TWI728173B

TWI728173B - 病毒疫苗

Info

Publication number: TWI728173B
Application number: TW106128111A
Authority: TW
Inventors: 保羅麥可豪利
Original assignee: 澳大利亞商賽門堤斯有限公司
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2021-05-21
Also published as: AU2017313450B2; MX2019001919A; BR112019003181A2; TW201809273A; IL264893A; NZ750578A; WO2018032057A1; AU2017313450A1; CN109862909A; IL264893B; CL2019000405A1; KR20190050787A; CA3034282A1; EP4331676A3; JP2019528271A; SG11201900814QA; EP4331676A2; US20210113684A1; US10905759B2; US20200009245A1

Abstract

本發明係關於一種組成物，其用於在動物中產生免疫反應，從而降低屈公病與天花感染、茲卡病毒與天花感染及/或屈公病、茲卡病毒與天花感染之風險。該組成物包含醫藥學上可接受之載劑與減毒之痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白及/或茲卡病毒之PrME的核酸序列。

Description

病毒疫苗

本發明係關於一種基於減毒之痘病毒載體的疫苗，用於防禦屈公病(chikungunya)與天花(smallpox)、茲卡病毒(zika virus)與天花及/或屈公病、茲卡病毒與天花。

本說明書中之參考文獻書目詳列於本說明書的結尾處。

本說明書中對任何先前公開案(或來源於其之資訊)或對已知之任何事項的提及不視為且不應視為認可、承認或以任何形式表明先前公開案(或來源於其之資訊)或已知事項形成本說明書相關研究領域中之公共常識的一部分。

本說明書中提及的所有公開案各以全文引用之方式併入本文中。

痘病毒科包含兩種亞科：脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)與昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。脊椎動物痘病毒亞科包含八個屬，包括正痘病毒屬(Orthopoxviridae)，該正痘病毒屬包含感染人類之病毒種(例如天花病毒、天花病原體、牛痘病毒(其形成了1796年由Jenner報導的最初天花疫苗)、痘瘡(vaccinia)病毒(用作第二代天花疫苗)及猴痘病毒)；以及鳥類痘病毒屬(Avipoxviridae)病毒，該等鳥類痘病毒屬病毒包含感染鳥類之病毒種，如禽痘與金絲雀痘病毒。除作為抗原用於天花疫苗之外，使用基於痘瘡的重組病毒及鳥類痘病毒作為「主鏈」載體亦受到許多關注。作為細胞質內載體，正痘病毒屬尤其能夠將外來抗原遞送至宿主細胞質及抗原加工路徑，抗原加工路徑將抗原加工成肽以便呈遞於細胞表面上。表現外來抗原的此類載體用於開發針對已證實用其它疫苗接種策略難以治療之疾病(諸如AIDS、肺結核、瘧疾及癌症)的疫苗。

脊椎動物痘病毒亞科具有尺寸在130kb(副痘病毒)至逾300kb(鳥類痘病毒)範圍內的線性雙股DNA基因體且其在宿主中的壽命週期完全在宿主細胞的細胞質中度過。痘病毒的運作實質上獨立於其宿主細胞及宿主細胞分子，尤其是涉及早期mRNA合成的過程。然而，宿主分子似乎用於起始或終止中間及晚期病毒轉錄。痘病毒產生了結構多樣的「宿主範圍因子」，其特異性靶向且操縱宿主信號傳導路徑以允許細胞條件發生病毒複製。大部分痘病毒可以結合且感染哺乳動物細胞，但無論隨後感染被容許(能夠產生感染性病毒粒子)或不被容許(實質上不能產生感染性病毒粒子)與否均依賴於所涉及的特定痘病毒及特定細胞類型。當前在痘病毒-宿主相互作用之分子層面(特定而言，宿主範圍基因)上及需要哪些因素來調節有利於病毒與細胞繁殖之關係的瞭解相對不充分。關於宿主範圍基因之評論，可以參考Werden等人，2008，該文獻全文併入本文中。

自1960年代早期至今日，已公開了關於用作天花疫苗及隨後用作病毒載體之痘瘡病毒株的觀測結果。痘瘡之某些病毒株，包括用作天花疫苗的病毒株，能夠在人類細胞中繁殖且因此代表了健康風險，諸如產生病毒性腦炎。為了開發更安全的疫苗，使來自安卡拉(Ankara)的痘瘡病毒株(稱為「CVA」)在非人類細胞中繼代超過500次。在此過程中，痘瘡基因體發生實質性變化，相較於最初CVA基因體，產生了至少六個較大缺失。經修飾之病毒不僅在人類中的病原性減弱，而且能夠產生保護性免疫反應。減毒之痘瘡病毒稱為MVA(經修飾之痘瘡安卡拉)且亦根據繼代次數來分類，原因是發現繼代次數不同的病毒在基因及表型上是不同的。然而，繼代次數515 MVA515應理解為基因穩定的。在二十世紀九十年代早期，觀測到MVA病毒株(諸如MVA572)及其衍生物MVA F6能夠在非容許細胞(病毒在其中將不繁殖)中高量表現痘瘡蛋白質及異源(重組)蛋白質，從而能夠開發作為所關注異源分子之載體的MVA，諸如編碼用於疫苗或遞送療法之抗原的彼等物。

最近，已試圖藉由將MVA之六個已知較大缺失引入CVA中來製造具有MVA品質之經修飾之痘瘡病毒。有趣的是，此竟未產生具有MVA之減毒品質的病毒。有人提出宿主範圍基因之缺乏可能是所觀測到之減毒的原因，然而此尚未經證實(參見例如Meyer等人，Journal of General Virology(1991)72：1031-1038)。

痘病毒構成一個病毒大家族，其特徵為較大的線性dsDNA基因體、細胞質繁殖位點及複雜的病毒粒子形態。痘瘡病毒為此類病毒之代表性病毒且就病毒形態發生而言研究最多。痘瘡病毒的病毒粒子呈現為「磚形」或「卵形」的膜結合粒子，其具有複雜的內部結構，該內部結構的特徵是與「側體」側接的壁狀雙凹核心。病毒粒子組裝路徑涉及含膜新月體的加工，該等新月體發展成不成熟病毒粒子(IV)，且接著演變成成熟病毒粒子(MV)。痘瘡病毒的病毒粒子內包含逾70種特定基因產物，其中痘瘡病毒組裝體上之逾50種特定基因的突變影響現已描述。

痘瘡病毒藉由其表面膜與宿主細胞之質膜融合而進入細胞，釋放核心(及側體)至細胞質中且啟動病毒轉錄程序。病毒粒子核心含有早期mRNA合成及修飾所必需的病毒編碼酶之完整補體。早期基因編碼DNA繁殖所必需之酶，且因此當早期基因表現達到峰值時，在中稱為「工廠」的細胞質位點隨之發生病毒DNA繁殖。早期基因亦編碼中間轉錄因子，且中間基因又編碼晚期轉錄因子，使得中間基因及晚期基因在病毒DNA繁殖之必要起始之後依次得到表現。從而以暫時級聯轉錄病毒基因之完整補體，其中早期、中間及晚期類別係根據類別特異性轉錄啟動子及病毒編碼轉錄因子區分。另外，僅繁殖的基因體是中間及晚期轉錄的勝任型模板。這兩種類別的基因一起編碼病毒粒子結構蛋白、病毒粒子酶，且組裝因子是組裝新後代病毒粒子所必需的。

病毒吸收及早期表達之後不久，細胞內形成感染特異性細胞質域，其密度均一且有時被尺寸隨著時間增加之內質網(ER)源內質網孔隙包圍。這些域代表了病毒DNA繁殖位點且通常稱為「病毒工廠」。

病毒組裝始於病毒工廠內形成硬質新月形結構(三維杯形)。在高解析度電子顯微照片中，此等新月形結構之外層是由規則間距的突起(稱為「針狀體」)組成。新月體的長度明顯增長，同時維持相同的曲率直至其變成閉合圓(三維球形)，稱為不成熟病毒粒子(IV)。IV經「病毒原質」材料填充，該材料密度均一，但可辨別地，電子密度大於周圍工廠。當IV形成時，亦發生衣殼化DNA之吸收：此等在電子顯微照片中顯示為IV內之電子密集性圓形或卵形亞域，稱為「核狀體」。含有縮合DNA 之核狀體的IV通常稱為「IVN」。若干種病毒粒子蛋白質前驅物經由蛋白分解裂解發生成熟是IVN向成熟病毒粒子(MV)之形態發生所必需的。發現大部分成熟病毒粒子位於工廠外部且可以叢集形式存在於工廠周邊或明顯與最近工廠相隔顯著的距離。

痘病毒的病毒粒子以三種感染形式存在：成熟病毒粒子(MV)、包覆病毒粒子(WV)及細胞外病毒粒子(EV)。該病毒之最簡單形式MV是含有與側體側接之含DNA雙凹核心的包膜粒子，該等側體填充核心之凹面。通常發現MV排他性地位於細胞內部且僅藉由細胞溶解釋放。WV由MV組成，該MV被兩個來源於高爾基體反面內質網孔隙的其他脂質雙層包圍。外膜含有特徵性病毒蛋白的WV是EV前驅物且亦發現於細胞內。EV由WV組成，該WV經由WV最外膜與質膜融合而已被胞吐，從而離開被另一個膜包覆的MV。發現EV的一部分附著至細胞表面，而發現有些在細胞外介質中是游離的。EV被認為對於病毒在生物體內擴散是重要的。

屈公病為屈公病病毒引起之感染。其特徵在於通常持續二至七天的突發型發熱，及典型持續數週或數月，而且有時持續數年的關節疼痛。死亡率為1000中略小於1，其中老年人死亡可能性最大。

病毒藉由蚊子傳遞至人類。病毒之動物貯主包括猴、鳥、牛及嚙齒動物。此與登革熱形成對比，登革熱僅以靈長類動物為宿主。

最佳預防方式為在該疾病常見的國家中進行總體蚊子控制及避免蚊子叮咬。然而，非常需要防禦此疾病的疫苗。

茲卡病毒(ZIKV)為黃病毒科之黃病毒屬成員且為正單股RNA病毒，其主要由亦攜帶登革熱(dengue)及屈公病病毒的埃及伊蚊(Aedes aegypti)傳播。其次，茲卡病毒亦可由白紋伊蚊(Aedes albopictus)擴散，白紋伊蚊的分佈遠達至溫帶區域。

茲卡病毒首次於1947年發現於烏干達茲卡森林的猴中且此病毒直至最近才僅僅是一種科學好奇心。感染者中約80%似乎未展現症狀，且其餘部分僅患有在幾天內消退的輕度疾病。最初限於小規模爆發於非洲及亞洲的該病毒於2007年散播至太平洋中的密克羅尼西亞聯邦雅浦島(Yap in Micronesia)。2013年，法屬波利尼西亞(French Polynesia)爆發引起28,000例感染。當前在美國人中的爆發被認為是來自波利尼西亞。病毒在2014年FIFA世界盃期間可能已引入巴西或其中有波利尼西亞運動員競技的輕舟賽。其後，該病毒已散遍若干個拉丁美洲國家，包括哥倫比亞(Colombia)、墨西哥(Mexico)、巴拉圭(Paraguay)及委內瑞拉(Venezuela)。

