CN107532174A - 转座酶多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了转座酶多肽和多核苷酸，其在哺乳动物细胞中具有高活性。还提供了用于用所述转座酶工程化细胞如嵌合抗原T细胞的方法。

Description

转座酶多肽及其用途
本申请要求于2016年3月11日提交的美国临时申请62/131,827的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表的并入
序列表与本文一起通过电子递交来提交并且通过引用并入本文，所述序列表包含在命名为“UTFCP1256WO_ST25.txt”的文件中，该文件为18KB(如在Microsoft中测量)并且在2016年3月3日创建。
发明背景
1.技术领域
本发明一般涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域。在某些方面，本发明的领域涉及转座酶多肽及其在遗传工程中的用途。
2.背景技术
在功能基因组学时代，需要有效的手段来改变细胞基因组中的编码序列。这种基因组工程可以用于产生具有稳定表达的转基因的细胞和用于细胞重编程。基因组工程中使用的一种合适的工具是转座子/转座酶系统。转座子或可转座元件包括具有其上游和下游末端重复序列的(短)核酸序列，并编码有助于将核酸切除并插入靶DNA序列的酶。已经改造了几种转座子/转座酶系统，用于异源DNA序列的遗传插入，包括Sleeping Beauty(SB)，一种来自鱼的Tc1/mariner样元件，其在多种脊椎动物培养的细胞系、胚胎干细胞中和在体内表现出转座活性(Ivics等人，1997)。然而，这些系统都没有被用于人/哺乳动物细胞工程。因此，需要在哺乳动物细胞和生物体内具有高水平活性的转座子/转座酶系统。
发明内容
在第一个实施方案中提供了重组多肽，所述重组多肽包含哺乳动物中增强的转座酶活性或由哺乳动物中增强的转座酶活性组成。在一些方面，实施方案的多肽包含与SEQID NO:1(hSB110)或SEQ ID NO:3(hSB81)至少90％相同的序列或由所述序列组成。在某些方面，多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的全长至少90％相同的序列或由所述序列组成，并且在哺乳动物细胞中表现出转座酶活性。在其它的方面中，多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90％相同的序列或由所述序列组成，在哺乳动物细胞中表现出转座酶活性，并且包含下列特征中的一种或多种：与136位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与253位(在hSB110中)对应的位置处的His、与255位(在hSB110中)对应的位置处的Arg和/或与314位(在hSB110中)对应的位置处的Thr。在其它方面，前述的至少90％相同的多肽不包含天然存在的转座酶的序列或不包含SEQ ID NO:5(SB11)、SEQ ID NO:6(SB10)或SEQ ID NO:7(SB100x)的序列。在一些方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:1(hSB110)或SEQ ID NO:3(hSB81)至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成。在一些方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:1(hSB110)或SEQ ID NO:3(hSB81)至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成，并且在哺乳动物细胞中表现出转座酶活性。在一些方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:1(hSB110)或SEQ ID NO:3(hSB81)至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成，在哺乳动物细胞中表现出转座酶活性，并且包含下列特征中的一种或多种或由下列特征中的一种或多种组成：与136位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与253位(在hSB110中)对应的位置处的His、与255位(在hSB110中)对应的位置处的Arg和/或与314位(在hSB110中)对应的位置处的Thr。在一些方面，前述的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽不包含天然存在的转座酶的序列或不包含SEQ ID NO:5(SB11)、SEQ IDNO:6(SB10)或SEQ ID NO:7(SB100x)的序列。在其它方面，实施方案的转座酶多肽还包含与转座酶序列的N或C端融合的异源多肽序列或由所述异源多肽序列组成。例如，异源多肽序列可以包含报告物、纯化标签或细胞穿透多肽(CPP)或由报告物、纯化标签或细胞穿透多肽(CPP)组成。在其它方面，实施方案的多肽表现出转座酶活性的哺乳动物细胞是人细胞。在其它方面，人细胞是免疫细胞。在其它方面，人免疫细胞是T细胞。在其它方面，T细胞是T辅助细胞(TH细胞)、细胞毒性T细胞(Tc细胞或CTL)、记忆T细胞(TCM细胞)、效应T细胞(TEM细胞)、调节T细胞(Treg细胞；也称为抑制T细胞)、天然杀伤T细胞(NKT细胞)、粘膜相关不变T细胞、α-βT细胞(Tαβ细胞)和/或γ-δT细胞(Tγδ细胞)。
在另外的方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:1(hSB110)或SEQ ID NO:3(hSB81)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成，包含下列特征中的一种或多种：与136位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与253位(在hSB110中)对应的位置处的His、与255位(在hSB110中)对应的位置处的Arg和/或与314位(在hSB110中)对应的位置处的Thr，并且进一步包含下列额外特征中的一种或多种：与14位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与33位(在hSB110中)对应的位置处的Ala、与115位(在hSB110中)对应的位置处的His、与214位(在hSB110中)对应的位置处的Asp、与215位(在hSB110中)对应的位置处的Ala、与216位(在hSB110中)对应的位置处的Val、与217位(在hSB110中)对应的位置处的Gln和/或与243位(在hSB110中)对应的位置处的His。在一些方面，前述的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽不包含天然存在的转座酶的序列或不包含SEQ ID NO:5(SB11)、SEQ ID NO:6(SB10)或SEQ IDNO:7(SB100x)的序列。在一些方面，实施方案的多肽包含选自由以下组成的组的序列特征中的2、3、4、5、6、7或8种：与14位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与33位(在hSB110中)对应的位置处的Ala、与115位(在hSB110中)对应的位置处的His、与214位(在hSB110中)对应的位置处的Asp、与215位(在hSB110中)对应的位置处的Ala、与216位(在hSB110中)对应的位置处的Val、与217位(在hSB110中)对应的位置处的Gln和与243位(在hSB110中)对应的位置处的His。在其它方面，前述的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽包含与214-217位(在hSB110中)对应的位置处的序列DAVQ。
在一些方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:1(hSB110)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成，包含与314位(在hSB110中)对应的位置处的Asn，并且包含下列特征中的一种或多种：与136位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与253位(在hSB110中)对应的位置处的His和/或与255位(在hSB110中)对应的位置处的Arg。在一些方面，前述的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽不包含天然存在的转座酶的序列或不包含SEQ ID NO:5(SB11)、SEQ ID NO:6(SB10)或SEQ ID NO:7(SB100x)的序列。在具体的方面，多肽包含SEQID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成。
在其它方面，实施方案的多肽包含与SEQ ID NO:3(hSB81)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或由所述序列组成，包含与314位(在hSB110中)对应的位置处的Thr，并且包含下列特征中的一种或多种：与136位(在hSB110中)对应的位置处的Arg、与253位(在hSB110中)对应的位置处的His和/或与255位(在hSB110中)对应的位置处的Arg。在一些方面，前述的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽不包含天然存在的转座酶的序列或不包含SEQ ID NO:5(SB11)、SEQ ID NO:6(SB10)或SEQ ID NO:7(SB100x)的序列。在具体的方面，多肽包含SEQID NO:3的序列或由SEQ ID NO:3的序列组成。
在另外的实施方案中，提供了包含编码根据实施方案的多肽的序列或由编码根据实施方案的多肽的序列组成的多核苷酸分子。在一些方面，分子可以是DNA表达载体。例如，DNA表达载体可以包含与用于在体外表达多肽的启动子(例如T7或SP6启动子)或用于在哺乳动物细胞中表达多肽的启动子可操作连接的转座酶编码序列。在一些方面，多核苷酸分子可以是RNA或mRNA。在其它方面，RNA可以包含5’-帽、IRES基序、(异源)5’UTR、(异源)3’UTR和/或多聚(A)序列。在一些方面，RNA可以另外包含20至300个核苷酸的多聚(A)序列。
