-hTERT转入基因被成功插入到pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI中。使用pVAC5’和pVAC3’引物也对得到的pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT(INVAC-1)载体在联结处进行部分测序。序列证实克隆过程成功完成。
已在Master Cell Bank质粒材料上对INVAC-1质粒进行全长测序(SEQ ID NO：11&图16)。除了一个碱基之外，结果与预期序列匹配。事实上，当与数据库中提交的人类端粒酶基因(登记号NM_198253)相比时，该完全测序鉴定到沉默突变(G6064C；GGG甘氨酸变为GGC甘氨酸)。该沉默突变可以被当作INVAC-1的附加特征，因为这个碱基变化破坏了野生型端粒酶基因中存在的独一无二的BamHI位点(GGATCC变为GCATCC)。
INVAC-1衍生构建体的表征和序列分析
合成并克隆了表达不同Ubi-hTERT融合蛋白的三个INVAC-1衍生DNA质粒(图2A)。如HindIII和XbaI消化和电泳所示(图2B)，所有Ubi-hTERT转入基因被成功连接到pcDNA3.1(+)Invitrogen表达载体中。使用与DNA插入片段侧翼的载体序列匹配的PEGFP-N5’和BGH引物对插入片段和联结部进行测序。测序结果证实转入基因已被正确克隆(SEQ ID NO：13、15、17&图17至19)。
INVAC-1和INVAC-1衍生蛋白在体外正确表达并通过蛋白酶体途径降解
进行蛋白质印迹分析，以提供关于体外瞬时转染到HEK293T和CrFK细胞系中18h至96h后野生型hTERT、INVAC-1和INVAC-1衍生蛋白的整体表达的信息。野生型hTERT蛋白的条带对应于124.5kDa处未修饰的hTERT的大小(图3A和3B，图的左部)。野生型hTERT蛋白表达显得随时间稳定，特别是在HEK293T细胞中。与其相比，INVAC-1(图3A和3B，图的右部，以及图3C，图的上部)和INVAC-1衍生蛋白(图3C，图的下部)随时间快速降解。
与野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)相反，INVAC-1构建体产生两个不同条带：弱的上方条带对应于预测大小为127.4kDa的Ubi-hTERT融合蛋白，下方条带对应于缺少泛素多肽的INVAC-1编码的hTERT蛋白(119kDa)。在HEK293T和CrFK这两个细胞系中都检测到这两种形式的INVAC-1编码的hTERT蛋白(图3A和3B)。对于INVAC-1衍生构建体Δ10Not、Δ10Cog和Δ23来说观察到同样的模式(图3C)。INVAC-1和INVAC-1衍生蛋白与野生型hTERT相比更弱的表达、它们的表达模式以及它们随时间消失的动力学合在一起，表明这些蛋白按照为泛素融合蛋白的降解提出的模型(Bachmair，1986)，通过泛素依赖性蛋白酶体途径快速降解。119kDa的INVAC-1条带的快速出现表明大多数蛋白在翻译的同时被泛素特异性加工蛋白酶在Ubi-hTERT联结部切开或几乎如此。因此，所述蛋白按照所谓的蛋白质降解的N-末端规则(Tasaki，2012；Varshavsky，1996)，进入快速蛋白酶体依赖性降解途径。
这些结果验证了由INVAC-1和INVAC-1衍生物编码的Ubi-hTERT融合蛋白的体外表达模式和身份。融合到hTERT衍生蛋白的泛素多肽通过按照N-末端规则增强蛋白质降解来发挥作用。按照这种N-末端规则，hTERT变成不稳定的蛋白，被参与用于通过I类主要组织相容性复合物(MHC)分子进行抗原呈递的肽的生产的蛋白酶体系统快速降解(Cadima-Couto，2009；Michalek等，1993)。因此，这些数据表明在哺乳动物组织培养细胞中经历增强的降解的Ubi-hTERT融合构建体也可以在体内被快速降解，并且与野生型hTERT相比可以有效地诱导更高的CD8+ T-细胞应答。
INVAC-1蛋白具有占优势的细胞质分布和核仁排斥模式
怀着使INVAC-1衍生的hTERT蛋白离开原位以增强其降解的想法，移除了核仁定位信号(hTERT的N-端部分)。因此，在转染到CrFK、HEK293、HeLa、QT6细胞系中之后，通过免疫荧光分析评估了由INVAC-1编码的hTERT的细胞定位(图4)。
在转染的HEK293T细胞中，在24h时，野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)表现出主要位于细胞核和核仁中(图4A)。相反，INVAC-1蛋白在细胞核与细胞质之间分布，并且首要的是表现出清晰的核仁排斥模式(图4A)。野生型hTERT(pTRIP-CMV-hTERT)和INVAC-1质粒在HeLa细胞中的瞬时转染，对于两种蛋白质来说在转染后24和48小时显示出类似的定位模式(图4B)。
在pNTC8685-eRNA41H空骨架载体转染后可以在HEK293T和HeLa细胞中观察到的弱的抗hTERT荧光信号，可能是由与内源hTERT的交叉反应性造成的。
为了克服由内源hTERT蛋白表达造成的非特异性荧光背景，将非人类细胞系QT6鹌鹑纤维肉瘤和CrFK猫肾细胞用于免疫染色。在用pNTC8685-eRNA41H空骨架载体瞬时转染后在两种细胞系中没有观察到背景信号(图4C&D)。正如预期的，外源野生型hTERT蛋白(pTRIP-CMV-hTERT)主要在两种细胞系的细胞核和核仁中被检测到(图4C&D)。正如已经在HEK293T和HeLa细胞中观察到的，在CrFK细胞中，在24h时，INVAC-1蛋白具有核和细胞质分布(图4D)。有趣的是，在24和48h时QT6细胞中INVAC-1的表达仅仅在细胞质中，表明核仁定位信号的缺失极大改变了所述蛋白在该细胞系中的分布。
合在一起，这些结果显示出在不同细胞系中，INVAC-1衍生的hTERT蛋白与野生型hTERT相比具有修改的亚细胞分布。这种改变对于增强所述蛋白的蛋白酶体降解，成为用于I类MHC呈递的肽以产生特异性细胞免疫应答来说，可能是有利的(Andersson和Barry，2004)。
QT6和CrFK细胞(不具有非特异性hTERT背景)用INVAC-1衍生物(pUTD10Not、pUTD10Cog和pUTD23Tyn)的转染证实了这些hTERT衍生蛋白的核仁排斥模式(数据未示出)。与野生型hTERT相比，它们的亚细胞分布主要是细胞质的。
INVAC-1和INVAC-1衍生物不具有酶活性
人类端粒酶通过参与肿瘤细胞的永生并阻止其衰老而在肿瘤生长中发挥关键作用。因此，使用野生型端粒酶作为疫苗产品可能引起安全性顾虑。
进行了TRAP测定，以评估Ubi-hTERT构建体在端粒酶阴性CrFK细胞系中的端粒酶活性。只在使用pTRIP-CMV-hTERT质粒用野生型hTERT转染的CrFK细胞中检测到端粒酶活性。在用INVAC-1或INVAC-1衍生物转染的CrFK细胞中没有检测到端粒酶活性(图5)。