迄今為止已描述兩種ZIKV基因譜系：非洲及亞洲。自2015年與2016年之間之巴西樣品中分離出的病毒株類似於亞洲病毒株，尤其是法屬波利尼西亞病毒株[Baronti等人，2014,Complete coding sequence of Zika virus from a French Polynesia outbreak in 2013.Genome Announc 2：e00500-e00514；Brasil等人，2016,Zika virus outbreak in Rio de Janeiro,Brazil：Clinical characterization,epidemiological and virological aspects.PLoS Negl Trop Dis 10：e0004636；Faria等人，2016,Zika virus in the Americas：Early epidemiological and genetic findings.Science 352：345-349；Giovanetti等人，2016,Zika virus complete genome from Salvador,Bahia,Brazil.Infect Genet Evol.]。

非洲譜系MR766的參考ZIKV病毒株不同於亞洲譜系之處在於，包膜蛋白之ASN 153/154處的保守糖基化位點已缺失(參見Sirohi等人之圖3，2016,The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus.Science,352(6284)：467-70)，從而使MR766病毒株中之非糖基化E蛋白增加。糖基化之此缺乏似乎不影響茲卡病毒之感染力，而且可以起到毒性作用，且可以得到為何亞洲病毒株毒力似乎大於MR766的原因，然而迄今為止，此尚未得到證實。

就基於SCV之疫苗的設計而言，此等疫苗之抗原序列係基於亞洲譜系。使用PrME(pr膜加包膜)多蛋白序列作為疫苗的疫苗抗原。

本發明人已發現，藉由使用已工程改造的減毒痘病毒以使得其基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白及/或茲卡病毒之PrME之核酸序列，可以獲得降低屈公病與天花感染、茲卡病毒與天花感染及/或屈公病、茲卡病毒與天花感染之風險的組成物。

因此在第一態樣中，本發明提供一種用於在動物中產生免疫反應、從而降低屈公病與天花感染風險的組成物，該組成物包含醫藥學上可接受之載劑及減毒痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白的核酸序列。

在第二態樣中，本發明提供一種用於在動物中產生免疫反應、從而降低茲卡病毒感染及天花感染風險的組成物，該組成物包含醫藥學上可接受之載劑及減毒痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼茲卡病毒之PrME多蛋白的核酸序列。

在第三態樣中，本發明提供一種用於在動物中產生免疫反應、從而降低屈公病與茲卡病毒與天花感染風險之組成物，該組成物包含醫藥學上可接受之載劑及減毒痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白的核酸序列及編碼茲卡病毒之PrME多蛋白的核酸序列。

在第四態樣中，本發明提供一種誘導個體中產生針對屈公病與天花、天花與茲卡病毒感染及/或屈公病、天花與茲卡病毒感染之保護性免疫反應的方法，該方法包含向該個體投予本發明之第一、第二或第三態樣之組成物。

在第五態樣中，本發明提供本發明之第一、第二或第三態樣之組成物的用途，其用於製備供誘導個體中產生針對屈公病與天花、天花與茲卡病毒感染及/或屈公病、天花與茲卡病毒感染之保護性免疫反應的醫藥品。

圖1. SCV301A同源重組卡匣。

圖2. VACV-COP基因體中用於同源重組之F1及F2目標。

圖3. SCV301A之CHIKV-26S插入位點。

圖4. 因同源重組而缺失的Ecogpt及EGFP。

圖5. pTC29之質體圖譜。

圖6. 缺失HR卡匣。

圖7. B7R-B8R缺失HR卡匣。

圖8. 利用反式顯性(transdominant)選擇的同源重組操作方法。

圖9. ZIKR HR卡匣。

本發明不限於特定程序或藥劑、特定的藥劑調配物及各種醫學方法，因為此可以變化。本文所用之術語僅出於描述特定具體實例之目的且不希望具有限制性。除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。

與本文所述類似或等效的任何材料及方法可用於實施或測試本發明。從業者具體可參考：Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press,Plainsview,N.Y.；Ausubel等人，(1999)Current Protocols in Molecular Biology(增刊47),John Wiley & Sons,New York；Murphy等人，(1995)Virus Taxonomy Springer Verlag：79-87,Mahy Brian WJ及Kangro O Hillar(編)：Virology Methods Manual 1996,Academic Press；及Davison AJ及Elliott RM(編)：Molecular Virology,A practical Approach 1993,IRL Press at Oxford University Press；Perkus等人，Virology(1990)179(1)：276-86，或此項技術中之定義及術語以及熟習此項技術者已知的其他方法。

雖然可以使用與本文所述類似或等效之任何方法及材料實施或測試本發明，但所述的方法及材料較佳。出於本發明之目的，以下術語定義如下。

除非上下文另有要求，否則在通篇本說明書中，「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」一詞應理解為意味著包括所述步驟或元件或一組步驟或元件，但不排除任何其他步驟或元件或其他組步驟或元件。因此，術語「包含」及其類似術語之使用表示所列元件為必需或必選的，但其他元件為視情況存在的且可以存在或可以不存在。在減毒正痘載體之背景下，該等載體藉由包含基本成熟或組裝基因之缺失而經修飾用於減毒，然而涵蓋其他修飾，諸如對載體、抗原或其他蛋白質的修飾。

「由…組成」意謂包括且限於在片語「由…組成」中的任何事物。因此，片語「由…組成」表示所列元件為所需或必選的，且不可存在其他元件。「基本上由…組成」意欲包括該片語中所列之任何元件，且限於不干擾或不影響所列元件在本發明中所指定之活性或作用的其他元件。因此，片語「基本上由…組成」表示所列元件為所需或必選的，但其他元件為視情況存在的且視其是否影響所列元件之活性或作用而定可存在或可不存在。

如本文所用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個態樣。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括單個細胞，以及兩個或多於兩個細胞；提及「一種生物體」包括一種生物體，以及兩種或超過兩種生物體等。在一些具體實例中，「一」意謂「一個或超過一個」。

如本文所用，「及/或」係指及涵蓋一或多個相關所列項之任何及所有可能組合，以及組合的缺乏(當以替代性(「或」)解釋時)。

如本文所用，「減毒」意謂病毒載體毒力之降低。毒力定義為病毒引起特定宿主致病之能力。不能產生感染性病毒的痘病毒載體可以首先感染細胞，但在宿主內實質上不能完全複製本身或繁殖或致病。此為載體將其蛋白質或核酸遞送至宿主細胞的細胞質、但不傷害個體所需的。

「控制元件」或「控制序列」意指特定痘病毒、載體、質體或細胞中表達可操作地連接之編碼序列所必需的核酸序列(例如DNA)。適用於真核細胞的控制序列包括轉錄控制序列，諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、轉錄增強子、轉譯控制序列(諸如轉譯增強子及內部核糖體結合位點(IRES))、調節mRNA穩定性的核酸序列，以及靶向序列，該等靶向序列使由所轉錄聚核苷酸編碼之產物靶向細胞內的細胞內隔室或靶向細胞外環境。

在提供序列的情況下，涵蓋相應序列。「對應於(corresponds to)」、「對應(corresponding)」或「對應於(corresponding to)」意指與參考核酸序列呈現實質性序列一致性的核酸序列(例如與參考核酸序列的全部或一部分呈現至少約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或甚至高達100%序列一致性)，或與參考胺基酸序列呈現實質性序列相似性或一致性的胺基酸序列(例如與參考胺基酸序列的全部或一部分呈現至少約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或甚至高達100%序列相似性或一致性)。

在治療或預防病狀或調節針對靶抗原或生物體之免疫反應的背景下，「有效量」意指一定量的藥劑(例如如本文所述的減毒正痘載體)或包含其的組成物以單次劑量或一系列劑量之一部分投予需要此類治療或預防之個體，所述量有效預防該病狀之症狀產生、控制此類症狀及/或治療現有症狀或有效調節針對靶抗原或生物體的免疫反應。有效量將視以下而變：待治療之個體之健康及身體狀況、待治療之個體之分類群、組成物之配方、醫學情形評估，及其他相關因素。預期屬於相對較寬範圍內的量可以經由常規試驗確定。

如本文所用，術語「編碼(encode/encoding)」及其類似術語是指由一種核酸得到另一種核酸或多肽之能力。舉例而言，若核酸序列可以轉錄且/或轉譯而產生多肽，或若核酸序列可以加工成可以轉錄且/或轉譯而產生多肽之形式，則稱核酸序列「編碼」多肽。此類核酸序列可以包括編碼序列，或編碼序列與非編碼序列。因此，術語「編碼(encode/encoding)」及其類似術語包括由DNA分子轉錄而產生之RNA產物、由RNA分子轉譯而產生的蛋白質、由DNA分子轉錄形成RNA產物及RNA產物隨後轉譯而產生的蛋白質，或由DNA分子轉錄得到RNA產物、RNA產物加工得到經加工RNA產物(例如mRNA)及經加工RNA產物隨後轉譯而產生的蛋白質。

術語「內源」是指通常在宿主生物體中發現的基因或核酸序列或區段。

術語「可表現(expressible)」、「表現(expressed)」及其變化形式是指細胞能夠將核苷酸序列轉錄成RNA且視需要轉譯mRNA以合成提供生物學或生物化學功能的肽或多肽。

如本文所用，術語「基因」包括能夠用於產生mRNA的核酸分子，視需要經由添加有助於此過程的元件。基因能夠或不能用於產生功能蛋白。基因可以包括編碼區域與非編碼區域(例如內含子、調控元件、啟動子、增強子、終止序列以及5'及3'未轉譯區域)。

術語「異源核酸序列」、「異源核苷酸序列」、「異源聚核苷酸」、「外來聚核苷酸」、「外源聚核苷酸」及其類似術語可互換用於指藉由實驗操縱而引入生物體基因體中的任何核酸(例如包含IRES的核苷酸序列)，且可以包括在該生物體中發現的基因序列，只要所引入的基因相對於修飾之前的病毒基因體序列含有一些修飾(例如至少一個核苷酸的點突變、缺失、取代或添加、核酸內切酶裂解位點之存在、loxP位點之存在等)。

術語「異源多肽」、「外來多肽」及「外源多肽」可互換用於指由如上文所定義之「異源核酸序列」、「異源核苷酸序列」、「異源聚核苷酸」、「外來聚核苷酸」及「外源聚核苷酸」編碼的任何肽或多肽。