在另外的实施方案中，本发明提供了制备如上所述的转座酶多肽的方法，包括用编码转座酶多肽的多核苷酸转染细胞并从多核苷酸表达多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了包含实施方案的多肽或多核苷酸分子的宿主细胞。在一些情况下，细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。在某些方面，细胞是干细胞或诱导多能干(iPS)细胞。在另外的方面，细胞是天然杀伤(NK)细胞、NK细胞的前体、T细胞、T细胞的前体或免疫细胞。在一些情况下，细胞可以包含编码实施方案的转座酶多肽的RNA。在另外的实施方案中，提供了细胞群体，所述细胞包含实施方案的多肽或多核苷酸分子。
在另一个实施方案中，提供了用于遗传工程化细胞的方法，包括：用如上所述的转座酶多肽或编码转座酶多肽的核酸以及包含编码侧翼有转座子重复序列的所选择遗传元件的序列的DNA载体转染细胞，然后在适合于(瞬时或稳定)转座酶活性的条件下孵育细胞，从而在细胞的基因组中整合选择的遗传元件并产生工程化细胞。在某些方面，编码侧翼有转座子重复的所选择遗传元件的DNA载体还包含编码实施方案的转座酶多肽的序列。因此，在某些方面，实施方案的方法包括用DNA载体转染细胞，所述DNA载体包含编码侧翼有转座子重复的所选择遗传元件的序列以及编码实施方案的转座酶的序列(其处于启动子序列的控制下)，然后在适于转座酶表达和活性的条件下孵育细胞，从而在细胞的基因组中整合选择的遗传元件并产生工程化细胞。在一些方面，该方法包括分离或培养工程化细胞的第三个步骤。在一些方面，选择的遗传元件是可筛选或可选择的标志物。在另外的方面，选择的遗传元件可以编码抗体、抑制性核酸(例如，小干扰RNA(siRNA))、治疗性多肽、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或免疫细胞功能的增强剂。在具体方面，选择的遗传元件编码CAR或TCR。在另外的方面，所选择的遗传元件可以是用于替代或修饰来自细胞的相应基因(例如，改变基因的序列或表达或“敲除”基因在细胞中的表达)的基因或其部分。在一些方面，转染的细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。在一些情况下，细胞可以是干细胞或iPS细胞。在某些方面，细胞可以是免疫系统细胞或其前体，如NK细胞、T细胞、NK细胞的前体或T细胞的前体。
在一些方面，转染细胞可以包括使用基于化学剂的转染试剂、细胞的电穿孔或提供核酸和/或蛋白质向细胞的细胞质和细胞核递送的其它技术。例如，可以使用盐沉淀物(例如CaPO4沉淀物)、脂质(例如带电荷或非极性脂质)、阳离子聚合物、PEG-复合物和/或蛋白质复合物(例如阳离子多肽)转染细胞。在一些方面，转染可涉及使用脂质体，如磷脂脂质体(例如，掺入甘油磷脂或鞘脂的脂质体)。在另外的方面，细胞可以用病毒载体(例如，腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒(例如慢病毒)或痘苗病毒载体)转导。在某些方面，根据实施方案使用的病毒载体是非整合型病毒载体。熟练技术人员将认识到，在某些方面，实施方案的转座酶可以与编码转座子重复的核酸一起或分开递送至细胞。例如，在某些方面，可以使用蛋白质转染试剂将转座酶作为重组多肽递送至细胞，并且可以使用核酸转染系统或病毒载体递送包含转座子重复的核酸分子。在另外的方面，编码转座酶的RNA与包含转座子重复和所选择的遗传元件的DNA共转染。
在另外的方面，该方法另外包括用实施方案的转座酶多肽或编码转座酶多肽的核酸以及包含编码侧翼有转座子重复序列的所选择遗传元件的序列的DNA载体转染细胞群体，并且适合于转座酶活性的条件下孵育所述群体，从而在细胞的基因组中整合选择的遗传元件并产生工程化细胞群体。在具体方面，该方法包括用转座酶多肽或编码转座酶多肽的核酸以及包含编码侧翼有转座子重复的CAR的序列的DNA载体转染T细胞或T细胞前体的群体，并且在适合于转座酶活性的条件下孵育群体，从而在细胞的基因组中整合CAR并产生工程化T细胞或T细胞前体的群体。在另外的方面，该方法包括用包含编码侧翼有转座子重复的CAR序列和编码实施方案转座酶的序列(可操作地连接到启动子)的DNA载体转染T细胞或T细胞前体的群体，并在适于转座酶活性的条件下孵育群体，从而在细胞的基因组中整合CAR并产生工程化T细胞或T细胞前体的群体。在一些方面，可以另外进行在选择性增强CAR表达性T细胞增殖的培养基中培养工程化细胞。
在又一个实施方案中，提供了在具有疾病的人受试者中提供T细胞应答的方法，其包括首先根据实施方案获得工程化T细胞或T细胞前体的群体，任选地，在选择性增强CAR表达性T细胞的增殖的培养基中培养细胞，然后对受试者施用有效量的CAR表达性T细胞以提供T细胞应答。
因此，在一些方面，实施方案的方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，所述样品包含T细胞或T细胞祖细胞；(b)用编码侧翼有转座子的嵌合抗原受体(CAR)和有效将编码CAR的DNA整合到细胞基因组中的实施方案的转座酶的DNA转染细胞以提供转基因CAR表达细胞群体；(c)任选地，在选择性增强CAR表达性T细胞增殖的培养基中离体培养转基因CAR细胞群体；和(d)对受试者施用有效量的转基因CAR细胞以提供T细胞应答。因此，在一些方面，将转基因CAR细胞离体培养少于21天，例如少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天或更少。在某些方面，将CAR细胞离体培养不超过3至5天。在另外的方面，将本方法的步骤(a)-(d)(即获得细胞样品至施用CAR T细胞)在不超过21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天中完成。在另外的方面，来自受试者的细胞样品可以是小于约200ml的外周血或脐带血的样品。在一些方面，可以通过血浆分离置换法(apheresis)来收集样品。在某些方面，通过不涉及血浆分离置换法(例如通过静脉穿刺术)的方法收集样品。在另外的方面，细胞样品的初始体积小于175ml、小于约175ml、小于150ml、小于约150ml、小于125ml、小于约125ml、小于100ml、小于约100ml、小于75ml、小于约75ml、小于50ml、小于约50ml、小于25ml或小于约25ml(例如，当从受试者获得时，细胞样品具有在约50至约200ml之间、约50至约100ml之间或在约100至约200ml之间初始体积)。
在一些方面，实施方案的方法涉及用编码嵌合抗原受体(CAR)和转座酶的DNA转染细胞。细胞转染方法是本领域熟知的，但是在某些方面，采用高效转染方法如电穿孔。例如，可以使用核转染装置将核酸引入细胞。在某些实施方案中，转染步骤不涉及用病毒感染或转导细胞，其可针对经处理的受试者中含有病毒序列的细胞引起遗传毒性和/或导致免疫应答。
实施方案的其它方面涉及用编码CAR的表达载体转染细胞。本领域已知一大批CAR构建体和其表达载体。例如，在一些方面，CAR表达载体是DNA表达载体，如质粒、线性表达载体或附加体。在一些方面，载体包含另外的序列，如促进CAR表达的序列，如启动子、增强子、多聚A信号和/或一个或多个内含子。在某些方面，CAR编码序列侧翼有转座子序列，使得转座酶的存在允许编码序列整合到转染细胞的基因组中。
如上详述，在某些方面，用促进CAR编码序列整合到转染细胞基因组的实施方案的转座酶进一步转染细胞。在一些方面，转座酶作为DNA表达载体提供。在某些方面，转座酶作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得在转基因细胞中不发生转座酶的长期表达。例如，在一些方面，提供了由mRNA编码的转座酶(例如，包含帽和多聚-A尾的mRNA)。
在另外的方面，实施方案的转基因CAR细胞还包含用于表达刺激T细胞增殖和/或存活的膜结合细胞因子的表达载体。特别地，由于由细胞因子表达提供的模拟，包含此类细胞因子的CAR细胞可以通过激活和增殖细胞(AaPC)或人工抗原呈递细胞(aAPC)在少量的或无的离体培养物的情况下增殖和/或持续。同样地，即使不存在大量由CAR识别的抗原(例如在缓解期的癌症患者或具有最小残留疾病的患者的情况下)时，此类CAR细胞也可在体内增殖。在一些方面，CAR细胞包含用于表达Cγ细胞因子和元件(例如跨膜结构域)的DNA或RNA表达载体，以提供细胞因子的表面表达。例如，CAR细胞可以包含IL-7、IL-15或IL-21的膜结合形式。在一些方面，通过细胞因子编码序列与细胞因子受体的融合将细胞因子栓系于膜。例如，细胞可以包含用于表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白的载体。在另外的方面，编码膜结合的Cγ细胞因子的载体是DNA表达载体，如整合到CAR细胞的基因组中的载体或染色体外载体(例如和附加体载体)。在另外的方面，膜结合的Cγ细胞因子的表达受诱导型启动子(例如，药物诱导型启动子)的控制，使得细胞因子在CAR细胞中的表达(从而CAR细胞的增殖)可以通过诱导或抑制启动子活性来控制。
实施方案的方面涉及从患者获得样品，包括NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。例如，在一些情况下，样品是脐带血样品、外周血样品(例如单核细胞级分)或来自受试者的包含多能干细胞的样品。在一些方面，可以培养来自受试者的样品以产生诱导多能干(iPS)细胞，并且这些细胞用于产生NK细胞、NKT细胞或T细胞。细胞样品可以直接从受试者培养，或者可以在使用前冷冻保存。在一些方面，获得细胞样品包括收集细胞样品。在其它方面，样品由第三方获得。在另外的方面，可以处理来自受试者的样品以纯化或富集样品中的T细胞或T细胞祖细胞。例如，可以对样品进行梯度纯化、细胞培养选择和/或细胞分选(例如通过荧光激活细胞分选(FACS))。
在一些方面，实施方案的方法还包括使用抗原呈递细胞(例如，用于扩增工程化细胞)。例如，抗原呈递细胞可以是树突状细胞、活化和增殖细胞(AaPC)或灭活(例如照射的)人工抗原呈递细胞(aAPC)。用于产生此类抗原呈递细胞的方法是本领域已知的并且在本文中进一步详述。因此，在一些方面，将转基因CAR细胞与抗原呈递细胞(例如，灭活的aAPC)离体共培养一段有限的时间，以扩大CAR细胞群体。共培养CAR细胞的步骤可以在包含例如白细胞介素-21(IL-21)和/或白细胞介素-2(IL-2)的培养基中进行。在一些方面，共培养以约10:1至约1:10；约3:1至约1:5；或约1:1至约1:3的CAR细胞与抗原呈递细胞的比率进行。例如，CAR细胞和抗原呈递细胞的共培养物可以为约1:1、约1:2或约1:3的比率。