如图5A和5C中所示，原始吸收值数据证实了INVAC-1和INVAC-1衍生物的端粒酶活性水平与未处理的细胞的水平相当。
相对端粒酶活性(RTA)数据(图5B和5D)代表了通过使用包括热失活样品的各种不同阴性对照而将测定法的特异性考虑在内的充分分析的结果，显示出INVAC-1和INVAC-1衍生物完全不具有任何端粒酶活性。
用内部扩增标准品(IS)对照所处理的所有样品是高度阳性的，证实了在CrFK裂解液样品中不存在Taq DNA聚合酶抑制剂，并因此再次强调了所述测定法的特异性。
总而言之，这些结果证实INVAC-1和INVAC-1衍生物不具有任何酶活性。因此，就端粒酶活性而言，对于在人类中使用INVAC-1来说不存在安全性顾虑。
电穿孔对于在INVAC-1的ID给药后诱导显著水平的分泌干扰素-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞来说是有利的
在事先用INVAC-1通过真皮内途径免疫接种并随后进行或不进行皮肤电穿孔的C57BL/6小鼠中评估hTERT特异性CD8 T-细胞应答的强度(图6)。注射后14天，收获小鼠脾脏，并使用限制到H2的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的免疫应答。在INVAC-1的ID注射后接受电穿孔的小鼠组与不接受电穿孔的组之间观察到IFNγ+CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.05)。因此，这些结果表明电穿孔对于在用INVAC-1进行ID疫苗接种后诱导显著水平的hTERT特异性CD8 T-细胞应答来说是有利的。
通过不同给药途径进行INVAC-1疫苗接种随后进行电穿孔诱导了分泌干扰素-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞。ID疫苗接种途径似乎是最佳途径
常规疫苗通常通过SC或IM途径给药。然而，真皮内免疫接种途径现在在疫苗接种领域中正在重新获得关注(Combadiere和Liard，2011)。因此，试验了将ID途径用于INVAC-1的给药并与常规的SC和IM途径进行比较。
在第一组实验中，将不同组的转基因HLA-B7小鼠通过ID或SC途径用INVAC-1免疫接种，随后立即进行电穿孔(图7A)。疫苗接种/电穿孔后14天，收获小鼠脾脏，并使用限制到HLA-B7的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测脾脏中诱导的免疫应答。在第二组实验中，将一组转基因HLA-B7小鼠通过ID途径用INVAC-1免疫接种并将另一组通过IM途径免疫接种，随后立即进行电穿孔(图7B)。使用限制到HLA-B7的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测PBMC中hTERT特异性CD8 T-细胞的频率。已确定，使用INVAC-1疫苗接种随后进行电穿孔能够在HLA-B7小鼠中诱导hTERT特异性CD8 T-细胞应答，不论使用何种疫苗接种途径(图7A和7B)。
此外，如图7A中所示，在通过ID途径疫苗接种的小鼠组中，与通过SC途径疫苗接种的组相比响应动物的数目更高，分别为8个中的6个和8个中的3个响应者。在ID疫苗接种的小鼠组与IM疫苗接种的动物组之间，也观察到hTERT特异性CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.05)(图7B)。
两个实验证实，对于INVAC-1介导的hTERT特异性CD8 T-细胞的诱导来说，ID疫苗接种途径比IM和SC途径更加高效。使用其他小鼠模型即HLA-A2-DR1小鼠获得了类似数据(数据未示出)。因此，使用INVAC-1进行的所有后续免疫原性研究都被设计成使用疫苗的ID给药随后进行电穿孔。
疫苗剂量对使用INVAC-1的单次ID免疫接种和电穿孔后的hTERT特异性CD8 T-细胞应答的影响
所试验的另一个重要参数是疫苗剂量对hTERT特异性CD8 T-细胞应答的影响。将C57BL/6小鼠在两侧下部使用逐渐增加剂量的INVAC-1通过ID途径免疫接种，然后进行电穿孔。疫苗体积保持恒定在50μL/位点。取决于接收的最终疫苗剂量，将动物在2或4个位点中接种疫苗。在疫苗接种/电穿孔后14天，收获小鼠脾脏，并使用限制到H2的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测特异性细胞免疫应答。
在第一组实验中，C57BL/6小鼠使用12.5μg至100μg范围内的剂量接受单次INVAC-1 ID注射/电穿孔(图8A)。在用100μg INVAC-1疫苗接种的动物组中，与用PBS疫苗接种的对照动物相比观察到hTERT特异性CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.01)(图8A)。还观察到hTERT特异性CD8 T-细胞的中值数目与接受的疫苗剂量(从12.5μg至100μg)成比例增加。响应动物的数目也随着疫苗剂量增加，分别为12.5μg剂量下6个中的4个响应者，25μg剂量下5个中的4个响应者，及50和100μg剂量下6个中的6个响应者。
在第二组实验中，C57BL/6小鼠使用100μg至1200μg范围内的剂量接受单次INVAC-1 ID注射/电穿孔(图8B)。在用800μg INVAC-1以4mg/mL进行疫苗接种的动物组中，与用PBS疫苗接种的对照动物相比观察到hTERT特异性CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.05)(图8B)。注意到从100μg至800μg，hTERT特异性CD8 T-细胞的中值数目与接受的疫苗剂量成比例增加，并且当注射1200μg时，该中值数目减小。响应动物的数目随着疫苗剂量增加，分别为100μg剂量下5个中的4个响应者，超过200μg剂量下5个中的5个或4个中的4个响应者。对于1200μg剂量来说，尽管所有动物都是响应者，但仍有5个动物中的2个动物具有接近于截止值的特异性响应水平。
总而言之，对于C57BL/6小鼠中的疫苗特异性CD8 T-细胞判据来说，作为给药不同量INVAC-1的结果观察到了剂量响应。有趣的是，与对照小鼠相比，在用最高疫苗剂量(800和1200μg)注射的动物中没有观察到疫苗毒性的迹象(体重监测和处死时的肉眼尸检)。在转基因HLA-B7小鼠中获得了类似数据(数据未示出)。
推荐将初免-加强方案用于INVAC-1疫苗接种以便提高hTERT特异性CD8 T-细胞应答水平