術語「保護性免疫反應」意謂預防或降低屈公病及/或天花感染風險或嚴重度的免疫反應。

本發明之痘病毒載體較佳在哺乳動物細胞中繁殖。可以用於本發明之哺乳動物細胞的詳情提供於PCT/AU2014/050330，其揭示內容藉由交叉引用的方式併入本文中。

在一些具體實例中，哺乳動物細胞為人類細胞、靈長類動物細胞、倉鼠細胞或兔細胞。

細胞可以是單細胞，或可以在組織培養液中以液體培養物、單層或其類似物形式生長。宿主細胞還可以直接地或間接地來源於組織或可以存在於包括動物的生物體內。

應瞭解，「誘導」如本文所涵蓋的免疫反應包括誘發或刺激免疫反應及/或增強先前已有的免疫反應。

如本文所用，術語「可操作地連接(operably connected)」或「可操作地連接(operably linked)」是指一種並接，其中如此所述之組分處於允許其以其預定方式發揮功能之關係。舉例而言，轉錄控制序列「可操作地連接」至編碼序列是指轉錄控制序列相對於編碼序列的定位及/或取向允許在與轉錄控制序列相容的條件下表達編碼序列。在另一實例中，IRES可操作地連接至正痘病毒編碼序列是指IRES相對於正痘病毒編碼序列的定位及/或取向允許正痘病毒編碼序列發生帽非依賴性轉譯。

如本文所用，術語「開放閱讀框架(open reading frame)」及「ORF」在本文中可互換地用於指在編碼序列之轉譯起始密碼子與終止密碼子之間編碼的胺基酸序列。術語「起始密碼子」(例如ATG)及「終止密碼子」(例如TGA、TAA、TAG)是指編碼序列中之三個相鄰核苷酸單元(『密碼子』)，其分別指定蛋白質合成之起始及鏈終止(mRNA轉譯)。

如本文所用，術語「聚核苷酸」、「聚核苷酸序列」、「核苷酸序列」、「核酸」或「核酸序列」表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該術語典型地是指具有至少10個鹼基長度之核苷酸聚合物形式(核糖核苷酸或去氧核苷酸)或任一種類型的核苷酸之修飾形式。該術語包括DNA或DNA之單股及雙股形式。

「多肽」、「肽」、「蛋白質」及「蛋白質分子」在本文中可互換地用於指包含或組成為胺基酸殘基聚合物的分子，或指其變異體及合成類似物。因此，此等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為非天然存在之合成胺基酸(諸如天然存在之對應胺基酸之化學類似物)的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物。

如本文所用，如適用於「核酸分子」、「聚核苷酸」及其類似物的術語「重組」應理解為意謂可以在本文所述之宿主細胞或游離系統中轉錄且/或轉譯的人工核酸結構(亦即，非複製cDNA或RNA；或複製子、自複製cDNA或RNA)。可以將重組核酸分子或聚核苷酸插入載體中。可以使用非病毒載體，諸如質體表現載體或病毒載體。根據本發明之載體種類及核酸構築體插入技術已為技術人員所知。在本發明所述之配置中，根據本發明之核酸分子或聚核苷酸不存在於自然界中。換而言之，異源核苷酸序列天然不與親代病毒基因體之元件(例如啟動子、ORF、聚腺苷酸化信號、核糖核酸酶)組合。

如本文所用，術語「重組病毒」應理解為提及包含至少一種異源核酸序列的「親代病毒」。

如本文所用，術語「序列一致性」是指序列在對比窗內基於逐個核苷酸或逐個胺基酸一致的程度。因此，「序列一致性百分比」如下計算：在對比窗內比較兩個最佳比對序列，測定兩個序列中存在一致核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或一致氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)之位置的數目以得到匹配位置數目，將匹配位置數目除以對比窗中之位置總數(亦即窗尺寸)，且將結果乘以100，以得到序列一致性百分比。出於本發明之目的，「序列一致性」應理解為意謂藉由DNASIS電腦程式(用於視窗之2.5版；獲自日立軟體工程有限公司(Hitachi Software engineering Co.,Ltd.)，美國加利福尼亞南舊金山(South San Francisco, California,USA))、使用如隨附軟體之參考手冊中所使用之標準預設值計算的「匹配百分比」。

術語「信號序列」或「信號肽」是指一種短(約3個至約60個氨基酸長度)肽，其將來自胞溶質之蛋白質之共轉譯或轉譯後轉運引向某些細胞器，諸如細胞核、線粒體基質及內質網。對於具有靶向ER之信號肽的蛋白質而言，蛋白質轉運至ER之後，典型地由前驅物形式藉由信號肽酶裂解而形成信號肽，且所得蛋白質沿著分泌路徑移動至其細胞內(例如高爾基氏體、細胞膜或細胞壁)或細胞外位置。如本文所用，「靶向ER的信號肽」包括胺基端疏水性序列，其通常在蛋白質之一部分或全部經由ER膜插入ER管腔內之後，在酶作用下移除。因此，在此項技術中已知呈信號前驅物形式之序列可以作為呈前驅物形式之蛋白質之一部分存在，但在呈成熟形式之蛋白質中一般不存在。

「相似度」是指一致氨基酸數目的百分比或構成如下表A所定義之保守取代的氨基酸數目百分比。相似度可以使用序列對比程式測定，諸如GAP(Deveraux等人，1984,Nucleic Acids Research12：387-395)。以此方式，長度與本文所列序列相似或實質上不同的序列可以藉由將空位插入比對序列中來比較，此類空位係藉由例如GAP所用的對比算法來測定。

對比窗比對用之最佳序列比對可以藉由電腦化算法實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)或藉由檢驗及所選多種方法中的任一者產生之最佳比對(亦即在對比窗上產生最高同源性百分比)進行。亦可參考BLAST程式族，如例如Altschul等人，1997,Nucl.Acids Res.25：3389所揭示。序列分析之詳述論述可見於Ausubel等人，「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley & Sons公司，1994-1998，第15章之單元19.3中。

術語「個體」、「患者」、「宿主」或「個體」在本文中可互換地用於指需要治療或預防的任何個體，尤其是脊椎動物個體，且甚至更特定言之，哺乳動物個體。屬於本發明範圍內之適合脊椎動物包括(但不限於)脊索動物亞門之任何成員，包括靈長類動物(例如人類、猴及猿，且包括猴物種，諸如獼猴屬(例如獼猴，諸如食蟹獼猴，及/或恆河猴(恆河獼猴))及狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，以及狨(狨屬物種)、松鼠猴(松鼠猴屬物種)及獠狨(長牙狨屬物種)，以及猿物種，諸如黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes))，嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔類動物(例如家兔、野兔)、牛科動物(例如牛)、綿羊科動物(例如綿羊)、山羊科動物(例如山羊)、豬科動物(例如豬)、馬科動物(例如馬)、犬科動物(例如犬)、貓科動物(例如貓)、禽類(例如雞、火雞、鴨、鵝、伴侶鳥類，諸如金絲雀、虎皮鸚鵡等)、海洋哺乳動物(例如海豚、鯨)、爬行動物(蛇、蛙、蜥蜴等)，及魚。較佳個體為需要治療或預防病狀之人類。然而，應瞭解前述術語並非暗示症狀存在。

術語「轉殖基因」在本文中用於描述已成為或將要人工引入宿主生物體基因體中且傳遞至宿主後代的遺傳物質。在一些具體實例中，其向其中引入其之哺乳動物細胞或正痘載體賦予所需特性，或以其它方式產生所需的治療或診斷結果。

如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語是指獲得所需的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物(尤其人類)之疾病之任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病、但尚未診斷出患有該疾病之個體出現該疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；以及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。

術語「野生型」、「天然」、「原生」及其類似術語係相對於生物體、多肽或核酸序列而言，該生物體多肽或核酸序列為天然存在的或可獲得於至少一種天然存在之生物體中，該生物體未發生變化、突變或以其它方式被人類操縱。

變異體包括完全或部分與參考分子或其互補形式足夠相似的核酸分子，使得選擇性雜交可以在中等或高嚴格度條件下實現，或在包含至少約15個核苷酸的對比窗內與限定所提及痘病毒宿主範圍因子的核苷酸序列具有約60%至90%或90至98%序列一致性的核酸分子。較佳地，雜交區域具有約12至約18個核鹼基或大於18個核鹼基的長度。較佳地，特定核苷酸序列與參考序列之間的一致性百分比為至少約80%或85%，或更佳約90%或大於90%相似度，諸如約95%、96%、97%、98%、99%或大於99%。涵蓋80%與100%之間的一致性百分比。核苷酸序列之長度視其所提出之功能而定。涵蓋同源物。術語「同源物(homolog)」、「同源基因(homologous genes)」或「同源物(homologs)」廣泛地指功能上及結構上相關分子，包括來自其他物種的彼等物。同源物及直系同源物為變異體之實例。

核酸序列一致性可以用以下方式測定。使用本發明核酸序列，使用程式BLASTM 2.1版(基於Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)搜尋核酸序列資料庫，諸如基因庫資料庫(GenBank database)(可在網站http：//www.ncbi.nln.nih.gov/blast/接取)。該程式係以無空隙模式使用。使用預設過濾來移除歸因於低複雜性區域之序列同源性。利用BLASTP之預設參數。

胺基酸序列一致性可以用以下方式測定。使用本發明多肽序列，使用BLASTP程式搜尋多肽序列資料庫，諸如基因庫資料庫(可在網站http：//www.ncbi.nln.nih.gov/blast/接取)。該程式係以無空隙模式使用。使用預設過濾來移除歸因於低複雜性區域之序列同源性。利用BLASTP之預設參數。低複雜性序列之過濾可使用SEG程式。

較佳序列將在嚴格條件下與參考序列或其補體雜交。術語「在嚴格條件下雜交」及其文法等效術語是指核酸分子能夠與目標核酸分子(諸如固著於DNA或RNA墨點(諸如南方墨點或北方墨點)上的目標核酸分子)在限定的溫度及鹽濃度條件下雜交。就長度大於約100個鹼基的核酸分子而言，典型的嚴格雜交條件為比原生雙螺旋體之解鏈溫度(Tm)低不超過25℃至30℃(例如10℃)(一般參見Sambrook等人，(見上文)；Ausubel等人，(1999))。大於約100個鹼基之核酸分子的Tm可以依據式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na⁺))計算。就具有小於100個鹼基長度的核酸分子而言，例示性嚴格雜交條件為比Tm低5℃至10℃。

術語「缺失」在本文中是指靶基因編碼區之全部或一部分移除。該術語亦涵蓋消除靶基因之基因表現或消除或實質上下調所編碼蛋白質之含量或活性的呈任何形式之突變或轉型。

提及「基因」包括對應於基因之外顯子或開放閱讀框架的DNA。本文中提及「基因」亦包括：由轉錄及/或轉譯調節序列及/或編碼區及/或非轉譯序列(亦即內含子、5'-及3'-未轉譯序列)組成的經典基因體基因；或對應於基因之編碼區(亦即外顯子)及5'-及3'-未轉譯序列的mRNA或cDNA。