在一些方面，将用于培养CAR细胞例如AaPC或aAPC的细胞工程化为表达特定多肽以增强CAR细胞的生长。例如，细胞可以包含(i)由CAR靶向的抗原(即在转基因CAR细胞上表达)；(ii)CD64；(ii)CD86；(iii)CD137L；和/或(v)在aAPC表面上表达的膜结合的IL-15。在一些方面，AaPC或aAPCS包含在AaPC或aAPC表面上表达的CAR结合抗体或其片段。优选地，对本方法中使用的AaPC或aAPC测试感染性物质并确认为不含感染性物质，和/或进行测试并确认为灭活且非增殖的。
虽然在AaPC或aAPC上的扩增可以增加培养物中CAR细胞的数目或浓度，但是此方法是劳动密集型且昂贵的。此外，在一些方面，需要疗法的受试者应在尽可能短的时间内再输注转基因CAR细胞。因此，在某些方面，离体培养转基因CAR细胞不超过14天、不超过7天或不超过3天。例如，可以进行离体培养(例如，在AaPC或aAPC存在下培养)转基因CAR细胞的小于一次群体倍增。在另外的方面，不在AaPC或aAPC存在下离体培养转基因细胞。
在另外的方面，实施方案的方法包括在细胞转染后或细胞离体扩增后富集CAR表达性T细胞的细胞群体的步骤。例如，富集步骤可以包括例如通过使用由CAR结合的抗原或CAR结合抗体来分选细胞(例如通过FACS)。在另外的方面，富集步骤包括非T细胞的消耗或缺乏CAR表达的细胞的消耗。例如，可以从培养物中消耗CD56+细胞。在另外的方面，当将细胞施用于受试者时，将CAR细胞的样品保留(或维持在培养物中)。例如，可以将样品冷冻保存以用于随后的扩增或分析。
在某些方面，灭活转基因CAR细胞用于表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。例如，可以将T细胞工程化以消除内源性α/βT细胞受体(TCR)的表达。在具体实施方案中，将CAR+T细胞遗传修饰以消除TCR的表达。在一些方面，存在使用锌指核酸酶(ZFN)的CAR表达T细胞中的T细胞受体α/β的破坏。在某些方面，例如通过使用锌指核酸酶，将CAR表达性T细胞中的T细胞受体αβ-链敲除。
如本文进一步详细描述的，实施方案的CAR细胞可用于治疗广泛的疾病和病症。可以通过将CAR细胞靶向抗原来治疗涉及特定抗原的特异性表达的基本上任何疾病。例如，可以用本发明的方法和/或组合物治疗自身免疫疾病、感染和癌症。这些包括癌症，如原发性、转移性、复发性、对疗法敏感性、疗法难治性癌症(例如化疗难治性癌症)。癌症可能是血液、肺、脑、结肠、前列腺、乳腺、肝脏、肾脏、胃、宫颈、卵巢、睾丸、垂体腺、食管、脾脏、皮肤、骨骼等(例如B细胞淋巴瘤或黑素瘤)。在癌症治疗的情况下，CAR细胞通常靶向癌细胞抗原(也称为肿瘤相关抗原(TAA))。
在另外的方面，实施方案的转基因CAR细胞可用于治疗具有最小残留疾病的受试者(例如存在非常低量的CAR靶向抗原的受试者)，如明显缓解的癌症患者。使用新的高度敏感的诊断技术，可以在不显示明显的癌症症状的患者中检测到癌症相关抗原(或癌细胞)。可以通过使用抗原靶向CAR细胞通过本方法来治疗这些患者以消除残留疾病。在某些实施方案中，用于靶向残留疾病的转基因CAR细胞进一步包括膜结合增殖细胞因子的表达，因为尽管靶抗原量少，但这些细胞将保留在体内扩增的能力。
实施方案的方法可以用于制备(例如，用于临床试验)对各种肿瘤抗原(例如CD19、ROR1、CD56、EGFR、CD33、CD123、c-met、GD2)具有结合特异性的CAR+T细胞。使用该技术产生的CAR+T细胞可用于治疗患有白血病(例如AML、ALL、CML)、感染和/或实体瘤的患者。例如，实施方案的方法可用于治疗细胞增殖性疾病、真菌、病毒、细菌或寄生虫感染。可以靶向的病原体包括但不限于疟原虫、锥虫、曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、HSV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原体。可以由实施方案的CAR细胞靶向的抗原的其它实例包括但不限于CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸盐结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-l包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在某些方面，实施方案的方法涉及靶向CD19或HERV-K表达细胞。例如，HERV-K靶向性CAR细胞可以包括包含单克隆抗体6H5的scFv序列的CAR。在另外的方面，实施方案的CAR可以与细胞因子例如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其组合缀合或融合。
在一些实施方案中，提供了用于治疗具有医学病况的个体的方法，包括提供有效量的来自本文所述的细胞群体的细胞的步骤，包括在一些方面超过一次，如相隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。在具体方面，癌症是膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、齿龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。在某些方面，癌症是淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病或B细胞相关的自身免疫性疾病。
如本说明书和权利要求书中所使用的，“一个”或“一种”可以是一个/种或多个/种。如本说明书和权利要求书中所使用的，当与单词“包括”一起使用时，单词“一个”或“一种”可以表示一个/种或多于一个/种。如本文所用，在说明书和权利要求书中，“另一”或“另外”可以表示至少第二或更多。
如本说明书和权利要求书中所用，术语“约”用于表示值包括装置的误差、用于确定值的方法的固有变化，或存在于研究对象之间的变化。
从下面的详细描述中，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管说明本发明的某些实施方案的详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修从该详细描述中对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或多个可以更好地理解本发明。
图1：用于基于转座酶的细胞工程化的示例性策略。在该实施方案中，制备了表达CAR的工程化T细胞。用编码侧翼有转座子重复的CAR的转座子DNA构建体以及编码转座酶的mRNA共转染T细胞。在这种情况下，使用4D-NUCLEOFECTORTM电穿孔系统(Lonza Group Ltd.，Switzerland)进行转染。一旦引入细胞，瞬时表达转座酶并介导CAR构建体整合到基因组DNA中。在细胞内降解编码转座酶的mRNA，这确保转座酶在细胞中没有长期表达。
图2：直方图显示如图1概述的用CAR转染的人T细胞的流式细胞术数据。相对于SB100x，在实施方案的两种重组转座酶(hSB110和hSB81)之间比较结果。上图显示了CAR阳性细胞数(y轴)相对于已经为非存活的细胞数，如在转染后8天，通过7AAD(7-氨基放线菌素D)染色(x轴)评估。下图显示转染后15天的CAR表达阳性细胞数(y轴)和表达CD3的细胞数(x轴)。研究结果显示，实施方案的重组转座酶在工程化细胞方面比SB100x显著更有效。到转染后第8天，与源自使用SB100x的仅15％细胞相比，超过22％的用hSB110和hSB81编码mRNA电穿孔的细胞表达CAR。同样地，到第15天，与源自使用SB100x的仅73.4％细胞相比，用hSB110和hSB81电穿孔的超过80％的细胞群体共表达CAR和CD3。
具体实施方式
I.细胞的遗传工程
细胞的遗传工程已经成为在一大批细胞中提供期望基因的稳定表达的有力技术。最近，这种技术甚至已经应用于在一系列疾病状况下用于治疗性干预的细胞。例如，表达受体靶向疾病相关抗原的受体的遗传工程化T细胞目前作为抗癌疗法进行临床试验。转座酶系统是用于工程化的理想系统，特别是在用作治疗剂的细胞的情况下，因为它们不引入维持在细胞中的异源遗传元件，这是基于病毒的工程系统的共同特征。然而，需要高效率来提供治疗干预所需的足够数量的工程化T细胞。
本文的研究表明新的重组转座酶，称为hSB110和hSB81，其在人细胞工程化中表现出显著改进的效率。例如，当用于将CAR表达性构建体整合到原代人T细胞中时，新的转座酶能够产生细胞群，其中超过20％的细胞在转染后第8天表现出CAR表达(图2)。此外，到第15天，转染群体中超过80％的细胞对CAR表达性呈阳性(图2)。人细胞的这种高效率遗传工程代表了相对于先前的基于转座酶的工程系统的显著改进。
实施方案的转座酶编码序列可用于哺乳动物细胞的高效率遗传工程。例如，转座酶可用于快速产生CAR表达性T细胞群体。在一个实施方案中，编码转座酶的mRNA与编码期望的CAR表达盒的DNA载体一起共转染到T细胞(或T细胞前体)中，所述期望的CAR表达盒侧翼有转座子重复。然后，可以纯化和/或选择性扩增CAR表达性T细胞。在用于疗法的T细胞的情况下，期望需要尽可能少的扩增以减少细胞制备的时间和成本。重要的是，本文提供的转座酶通过增加表现出CAR稳定表达且因此可用于进一步扩增的细胞的比例来显著地改善这种工程程序。
II.转座酶多肽和编码序列
如前述概述所述，实施方案的某些方面涉及重组转座酶多肽和编码所述多肽的核酸。在某些方面，根据实施方案使用的转座酶是包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:3至少80％、至少85％、至少90％、至少91％，至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列或由所述序列组成的多肽。在某些方面，相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:3的序列，转座酶实施方案可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或插入。例如，可以通过一个或多个氨基酸取代进一步修饰实施方案的转座酶多肽，同时保持其酶活性。在一些情况下，氨基酸位置可以取代为不同转座酶序列的相应位置处的氨基酸。例如，在美国专利No.6,489,458；7,148,203；8,227,432；美国专利公开No.2011/0117072；Mates等人,2009和于Ivics等人,1997中提供另外的转座酶的序列，其全部内容各自通过引用并入本文。