被推荐用于常规疫苗(BCG、麻疹、流感等)的大多数疫苗接种流程包括初免-加强方案以便提高疫苗特异性免疫应答的频率。因此，对于INVAC-1 ID疫苗接种和电穿孔，试验了初免-加强方案对hTERT特异性CD8 T-细胞应答的产生的影响。为此目的，将转基因HLA-B7小鼠用INVAC-1 ID免疫接种，并在疫苗给药后直接对皮肤疫苗接种位点进行电穿孔。在第一次免疫接种后21天，小鼠使用相同的疫苗接种程序接受第二次INVAC-1注射。在初免和加强免疫接种后不同时间点收集外周血，以便使用限制到HLA-B7的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测hTERT特异性CD8 T-细胞应答(图9)。在初免后14天观察到hTERT特异性CD8 T-细胞应答的峰值。然而，在接种疫苗的动物组中hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值相对低(11.3个斑点/200,000PBMC)，并且5个动物中有2个动物对疫苗没有响应。在加强后，在注射后第10天观察到hTERT特异性CD8 T-细胞的峰值。在该时间点(初免后D31，加强后D10)处，接种疫苗的动物组中hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值与免疫前样品中hTERT特异性CD8 T-细胞的频率中值显著不同(p<0.05)。在加强后5个动物中有4个响应者。
总而言之，推荐将初免-加强疫苗接种方案用于INVAC-1 ID疫苗接种/电穿孔，因为首先它允许提高血液中循环的hTERT特异性CD8 T-细胞(效应T-细胞)的频率，其次它缩短了达到特异性细胞免疫应答峰值所必需的时间，这在抗癌疫苗接种的情形中是重要的参数。
用Δ10Not、Δ10Cog或Δ23构建体ID疫苗接种后进行电穿孔也诱导hTERT特异性CD8 T-细胞应答。推荐使用初免-加强疫苗接种方案以提高疫苗特异性CD8 T-细胞的频率。
与INVAC-1的开发一起，设计了3种其他DNA质粒构建体(INVAC-1衍生物)：Δ10Not(pUTD10Not)，Δ10Cog(pUTD10Cog)或Δ23(pUTD23Tyn)。将三个缺失工程化到hTERT酶的催化位点中。它们的范围在10-23个氨基酸残基之间，并跨越关键的三联体缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸残基(Val-Asp-Asp，或者用单字母编码表示为VDD)(图2A)。这些构建体被设计以显示任何消除酶活性的缺失可以保留免疫原性。
为了证实这一假设，将C57BL/6小鼠用INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog、Δ23或PBS通过ID途径免疫接种，随后进行电穿孔(图10A)。一半的动物在第一次免疫接种后21天使用相同的程序接受第二次DNA或PBS的注射。在最后一次疫苗接种/电穿孔后14天(接受单次注射的小鼠组)或10天(接受2次注射的小鼠组)将动物处死。收获小鼠脾脏，并使用限制到H2的hTERT肽(4种肽的合并物)通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的CD8 T-细胞应答。
对于接受单次DNA注射的动物来说，与使用PBS疫苗接种的对照动物相比，仅在用100μg INVAC-1疫苗接种的小鼠组中观察到hTERT特异性CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.05)(图10A，深色点)。当分析响应者频率时，在用INVAC-1和Δ10Cog疫苗接种的小鼠组中4个动物中有3个响应者。然而，对于Δ10Cog来说，动物是hTERT特异性CD8 T-细胞应答低于50/200,000个脾细胞的低响应者。在用Δ23疫苗接种的动物组中4个动物中仅有1个响应者，并且用Δ10Not处理的动物中没有响应者。对于接受两次疫苗接种的动物(图10A，白色点)来说，与用PBS注射的对照小鼠相比，在用INVAC-1、Δ10Not和Δ10Cog免疫接种的小鼠脾脏中观察到分泌IFN-γ的hTERT特异性CD8 T-细胞的显著的频率中值(p<0.001)。在用Δ23疫苗接种的小鼠组中4只动物中仅有2只响应动物，这不是统计上显著的。总而言之，在C57BL/6小鼠中，在1轮或2轮疫苗接种后，INVAC-1和INVAC-1衍生构建体允许诱导hTERT特异性CD8 T-细胞，INVAC-1是更具免疫原性的构建体。
在第二组实验中，将转基因HLA-B7小鼠用INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog、Δ23或PBS进行ID疫苗接种(图10B)随后进行电穿孔，并在第一次后21天使用相同程序接受第二次注射。在最后一次注射后10天收集脾脏，并使用限制到B7的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的CD8 T-细胞应答。如图10B中所示，与用PBS注射的对照小鼠相比，在用INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog和Δ23免疫接种的小鼠的脾脏中观察到分泌IFN-γ的hTERT特异性CD8T-细胞的显著的频率中值(p<0.001)。
如对INVAC-1所示，在两种不同小鼠株系中，在ID疫苗接种和电穿孔后，3种INVAC-1衍生物Δ10Not、Δ10Cog和Δ23也能在体内诱导hTERT特异性CD8 T-细胞。对于INVAC-1衍生物来说也推荐初免-加强疫苗接种方案，以获得显著水平的hTERT特异性CD8 T-细胞应答。合在一起，这些结果证实INVAC-1是允许诱导最佳hTERT特异性CD8 T-细胞应答的构建体。这可能是由如蛋白质印迹所显示的在质粒转染后在ΔhTERT蛋白表达水平中观察到的差异造成的(图3)。
在ID疫苗接种后进行电穿孔后hTERT特异性T-细胞应答的广度随着用于疫苗接种的hTERT质粒构建体(INVAC-1、pNTC-hTERT或pNTC-hTERT-ΔVDD)而不同
评估了在INVAC-1构建体内工程化的hTERT序列修饰，即(1)核仁定位信号的缺失，(2)泛素序列的添加和(3)催化位点内的缺失，对针对hTERT的T-细胞免疫应答的全部组成成分的影响。筛查了在使用INVAC-1进行ID免疫接种/电穿孔后INVAC-1 hTERT特异性细胞免疫应答，并与编码人类TERT的本源/野生型序列的DNA(pNTC-hTERT)和编码仅缺失VDD区域的hTERT序列的DNA(pNTC-hTERT-ΔVDD)所诱导的应答进行比较。对照动物接受25μgpNTC空载体的ID注射，随后进行电穿孔。