「調控元件」或「調控序列」意指為特定宿主細胞中表現可操作地連接之編碼序列所必需的核酸序列(例如DNA)。適用於原核細胞的調節序列包括例如啟動子，及視需要存在之順式作用序列，諸如操縱序列，及核糖體結合位點。適用於真核細胞的控制序列包括啟動子、聚腺苷酸化信號、轉錄增強子、轉譯增強子、調節mRNA穩定性的前導序列或尾隨序列，以及使由所轉錄聚核苷酸編碼之產物靶向細胞內之細胞內隔室或靶向細胞外環境的靶向序列。

適用於實現本發明之經修飾之哺乳動物細胞的嵌合構築體包含編碼可操作地連接至調控序列之正痘宿主範圍因子的核酸序列。調控序列宜包含與細胞表現相容的轉錄及/或轉譯控制序列。典型地，轉錄及轉譯調節控制序列包括(但不限於)啟動子序列、5'非編碼區、順式調節區(諸如轉錄調控蛋白質或轉譯調控蛋白質用的功能結合位點)、上游開放閱讀框架、核糖體結合序列、轉錄起始位點、轉譯起始位點，及/或編碼前導序列的核苷酸序列、終止密碼子、轉譯終止位點及3'非轉譯區域。涵蓋如此項技術中已知之組成性或誘導性啟動子。啟動子可以是天然存在之啟動子，或超過一種啟動子之元件組合而成的混合啟動子。

所涵蓋之啟動子序列可以是哺乳動物細胞原生的或可以來源於替代來源，其中該區域在所選生物體中具有功能性。啟動子之選擇根據預定的宿主細胞而異。舉例來說，可以用於在哺乳動物細胞中表現的啟動子尤其包括可以回應於重金屬(諸如鎘)而被誘導的金屬硫蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子以及病毒啟動子，諸如SV40大T抗原啟動子、人類細胞巨大病毒(CMV)即刻早期(IE)啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒LTR 啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純性疱疹病毒啟動子及HPV啟動子，尤其是HPV上游調節區(URR)。所有此等啟動子已有充分描述且在此項技術中容易獲得。

本文亦可使用增強子元件提高哺乳動物構築體之表現量。實例包括如例如Dijkema等人(1985)EMBO J.4：761所述之SV40早期基因增強子；如例如Gorman等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777所述之來源於勞斯肉瘤病毒之長末端重複序列(LTR)的增強子/啟動子；及如例如Boshart等人(1985)Cell 41：521所述之來源於人類CMV之元件，諸如CMV內含子A序列中所含的元件。

嵌合構築體也可以包含3'非轉譯序列。3'非轉譯序列是指包含DNA區段之基因一部分，該DNA區段含有聚腺苷酸化信號及能夠實現mRNA加工或基因表現之任何其他調控信號。聚腺苷酸化信號的特徵為實現聚腺苷酸尾向mRNA前驅物之3'端的添加。聚腺苷酸化信號公認為典型形式5' AATAAA-3'存在同源性，然而變異並非不常見。3'非轉譯調控DNA序列較佳包括約50至1,000nts且除聚腺苷酸化信號及能夠實現mRNA加工或基因表現之任何其他調控信號之外，亦可以含有轉錄及轉譯終止序列。

在一些具體實例中，嵌合構築體進一步含有允許選擇含有構築體之細胞的可選標記基因。選擇基因在此項技術中已熟知且與在所關注細胞中表現相容。

在一個具體實例中，正痘結構或組裝基因在啟動子控制下表現。在一個非限制性具體實例中，啟動子為細胞組成性啟動子，諸如人類EF1 α(人類延伸因子1 α基因啟動子)、DHFR(二氫葉酸還原酶基因啟動子)或PGK(磷酸甘油酸激酶基因啟動子)，其引導CP77之足量表現以在針對宿主細胞之顯著毒性作用不存在的情況下維持病毒繁殖。啟動子亦可具有誘導性，諸如細胞誘導性啟動子，MTH(來自金屬硫蛋白基因)病毒啟動子亦用於哺乳動物細胞中，諸如CMV、RSV、SV-40及MoU3。

本發明提供一種包含減毒痘病毒之組成物，該減毒痘病毒可作為疫苗用於誘導針對屈公病與天花病毒感染之防禦。如本文所用，術語「減毒(attenuation)」、「減毒(attenuated)」及其類似術語意謂減少病毒載體毒力。毒力典型地定義為病毒引起特定宿主致病之能力。舉例來說，不能產生感染性病毒的痘病毒可以首先感染細胞，但實質上不能完全複製自身或在宿主或宿主細胞內繁殖或導致疾病或病狀。此為所需的，因為痘病毒載體可以將核酸遞送至宿主或宿主細胞，但典型地不傷害宿主或宿主細胞。

痘病毒科包含兩種亞科：脊椎動物痘病毒亞科與昆蟲痘病毒亞科。脊椎動物痘病毒亞科包含八個屬，包括正痘病毒屬，該正痘病毒屬包含感染人類的病毒種，而昆蟲痘病毒亞科感染昆蟲。正痘病毒屬包括例如作為天花病原體的天花病毒、形成1796年由Jenner報導之原始天花疫苗的牛痘病毒，以及已用作第二代天花疫苗的痘瘡病毒。鳥類痘病毒屬病毒包含感染鳥類的病毒種，諸如禽痘及金絲雀痘病毒。除作為抗原用於天花疫苗之外，使用基於痘瘡的重組病毒及鳥類痘病毒作為遞送及/或表現所關注之異源基因的載體亦受到眾多關注。作為細胞質內載體，正痘病毒屬能夠將外來抗原遞送至宿主細胞質及抗原加工路徑，抗原加工路徑將抗原加工成肽以便呈遞於細胞表面上。表現外來抗原的此類載體適用於基因療法及開發針對多種病狀及疾病之疫苗。

痘病毒構成一個病毒大家族，其特徵為大線性dsDNA基因體、細胞質繁殖位點及複雜的病毒粒子形態。痘瘡病毒為此類病毒中之代表性病毒且就病毒形態發生而言為研究最多者之一。痘瘡病毒的病毒粒子呈現為「磚形」或「卵形」的膜結合粒子，其具有複雜的內部結構，該內部結構的特徵是與「側體」側接的壁狀雙凹核心。病毒粒子組裝路徑涉及含膜新月體的加工，該等新月體發展成不成熟病毒粒子(IV)，且接著演變成成熟病毒粒子(MV)。痘瘡病毒的病毒粒子內包含逾70種特定基因產物，其中痘瘡病毒組裝體上之逾50種特定基因的突變影響現已描述。

適合之減毒痘病毒已為熟習此項技術者所知。說明性實例包括經修飾之減毒痘瘡安卡拉(MVA)、NYVAC、鳥類痘、金絲雀痘及禽痘。因此，在本文所揭示之一個具體實例中，減毒痘病毒選自由以下組成的群組：經修飾之痘瘡安卡拉(MVA)、NYVAC、鳥類痘、金絲雀痘及禽痘。在一個具體實例中，減毒痘病毒為減毒痘瘡病毒。說明性實例為痘瘡病毒株哥本哈根(Copenhagen，COP)、西儲地(Western Reserve，WR)、Wyeth、ACAM2000、LC16m8及Connaught Laboratories(CL)。

熟習此項技術者會瞭解，其他正痘病毒株可以是經修飾以產生減毒痘病毒。在一個說明性實例中，可以藉由修飾(例如缺失、取代或以其它方式干擾功能)來自痘病毒基因體之基因來產生減毒痘病毒，該痘病毒基因體編碼內源性基本組裝或成熟蛋白質。因此，在本文所揭示之一個具體實例中，減毒痘病毒為經修飾之正痘病毒，其中該修飾包含編碼內源性基本組裝或成熟蛋白質之基因之缺失。

在一個具體實例中，減毒痘病毒為經修飾之痘瘡病毒，其中該修飾包含編碼內源組裝或成熟蛋白質之痘瘡病毒基因體中之基因缺失(或以其它方式干擾功能)且其中該修飾使在宿主細胞(例如人類細胞)中繁殖(或可以繁殖)的痘瘡載體轉形成在宿主細胞中實質上不具複製性的減毒痘瘡載體。在一個具體實例中，基本內源組裝或成熟基因選自由以下組成之群：COP-A2.5L、COP-A3L、COP-A4L、COP-A7L、COP-A8R、COP-A9L、COP-A10L、COP-A11R、COP-A12L、COP-A13L、COP-A14L、COP-A14.5L、COP-A15L、COP-A16L、COP-A17L、COP-A21L、COP-A22R、COP-A26L、COP-A27L、COP-A28L、COP-A30L、COP-A32L、COP-D2L、COP-D3R、COP-D6R、COP-D8L、COP-D13L、COP-E8R、COP-E10R、COP-E11L、COP-F10L、COP-F17R、COP-G1L、COP-G3L、COP-G4L、COP-G5R、COP-G7L、COP-G7L、COP-H1L、COP-H2R、COP-H3L、COP-H4L、COP-H5R、COP-H6R、COP-I1L、COP-I2L、COP-I6L、COP-I7L、COP-I8R、COP-J1R、COP-J4R、COP-J6R、COP-L1R、COP-L3L、COP-L4R及COP-L5R。

在一個較佳具體實例中，修飾包含D13L基因及/或K1L基因及/或A39R基因及/或B7R-B8R基因之缺失。

在另一較佳具體實例中，修飾包含D13L基因、A39R基因及B7R-B8R基因之缺失。

在第一態樣中，本發明提供一種用於在動物中產生免疫反應、從而降低屈公病與天花感染風險的組成物，該組成物包含醫藥學上可接受之載劑及減毒痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白的核酸序列。

在本發明之較佳形式中，減毒痘病毒選自由以下組成之群：痘瘡、牛痘、經修飾之痘瘡安卡拉(MVA)、NYVAC、鳥類痘、金絲雀痘及禽痘。較佳的是，減毒痘病毒為經修飾之正痘病毒，其中該修飾包含編碼內源實質組裝或成熟蛋白質之基因的缺失。更佳的是，該修飾包含D13L基因之缺失且較佳進一步包含K1L基因之缺失。

在某些具體實例中，醫藥學上可接受之載劑包含佐劑。較佳的是，佐劑選自由以下組成之群：氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁、羥磷灰石、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、Montanide®、弗氏不完全佐劑、免疫刺激複合物(iscoms)、免疫刺激複合物基質、ISCOMATRIX^TM佐劑、Matrix M^TM佐劑、Matrix C^TM佐劑、Matrix Q^TM佐劑、AbISCO®-100佐劑、AbISCO®-300佐劑、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、含有ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐劑、QS-21、QS-21衍生物，及含有QS-21或QS21衍生物的佐劑。