在一些方面，可以在一个或多个位置处进行氨基酸取代，其中取代为具有相似亲水性的氨基酸。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。因此，这种保守取代可以在转座酶中进行，并且可能仅对其活性具有较小的影响。如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值已分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可以用作指导，因此，亲水性值在±2以内的氨基酸、在±1以内的氨基酸、以及在±0.5以内的氨基酸的取代包括考虑的实施方案。因此，本文所述的任何转座酶多肽可以通过将氨基酸取代为具有相似亲水性值的不同但同源的氨基酸来修饰。亲水性在+/-1.0或+/-0.5分内的氨基酸认为是同源的。
在另外的方面，将实施方案的转座酶多肽与异源多肽序列，如纯化标签(例如T7、多聚His或GST标签)、报告物或CPP融合。例如，可以将多肽与报告物，如成像剂融合(或缀合)。应当理解，在某些情况下，融合蛋白可以包含位于转座酶和异源多肽之间的另外的氨基酸。通常，这些序列可互换地称为“接头序列”或“接头区域”。本领域技术人员将认识到接头区域可以是一个或多个氨基酸的长度并且通常包含一个或多个对接头赋予柔性的甘氨酸残基。此类接头序列可以重复1、2、3、4、5、6次或更多次或与一个或多个不同的接头组合以形成接头序列的阵列。例如，在一些应用中，接头区域可以包含蛋白酶切割位点(例如，用于除去纯化标签或CPP)。
如本文所用，术语CPP和膜移位肽(MTP)可互换使用，是指增加多肽被细胞内化的能力的肽序列。根据实施方案使用的CPP的实例包括但不限于源自HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足(Antennapedia)同源盒基因产物、protegrin I、T1CPP、T2CPP或INF7CPP的肽片段(参见，例如美国专利公开号20140140976，其通过引用并入本文)。
III.细胞工程化
实施方案的各个方面涉及使用实施方案的转座酶的哺乳动物细胞的遗传工程化。通常，此类方法将涉及向细胞引入(i)编码转座酶(或转座酶多肽)的第一载体和(ii)编码侧翼有转座子重复的期望遗传元件的第二载体。任何类型的哺乳动物细胞可以通过这种方法进行遗传工程化。然而，在某些方面，细胞(细胞群体)是干细胞、iPS细胞、免疫细胞或这些细胞的前体。下面描述的方法涉及用于CAR表达的T细胞(或其它免疫细胞)工程化的具体实例。然而，熟练技术人员将认识到，方法可以同样地应用于任何给定的细胞类型或工程化构建体。
因此，在某些实施方案中，提供了用于制备和/或扩增抗原特异性重定向T细胞的方法，其包括用含有编码CAR的DNA构建体的表达载体转染T细胞。任选地，用抗原阳性细胞、重组抗原或针对受体的抗体刺激此类细胞以引起细胞增殖。
另一方面，提供稳定转染和重定向T细胞的方法。根据实施方案的这种转染可以是本领域熟知的任何各种转染技术。在一些方面，可以使用病毒载体或病毒颗粒将核酸引入细胞。事实上，大多数研究者已经使用病毒载体携带异源基因进入T细胞。然而，在一些方面，实施方案的转染不涉及使用病毒载体。例如，转染可以是通过电穿孔、使用带电荷或不带电荷的脂质、阳离子聚合物或多肽、盐沉淀或其它非病毒核酸转移(例如但不限于声孔作用)进行。在某些方面，转染使用裸DNA(或在转座酶的情况下使用RNA或蛋白质)。通过使用裸DNA，可以减少产生重定向T细胞所需的时间。“裸DNA”是指编码CAR的DNA以适合于表达的取向被包含在表达盒或载体中。实施方案的电穿孔方法产生表达并且在其表面上携带CAR的稳定转染子。
在一些方面，实施方案的CAR可以进一步定义为“嵌合TCR”是指由T细胞表达并且包含细胞内信号传导、跨膜和细胞外结构域的受体，其中细胞外结构域能够以MHC非约束性方式特异性结合通常不以该方式被T细胞受体结合的抗原。在适当条件下由抗原刺激T细胞导致细胞的增殖(扩增)和/或IL-2的产生。该方法适用于对任何给定靶抗原有特异性的嵌合TCR的转染，如对HER2/Neu(Stancovski等人,1993)、ERBB2(Moritz等人,1994)、叶酸盐结合蛋白质(Hwu等人,1995)、肾细胞癌(Weitjens等人,1996)和HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41(Roberts等人,1994)有特异性的嵌合TCR。其它细胞表面靶抗原包括但不限于CD20、癌胚抗原、间皮素、ROR1、c-Met、CD56、GD2、GD3、甲胎蛋白、CD23、CD30、CD123、IL-11Rα、κ链、λ链、CD70、CA-125、MUC-1、EGFR和变体、上皮肿瘤抗原等。
在某些方面，根据实施方案使用的T细胞是原代人T细胞，如源自人外周血单核细胞(PBMC)、用G-CSF刺激后收集的PBMC、骨髓或脐带血的T细胞。条件包括使用mRNA和DNA和电穿孔。转染后，可以将细胞立即输注或可以储存。在某些方面，在转染后，可以将细胞在基因转移到细胞后约1、2、3、4、5天或更长的时间内作为大量群体离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，在转染后，克隆转染子，并且离体扩增显示单一的整合或附加体维持的表达盒或质粒的存在和嵌合受体的表达的克隆。选择用于扩增的克隆表明特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过用IL-2或其它细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩增重组T细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增重组T细胞。可以在人工抗原呈递细胞上或用与T细胞表面上的CD3交联的抗体(如OKT3)扩增重组T细胞。可以在人工抗原呈递细胞上或用结合T细胞表面上的CD52的抗体(例如阿仑单抗(alemtuzumab))删除重组T细胞的亚群。另一方面，可以冷冻保存遗传修饰的细胞。
可以通过以下方式评估输注后的T细胞增殖(存活)：(i)使用对转座子和/或CAR有特异性的引物的q-PCR和/或数字PCR(例如，Droplet DigitalTM PCR(Bio-Rad，Hercules，California))；(ii)使用对CAR有特异性的抗体的流式细胞术；和/或(iii)使用可溶性TAA的流式细胞术。
在本发明的某些实施方案中，将CAR细胞递送至有此需要的个体，如具有癌症或感染的个体。然后，细胞增强个体的免疫系统以攻击相应的癌症或病原性细胞。在一些情况下，给个体提供一个或多个剂量的抗原特异性CAR T细胞。在给个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性CAR T细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中增殖的时间，并且在具体实施方案中，剂量之间的持续时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。
经修饰而包含嵌合抗原受体(和在一些情况下，缺乏功能性TCR)的同种异体或自体T细胞的来源可以是任何种类，但是在具体实施方案中，例如，细胞获自脐带血液、外周血、人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的储库。用于治疗效果的合适剂量将为每剂量至少105个或介于约105个至约1010个之间的细胞，例如优选在一系列给药循环中。示例性给药方案由以下组成：递增剂量的四个一周给药循环，在第0天以至少约105个细胞起始，例如在开始患者内剂量递增方案的几周内逐渐增加至约1010个细胞的靶剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储存器进入装置)、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。
本发明的药物组合物可以单独使用或与可用于治疗癌症的其它得到确认的药剂组合使用。无论单独递送或与其它药剂组合递送，本发明的药物组合物可以通过各种途径递送至哺乳动物，特别是人体内的各种部位以达到特定的效果。本领域技术人员将认识到，尽管可以使用超过一种途径用于施用，但是特定路径可以提供比另一种途径更直接且更有效的反应。例如，皮内递送可以相对于吸入更有利地用于治疗黑素瘤。可以通过施用，包括将制剂施加或滴注入体腔中、气雾剂的吸入或吹入，或通过肠胃外引入，包括肌肉内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或皮内施用实现局部或系统性递送。
实施方案的组合物可以以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)含有单独或与其它活性剂适当组合的预定量的组合物。如本文所用，术语单位剂型是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有单独或与其它活性剂组合的预定量的本发明组合物，其以足以在合适的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合产生期望效果的量计算。本发明的单位剂量形式的规格取决于特定受试者中与药物组合物相关的特定药效学。
理想地，有效量或足够数目的分离的经转导的T细胞存在于组合物中并引入受试者中，使得建立长期、特异性的抗肿瘤应答以比在缺乏此类治疗时否则会导致的情况减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生长。理想地，当与肿瘤的原始或初始(例如，“治疗第0天”)大小相比时，重新引入到受试者中的经转导的T细胞的量导致约或至少约10％、约或至少约20％、约或至少约30％、约或至少约40％、约或至少约50％、约或至少约60％、约或至少约70％、约或至少约80％、约或至少约90％、约或至少约95％、约或至少约98％、或约100％或100％的肿瘤大小减小。