第一系列HLA-B7转基因小鼠使用之前描述的疫苗接种流程(25μg/小鼠)接受4种构建体中任一种的单次注射。第二系列动物使用之前描述的疫苗接种流程(25μg/小鼠)，接受使用4种构建体中任一种的初免注射，并在第一次疫苗接种后21天接受加强。
在单次注射后14天或加强后10天，使用269种交叠11个氨基酸并重新覆盖hTERT的整个蛋白质序列的15个氨基酸的肽(27个合并物，各自由10个肽构成)，在IFNγELIspot测定法中试验来自于疫苗接种和对照小鼠的脾细胞。
使用INVAC-1的免疫接种自从初免后诱导了针对大量hTERT表位的T-细胞的大量组成成分，识别了约12个肽合并物(图11A)。这些数据表明使用一定密度的MHC肽复合物在树突细胞的表面上加工之后表达了最少12个限制到HLA-B7的表位，允许诱导强的T-细胞应答。这些重要的结果显示了INVAC-1对于大量hTERT肽在APC表面上的加工和表达的能力。使用其他构建体(hTERT和hTERTΔVDD)获得的差异，验证了在INVAC-1中做出的优化特点引起针对hTERT的T-细胞全部组成成分的广度。此外，这些结果强调了DNA疫苗接种与肽免疫接种相比的优点。
在本研究中证实了在转基因小鼠中使用INVAC-1的第二轮免疫接种(初免-加强)的优点。体内T-细胞全部组成成分被改善，因为至少揭示了5个新的表位(图11B)。在加强后识别了总共至少17个表位。这些数据证实了在患者中的几次注射将有益于获得更好的抗肿瘤应答。
通过为27个肽合并物检测的特异性T-细胞的全部频率中值进行加和对这些数据进行整体分析，在三种hTERT构建体之间在一轮(初免)或两轮(初免-加强)免疫接种后没有观察到重要差异(图11C)。这表明在INVAC-1hTERT中做出的修饰对免疫应答的广度没有影响，尽管在使用INVAC-1加强后观察到显著更高的T-细胞介导的免疫应答。
总而言之，INVAC-1疫苗接种介导针对大量hTERT表位的T-细胞免疫应答的大量组成成分，所述免疫应答在被T-细胞识别的肽/表位方面不同于野生型hTERT和hTERTΔVDD构建体。
使用INVAC-1进行ID疫苗接种随后进行电穿孔诱导具有抗癌免疫应答的特征的hTERT特异性T-细胞应答：细胞毒性CD8 T-细胞和Th1CD4 T-细胞
在抗肿瘤免疫应答中相关的免疫细胞中，细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CTL)和Th1CD4 T-细胞已被鉴定为最强有力的效应细胞(Vesely等，2011)(Braumuller等，2013)。
在第一步中，在使用INVAC-1进行ID疫苗接种/电穿孔后调查了体内hTERT特异性CD8 T-细胞的细胞毒性活性。事实上，这种活性是杀死肿瘤细胞所必需的。为了测量由INVAC-1免疫应答引发的hTERT特异性CD8+ T-细胞应答的体内细胞裂解强度，使用羧基荧光素-二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的肽脉冲过的脾细胞作为靶细胞进行了体内细胞毒性测定。将如上所述使用INVAC-1(或作为对照的PBS)通过ID途径接受初免或初免-加强疫苗接种的HLA-B7转基因小鼠，用7.106个靶细胞进行静脉内注射。靶细胞是来自于未接触过抗原的同类系小鼠的脾细胞，其独立地用3种不同浓度的CFSE标记并用限制到HLA-B7的hTERT肽(p351，免疫显性肽，或p1123，亚显性肽)脉冲或未被脉冲作为内部对照。在15-18小时后收获脾细胞，并通过流式细胞术定量在免疫接种过的小鼠与对照小鼠中肽脉冲过的细胞的消失。
结果显示，在单次注射后所有小鼠产生针对免疫显性肽p351的特异性CTL(图12A，白色点)，特异性裂解中值为35％。三分之一的动物发生针对亚显性肽p1123的特异性CTL(图12A，黑色点)。可以预期，多个注射循环允许增加发生针对亚显性肽1123的特异性CTL裂解的动物的数目。
最近已描述，hTERT特异性CD4 T-细胞应答可能与NSCLC患者中更好的化疗响应有关(Godet等，2012)。因此，调查了在INVAC-1ID注射后hTERT特异性CD4 T-细胞应答的存在。为此目的，将HLA-A2/DR1转基因小鼠用INVAC-1进行ID免疫接种，然后进行电穿孔，在疫苗接种后14天，使用限制到DR1的hTERT肽，通过IFN-γELISPOT测定法监测脾脏中的hTERT特异性CD4 T-细胞应答。如图12B中所示，与用PBS注射的对照小鼠相比，在ID疫苗接种的小鼠的脾脏中观察到分泌IFN-γ的hTERT特异性CD4 T-细胞的显著的频率中值(p<0.001)。
已强调，Th1免疫力对体内癌细胞消除具有明显的正面效果(Braumuller等，2013)。事实上，CD4+ Th1细胞产生几种对于针对肿瘤的细胞介导的免疫力来说必不可少的细胞因子(例如IFN-γ、TNF-α和IL-2)。因此，在INVAC-1 ID疫苗接种后，调查了由hTERT特异性CD4 T-细胞分泌的不同细胞因子。为此目的，将来自于INVAC-1疫苗接种的HLA-A2/DR1转基因小鼠的脾细胞用hTERT肽的合并物在体外刺激24小时或未被刺激。回收上清液并在细胞因子结合测定法(CBA)中测定，以便评估由hTERT特异性CD4 T-细胞分泌的Th1、Th2和Th17细胞因子的浓度。如图12C中所示，与来自于对照小鼠的上清液相比，在来自于从INVAC-1疫苗接种的小鼠回收的脾细胞的上清液中检测到显著浓度的Th1细胞因子IL-2、TNFα和IFNγ(p<0.05)。
因此，使用INVAC-1的ID疫苗接种/电穿孔能够促进表现出体内细胞毒性活性的hTERT特异性CD8 T-细胞以及具有Th1分布情况的特异性CD4 T-细胞的扩增。两种类型的应答都是有利的抗癌免疫应答的特征。
在HLA-A2/DR1转基因小鼠中，使用INVAC-1的治疗性和预防性ID疫苗接种并随后进行电穿孔延迟了同基因肿瘤接种后的肿瘤生长
到目前为止，结果显示INVAC-1的ID注射随后进行电穿孔能够在小鼠中诱导细胞毒性CD8 T-细胞和Th1 CD4 T-细胞。然后，下一步是评估在Sarc-2(纤维肉瘤)肿瘤细胞接种后由INVAC-1 ID疫苗接种和电穿孔提供的对转基因HLA-A2/DR1小鼠的保护。在第一项尝试中，采用初免-加强策略将转基因HLA-A2/DR1小鼠用INVAC-1进行ID疫苗接种并随后进行电穿孔，或用PBS进行假疫苗接种。在预防性疫苗接种后1个月，使用50,000个Sarc-2细胞通过SC途径对小鼠进行激惹。每2-3天测量肿瘤体积。图13A示出了激惹后的肿瘤体积中值随小鼠处理的动力学。然后计算500mm3处的肿瘤生长延迟(TGD)。这个判据允许通过比较对照和处理组中达到规定肿瘤体积的时间来度量疫苗处理对肿瘤生长的影响。在用INVAC-1疫苗接种的小鼠组与接受PBS的动物组之间观察到11天的肿瘤生长延迟。因此，使用INVAC-1的预防性疫苗接种造成肿瘤生长减缓。由于肿瘤接种在最后一次接种疫苗后1个月进行，因此抗肿瘤效应可能在一定程度上归因于hTERT特异性记忆T-细胞的存在。