本文允用的各種具體實例進一步藉由以下非限制性實施例描述。

實施例1

構築策略之概述

構築SCV1002(單一載體化CHIK/ZIKA疫苗)之前，構築三種SCV病毒。藉由用CHIKV-26S表現卡匣與EGFP及Ecogpt表現卡匣一起置換痘瘡病毒哥本哈根病毒株之A39R ORF來構築SCV301C。藉由使來自SCV301C的EGFP及Ecogpt卡匣缺失來產生SCV302。接著藉由使來自SCV302的B7R-B8R ORF及D13L ORF缺失來產生SCV305(SCV-CHIK疫苗)。最後，藉由用ZIKV-prME表現卡匣置換SCV302之B7R-B8R ORF且使D13L ORF缺失來產生SCV1002(SCV-CHIK/ZIKA疫苗)。

構築SCV301C(VACV-CHIK)

描述

SCV301C(CHIKV-26S)中之屈公病疫苗抗原表現卡匣由以下元件之線性陣列組成：˙痘瘡早期/晚期啟動子，˙毒性Reunion病毒株06_21痘病毒之26S次基因體多蛋白的CHIKV蛋白質編碼序列，˙及痘病毒早期轉錄終止序列。

CHIKV 26S次基因體多蛋白當表現時將加工成形成病毒粒子所必需的個別結構基因。由於完整CHIKV基因體不存在且次基因體RNA不含有5'UTR及3'UTR，因此所轉錄的病毒RNA本質上不封裝成新形成的病毒粒子，僅26S次基因體多蛋白之表現將產生缺乏病毒基因體RNA之病毒樣粒子(VLP)。疫苗接種後引起VLP形成之次基因體多蛋白之活體內表現將有利於中和抗體刺激，一種抵抗CHIKV之預防性疫苗接種之關鍵相關免疫。

CHIKV-26S表現卡匣中之26S次基因體多蛋白之胺基酸序列獲自毒性Reunion病毒株，其在遺傳上變化以拓寬其針對新蚊子載體(基因庫，寄存編號：AM258992)的宿主範圍。Reunion在2005年與2006年之間流行期間，病毒發生突變已使其載體宿主範圍拓寬至亞洲虎蚊(白紋伊蚊)。亞洲虎蚊為全世界散播最快的蚊子。其經充分調適可圍繞人類生存且已知可在用過之輪胎中行進。其已發現於幾乎全世界的鄉村及綠色市區，且為人類、家養及野生動物以及鳥類之侵襲性日間叮咬者。此蚊子具有全世界散播屈公病的潛力。為了獲得尚未發現的痘病毒早期轉錄基元「TTTTTNT」，篩選CHIKV-26S蛋白質編碼序列之最終核苷酸序列設計。緊接著終止密碼子之後添加痘病毒早期轉錄終止序列TTTTTAT。上述 CHIKV-26S表現卡匣之序列以SEQ ID NO：1明示。

為了產生SCV301C，由GeneArt有限公司合成由以下組成的同源重組卡匣：CHIKV-26S表現卡匣、增強型螢光綠色蛋白質表現卡匣、Ecogpt表現卡匣，其皆與靶向同源重組之VACV-COP A39R ORF之上游及下游序列之同源重組左臂及右臂側接，如下述圖1及圖2中所示。表1列舉了SCV301A同源重組卡匣之特徵且序列詳情提供於SEQ ID NO：2中。

藉由將CHIKV-26S同源重組卡匣插入痘瘡病毒哥本哈根病毒株(VACV-COP)中、藉由F1與F2之間同源重組的A39R ORF用其具有VACV-COP基因體之同源序列置換來構築SCV301A，如上圖2中所示，其產生圖3中所示之插入組態。

方法學

藉由用GeneArt有限公司合成的CHIKV-26S同源重組卡匣置換VACV之A39R ORF的同源重組來構築SCV301C(VACV-CHIKV)，該CHIKV-26S同源重組卡匣由以下組成：在VACV啟動子控制下之表現CHIKV 26S結構多蛋白之痘病毒表現卡匣(基因庫寄存編號：AM258992)(Chakrabarti 等人，1997)，以及用於表現大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)之痘病毒表現卡匣。同源重組及含有Ecogpt表現卡匣之共插入之重組病毒的正向選擇係如Smith(1993)之方案6中所述且如Falkner等人(1988)及Boyle等人(1988)中所公開來進行，其中側接CHIKV-26S及Ecogpt表現卡匣的同源重組臂經設計以與側接A39R ORF的序列同源。簡言之，在BHK21細胞中進行同源重組，該等BHK21細胞以0.01pfu/細胞之感染倍率用VACV-COP感染1小時，隨後用CHIKV-26S同源重組卡匣轉染。經感染/轉染的細胞接著培育2至3天直至可以發現總體細胞病變效應，隨後進行收穫及細胞溶解，以製備病毒萃取物。如Smith(1993)之方案6中所述，藉由Ecogpt藥物選擇、對BHK21細胞使用MXHAT處理來對SCV301C進行正向選擇，但其中進行20輪藉由在48WP中進行有限稀釋之斑塊純化以排除痕量的親代VACV-COP，如藉由A39R特異性PCR分析所評估。接著在不進行MXHAT處理的情況下，在BHK21細胞中擴增候選純系，以製備疫苗接種研究所用之各批SCV301C所來源的病毒種儲備液。SCV301C基因體序列以SEQ ID NO：3明示。

參考文獻：

Chakrabarti, S, Sisler, JR 及 Moss, B (1997). Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23: 1094-1097.

Smith, GL (1993) 於: Davison, AJ 及 Elliotand, RM (編). Expression of genes by vaccinia virus vectors in "Molecular Virology a Practical Approsch". IRL Press, 位於 Oxford University Press.

Falkner, FG, 及 Moss, B (1988). Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J Virol 62: 1849-1854.

Boyle, DB, 及 Coupar, BE (1988). A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses. Gene 65: 123-128.

構築SCV305(SCV-CHIK)

EGFP/Ecogpt報導子卡匣之缺先，以產生SCV302

描述

為了構築SCV305，需要使SCV301C中之EGFP及Ecogpt表現卡匣缺失，以產生SCV302：僅含插入A39R ORF中之屈公病26S多蛋白表現卡匣的重組痘瘡病毒哥本哈根病毒株。此病毒如下構築：藉由與pTC29同源重組而使SCV301C中的Ecogpt/EGFP報導子表現卡匣缺失且逆向選擇具有功能性Ecogpt表現之病毒，如下文在圖4中所示。

pTC29之描述

pTC29為含有同源重組臂A39R-F1及SCV301C-F2的質體純系，其為藉由同源重組而使SCV301C中之EGFP及Ecogpt表現卡匣缺失所必需的，如圖4中所示。pTC29之序列詳情以SEQ ID NO：4明示且質體圖譜描繪於圖5中。

方法學

如Smith(1993)之方案7中所述且如Isaacs等人(1990)中所公開，藉由同源重組及針對Ecogpt表現之逆向選擇而自SCV301C中移除Ecogpt及EGFP表現卡匣，其中同源重組臂經設計以與側接重組VACV-CHIK基因體內之Ecogpt及EGFP表現卡匣之序列同源。同源重組之後，進一步在6- 硫鳥嘌呤(6-TG)存在下對hrpt細胞系中的SCV302進行斑塊純化，以針對表現Ecogpt之污染病毒(亦即原始SCV301C)進行逆向選擇。

參考文獻

Smith, G.L. (1993). Expression of genes by vaccinia virus vectors. 於 Molecular Virology a Practical Approach, A.J. Davison 及 R.M. Elliotand 編, (IRL Press, 位於 Oxford University Press), 第257-283頁.

Isaacs, S.N., Kotwal, G.J., 及 Moss, B. (1990). Reverse guanine phosphoribosyltransferase selection of recombinant vaccinia viruses. Virology 178, 626-630.

B7R-B8R及D13L之缺失，以產生SCV305

描述

藉由與D13L缺失同源重組(HR)卡匣(經由反式顯性CP77/DsRed選擇而使D13L缺失)及B7R-B8R缺失同源重組(HR)卡匣(經由青色/吉歐黴素反式顯性選擇而使B7R-B8R缺失)發生單一同源重組反應而自SCV302中同時移除D13L與B7R-B8R ORF來構築SCV305。各卡匣之組態詳情描繪於圖6及7中且序列詳情明示於SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6中。

為了選擇具有D13L缺失之病毒，使用表現D13蛋白質之細胞系：CHO+D13(表現D13蛋白質之CHO細胞系)及CHO+D13+CP77(表現D13蛋白質及CP77蛋白質之CHO細胞系)。使用此兩種細胞系之原因在於，病毒表現CP77實現了在CHO細胞中的繁殖且因此用作正向選擇工具。用CP77/DsRed表現卡匣置換D13L ORF實現了D13L缺失病毒在CHO-D13細胞中的擴增，此可以藉由經感染細胞之紅色螢光驗證。確認D13L缺失之後，為了使CP77/DsRed報導子卡匣缺失，設計分子內重組以便在CP77之病毒表現不再需要時使此卡匣缺失。此如下進行：在不僅表現D13蛋白質、而且表現CP77蛋白質的CHO+D13+CP77中擴增D13L缺失病毒，從而使得病毒表現之CP77冗餘，且允許藉由分子內重組實現其移除，如圖4中所說明。

為了選擇具有B7R-B8R缺失的病毒，使用吉歐黴素抗性/青色螢光報導子卡匣、藉由同源重組置換此等ORF。藉由在感染期間用吉歐黴素培養細胞且選擇青色螢光細胞來對吉歐黴素/青色卡匣之插入進行正向選擇。B7R-B8R缺失一經確認，則在感染期間、在吉歐黴素不存在下開始藉由分子內重組移除此報導子，如圖8中所說明。

使D13L與B7R-B8R同時缺失之實驗策略如下進行：(i)使具有D13L缺失卡匣及B7R-B8R HR卡匣的SCV302在CHO+D13細胞中同源重組；(ii)在經吉歐黴素處理之CHO+D13細胞中擴增SCV305；(iii)個別地分離出共同發出青色與紅色螢光之經感染細胞直至分離出單純雙基因剔除之純系；且接著(iv)藉由在不進行吉歐黴素處理的情況下感染CHO+D13+CP77細胞及分離出無螢光(就青色及紅色而言)之經感染細胞來起始兩種報導子卡匣之移除。

藉由PCR及定序分析來確認經鑑別不含污染病毒中間物的純系，該等污染病毒中間物中之目標ORF缺失。藉由PCR及定序分析進一步確認CHIKV-26S表現卡匣於A39R ORF內之存在且藉由西方墨點分析來確認CHIKV蛋白質之表現。藉由感染性研究驗證SCV305在痘瘡病毒容許性細胞系中的總減毒。

