JP2004535203A

JP2004535203A - ウイルス増殖方法

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Publication number: JP2004535203A
Application number: JP2003514077A
Authority: JP
Inventors: ハウレイ・ポール; ヘラー・カール; レーテ・イングマール
Original assignee: バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2002-07-02
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2022-07-02
Also published as: CN1533433A; KR100908377B1; IL158927A0; DK1412486T3; PL205926B1; WO2003008533A3; HUP0400393A3; CA2450206A1; WO2003008533A2; BRPI0211276B1; NZ529914A; NO339056B1; EA006628B1; DE60223812D1; US20040234950A1; MXPA04000326A; IL158927A; NO20040158L; HUP0400393A2; EA200400195A1

Abstract

本発明は、ポキシウイルス、とりわけコルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）を産生するための方法に関する。その際前記ポキシウイルスは、３７℃以下の温度にて培養する。本発明の方法は低い温度で、ウイルスの増殖をますます増加させる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポキシウイルス、とりわけコルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）を産生するための方法に関し、そこで、前記ポキシウイルスは、３７℃以下の温度にて培養する。本方法により、低い温度で、ウイルスの増殖が増加する。
【背景技術】
【０００２】
ポキシウイルスは、脊椎および無脊椎細胞の細胞質中で複製する、複合ＤＮＡウイルスの大きなファミリーを含んでいる。ポキシウイルスは、コルドポキシウイルス（脊椎動物ポキシウイルス）およびエントモポキシウイルス（昆虫ポキシウイルス）のサブファミリーに分けることが可能である（ＦｅｉｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ／ｅｄｓ．：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．；３^rd eｄ／ＩＳＢＮ０−７８１７−０２５３−４／とりわけ８３章を参照のこと）。
【０００３】
コルドポキシウイルスは、ラクダポキシ−ウイルス類、ヒツジポキシ−ウイルス類、ヤギポキシ−ウイルス類またはアビポキシウイルス類（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、とりわけニワトリポキシウイルス類、および痘瘡ウイルスおよびワクシニアウイルスのようなヒトに関連するポキシウイルス類のような、（異なる属で分類される）多くの動物ポキシウイルスを含む。
【０００４】
ポキシ−ウイルス、とりわけコルドポキシウイルスは、ヒトおよび動物における重要な病原体である。またポキシ−ウイルス感染に対するワクチン接種に関して、長い歴史がある。ほぼ２世紀前、ヒトに、天然痘に対して免疫化するために、牛痘が予防的に接種された。その後免疫がワクシニアウイルスで実施された。しかしながら、ワクシニアウイルスでの天然痘ワクチン接種により、時折、種痘後脳炎、広汎性痘疹、接触感染のような、重度の合併症となった。そこで、これらの合併症を示さない新規ワクチンがＡｎｔｏｎＭａｙｒによって開発された。ポキシワクチンは、ポキシウイルス改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭｏｄｉｆｉｅｄＶａｃｃｉｎｉａＶｉｒｕｓＡｎｋａｒａ；ＭＶＡ）からなり、ワクチンに関連した任意の合併症を引き起こすことのない、約１５００００ワクチン接種での、天然痘に対するワクチン接種のために使用された。免疫不全の子供でさえ、重度な副作用を示さなかった。ＭＶＡは、ニワトリ胚繊維芽細胞培養における５７５回の継代後、元々の痘瘡ウイルスアンカラの変異および選別によって得られた。このＭＶＡの安全性は、生物学的、化学的および生理学的特徴により反映される。ＭＶＡは、分子量が小さく、ゲノム中で６つの欠失であり、哺乳動物に対して非常に弱毒化され、すなわち、ＤＮＡおよびタンパク質は合成され、実質的にはウイルス粒子は産生されない。
【０００５】
天然痘に対するワクチン接種は、非常に成功した。１９７９年、世界保険機構は、天然痘の撲滅を宣言した。したがって、子供の集団ワクチン接種が終了し、研究所勤務員およびいくつかの国の兵士隊員のみでワクチン接種がされている。
【０００６】