在第二系列实验中，将转基因小鼠用20,000个Sarc-2细胞移植，并在细胞接种后4天用INVAC-1进行ID疫苗接种，随后进行电穿孔(图13B)。对照动物接受具有与INVAC-1相同的骨架但不编码任何肿瘤抗原的“空”质粒(NTC)的ID注射。在肿瘤移植后21和35天，使用相同程序进行两次加强疫苗接种。计算500mm3处的肿瘤生长延迟。在用INVAC-1疫苗接种的小鼠组与接受NTC空质粒的动物组之间观察到4天的肿瘤生长延迟。总而言之，使用INVAC-1的治疗性疫苗接种允许肿瘤生长的相对弱但被重复观察到的减缓。
在HLA-A2/DR1转基因小鼠中鼠类GM-CSF的给药与INVAC-1 ID疫苗接种/电穿孔一起提高hTERT特异性细胞免疫应答的强度和质量并延迟同基因肿瘤激惹后的肿瘤生长
到目前为止，不同细胞因子已被用作免疫调节剂，以在动物模型和人类两者中在抗癌疫苗接种研究中促进抗原识别和T-细胞扩增。一种最常用的细胞因子是GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。已知这种细胞因子帮助抗原呈递细胞的成熟并有利于Th1细胞免疫应答(Parmiani等，2007)。就GM-CSF在抗肿瘤疫苗的情形中发挥的主要作用而言，试验了添加鼠类GM-CSF(mGM-CSF)对INVAC-1 ID疫苗接种和电穿孔后hTERT特异性T-细胞应答的影响。为此目的，C57BL/6小鼠接受mGM-CSF的ID注射，并在18小时后用INVAC-1通过ID途径进行疫苗接种，随后进行电穿孔(图14A)。另一组小鼠用INVAC-1进行ID疫苗接种/电穿孔而不添加mGM-CSF。对照动物用PBS进行模拟疫苗接种并进行电穿孔。在注射后14天收获小鼠脾脏，并使用限制到H2的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的免疫应答。在INVAC-1的ID注射之前接受mGM-CSF的小鼠组与不接受的组之间观察到IFNγ+CD8 T-细胞频率的显著差异(p<0.001)。因此，mGM-CSF的添加允许hTERT特异性CD8 T-细胞频率的重要增加。第二步由调查这种免疫调节剂对hTERT特异性CD4 T-细胞的质量、特别是对Th1特异性T-细胞的产生的影响构成。为此目的，将来自于INVAC-1或INVAC-1/mGM-CSF疫苗接种的HLA-A2/DR1转基因小鼠的脾细胞在体外用限制到DR1的hTERT肽的合并物刺激24小时或未被刺激。回收上清液并在细胞因子结合测定法(CBA)中测定，以便评估由hTERT特异性CD4T-细胞分泌的Th1、Th2和Th17细胞因子的浓度。如图14B中所示，与来自于仅使用INVAC-1疫苗接种的小鼠的上清液相比，在来自于从用INVAC-1/mGM-CSF疫苗接种的小鼠回收的脾细胞的上清液中检测到显著浓度的Th1细胞因子IL-2、TNFα和IFNγ。当添加mGM-CSF时，作为Th1抗肿瘤细胞因子的TNFα(p<0.01)、IFNγ(p<0.05)和IL-2(p<0.05)的浓度显著增加。
随后，在Sarc-2动物肿瘤模型中研究了mGM-CSF/INVAC-1组合，以便评估mGM-CSF是否可以增强抗肿瘤效果。
为此目的，将HLA-A2/DR1转基因小鼠用20,000个Sarc-2细胞移植，并在细胞移植后4天用INVAC-1和mGM-CSF进行ID疫苗接种，随后进行电穿孔(图14C)。对照动物接受空质粒(NTC)和mGM-CSF或PBS和mGM-CSF的ID注射。在肿瘤移植后21和35天，使用相同程序进行两次加强疫苗接种。计算500mm3处的肿瘤生长延迟(TGD)。在用INVAC-1/mGM-CSF疫苗接种的小鼠组与接受NTC/mGM-CSF的动物组之间观察到14天的TGD；在INVAC-l/mGM-CSF与PBS/mGM-CSF组之间观察到10天的TGD。这些结果证实了使用与mGM-CSF组合的INVAC-1的治疗性疫苗接种允许肿瘤生长减缓。
鼠类IL-12的给药与INVAC-1 ID疫苗接种/电穿孔一起提高hTERT特异性CD8 T-细胞应答的强度
还调查了IL-12细胞因子对INVAC-1 ID疫苗接种和电穿孔后的hTERT特异性CD8T-细胞应答的影响。为此目的，HLA-A2/DR1小鼠接受IL-12的ID注射以及INVAC-1的ID给药，随后进行电穿孔(图15)。另一组小鼠用INVAC-1进行ID疫苗接种/电穿孔而不添加IL-12。对照动物用PBS和IL-12或单独的PBS进行模拟疫苗接种，随后进行电穿孔。在注射后14天收获小鼠脾脏，并使用限制到A2的hTERT肽通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的免疫应答。当添加IL-12时，响应小鼠的频率提高。事实上，对于INVAC-1疫苗接种的组和INVAC-1/IL-12疫苗接种的组来说，在5只动物中分别有2只和4只响应动物。
实施例II
缩写：
AA：氨基酸，bp：碱基对，CTL：细胞毒性T-淋巴细胞，CMV：细胞肥大病毒，DNA：脱氧核糖核酸，EP：电穿孔，ID：真皮内，NoLS：核仁定位序列，RNA：核糖核酸，RTA：相对端粒酶活性，TRAP：端粒重复序列扩增流程，TERT：端粒酶反转录酶，Ubi：泛素，VDD：缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸
材料和方法
质粒DNA载体
INVAC-1
INVAC-1构建体已描述在实施例I中。
INVAC-1改组衍生物
pUTScram和pUTInv构建体是约8.9kb的双链DNA质粒，其编码无酶活性的基于人类泛素-端粒酶的融合蛋白。将混杂的和反向的转入基因插入到Invitrogen pcDNA3.1(+)载体(5.4kb)中，所述载体源自于被设计用于在哺乳动物细胞中高水平的稳定和瞬时表达的pcDNA3.0。转入基因的表达由人类细胞肥大病毒立即早期(CMV)启动子驱动，以允许在广范围的哺乳动物细胞中高效高水平表达。所述载体含有多克隆位点(MCS)以便于克隆。高效转录终止由牛生长激素(BGH)多腺苷化信号驱动。
pUTScram(被称为混杂的)