因此，经转导的T细胞的施用量应该考虑施用途径，并且应该使得可以引入足够数目的经转导的T细胞以达到期望的治疗应答。此外，包含在本文所述组合物中的每种活性剂的量(例如，每个待接触的细胞的量或每某个体重的量)可以在不同的应用中变化。通常，转导的T细胞的浓度理想地应当足以在所治疗的受试者中提供至少约1×106至1×109个经转导的T细胞，甚至更期望地约1×107至约5×108个经转导的T细胞，尽管可以使用高于(例如大于)5×108个细胞或低于(例如小于)1×107个细胞的任何合适的量也是如此。给药日程表可以基于得到确认的基于细胞的疗法(参见例如Topalian和Rosenberg，1987；美国专利号4,690,915)或者可以采用替代的连续输注策略。
这些值提供了在优化用于实施本发明的本发明的方法时由从业者使用的对转导的T细胞的范围的一般指导。在本文中叙述这种范围绝不排除使用较高或较低量的组分，这在特定应用中可能是有保证的。例如，实际剂量和日程表可以根据组合物是否与其它药物组合物组合施用，或者根据药代动力学、药物处置和代谢方面的个体间差异而变化。本领域技术人员可以容易地根据特定情形的紧急情况进行任何必要的调整。
IV.工程构建体
在某些具体方面，使用实施方案的转座酶系统来用以选择的遗传元件结尾的表达构建体工程化细胞。在此类方面，选择的遗传元件侧翼有转座子重复，其与实施方案的转座酶如IR/DR序列一起起作用。选择的遗传元件可以包含期望转染到细胞中的任何序列，但是在某些方面，元件编码多肽编码序列和用于哺乳动物表达的合适的表达控制序列。在一些具体方面，选择的遗传元件编码抗原结合部分，如抗体、T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。如本文所用，术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体或CAR结合的分子。
因此，本发明的实施方案涉及核酸，包括编码抗原特异性CAR多肽，包括已被人源化以减少免疫原性的CAR(hCAR)的核酸，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可以识别由一个或多个抗原之间的共享空间组成的表位。模式识别受体(如Dectin-1)可用于衍生对碳水化合物抗原的特异性。在某些实施方案中，结合区可以包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性源自与受体结合的肽(例如，细胞因子)。互补决定区(CDR)是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变结构域中发现的短氨基酸序列，其与抗原互补，因此给受体提供其针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每个多肽链含有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于抗原受体通常由两条多肽链组成，存在有针对每种抗原受体的六个CDR，其可以与抗原接触--每个重链和轻链含有三个CDR。因为在CDR中发现与免疫球蛋白和T细胞受体相关的大多数序列变异，所以这些区域有时被称为高变区。在这些中，CDR3显示出最大的变异性，因为它通过VJ(在重链和TCRαβ链的情况下VDJ)区的重组来编码。
考虑的是，人CAR核酸是用于增强人患者的细胞免疫疗法的人基因。在具体实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区域或结构域可以包含源自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，如美国专利7,109,304中所述的那些，其通过引用并入本文，或者它可以包括任何其它抗原结合部分。该片段还可以是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，片段是由针对人细胞中表达的人密码子选择而优化的序列编码的抗原特异性scFv。
排列可以是多聚体的，如双抗体或多聚体。多聚体最有可能由轻链和重链的可变部分的交叉配对形成为Winters所称的双抗体。构建体的铰链部分可以具有多个备选，从被完全删除，至使第一半胱氨酸得到保持，至脯氨酸而不是丝氨酸取代，至被截短直至第一半胱氨酸。可以删除Fc部分。任何稳定和/或二聚化的蛋白质都可以用于此目的。可以仅使用Fc结构域之一，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用已被修饰以改善二聚化的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区。也可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。也可以使用CD8α的部分。
实施方案的嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域负责激活其中已经放置嵌合受体的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指分化细胞的专门功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。初始、记忆或记忆型T细胞中的效应物功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应物功能信号并引导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常将使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个细胞内多肽。在细胞内信号传导结构域的截短部分可以得到应用的程度上，只要它仍然转导效应物功能信号，就可以使用此类截短部分代替完整链。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。实例包括T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI和信号传导分子的组合，如CD3ζ以及CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及其组合，以及其它类似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其它成员的细胞内信号传导部分，如FcγRIII和FcεRI。关于使用这些备选跨膜和细胞内结构域的嵌合T细胞受体的公开，参见Gross等人(1992),Stancovski等人(1993),Moritz等人(1994),Hwu等人(1995),Weijtens等人(1996)，以及Hekele等人(1996)。在某些实施方案中，将人CD3ζ细胞内结构域用于活化。
抗原特异性细胞外结构域和细胞内信号传导结构域可以通过跨膜结构域，如人IgG4Fc铰链和Fc区连接。备选包括人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域或来自其它人跨膜信号传导蛋白，如CD16和CD8和促红细胞生成素受体的其它跨膜结构域。可以对跨膜氨基酸序列添加另外的修饰。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其它共刺激受体，如跨膜结构域和经修饰的CD28细胞内信号传导结构域的序列。其它共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ启动的主要信号之外，插入人类CAR中的人共刺激受体提供的另外的信号对于T细胞的完全活化是重要的，并且可以帮助改善过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功。
在具体实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和掺入编码CAR的DNA序列的表达盒。本发明的载体主要设计为将期望的基因递送至免疫细胞，优选T细胞，在受调节的真核启动子(例如MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或泛素启动子)的控制下。此外，如果没有其它原因，载体可以含有选择标志物，以便于其在体外的操作。在其它实施方案中，CAR可以在体外从DNA模板转录的mRNA表达。
嵌合抗原受体分子是重组的，并且以它们通过其细胞质尾部中存在的免疫受体激活基序(ITAM)结合抗原和转导激活信号的能力而区分。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scFv)产生)的受体构建体提供“通用”的另外的优点，在于它们以HLA独立的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，几个实验室已经报告了与编码CD3复合物的ζ链(ζ)、Fc受体γ链和sky酪氨酸激酶的细胞内部分的序列融合的scFv构建体(Eshhar等人,1993；Fitzer-Attas等人,1998)。已经在几种鼠和人抗原scFv:ζ系统中记录了重新定向的T细胞效应物机制，包括CTL的肿瘤识别和裂解(Eshhar,1997；Altenschmidt等人,1997；Brocker等人,1998)。
迄今为止，非人抗原结合区域通常用于构建嵌合抗原受体。使用非人抗原结合区域(如鼠单克隆抗体)的潜在问题是缺乏人效应物功能并且不能渗透肿瘤块。换句话说，此类抗体可能不能通过抗体依赖性细胞性细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性裂解或裂解人靶细胞以破坏CAR表达性细胞。此外，非人单克隆抗体可被人宿主识别为外源蛋白，因此重复注射此类外源抗体可导致诱导免疫应答，这导致有害的超敏感性反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这通常被称为人抗小鼠抗体(HAMA)应答。因此，使用人抗体是更优选的，因为它们不像鼠抗体那样引起强HAMA应答。类似地，在CAR中使用人序列可以避免免疫介导的识别以及因此由内源性T细胞的消除，所述内源性T细胞驻留于接受体中并且在HLA的背景中识别加工的抗原。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括：a)细胞内信号传导结构域、b)跨膜结构域和c)包含抗原结合区的细胞外结构域。