方法學

D13缺失HR與B7R-B8R缺失HR卡匣均由GeneArt有限公司合成。為了產生SCV305(SCV-CHIK)，藉由同源重組使SCV302中之D13L ORF及B7R-B8R ORF缺失，其中藉由在吉歐黴素存在下感染僅表現D13蛋白質之CHO細胞(CHO-D13)來進行達成成功缺失之正向選擇。由於CHO不容許VACV感染，因此藉由編碼牛痘病毒CHO宿主範圍蛋白質CP77之表現卡匣置換D13L ORF來達成針對D13L缺失病毒之正向選擇。構築由以下組成之同源重組質體：CP77表現卡匣以及與重組左臂及右臂側接之dsRed螢光蛋白表現卡匣，該等重組臂與側接SCV302內之D13L ORF的序列同源。由於VACV表現CP77未使CHO形成溶胞斑，因此添加dsRed表現卡匣；因此，根據紅色螢光之存在來監測感染。為了有助於移除已置換D13L ORF之CP77及dsRed表現卡匣以及置換B7R-B8R ORF之AmCyanZeo表現卡匣，將同源重組左臂之重複序列置放於CP77及dsRed表現卡匣下游以及AmCyanZeo表現卡匣下游，但位於兩種同源重組卡匣內之同源重組右臂之上游。藉由將D13L及B7R-B8R缺失性同源重組卡匣以0.01PFU/細胞之感染倍率轉染至預先經VACV-CHIK感染之CHO-D13中來進行同源重組。經由同源重組感染、藉由在經吉歐黴素處理之CHO-D13中擴增病毒來富集SCV305，隨後用擴增之病毒感染一組經吉歐黴素處理之新鮮CHO-D13細胞。回收此等經感染之細胞且藉由TrypLE Select消化(Thermo Fisher Scientific)製成單一細胞懸浮液且接著使用FACSAria Fusion流式細胞儀(BD Biosciences)分選單一細胞，以便將一個紅色及青色螢光細胞接種至96孔盤之1個孔中，該孔含有經吉歐黴素處理之經培養CHO-D13細胞。接著在37℃/5% CO2下培育經紅色/青色螢光細胞接種之96孔盤，直至可以在96孔盤之任一孔中發現紅色及青色螢光感染焦點。收穫含有單一感染焦點之孔且再懸浮成單一細胞懸浮液，隨後分選單一細胞且接種至含有經吉歐黴素處理之新鮮CHO-D13細胞之96孔盤中。此單一細胞分選過程重複五次以排除具有原始SCV302之痕量污染且產生純系SCV305。多種經純系純化之SCV305候選物在經吉歐黴素處理之CHO-D13細胞中擴增且接著藉由PCR 分析來測試污染性SCV302之存在且確認CP77及dsRed表現卡匣對D13L的置換及AmCyanZeo表現卡匣對B7R-B8R的置換。接著在CHO+D13+CP77細胞系(表現CP77與D13蛋白質)中擴增最佳純系，以促進同源重組左側序列與重複序列之間的分子內重組，原因是CP77之病毒表現之依賴性不再是必需的且抗吉歐黴素蛋白質表現之需要在吉歐黴素不存在下不再是必需的，從而使得CP77及dsRed表現卡匣以及AmCyanZeo表現卡匣自SCV305中缺失。藉由TrypLE Select消化且使用FACSAria Fusion流式細胞儀分選細胞而使經感染之CHO+D13+CP77細胞形成單一細胞懸浮液，其中非螢光細胞經成批分選且保留。藉由CHO+D13+CP77細胞之漸進式擴大感染來進一步擴增SCV305病毒以製備種子儲備液。SCV305之完整基因體序列以SEQ ID NO：7明示。

SCV1002(SCV-CHIK/ZIKA)之構築

描述

SCV1002為一種由以下特徵組成之單一載體化多價屈公病及茲卡病毒疫苗：

˙A39R ORF經SCV-CHIKV-26S次基因體表現卡匣(CHIKV-26S)置換

˙B7R-B8R ORF經SCV-ZIKV-prME表現卡匣置換

˙D13 ORF缺失

藉由茲卡病毒prME多蛋白表現卡匣置換SCV302之B7R-B8R ORF且使D13L ORF缺失來構築SCV1002。茲卡病毒prME表現卡匣之序列詳情以SEQ ID NO：8明示，其中prME序列起點獲自巴西病毒株 ZikaSPH2015(基因庫：KU321639)。如圖9中所示藉由GeneArt合成ZIKV-prME同源重組(HR)卡匣，其中序列詳情以SEQ ID NO：9明示。

方法學

藉由ZIKV prME(巴西分離株ZikaSPH2015，基因庫：KU321639)之痘病毒表現卡匣置換B7R-B8R ORF且藉由同源重組使D13L ORF缺失來構築SCV1002(SCV-CHIK/ZIKA)。藉由置換B7R-B8R ORF來插入ZIKV prME表現卡匣時，由GeneArt有限公司合成由以下元件組成之同源重組卡匣：(i)B7R基因上游之F1同源重組靶向序列；(ii)由痘瘡病毒早期/晚期啟動子組成之表現卡匣，該啟動子可操作地連接至螢光藍色蛋白質與抗吉歐黴素蛋白質融合物(BFPzeo)且終止於痘病毒早期轉錄終止序列；(iii)F1同源重組臂之重複；(iv)由痘瘡病毒早期/晚期啟動子組成之表現卡匣，該啟動子可操作地連接至ZIKV prME之蛋白質編碼序列，繼之為痘病毒早期轉錄終止序列；及最後(v)B8R基因下游之F2同源重組靶向序列。如SCV305(SCV-CHIK)之構築中所述來移除D13L ORF。

藉由將ZIKV prME HR卡匣與D13L缺失型HR以0.01PFU/ 細胞之感染倍率轉染至預先經SCV302感染之CHO+D13細胞中來進行同源重組。經由同源重組感染，藉由在CHO+D13細胞中、在吉歐黴素(ThermoFisher Scientific)存在下擴增病毒、隨後在吉歐黴素存在下用擴增之病毒二次感染一組新鮮CHO+D13細胞來富集所得SCV1002。回收此等經感染之細胞且藉由TrypLE Select消化來製成單一細胞懸浮液且接著使用FACSAria Fusion流式細胞儀(BD Biosciences)分選單一細胞，以便將單一藍色及紅色螢光細胞接種至含有CHO+D13細胞之96孔盤之一個孔中。在吉歐黴素存在下培育之後，收穫含有單一藍色及紅色螢光感染焦點之孔且再懸浮為單一細胞懸浮液，隨後分選單一細胞且接種至含有新鮮CHO+D13細胞之96孔盤中。此單一細胞分選及在吉歐黴素存在下的培養重複五次以排除具有原始SCV302之痕量污染且產生純系SCV1002。若干個經純系純化之SCV1002在CHO+D13+CP77細胞中、在吉歐黴素不存在下擴增且接著進行PCR分析，以確認ZIKV prME插入B7R-B8R基因座中、CHIK表現卡匣滯留於A39R基因座中，及污染性SCV302之缺乏。在CHO+D13+CP77細胞中、在吉歐黴素不存在下擴增純系，以促進F1同源重組序列與F1重複序列之間的分子內重組，從而使BFPzeo與DsRed/CP77表現卡匣均缺失。對此等培養物之單一細胞懸浮液成批分選(FACSAria)且保留無螢光細胞。重複PCR以確認插入序列之保留及BFPzeo、DsRed/CP77之損失及D13L ORF之缺失。製備CHO-D13+CP77細胞之SCV1002疫苗儲備液且滴定。完整SCV1002基因體序列以SEQ ID NO：10明示。

實施例2

SCV305疫苗接種防禦ECTV

各組6-8週齡雌性C57BL/6小鼠(每組n=5隻小鼠)腹膜內接種疫苗SCV305(10⁵、10⁶、10⁷PFU)或接種假疫苗PBS。藉由終點ELISA來測定抗痘瘡病毒特異性IgG含量。發現接種疫苗SC305可得到實質上特異性抗痘瘡病毒抗體，此與接種相似劑量之痘瘡病毒(VACV)所達成的相似。

四週之後，用致死劑量(50 LD₅₀)之鼠痘病毒白鼠脫腳病(ECTV)攻擊小鼠。ECTV對小鼠具有高度感染性且使得小鼠出現的症狀與天花在人體中引起的症狀相同。

接種10⁷、10⁶及10⁵PFU SCV305或10⁵PFU VACV的小鼠展現相似之防禦體重減輕、臨床症狀及死亡之程度。在所有接種疫苗的小鼠中亦防止ECTV擴散至多個器官。此等結果說明，SCV305之單一疫苗接種可以完全防禦致死性痘病毒攻擊，表明SCV保持作為天花疫苗之效用。

SCV305單一疫苗接種產生穩固且耐久的抗屈公病病毒抗體反應

抗體被認為對於防禦屈公病病毒(CHIKV)而言具有關鍵作用，其中人類及小鼠抗體針對所示CHIKV之E2表面醣蛋白以介導保護作用。給予小鼠單次劑量之疫苗(10⁵、10⁶及10⁷PFU之SCV-CHIK)且藉由ELISA檢查CHIKV E2特異性IgG反應。觀測到CHIKV-E2特異性IgG含量出現劑量及時間依賴性增加，其中給予10⁷PFU之小鼠展示的動力學及抗體反應程度與複製勝任型VACV-CHIK接種小鼠所誘導的相似。此說明了增殖缺陷型SCV305疫苗能夠產生與增殖勝任型VACV-CHIK疫苗類似的針對重組免疫原之抗體反應。

在接受10⁵PFU之SCV305疫苗的4/6小鼠中偵測到中和抗體反應，而接受10⁶PFU及10⁷PFU之SCV305疫苗的所有6隻小鼠均產生中和抗體反應。

疫苗接種後30天，檢查小鼠血清之CHIKV特異性IgG1及IgG2c含量，得到抗體反應之『Th1/Th2平衡』示值。在10⁷PFU下，SCV305刺激的IgG2c反應類似於VACV-CHIK所誘導之反應。然而，SCV305誘導之IgG1反應高於VACV-CHIK，表明SCV-CHIK產生更平衡之Th1(IgG2c)/Th2(IgG1)反應，其中VACV-CHIK更偏向Th1。

為了分析SCV-CHIK疫苗所誘導之抗體反應耐久性，在疫苗接種後的第4週、6個月及1年檢查抗CHIKV抗體反應。在此時間段期間觀測到抗CHIKV抗體含量發生有限的降低，其中在整個期間、在SCV305與VACV-CHIK接種之小鼠之間，抗體含量仍類似。另外，在疫苗接種後1年，偵測到SCV305及VACV-CHIK接種之小鼠中存在CHIKV E2特異性抗體分泌型細胞(ASC)及CHIKV E2/E1及衣殼特異性IFN-γ產生細胞。

疫苗接種CHIKV攻擊模型的試驗證明，接種VACV-CHIK(10⁷PFU)且用CHIKV(Reunion Island分離株；LR2006-OPY1，10⁴CCID₅₀)攻擊的小鼠完全防禦病毒血症及關節痛。由於SCV-CHIK疫苗在相同的10⁷PFU劑量下誘導的中和抗體反應類似於VACV-CHIK，因此評估SCV305疫苗在較低劑量(10⁵及10⁶PFU)下之保護功效。接種10⁶PFU SCV305且在隨後40天攻擊(使用Reunion Island分離株；LR2006-OPY1，10⁴CCID₅₀)的小鼠未展示可偵測的病毒血症或足腫脹。接種低10倍劑量(10⁵PFU)之小鼠受到部分保護，其中相較於VACV感染之對照小鼠，病毒血症出現約4-log減輕且足腫脹顯著減小。耐久性研究證明接種SCV305之小鼠在疫苗接種後一年防禦CHIKV攻擊。