Ubi-混杂的hTERT插入片段(混杂的，1184 AA)始于pUTScram质粒的923位并止于4474位(图20A)。pUTScram编码1184个氨基酸的基于人类泛素-端粒酶的融合构建体(混杂的)，对应于约130.2kDa的蛋白质。hTERT蛋白缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。催化位点被编码VDD(*号；图28)并对应于的野生型人类端粒酶(hTERT；专利WO 2007/014740和hTERT同种型1登记号NM_198253)的867-869位氨基酸的9bp的缺失而失活。hTERT序列被分成10个免疫原性片段并以下述特定顺序重新组装：片段7(210bp)，片段2(201bp)，片段6(312bp)，片段4(117bp)，片段9(576bp)，片段3(120bp)，片段1(258bp)，片段8(477bp)，片段10(516bp)，片段5(303bp)。这10个片段用6xGly连接物(G连接物；18bp)桥接。因此，从hTERT序列缺失了76个非免疫原性AA(228 bp)。Ubi-hTERT改组插入片段的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签(图22)。
pUTInv(被称为反向的)
Ubi-反向的hTERT插入片段(反向的，1184 AA)始于pUTInv质粒的923位并止于4474位(图20B)。pUTInv编码1184个氨基酸的基于人类泛素-端粒酶的融合构建体(反向的)，对应于约130.2kDa的蛋白质。hTERT蛋白缺失了前23个氨基酸(1-23 AA)，其被泛素多肽(76 AA)替换。催化位点被编码VDD(*号；图29)并对应于的野生型人类端粒酶(hTERT；专利WO 2007/014740；登记号NM_198253)的867-869位氨基酸的9bp的缺失而失活。hTERT序列被分成10个免疫原性片段并以下述特定顺序重新组装：片段10(516bp)，片段9(576bp)，片段8(477bp)，片段7(210bp)，片段6(312bp)，片段5(303bp)，片段4(117bp)，片段3(120bp)，片段2(201bp)，片段1(258bp)。这10个片段用6xGly连接物(G连接物；18bp)桥接。因此，从hTERT序列缺失了76个非免疫原性AA(228bp)。Ubi-hTERT改组插入片段的C-端序列处的14个氨基酸编码V5表位标签(图22)。
基因合成和克隆
所述基因通过交叠的40mer寡核苷酸组装过程，作为基于泛素-端粒酶的融合构建体从头合成(GeneCust，Luxembourg)。制造了几个保守碱基改变以消除限制性位点并弱化富含GC的序列。基因合成包括独一无二的侧翼限制性位点HindIII/XbaI，以允许将基因亚克隆到所需表达系统中。将合成的基因克隆到pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen,Carlsbad,USA)的HindIII与XbaI限制性位点之间。质粒的序列通过用PEGFP-N5’CGGTGGGAGGTCTATATAAG(SEQ ID NO：27)和BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC(SEQ ID NO：28)引物进行测序来验证。
质粒生产
将这些由GeneCust合成的INVAC-1改组衍生物转化到大肠杆菌5-α细胞(fhuA2Δ(argF-lacZ)U169phoA glnV44Φ80Δ(lacZ)M15gyrA96recA1relA1endA1thi-1hsdR17)(Lucigen Corporation,Middleton,USA，参见60602-2)中，并由RD Biotech(Besangon,France)在其中进行生产。将细胞在含有氨苄青霉素的Lenox肉汤培养基(#EU04000D,Euromedex)上铺板并繁殖。在提取和纯化后，制备重悬浮在1X无菌PBS中的浓缩的无内毒素大量制备质粒储液(2mg/mL)。所述载体通过限制性作图来验证(HindIII-XbaI；图21)。
pTRIP-CMV-hTERT
该DNA质粒已描述在实施例I中。
用于蛋白质印迹和TRAP测定法的细胞培养和瞬时转染
CrFK(Crandell Rees猫肾)和HEK293T(人类胚胎肾)细胞系培养在增补有10％热失活胎牛血清(PAA，Velizy-Villacoublay，France)和1％青霉素/链霉素(LifeTechnologies,Saint-Aubin,France)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。
将细胞在37℃和含有5％CO2的加湿气氛下，在75cm2培养瓶中生长成单层。将细胞生长到在转染当天70-80％合生。对于蛋白质印迹分析来说，将5x105个细胞接种在6孔组织培养板中并温育24h。对于TRAP测定法来说，将7xl05个细胞接种在6孔组织培养板中并温育24h。
使用jetPrime阳离子型聚合物转染试剂，按照制造商的说明书(Polyplus-transfection Inc.,France)将INVAC-1、pUTScram和pUTInv构建体转染到靶细胞中。将用pTRIP-CMV-hTERT质粒转染的细胞用作阳性对照，并将未转染的细胞用作阴性对照。4小时后除去转染培养基并用2mL DMEM培养基替换。在转染适合的时间后——对于蛋白质印迹分析来说18-96小时和对于TRAP测定法来说24小时，收获细胞并分析端粒酶的表达和活性。
蛋白质印迹
蛋白质印迹分析使用转染的HEK293T细胞进行。蛋白质印迹程序如实施例I中所描述。
TRAP测定法
该程序如实施例I中所描述。
小鼠
在这些实验中使用HLA-B*0702转基因小鼠株系。
HLA-B*0702转基因小鼠表达人类HLA-B*0702分子的α1-α2结构域和鼠类H2D分子的α3结构域。这些小鼠不表达H2-Db和H2-Kb分子(Rohrlich,Cardinaud等，2003)。
小鼠在9至15周龄之间使用，并由巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute)供应。动物被饲养在巴斯德研究所的无特定病原体动物房(Animal Facilities Lwoff n°22，协议号B 75 15-07)。在真皮内(ID)或静脉内(IV)注射之前，将小鼠根据各个动物的体重和麻醉持续时间，用2％甲苯噻嗪(Rompun,Bayer Santé,Loos,France)和8％氯胺酮(Imalgen1000,Merial,Lyon,France)在1X磷酸盐缓冲盐水(1X PBS,Life Technologies,Saint-Aubin,France)中的混合溶液，通过腹膜内途径(IP)进行麻醉。所有动物严格按照良好动物规范操作，并遵照当地动物实验管理指令(Directive 2010/63/UE)。
hTERT肽
限制到HLA-B*0702的hTERT肽之前描述在实施例I中。在使用前将冷冻干燥的肽以2mg/mL溶解在无菌水中，并储存在-20℃。
小鼠免疫接种和体内电穿孔程序