在具体实施方案中，CAR中的细胞内受体信号传导结构域包括T细胞抗原受体复合物的那些，如CD3的ζ链，还有FcγRIII共刺激信号传导结构域、CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2，单独或例如与CD3ζ串联。在具体实施方案中，细胞内结构域(其可以称为细胞质结构域)包含TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40中的一种或多种的部分或全部。在一些实施方案中，使用在细胞内结构域中内源T细胞受体复合物的任何部分。可以使用一个或多个细胞质结构域，因为所谓的第三代CAR具有融合在一起的至少两个或三个信号传导结构域，例如用于叠加或协同效应。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可以称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域，包括由模式识别受体识别的碳水化合物抗原，如Dectin-1。肿瘤相关抗原可以是任何种类的，只要其在肿瘤细胞的细胞表面上表达即可。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras等等。在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，CAR可以与膜结合细胞因子共表达以改善持续性。例如，CAR可以与膜结合IL-15共表达。
在某些实施方案中，细胞内肿瘤相关抗原可以是靶向的，如HA-1、存活蛋白、WT1和p53。这可以通过在通用T细胞上表达的CAR来实现，所述通用T细胞识别在HLA的背景中从细胞内肿瘤相关抗原描述的加工肽。此外，通用T细胞可以经遗传修饰以表达在HLA的背景中识别细胞内加工的肿瘤相关抗原的T细胞受体配对。
病原体可以是任何种类的，但是在具体实施方案中，病原体是例如真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括腺病毒科、埃巴病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒(Polyomavirus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。示例性致病性病毒导致天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性致病性真菌包括念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。示例性致病性细菌包括链球菌(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)，大肠杆菌(E.coli)、立克次体属(Rickettsia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋菌(Spirochetes)和沙门氏菌属(Salmonella)。在一个实施方案中，病原体受体Dectin-1可用于产生识别真菌细胞壁上的碳水化合物结构的CAR。经遗传修饰以表达基于Dectin-1的特异性的CAR的T细胞可以识别曲霉属和靶菌丝生长。在另一个实施方案中，CAR可以基于识别病毒决定簇(例如，来自CMV和埃博拉病毒的糖蛋白)以中断病毒感染和病理学的抗体来制备。
在一些实施方案中，致病性抗原是曲霉碳水化合物抗原，对于所述曲霉碳水化合物抗原，CAR中的细胞外结构域识别真菌细胞壁的碳水化合物的模式，如通过Dectin-1。
根据本发明的嵌合免疫受体可以通过本领域已知的任何手段制备，尽管优选使用重组DNA技术产生它。可以通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv文库，定点诱变等)来制备编码嵌合受体的几个区域的核酸序列并将其组装成完整的编码序列。可以将所得到的编码区插入表达载体中并用于转化合适的表达宿主同种异体T细胞系。
如本文所用，核酸构建体或核酸序列或多核苷酸旨在指可以转化或引入T细胞中并且被转录和翻译以产生产物(例如，嵌合抗原受体)的DNA分子。
在本实施方案中使用的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，启动子与编码嵌合受体的核酸序列可操作地连接，即它们定位为使得促进从编码嵌合受体的DNA转录信使RNA。启动子可以是基因组来源的或合成产生的。用于T细胞的多种启动子是本领域公知的(例如，Marodon等人(2003)公开的CD4启动子)。启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定细胞类型或特定成熟水平相关联。或者，许多公知的病毒启动子也是合适的。感兴趣的启动子包括β-肌动蛋白启动子、SV40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子，逆转录病毒启动子和Friend脾脏病灶形成病毒启动子。启动子可以或可以不与增强子相关，其中增强子可以与特定启动子天然相关或与不同的启动子相关。
编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以从基因组DNA源、cDNA源获得，或可以是合成的(例如通过PCR)或其组合。根据基因组DNA的大小和内含子的数目，可以需要使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定mRNA或提供T细胞特异性表达(Barthel和Goldfeld，2003)。此外，使用内源或外源非编码区稳定mRNA可以是更有利的。
为了表达本发明的嵌合抗原受体，编码嵌合受体的N端组分的核酸序列的天然存在或内源转录起始区可用于在靶宿主中产生嵌合受体。或者，可以使用允许组成型或诱导型表达的外源转录起始区，其中可以根据目标宿主、期望的表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。
同样地，指导嵌合受体至表面膜的信号序列可以是嵌合受体的N端组分的内源信号序列。任选地，在一些情况下，可以期望将该序列交换为不同的信号序列。然而，所选择的信号序列应与T细胞的分泌途径相容，使得嵌合受体呈现在T细胞的表面上。
类似地，终止区可以由编码嵌合受体的C端组分的核酸序列的天然存在或内源转录终止区提供。或者，终止区可以源自不同的来源。在大多数情况下，终止区域的来源通常认为对重组蛋白质的表达不是关键的，并且可以使用多种终止区域而不会不利地影响表达。
本发明的嵌合构建体可以在具有或怀疑患有癌症的受试者中通过减少肿瘤的大小或预防这些受试者中的肿瘤的生长或再生长得到应用。因此，本发明还涉及在受试者中减少生长或预防肿瘤形成的方法，通过将本发明的嵌合构建体引入受试者的分离的T细胞中并将经转化的T细胞重新引入受试者中，从而实现抗肿瘤应答，以减少或消除受试者中的肿瘤。可以使用的合适的T细胞包括细胞毒性淋巴细胞(CTL)或具有需要中断的T细胞受体的任何细胞。如本领域技术人员所熟知的，各种方法容易地用于从受试者中分离这些细胞。例如，使用细胞表面标志物表达或使用市售试剂盒(例如，来自Pierce,Rockford,Ill.的ISOCELLTM)。
考虑的是，可以将嵌合构建体作为裸DNA、与其它试剂(包括但不限于脂质、阳离子聚合物、PEG-复合物，蛋白质复合物)组合或在合适的载体中引入受试者自身的T细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染T细胞的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号6,410,319，通过引用并入本文。裸DNA通常是指以对于表达正确的取向被包含在质粒表达载体中的编码本发明的嵌合受体的DNA。有利地，使用裸DNA减少产生表达本发明的嵌合受体的T细胞所需要的时间。
一旦建立了转染或转导的T细胞能够以期望的调节和期望的水平表达作为表面膜蛋白的嵌合受体，则可以确定嵌合受体在宿主细胞中是否为功能性的，以提供期望的信号感应。随后，将经转导的T细胞重新引入或施用于受试者以激活受试者中的抗肿瘤应答。为了便于施用，可以用适当的载体或稀释剂(其还可以是药学上可接受的)将根据本发明的转导的T细胞制成药物组合物或制成适于在体内施用的植入物。制备此类组合物或植入物的方法已经在本领域中描述(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack编(1980))。在适当的情况下，转导的T细胞可以以对于其各自的施用路径通常的方式配制成半固体或液体形式的制剂，如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气溶胶。本领域已知的手段可用于防止或最小化组合物的释放和吸收，直到其到达靶组织或器官，或确保组合物的定时释放。然而，期望地，使用不会使表达嵌合受体的细胞失效的药学上可接受的形式。因此，理想地，转导的T细胞可以制成含有平衡盐溶液，优选汉克氏平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。
V.实施方案的试剂盒
本文所述的任何组合物可以包含在试剂盒中。在一些方面，试剂盒中提供了实施方案的转座酶多肽或编码转座酶多肽的核酸。此类试剂盒可以包括多种附加元件，如编码转座子重复的DNA载体、转染试剂、细胞、CAR表达构建体、培养基、aAPC、生长因子、抗体(例如用于分选或表征CAR T细胞)和/或编码CAR或转座酶的质粒。
在非限制性实例中，试剂盒包含实施方案的转座酶多肽或编码转座酶多肽的核酸，产生CAR表达性构建体(具有侧翼转座子重复)的一种或多种试剂，用于转染表达构建体的细胞和/或一种或多种用于获得用于转染表达构建体的细胞的仪器(此类仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何此类医学上批准的装置)。在另外的方面，包括诸如电穿孔装置的转染装置。
在一些实施方案中，试剂盒中提供了用于消除内源性TCRα/β表达的表达构建体、产生构建体的一种或多种试剂和/或CAR+T细胞。在一些实施方案中，这包括编码锌指核酸酶的表达构建体。
试剂盒可以包含一种或多种适当等分取样的本发明的组合物或用于产生本发明组合物的试剂。试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置可以包括可以放置并且优选适当等分取样的组合物的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置。在试剂盒中有多个组分的情况中，则试剂盒通常还将包含可以分开放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。然而，组分的各种组合可以包括在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于包含嵌合受体构建体的装置和用于商业销售的密闭约束中的任何其它试剂容器。例如，此类容器可以包括保留期望的小瓶的注射或吹塑塑料容器。