CHIKV基因體RNA之持久性(尤其在關節組織中)已與CHIKV感染人體及小鼠模型之後的慢性關節炎疾病相關。在攻擊後30天，接種10⁶PFU之SCV305疫苗的小鼠之持久性病毒RNA含量相對於背景含量出現顯著降低，此說明SCV305疫苗接種可以防止關節組織中建立持久性CHIKV RNA。

綜合而言，此等發現證明SCV305疫苗能夠誘發穩固、平衡且耐久的CHIKV特異性抗體反應，且提供針對病毒血症、急性關節炎之保護作用及CHIKV攻擊之後之病毒RNA之持久性。

實施例3

SCV1002疫苗接種

當合併不同的活減毒病毒疫苗時，病毒之間的競爭為最頻繁觀測到之問題。此問題可以如下規避：增加組合疫苗劑量或調整各種疫苗組分之劑量以克服來自主要疫苗組分之競爭。

已報導三價白喉-百日咳-破傷風疫苗之組分之間、犬瘟熱菌苗與活犬瘟熱病毒之間且當博德氏桿菌用作活組合犬瘟熱病毒、2型腺病毒、小病毒與副流感病毒疫苗之稀釋劑時存在『免疫學干擾』所致之抗原競爭(Hunt等人，2001)。在此等實施例中，接種多組分疫苗引發的抗體比各組分單獨投予時少。在一些情況下，對一種抗原的反應佔優勢，而對其它抗原的反應受到遏制。在發生相互競爭的其他情況下，對所有組分的反應減少。

抗原競爭程度已表明可依賴於疫苗接種之多種參數，包括競爭抗原之相對接種位點、各抗原投予之間之時間間隔以及主導抗原相對於受遏制抗原之劑量。

儘管以上可以藉由利用同一載體(藉此確保各種免疫抗原同等呈現至免疫系統)及利用僅用於遞送抗原之單一載體(僅需考慮的載體疫苗接種之最佳路徑)表現來自若干致病媒介物之免疫抗原來解決，仍存在可能因優先抗原捕獲及抗原呈遞細胞(諸如B細胞及樹突狀細胞)呈遞MHC而發生抗原干擾的風險。具有主導B細胞及/或T細胞抗原決定基的抗原所產生的免疫反應比具有次最佳B細胞及/或T細胞抗原決定基之抗原更強。因此，當接種表現來自多種致病媒介物之多種抗原的單一載體時，此會引起偏向最主導抗原之免疫反應。預期亦表現來自其他疾病之其他抗原之載體所表現之抗原(例如與茲卡病毒抗原一同表現的屈公病抗原)所產生的免疫反應可能不比僅表現屈公病抗原的免疫載體強。

為了確定來自多種致病病毒之多種主導抗原之表現是否干擾彼此之免疫反應，進行研究。舉例而言，屈公病E2蛋白質非常有力地刺激可以中和屈公病感染的極佳中和抗體反應。同樣，茲卡病毒E蛋白質亦刺激可中和茲卡病毒感染的有力中和抗體反應。然而，利用同一載體表現這兩種主導抗原可能干擾彼此間刺激針對其相應病毒之強免疫反應的能力，亦即，一種主導抗原可以具有強於另一者的更多優勢。

為了確定利用同一載體表現多種主導抗原相較於利用單一載體表現各種主導抗原無損於刺激最佳免疫反應，用小鼠進行疫苗接種研究，在屈公病特異性中和抗體之刺激方面對SCV1002(CHIK/ZIKA疫苗)與SCV305(CHIK疫苗)進行比較。

疫苗接種策略：

在每個處理組6隻小鼠的群組中，用單一載體化CHIKV/ZIKV疫苗(SCV1002)、單獨CHIKV(SCV305)或空載體對照物(SCV105)接種野生型C57BL/6及干擾素受體缺乏型(IFNAR)雌性小鼠一次。所有處理組均經由腹膜內注射給予每隻小鼠10⁶pfu疫苗且在疫苗接種後第2及4週抽血。所有小鼠在疫苗接種後第6週攻擊。

中和分析：

中和抗體含量通常用作保護關聯參數。因此，攻擊所有疫苗組(ZIKV/CHIKV(SCV1002)、單獨CHIKV(SCV305)或空載體對照物(SCV105))之前，通過對針對屈公病Reunion病毒株之Vero細胞使用標準微中和分析來計算中和抗體含量。簡言之，血清經熱滅活(56℃維持30分鐘)，得自各小鼠之血清在96孔盤中雙重複連續稀釋且與100CCID₅₀單位之病毒一起培育且在37℃下培育1小時。在此中和步驟之後，將新鮮分離的Vero細胞覆加(每孔10⁴個細胞)至血清/病毒混合物上且培育5天直至在顯微鏡下目測到細胞病變效應。使用結晶紫染色測定得到針對細胞病變效應之100%保護作用的血清稀釋液。

結果

單次投予疫苗之後，表現CHIKV抗原之疫苗候選物均誘導針對屈公病病毒之中和抗體。

然而，單次投予單一載體化CHIK/ZIKA疫苗誘導高得多的CHIKV中和抗體含量，儘管用於疫苗接種的劑量相等。

結論

此疫苗接種研究表明，當小鼠接種單次注射之相等劑量之SCV305(單獨CHIK疫苗)及SCV1002(單一載體化CHIK/ZIKA疫苗)時，單一載體化疫苗(SCV1002)得到更佳的屈公病特異性中和抗體反應。此出人意料，原因在於認為另一種主導抗原(亦即茲卡病毒E蛋白質)之表現會競爭免疫反應且因此減弱或降低針對屈公病(E2抗原，中和抗體之目標)與茲卡病毒(E抗原，中和抗體之目標)之兩種主導抗原的免疫反應。情況似乎並非如此且可以推測出茲卡病毒抗原之表現具有有助於增強屈公病抗原免疫反應的輔助作用，該免疫反應預期為疫苗接種後屈公病VLP所產生的。

保護小鼠胎兒以防母親茲卡病毒感染，該母親在懷孕之前預先接種SCV1002

美洲及亞洲正在爆發之茲卡病毒主要併發症為病毒引起之先天性缺陷，該病毒能夠跨越胎盤且感染胎兒腦。Setoh等人(2017,De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case.mSphere 2：e00190-17.https：//doi.org/10.1128/mSphereDirect.00190-17)描述一種小鼠模型，其中可以使用ZIKV-Natal病毒株在IFNAR-/-小鼠(包括子宮內生長限制)中建立胎兒腦感染模型，但在障壁中不會引起有症狀的感染。

此研究之目的為表明，雌性小鼠在懷孕之前預先接種SCV1002(單一載體化ZIKA/CHIK)可以向其未出生的胎兒提供針對茲卡病毒感染之保護作用。

此研究藉由向雌性IFNAR-/-接種SCV1002(單一載體化 CHIK/ZIKA疫苗)或SCV105(單獨載體)、隨後與雄性IFNAR小鼠交配來進行。懷孕小鼠接著用初生兒茲卡病毒病毒株感染，如Setoh等人(2017)所述。

疫苗接種時程：

˙六至八週齡雌性干擾素受體缺乏小鼠(IFNAR-/-)在第0週經由肌肉內路徑接種單一載體化疫苗ZIKV/CHIKV(SCV1002)或空對照疫苗(SCV105)一次，每隻小鼠10⁶

˙各組小鼠在疫苗接種後第4週抽血，以檢驗疫苗之血清轉化

˙在疫苗接種後第6週，起始定時交配以誘導接種小鼠懷孕。每天檢驗雌性小鼠成功懷孕之證據(陰道柱塞)

˙在胚胎日第6.5日，懷孕小鼠經由皮下感染途經感染10⁴CCID50單位之初生兒茲卡病毒株

感染之後，懷孕小鼠在第1至5天之間每天抽血以檢驗病毒血症

˙在胚胎日第17.5日，揀選懷孕小鼠，收穫母體胎盤及胎兒頭以評估感染性ZIKV，如Setoh等人(2017)所述。

結果

懷孕之前預先接種SCV1002(CHIK/ZIKA疫苗)的懷孕雌性小鼠能夠在初生兒茲卡病毒病毒株攻擊期間防止茲卡病毒複製，如攻擊後未偵測到病毒血症所表明。然而，正如所預期，接種SCV105(單獨SCV載體)的小鼠不能夠防止茲卡病毒之病毒複製，如攻擊之後的前5天中所發現的高水準病毒血症所表明。

交配及懷孕之前預先接種單次注射SCV1002(CHIK/ZIKA 疫苗)之雌性小鼠在攻擊之後，在其胎盤中及在胎兒腦中無可偵測含量之茲卡病毒。疫苗接種防止攻擊病毒感染胎盤且藉此阻斷茲卡病毒向前傳送至脆弱胎兒。

然而，對於預先接種單獨SCV載體的雌性小鼠而言，情況並非如此，其中在攻擊之後，在懷孕期間，一些胎盤被感染且茲卡病毒感染傳送至胎兒之一些腦中。

結論

相較於對照疫苗，預先接種單次注射之CHIK/ZIKA單一載體化疫苗的懷孕雌性小鼠可以預防ZIKV攻擊，如根據病毒血癥結果所表明。

母親在懷孕之前接種疫苗可以藉由防止茲卡病毒攻擊病毒感染母體胎盤及阻斷向前傳送至胎兒腦而向其未出生的胎兒提供保護。

此等結果在此臨床前模型中證明，茲卡攻擊病毒向前傳送至胎兒可以藉由母親在懷孕之前預先接種疫苗來阻斷。

SCV1002向小鼠提供針對羅斯河病毒(Ross River Virus)致死性攻擊的保護

屈公病(CHIKV)屬於α病毒群組，其中該群組中之另一成員為羅斯河病毒(RRV)。RRV在澳大利亞之北部及中部以及太平洋地區為區內流行病。RRV及CHIKV藉由蚊子傳播且均可引起多發性關節炎且在人體中引起持久性感染。然而，屈公病病毒之蚊子載體為埃及伊蚊及白紋伊蚊，而羅斯河病毒之主要蚊子載體為兩種鹽沼繁殖蚊：康托伊蚊(Aedes camptorhynchus)及維吉伊蚊(Aedes vigilax)，以及淡水繁殖蚊：環喙庫蚊 (Culex annulirostris)。

用RRV容易致死的小鼠品系(IRF3/7基因剔除)進行疫苗接種研究，以確定SCV1002之屈公病疫苗抗原是否可以在SCV1002(CHIK/ZIKA疫苗)接種後六週提供針對RRV致死性攻擊之充分保護。