真皮内(ID)免疫接种在小鼠侧面下部，在剃毛后使用胰岛素注射器和特定针头(U-100，29GX1/2”-0.33x12mm,Terumo,Belgium)进行。在剃毛后、免疫接种程序期间和之后没有观察到红斑。每只动物接受具有100μg DNA的质粒(INVAC-1、pUTScram或pUTInv)或1XPBS的初免ID注射。根据疫苗接种方案，小鼠可以接受相似的第二次DNA或1X PBS注射。
体内DNA电穿孔使用装备有平板电极(P-30-8G,IGEA)的2电穿孔系统和软件(IGEA,Italy)来进行。紧接ID疫苗接种之后，在注射位点处制造皮肤皱襞，用导电凝胶(Labo FH，蓝色接触凝胶，NM Médical,France)完全覆盖，并置于平板电极之间。施加两种不同电压的脉冲(HV-LV)：HV：1250V/cm，1Hz，100μs；1个脉冲，1000ms中断；LV：180V/cm，1Hz，400ms，1个脉冲。
ELISpot测定法
ELISpot测定法按照在实施例I中描述的方法来进行。在实施例II中仅使用限制到HLA-B*0702的三种特异性hTERT肽(p277、p351和p1 123)的合并物。
体内细胞毒性测定法
体内裂解分析按照在实施例I中描述的程序来进行。在实施例II中仅使用限制到HLA-B*0702的两种特异性hTERT肽(p351和p1123)分别作为免疫显性和亚显性肽。
统计分析和数据处理
将GraphPad Prism软件用于数据处理、分析和图示。数据表示平均值±标准偏差或中值。ELISpot测定法的统计分析使用Mann Whitney非参数和/或Kruskal-Wallis分析和Dunn's多重比较检验来进行。显著性被设定在p-值<0.05。
结果
INVAC-1质粒DNA的表征和序列分析
INVAC-1质粒DNA的表征和序列分析已经描述在实施例I中。INVAC-1改组衍生构建体(pUTScram和pUTInv)的表征和序列分析
合成并克隆了两个INVAC-1改组衍生基因(图20)。这些构建体是基于实施例I中描述的INVAC-1核苷酸序列和国际专利申请WO2007/014740中描述的野生型hTERT氨基酸序列。
为了在哺乳动物细胞中高水平表达进行了密码子优化(图27)。混杂和反向的Ubi-hTERT改组的转入基因被成功连接到pcDNA3.1(+)Invitrogen表达载体中，正如通过HindIII和XbaI消化和电泳所示(图21)。插入片段和联结部使用与DNA插入片段侧翼的载体序列匹配的PEGFP-N5’和BGH引物进行测序。测序结果证实了转入基因已被正确克隆(图28和29)。
INVAC-1改组衍生蛋白在体外正确表达并通过蛋白酶体途径降解
进行了蛋白质印迹分析以提供关于在体外瞬时转染到HEK293T细胞系中18h至96h后野生型hTERT、INVAC-1、pUTScram和pUTInv蛋白的总体表达的信息。野生型hTERT蛋白的条带对应于124.5kDa处的未修饰hTERT的大小(图23A和23C，图的左部)。在实施例I中，INVAC-1蛋白已被显示随时间快速降解，与此相反野生型hTERT蛋白以稳定的水平表达。随时间检测到混杂和反向的改组蛋白的特定条带(图23A和23C，图的右部)。对于两者来说，在比完整蛋白的预测大小(130.2kDa)更小的大小(<110kDa)处观察到这些条带。混杂和反向的蛋白的这些形式对应于降解产物。事实上，不能在蛋白质印迹分析上检测到未降解的混杂和反向的表达产物。这些构建体分别给出1至3个特定条带，表明这些蛋白质在刚刚产生后的快速降解。对于INVAC-1来说，在归一化到β-肌动蛋白上样对照后证实了降解的混杂产物相同的随时间降解图案(ImageJ分析；图23B)。降解的反向产物具有更类似于其他INVAC-1衍生蛋白的图案(图23C、23D和图3C：pUTD10Not、pUTD10Cog和pUTD23Tyn，参见实施例I)。
INVAC-1改组衍生物具有占优的细胞质分布和核仁排斥模式
正如对INVAC-1和INVAC-1衍生物(pUTD10Not、pUTD10Cog和pUTD23Tyn，参见实施例I)所证实的，由pUTScram和pUTInv编码的混杂和反向的改组蛋白在细胞核与细胞质之间分布，并具有核仁排斥模式(数据未示出)。
INVAC-1改组衍生物不具有酶活性
在端粒酶阴性CrFK细胞系中进行TRAP测定法以评估Ubi-hTERT改组构建体的端粒酶活性。只在使用pTRIP-CMV-hTERT质粒用野生型hTERT转染的CrFK细胞中检测到端粒酶活性。
如图24A中所示，原始吸收值数据证实了混杂和反向的蛋白的端粒酶活性水平与未处理细胞的水平相当。相对端粒酶活性(RTA)数据(图24B)代表了通过使用包括热失活样品的各种不同阴性对照而将测定法的特异性考虑在内的充分分析的结果，证实了这些改组蛋白完全不具有任何端粒酶活性。
改组hTERT构建体诱导hTERT特异性CD8 T-细胞应答
pUTScram和pUTInv构建体被设计成诱导多个hTERT表位的抗原呈递，增加了INVAC-1特点的范围。在用不同构建体ID免疫接种并随后进行皮肤电穿孔的HLA-B7小鼠中，评估了在两轮免疫接种(初免-加强方案)后pUTScram、pUTInv和INVAC-1的免疫原性的比较。在第二次疫苗接种/电穿孔后10天，将动物处死。收获小鼠脾脏，并使用限制到HLA-B7 I类MHC的hTERT肽(3种肽p277、p351和p1123的合并物)通过IFN-γELISPOT测定法监测诱导的CD8 T-细胞应答。与对照动物相比，在用INVAC-1、pUTScram(混杂的)和pUTInv(反向的)疫苗接种的小鼠中观察到hTERT特异性CD8 T-细胞频率的显著差异(图25)。
这些结果证实，人造的hTERT改组构建体pUTScram(混杂的)和pUTInv(反向的)与INVAC-1相同，在两轮免疫接种后诱导明显高水平的hTERT特异性CD8 T-细胞应答。事实上，正如以前对INVAC-1所证实的，初免-加强疫苗接种方案的优点是选择性加强以前被激活的特异性T-细胞并拓宽表位呈递，以便产生涉及新的特异性TCR的二次hTERT特异性T-细胞。
使用人造的改组hTERT构建体pUTScram和pUTInv的疫苗接种在体内诱导细胞毒性hTERT特异性CD8 T-细胞
在抗肿瘤免疫应答中相关的免疫细胞中，细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CTL)和Th1CD4 T-细胞已被鉴定为最强有力的效应细胞(Vesely,Kershaw等，2011)(Braumuller，Wieder等，2013)。