VI.实施例
包括以下实施例来证明本发明的某些实施方案。本领域技术人员应当理解，下面的实施例中公开的技术表示发明人发现在本发明的实践中运作良好的技术，因此可认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果。
实施例1：在人细胞中具有高活性的重组转座酶
将最初源自盐湖鲑鱼(Salmo salar)(大西洋鲑鱼)的编码转座酶的DNA序列进行工程化和人源化以产生在人细胞中具有改善的效率的酶。两种所产生的转座酶(及其核酸编码序列)的序列如下所示，并命名为hSB110和hSB81。
hSB110(SEQ ID NO:1):
hSB110(SEQ ID NO:2):
hSB81(SEQ ID NO:3):
hSB81(SEQ ID NO:4):
然后，对hSB110和hSB81转座酶以及对照转座酶测试其产生具有遗传整合CAR的工程化人T细胞的能力。图1中显示了这些研究的方案。用编码侧翼有转座子重组的CAR的转座子DNA构建体以及编码转座酶多肽的mRNA共转染人T细胞。对于转染，使用4D-NUCLEOFECTORTM电穿孔系统(Lonza)。电穿孔后，培养细胞并通过流式细胞术评估CAR表达。
图2中显示了这些研究的结果。上图的直方图显示CAR阳性细胞数(y轴)相对于已经为非存活的细胞数，如转染后8天通过7AAD染色(x轴)评估。下图显示转染后15天的CAR阳性细胞数(y轴)和表达CD3的细胞数(x轴)。这些结果清楚地表明hSB110和hSB81转座酶在工程化细胞方面比SB100x显著更有效。到转染后第8天，超过22％的hSB110和hSB81电穿孔细胞表达CAR。在此时间点，来自SB100x电穿孔的仅15％细胞表达CAR。用任何测试构建体在非存活细胞数方面没有观察到显著差异(如通过7AAD染色评估)。此外，到第15天，用hSB110和hSB81电穿孔的超过80％的细胞群体共表达CAR和CD3。
***
根据本公开，可以在没有过度实验的情况下制造和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据某些实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文所述方法和步骤或所述方法的步骤顺序应用变化。更具体地，显而易见的是，在获得相同或相似的结果的情况下，可以用化学和生理相关的某些试剂替换本文所述的试剂。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val
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Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Arg Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys His Val Arg Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 2
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
atgggcaaga gcaaagagat cagccaggac ctgcggaagc ggatcgtgga cctgcacaag 60
agcggctcta gcctgggcgc catcagcaag agactggccg tgcctagaag cagcgtgcag 120
accatcgtgc ggaagtacaa gcaccacggc accacccagc ccagctacag atctggaagg 180
cggagagtgc tgagccccag ggacgagaga acactcgtgc gcaaggtgca gatcaacccc 240
cggaccaccg ccaaggacct cgtgaagatg ctggaagaga caggcaccaa ggtgtccatc 300
agcaccgtga agcgggtgct gtaccggcac aacctgaagg gccacagcgc cagaaagaag 360
cccctgctgc agaacagaca caagaaggcc cggctgagat tcgccagagc ccacggcgac 420
aaggacagaa ccttctggcg gaacgtgctg tggagcgacg agacaaagat cgagctgttc 480
ggccacaacg accacagata cgtgtggcgg aagaagggcg aggcctgcaa gcccaagaac 540
accatcccca cagtgaagca cggcggaggc agcatcatgc tgtggggctg ttttgccgct 600
ggcggcacag gcgccctgca caaaatcgac ggcatcatgg acgccgtgca gtacgtggac 660
atcctgaagc agcacctgaa aacctctgtg cggaagctga agctgggccg gaaatgggtg 720
ttccagcacg acaacgaccc caagcacacc agcaagcacg tgcggaaatg gctgaaggac 780
aacaaagtga aagtgctgga atggcccagc cagtcccccg acctgaaccc catcgaaaac 840
ctgtgggccg agctgaagaa aagagtgcgg gccagacggc ccaccaacct gacacagctg 900
caccagctgt gccaggaaga gtgggccaag atccacccca actactgcgg caagctggtg 960
gaaggctacc ccaagaggct gacccaagtg aaacagttca agggcaacgc caccaagtac 1020
tga 1023
<210> 3
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
85 90 95
Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys
115 120 125
Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Arg Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr
130 135 140
Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe
145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys His Val Arg Lys
245 250 255
Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340
<210> 4
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
atgggcaaga gcaaagagat cagccaggac ctgcggaagc ggatcgtgga cctgcacaag 60
agcggctcta gcctgggcgc catcagcaag agactggccg tgcctagaag cagcgtgcag 120
accatcgtgc ggaagtacaa gcaccacggc accacccagc ccagctacag atctggaagg 180
cggagagtgc tgagccccag ggacgagaga acactcgtgc gcaaggtgca gatcaacccc 240
cggaccaccg ccaaggacct cgtgaagatg ctggaagaga caggcaccaa ggtgtccatc 300
agcaccgtga agcgggtgct gtaccggcac aacctgaagg gccacagcgc cagaaagaag 360
cccctgctgc agaacagaca caagaaggcc cggctgagat tcgccagagc ccacggcgac 420
aaggacagaa ccttctggcg gaacgtgctg tggagcgacg agacaaagat cgagctgttc 480
ggccacaacg accacagata cgtgtggcgg aagaagggcg aggcctgcaa gcccaagaac 540
accatcccca cagtgaagca cggcggaggc agcatcatgc tgtggggctg ttttgccgct 600
ggcggcacag gcgccctgca caaaatcgac ggcatcatgg acgccgtgca gtacgtggac 660
atcctgaagc agcacctgaa aacctctgtg cggaagctga agctgggccg gaaatgggtg 720
ttccagcacg acaacgaccc caagcacacc agcaagcacg tgcggaaatg gctgaaggac 780
aacaaagtga aagtgctgga atggcccagc cagtcccccg acctgaaccc catcgaaaac 840
ctgtgggccg agctgaagaa aagagtgcgg gccagacggc ccaccaacct gacacagctg 900
caccagctgt gccaggaaga gtgggccaag atccacccca cctactgcgg caagctggtg 960
gaaggctacc ccaagaggct gacccaagtg aaacagttca agggcaacgc caccaagtac 1020
tga 1023
<210> 5
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
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Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
180 185 190
Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val
225 230 235 240
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245 250 255