實驗設計

用對屈公病與羅斯河病毒感染均敏感的IRF3/7基因剔除小鼠進行此疫苗接種及攻擊研究，其中此等病毒之感染對此小鼠品系具致死性。

兩組IRF3/7^-/-小鼠經由肌肉內路徑接種單次注射之每隻小鼠10⁶pfu之SCV1002(單一載體化CHIK/ZIKA疫苗)或SCV105(單獨SCV載體)。

疫苗接種後第6週，所有小鼠如Rudd等人(2012)所述經由足頂皮下路徑接受10⁴CCID₅₀之羅斯河病毒(病毒株TT)攻擊。

在攻擊後的30天期間，監測攻擊所致之存活率。當臨床症狀達到倫理學定義的端點(如Rudd等人(2012)Interferon Response Factors 3 and 7 Protect against Chikungunya Virus Hemorrhagic Fever and Shock.J.Virol.,86(18)：9888-9898))時，使小鼠安樂死。

結果

發現IRF3/7^-/-接種SCV1002而非SCV105可提供針對RRV致死性攻擊之充分保護。這證明SCV-CHIK/ZIKV疫苗(SCV1002)對α病毒屬中之其他病毒具有交叉保護作用。

接種SCV1002之IFNAR ^-/- 小鼠用ZIKV攻擊，接著用CHIKV攻擊

經由腹膜內注射，向各組6隻大於6週齡成年雌性小鼠注射每隻小鼠10⁶pfu SCV1002、SCZ305或SCV105(SCV空載體)。疫苗接種之後，監測小鼠的任何不良影響。

疫苗接種後第六週，各組小鼠經由皮下注射至尾基部而用每隻小鼠10³CCID₅₀之小鼠適應型非洲茲卡病毒株MR766攻擊。

茲卡病毒攻擊後第六週，存活組小鼠經由皮下注射至足頂而用每隻小鼠10⁴CCID₅₀之屈公病病毒La Reunion病毒株(LR2006-OPY1)攻擊。

結果

接種SCV1002(單一載體化CHIK+ZIK疫苗)之小鼠完全防禦茲卡病毒攻擊，然而接種SCV305(單獨CHIK疫苗)及SCV105(單獨載體)之小鼠在感染後第9天屈服於茲卡病毒感染。

接種SCV1002(單一載體化CHIK+ZIK疫苗)之IFNAR^-/^-小鼠首先用ZIKV攻擊且在部分保護的情況下存活，亦即，33%有效針對CHIKV之極具致死性的攻擊，該CHIKV能夠在攻擊後第3天殺死所有未接種疫苗的小鼠。

結論

INFAR^-/-小鼠每隻小鼠接種10⁶pfu之單次劑量之SCV1002提供針對茲卡病毒之小鼠適應型病毒株之致死性攻擊的完全保護。

隨後經極具致死性劑量之CHIKV攻擊的存活小鼠受到部分保護，亦即，SCV1002疫苗在此小鼠模型中、在每隻小鼠10⁴感染單位下具有針對CHIKV感染之33%有效性。10⁴感染單位之攻擊劑量對於缺乏干擾素受體且因此不能以抗病毒模式對干擾素作出反應之此免疫受損小鼠模型而言過高。抗病毒干擾素之產生通常會控制初始感染，而適應性免疫反應有時間對侵入之病毒感染作出反應。就事後而言，此小鼠模型中用於CHIKV攻擊之此劑量過高，因為其在3天內殺死所有未接種疫苗的小鼠，3天對於為了控制及清除侵入性病毒感染而發生之抗病毒回憶性抗體反應的時間範圍而言過短。在天然情形中，抗病毒干擾素會控制初始病毒感染足夠長的時間，以便適應性免疫反應接管及中和及清除宿主中之感染。儘管CHIKV在IFNAR小鼠中之毒力水準不合乎自然規律得高(其中未接種疫苗的小鼠在10⁴感染單位之劑量感染後第3天被殺死)，接種SCV1002出乎意料地能夠在此極端條件下提供一些保護作用，從而突出顯示了此疫苗之高免疫原性效能。

CHIKV感染，隨後為SCV1002疫苗接種

此研究之目的為在天然感染之背景下評估抗原干擾或抗原原罪。先前天然感染屈公病病毒會影響針對茲卡病毒之免疫反應的誘導，而在接種SCV1002(SCV-CHIK/ZIKA疫苗)之後出現疫苗誘導之針對屈公病的增強反應。

野生型C57BL/6小鼠經屈公病病毒感染，允許其清除病毒且接著用單一載體化CHIKV/ZIKV疫苗增強免疫。小鼠在疫苗增強免疫之前及在疫苗接種之後第4週抽血，以評估抗CHIKV及抗ZIKV抗體反應之水準。

各組6隻大於6週齡成年雌性小鼠經由皮下感染至足頂部來注射每隻小鼠10⁴CCID₅₀屈公病病毒La Reunion病毒株(LR2006-OPY1)。感染之後監測小鼠之任何不利影響且在感染之後第8週、在疫苗接種之前抽血。

感染後第八週，小鼠用單一載體化CHIKV/ZIKV疫苗(SCV1002)增強免疫，每隻小鼠腹膜內遞送10⁶pfu。監測小鼠在疫苗接種之後的任何不良影響且在疫苗接種之後四週，再次對小鼠抽血以比較疫苗接種之前與之後的抗CHIKV及抗ZIKV抗體含量。

發現先前暴露於CHIKV感染之野生型小鼠接種SCV1002可誘導抗ZIKV抗體的含量與先前不發生CHIKV感染所發現的含量相似。

抗原原罪為一種現象，其中暴露於一種抗原可以抑制第二抗原誘導保護性免疫反應的能力。表明此概念背後之機制涉及對第一抗原預致敏的B細胞，該機制經程式化可對第一抗原單獨作出反應。當引入第二抗原時，此等B細胞基本上在可以產生富有成效的免疫反應之前移除第二抗原，導致免疫力極低或不良。在此研究中測試此概念。

然而，由於先前經屈公病病毒感染且接著接種CHIKV/ZIKV疫苗之小鼠能夠誘導與先前無CHIKV感染情況下所發現相似之富有成效的CHIKV及ZIKV免疫反應，因此抗原原罪在此環境中不起作用。這很可能是因為CHIKV及ZIKV為來自兩個不同病毒科之極其不同的病毒。此資料表明雙重疫苗可以用於已知CHIKV先前流行的國家。

保護雄性小鼠以防茲卡病毒感染

茲卡病毒仍為亦可經由性傳播的唯一蚊傳播病毒。茲卡病毒可以自雄性傳播至雌性或自雄性傳播至雄性且該病毒已顯示在症狀發作之後，可在精液中存留長達若干個月。

此研究之目的為表明接種疫苗SCV1002(單一載體化ZIKA/CHIK)可以向雄性小鼠提供針對茲卡病毒感染之保護作用。

如下進行此研究：雄性IFNAR-/-接種SCV1002(單一載體化CHIK/ZIKA疫苗)或SCV105(單獨載體)，隨後用初生兒茲卡病毒病毒株感染，如Setoh等人(2017)(De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case.mSphere 2：e00190-17.https：//doi.org/10.1128/mSphereDirect.00190-17)所述。

6至8週齡雌性干擾素受體缺乏小鼠(IFNAR-/-)在第0週經由肌肉內路徑接種每隻小鼠10⁶PFU之單一載體化疫苗ZIKV/CHIKV(SCV1002)或空對照疫苗(SCV105)。

各組小鼠在疫苗接種後第4週抽血，以檢驗疫苗之血清轉化。在疫苗接種後第6週，雄性小鼠經由皮下感染途經感染10⁴CCID₅₀單位之初生兒茲卡病毒株。感染之後，小鼠在第1至5天之間每天抽血以檢驗病毒血症。

在感染後第21天，揀選小鼠，收穫睪丸，使用定量即時PCR、使用靶向prM基因之引子評估ZIKV RNA。使用Trizol(Life Technologies)，依循製造商說明書萃取RNA。使用Biorad iscript逆轉錄酶超混合液，依循製造商說明書合成cDNA。使用Biorad iTaq Universal Sybr綠色超混合液套組進行即時定量。即時PCR結果相對於管家基因RPL13之含量來定量。

接種SCV1002(CHIK/ZIKA疫苗)之雄性小鼠在初生兒茲卡病毒病毒株攻擊之後不能複製茲卡病毒，如根據攻擊後最低程度地偵測到病毒血症所表明。然而，如所預期，接種SCV105(單獨SCV載體)的小鼠能夠複製茲卡病毒，如根據攻擊之後前3天所發現之高水準病毒血症所表明。

相較於接種對照疫苗SCV105之小鼠，接種SCV1002(CHIK/ZIKA)亦能夠降低在第21天在睪丸中所發現之病毒RNA的量。

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Claims

一種用於在動物中產生免疫反應從而降低屈公病(chikungunya)與茲卡(Zika)病毒與天花感染風險的組成物，該組成物包含醫藥學上可接受之載劑及減毒痘病毒，其中該痘病毒基因體包含編碼屈公病病毒之26S次基因體多蛋白的核酸序列及編碼茲卡病毒之PrME多蛋白的核酸序列，其中該減毒痘病毒為經修飾之痘病毒，該經修飾之痘病毒包含至少一個基因之缺失，該至少一個基因編碼內源性基本組裝或成熟蛋白質，其中該編碼內源性基本組裝或成熟蛋白質的至少一個基因係D13L。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該修飾進一步包含K1L基因之缺失。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該修飾進一步包含A39R基因之缺失。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該修飾進一步包含B7R-B8R基因之缺失。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該修飾包含D13L基因、A39R基因及B7R-B8R基因之缺失。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之組成物，其中該減毒痘病毒係減毒正痘病毒。
如申請專利範圍第6項之組成物，其中該減毒痘病毒係減毒牛痘病毒。
如申請專利範圍第1-5項中任一項之組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含佐劑。
如申請專利範圍第6項之組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含佐劑。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含佐劑。
如申請專利範圍第8項之組成物，其中該佐劑選自由以下組成之群：氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁、羥磷灰石、水包油佐劑、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐劑、免疫刺激複合物(iscoms)、免疫刺激複合物基質(iscom matrix)及含有QS-21的佐劑。
如申請專利範圍第9項之組成物，其中該佐劑選自由以下組成之群：氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁、羥磷灰石、水包油佐劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、免疫刺激複合物、免疫刺激複合物基質及含有QS-21的佐劑。
如申請專利範圍第10項之組成物，其中該佐劑選自由以下組成之群：氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁、羥磷灰石、水包油佐劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、免疫刺激複合物、免疫刺激複合物基質及含有QS-21的佐劑。
一種如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之組成物的用途，其用於製備用於在個體中誘導針對屈公病與天花、天花與茲卡病毒感染及/或屈公病、天花與茲卡病毒感染之保護性免疫反應的醫藥品。