在使用INVAC-1、pUTScram和pUTInv进行ID疫苗接种/电穿孔后，在体内调查了hTERT特异性CD8 T-细胞的细胞毒性活性。为了测量由DNA免疫接种引发的hTERT特异性CD8+ T-细胞应答的体内细胞裂解强度，使用羧基荧光素-二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记并用肽脉冲过的脾细胞作为靶细胞进行体内细胞毒性测定。将如上所述通过ID途径接受使用DNA构建体(或作为对照的PBS)的一次疫苗接种的HLA-B7转基因小鼠，用107个靶细胞进行静脉内注射。靶细胞是来自于未接触过抗原的同类系小鼠的脾细胞，其独立地用3种不同浓度的CFSE标记并用限制到HLA-B7的hTERT肽(p351，免疫显性肽，或p1123，亚显性肽)脉冲或未被脉冲作为内部对照。在15-18小时后收获免疫接种的小鼠的脾细胞，并通过流式细胞术分析脾细胞悬液。通过将疫苗接种的小鼠和对照小鼠中脉冲过与未脉冲的CFSE标记的细胞之比进行比较，来评估特异性裂解的百分率。
结果显示，用不同构建体免疫接种的所有小鼠都在一次免疫接种后发生hTERT特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
正如预期的，对于三个组来说，针对免疫显性肽p351的细胞毒性高于针对亚显性肽p1123的细胞毒性(图26)。
使用INVAC-1和pUTInv的免疫接种分别引起37％和35％的带有端粒酶免疫显性(p351)表位的靶细胞的特异性裂解(图26，黑色点)。与此相比，使用pUTScram的免疫接种引起20％的特异性裂解。5只INVAC-1免疫接种的小鼠中的2只和6只pUTScram免疫接种的小鼠中的1只发生针对亚显性肽p1123的特异性CTL(图26，灰色点)。
正如前面陈述的，可以预期多个注射循环将允许增加发生针对免疫显性和亚显性肽两者的特异性CTL裂解的动物的数量。事实上，以前的结果(参见实施例I)证实了第二次免疫接种拓宽了针对亚显性表位的免疫应答的广度。
总而言之，作为INVAC-1，人造的混杂或反向的改组hTERT介导的免疫接种可以产生表现出体内细胞裂解活性的hTERT特异性CD8 T-细胞。
参考文献
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Claims (28)
1.一种核酸构建体，其包含编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的人类端粒酶反转录酶(hTERT)蛋白的序列。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白在N-端与增强所述hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的蛋白融合。
3.权利要求1或2任一项的核酸构建体，其中编码hTERT蛋白的所述序列含有提供TERT蛋白的催化活性的失活的突变。
4.权利要求3的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白通过缺失至少一个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
5.权利要求4的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白通过缺失867-869位氨基酸(VDD)而不具有端粒酶催化活性。
6.权利要求5的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白通过进一步缺失867-869位氨基酸(VDD)上游和/或下游的1至12个氨基酸而不具有端粒酶催化活性。
7.权利要求1至6任一项的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白通过缺失至少1-23位氨基酸而不具有核仁定位信号。
8.权利要求7的核酸构建体，其中所述hTERT蛋白通过缺失1-47位氨基酸而不具有核仁定位信号。
9.权利要求2至8任一项的核酸构建体，其中增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的所述蛋白是泛素。
10.权利要求2至8任一项的核酸构建体，其中增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的所述蛋白是伴侣蛋白例如钙网蛋白。
11.权利要求1至10任一项的核酸构建体，其是DNA，优选为DNA质粒。
12.权利要求11的核酸构建体，其编码氨基酸序列SEQ ID NO：12。
13.权利要求12的核酸构建体，其包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：11的3488至6961位核苷酸。
14.权利要求11的核酸构建体，其编码氨基酸序列SEQ ID NO：14、16或18，并优选地包含核苷酸序列SEQ ID NO：13、15或17。
15.权利要求1至14任一项的核酸构建体，其用于在受试者中引发针对过表达端粒酶的细胞、优选为异型增生细胞、肿瘤细胞或被肿瘤病毒感染的细胞的免疫应答。
16.权利要求1至14任一项的核酸构建体，其用于在患者中预防或治疗肿瘤。
17.一种包含源自于人类端粒酶反转录酶(hTERT)的序列的核酸构建体，其中源自于hTERT的所述序列
i)以任何顺序编码hTERT的所有或基本上所有的表位，并且
ii)编码不具有端粒酶催化活性和核仁定位信号的蛋白。
18.符合权利要求17的核酸构建体，其以任何顺序包含所有或基本上所有的被示出为SEQ ID NO：61至97的免疫原性序列。
19.权利要求18的核酸构建体，其编码以任何顺序包含片段SEQ ID NO：51至SEQ IDNO：60的序列。
20.权利要求17至19任一项的核酸构建体，其中所述蛋白在N-端与增强所述蛋白向蛋白酶体寻址的蛋白融合。
21.权利要求17至20任一项的核酸构建体，其中所述蛋白通过缺失867-869位氨基酸(VDD)而不具有端粒酶催化活性。
22.权利要求17至21任一项的核酸构建体，其中增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的所述蛋白是泛素。
23.权利要求17至21任一项的核酸构建体，其中增强hTERT蛋白向蛋白酶体寻址的所述蛋白是伴侣蛋白例如钙网蛋白。
24.权利要求17至23任一项的核酸构建体，其是DNA，优选为DNA质粒。
25.权利要求17至24任一项的核酸构建体，其包含编码SEQ ID NO：48的序列。
26.权利要求17至24任一项的核酸构建体，其包含编码SEQ ID NO：50的序列。
27.权利要求17至26任一项的核酸构建体，其用于在受试者中引发针对过表达端粒酶的细胞、优选为异型增生细胞、肿瘤细胞或被肿瘤病毒感染的细胞的免疫应答。
28.权利要求17至27任一项的核酸构建体，其用于在患者中预防或治疗肿瘤。
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