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340
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
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1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
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Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
165 170 175
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Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
195 200 205
Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln
210 215 220
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340
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
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195 200 205
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275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
290 295 300
Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn
325 330 335
Ala Thr Lys Tyr
340

Claims (43)

1.一种重组多肽，所述重组多肽包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的序列，其中所述多肽包含与136位对应的位置处的Arg；与253位对应的位置处的His和/或与255位对应的位置处的Arg，所述多肽不包含SEQ ID NO:5的序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽包含下列特征中的一种或多种：
(a)与14位对应的位置处的Arg；
(b)与33位对应的位置处的Ala；
(c)与115位对应的位置处的His；
(d)与214位对应的位置处的Asp；
(e)与215位对应的位置处的Ala；
(f)与216位对应的位置处的Val；
(g)与217位对应的位置处的Gln；和/或
(h)与243位对应的位置处的His。
3.根据权利要求2所述的多肽，所述多肽包含所述特征(a)-(h)中的1、2、3、4、5、6、7或8种。
4.根据权利要求2所述的多肽，所述多肽包含与214-217位对应的位置处的序列DAVQ。
5.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽包含与314位对应的位置处的Asn。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1的序列是至少95％相同的。
7.根据权利要求5所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1的序列。
8.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽包含与314位对应的位置处的Thr。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:3的序列是至少90％或至少95％相同的。
10.根据权利要求9所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:3的序列。
11.一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码根据权利要求1-10中任一项所述的多肽的序列。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸分子，其中所述分子是DNA。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸分子，其中所述DNA包含用于表达所述多肽的启动子。
14.根据权利要求12所述的多核苷酸分子，其中所述DNA包含用于在哺乳动物细胞中表达所述多肽的启动子。
15.根据权利要求11所述的多核苷酸分子，其中所述分子是mRNA。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含5’-帽、IRES基序和/或多聚(A)序列。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含20至300个核苷酸的多聚(A)序列。
18.根据权利要求11所述的多核苷酸分子，其中所述分子包含与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4至少90％或至少95％相同的序列。
19.根据权利要求11所述的多核苷酸分子，其中所述分子包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的序列。
20.一种制备根据权利要求1所述的多肽的方法，所述方法包括用编码所述多肽的多核苷酸转染细胞，并且从所述多核苷酸表达所述多肽。
21.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求11所述的多核苷酸分子。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
23.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞是干细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。
24.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞是免疫系统细胞。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞、T细胞或者NK细胞或T细胞的前体。
26.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞包含根据权利要求1所述的多肽。
27.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞包含编码根据权利要求1所述的多肽的mRNA。
28.一种遗传工程化细胞的方法，所述方法包括：
(a)用(i)根据权利要求1所述的转座酶多肽或编码所述多肽的核酸；和(ii)编码侧翼有转座子重复的所选择遗传元件的DNA转染所述细胞；以及
(b)在适合于瞬时或稳定转座酶活性的条件下孵育所述细胞，从而在所述细胞的基因组中整合所述选择的遗传元件，并且产生工程化细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括：
(c)分离所述工程化细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述选择的遗传元件是可筛选或可选择标志物。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述选择的遗传元件编码治疗性多肽或抑制性核酸。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述选择的遗传元件编码抗体、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述选择的遗传元件编码CAR。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
35.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是干细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。
36.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞是免疫系统细胞或其前体。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞、T细胞或者NK细胞或T细胞的前体。
38.根据权利要求28所述的方法，其中转染所述细胞包括使用基于聚合物、多肽或脂质的转染试剂。
39.根据权利要求28所述的方法，其中转染所述细胞包括电穿孔所述细胞。
40.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括：
(a)用(i)根据权利要求1所述的转座酶多肽或编码所述多肽的核酸；和(ii)编码侧翼有转座子重复的所选择遗传元件的DNA转染细胞群体；以及
(b)在适合于转座酶活性的条件下孵育所述群体，从而在所述细胞的基因组中整合所述选择的遗传元件，并且产生工程化细胞的群体。
41.根据权利要求40所述的方法，所述方法还包括：
(a)用(i)根据权利要求1所述的转座酶多肽或编码所述多肽的核酸；和(ii)编码侧翼有转座子重复的CAR或TCR的DNA转染T细胞或T细胞前体的群体；以及
(b)在适合于转座酶活性的条件下孵育所述群体，从而在所述细胞的基因组中整合所述CAR，并且产生工程化T细胞或T细胞前体的群体。
42.根据权利要求41所述的方法，所述方法还包括：
(c)在选择性增强CAR或TCR表达性T细胞的增殖的培养基中培养所述工程化细胞。
43.一种在具有疾病的人受试者中提供T细胞应答的方法，所述方法包括：
(a)根据权利要求41获得工程化T细胞或T细胞前体的群体；
(b)任选地，在选择性增强CAR表达性T细胞的增殖的培养基中培养所述细胞；以及
(d)对所述受试者施用有效量的所述CAR表达性或TCR表达性或经遗传修饰的T细胞或NK细胞或免疫细胞以提供免疫应答。
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