天然痘の撲滅とともに、ヒトにおけるポキシウイルス感染の顕著な原因が取り除かれた。しかしながら、いくつかの非ヒトポキシウイルスは、宿主特異性が減少しており、すなわち、これらは、その典型的な宿主（たとえばウシ牛痘）のみでなく、他の動物（たとえばラットおよびネコ）への感染を引き起こす。ヒトも、この経路にて感染しうる。人口のある部分が、もはや天然痘に対して免疫性であるので、動物種のポキシウイルス感染が、これらに関して危険であり得る。家庭動物が、ヒトに対する感染の主な源である。したがって、家庭動物のポキシウイルスに対するワクチン接種が、その重要度を増している。さらに、ポキシウイルスは、たとえば、ワクチンとしての使用、または遺伝子治療のための、すなわち核酸配列を、それが発現される場所の標的細胞内に伝達するための、外来遺伝子の発現のための重要なベクターである。よって、ポリウイルスの効率的で、費用効果的な産生法が必要である。
【０００７】
ポキシウイルスは、異なる細胞型内で増幅可能である。たとえば、コルドポキシウイルス、とりわけＭＶＡは、初代または二代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養液内で増幅される。細胞は、１０〜１２日間培養する、ニワトリ卵の胚より得られる。胚の細胞を、ついで分離し、精製する。これらの初代ＣＥＦ細胞は、直接またはさらに細胞継代して二代ＣＥＦ細胞として使用可能である。続いて、初代または二代ＣＥＦ細胞を、ＭＶＡで感染させる。ＭＶＡの増幅のために、細胞を３７℃にて２〜３日間インキュベートする（たとえば、Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら、１９９１；Ｊ．ｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ７２、１０３１−１０３８、Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１１，１０３２−１０４０を参照のこと）。他のコルドポキシウイルスは、他の細胞型でも増幅するが、３７℃という同一の温度が、これらの場合に選択される。たとえば、ＨｅＬａＳ３細胞（ヒト子宮頸部癌細胞）内で培養される、ＡＴＣＣ（第ＶＲ１３５４）より入手可能な痘疹ウイルスもまた、３７℃にて３日間インキュベートする（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ１９９８、１６章、ユニット１６．１６、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ）。さらに、Ｖｅｒｏ細胞（サル肝臓細胞）中での増殖に適合したＭＶＡもまた、３７℃にて増幅する（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３）。したがって、増幅のために使用した細胞に依存せず、またコルドポキシウイルスの種または株に依存せず、ウイルスの増幅は３７℃で実施される。この選択された温度は、当業者の一般的な知識によく相関している。ほとんど排他的に、研究所内で増幅されたポキシ−ウイルスは、およそ３７℃の体温の温血動物から得られる。コルドポキシウイルスが、前記動物で増幅させることに適合するので、３７℃にて増幅することに適合し、すなわち３７℃でもっとも効率的に増幅する。
【０００８】
同一の理由により、エントモポキシウイルス（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）は、３７℃より低い温度にて培養する。昆虫の体温は、有意に３７℃より低く、大きな程度で、環境の温度に依存する。したがって、コルドポキシウイルスとは対照的に、エントモポキシウイルスは、より低い温度での増殖に適合する。米国特許第５，７２１，３５２号および米国特許第５，１７４，９９３号は、研究所内での、２８℃の、エントモポキシウイルス種、アムサクタモーリエエントモポキシウイルス（ＡｍｓａｃｔａｍｏｏｒｅｉＥｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）（ＡｍＥＰＶ）の増殖に関して、適切な温度を開示している。しかしながら、これらの特許は、これらの温度条件下での、コルドポキシウイルスの培養を開示はしていない。
【０００９】
さらに、他のウイルス感染に対するワクチンの産生は、一般的に３７℃にて実施される。いくつかのはしかワクチンは、より低い温度にて産生される。この場合、本来は３７℃にて産生され、しばしば重度の副作用を引き起こしたはしかワクチンは、ウイルスの３２℃での連続継代によって弱毒化された。前記株の３２℃での８５回の継代の後、本株は弱毒化される。すなわち本ウイルスの疾病原因性はあきらかに減少される（Ｐｌｏｔｋｉｎ、Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ，３^rdエディション、２３０−２３２）。結論として、温血動物のウイルス、とりわけワクシニアウイルスは、これらが、前記体温での動物で発見され、より低い温度への適合が、前記より低い温度での多重継代の後にのみ達成されることから、３７℃にてもっとも効果的に増幅されることが予想される。さらに、より低い温度への適合は、弱毒化に関連し、したがって、しばしばウイルスの再産生能力が減少する。
【００１０】
米国特許第５，６１６，４８７号は、安定化ウイルス、とりわけ安定化レトロウイルスを、ウイルス産生細胞を、３７℃以下の温度で、安定剤とともに培養することで、産生するための方法を開示している。安定化剤は、脂質または界面活性剤である。本特許は、安定剤として、とりわけ、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８およびＬｉｐｉｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを開示している。ＬｉｐｉｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは、コレステロール、タラ肝臓油、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８、酢酸ｄ−アルファ−トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０を含むと言われている。他の実施様態米国特許第５，６１６，４８７号は、３７℃より低い温度での特定のレトロウイルス産生細胞を培養するための方法を開示しており、そこで、産生されたレトロウイルスは、以上で定義したような安定化剤を用いて安定化される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ポキシ−ウイルス、とりわけ感染した細胞あたり、ウイルス粒子のより多くの産生を導くコルドポキシウイルスを調製するための方法を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的は、産生細胞を、３７℃以下の温度にて培養して、ポキシ−ウイルス、とりわけコルドポキシウイルスを調製するための方法によって達成される。
【００１３】
驚くべきことに、本発明にしたがった方法が、より低い温度（３７℃以下）にて、より効率のよいウイルスの増幅を導く、言い換えれば、感染細胞数に関連して、より高いウイルス産生となることがわかった。したがって、同量のウイルスを産生するのに、より少ない細胞しか必要ではない。種痘ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に必要なＣＥＦ細胞の産生が、面倒であり、高価であるので、このことは、改変ＭＶＡに対して利点である。さらに、インキュベーション温度の減少により、ポキシウイルスの増幅方法の間のエネルギーが節約され、したがって、ウイルスの産生におけるコストが節約される。
【００１４】
本明細書で使用するところの語句「ポキシウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）」は、好ましくは、サブファミリーコルドポキシウイルス（植物ポキシウイルス）のポキシウイルスを意味する（ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ／ｅｄｓ．：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，；３^rd ｅｄ／ＩＳＢＮ０−７８１７−０２５３−４／特に８３章を参照のこと）。語句「コルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）」、「コルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）」および「脊椎動物ポキシウイルス（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）」は、本明細書にて、同義で使用される。好ましいコルドポキシウイルスは種オルトポキシウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、パラポキシウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）、アビポキシウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カプリポキシウイルス（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、レプリポキシウイルス（Ｌｅｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スイポキシウイルス（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、モルスシポキシウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）およびヤタポキシウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）のポキシウイルスである。もっとも好ましいのは、種オルトポキシウイルスおよびアビポキシウイルスのポキシウイルスである。
【００１５】
好ましい実施様態において、本発明にしたがった方法にて産生されるポキシ−ウイルスは、ワクチンとして有用であるか、または宿主細胞内に対象の遺伝子を導入するために、遺伝子治療ベクターとして使用可能なポキシ−ウイルス、とりわけコルドポキシウイルスである。好適なウイルス株は、当業者によく公知である。好適な株は、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）またはヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ：ＥＣＡＣＣ）より入手可能である。
【００１６】
以上で述べたように、本発明にしたがって産生するための特に好ましいポキシ−ウイルスは、アビポキシウイルスとオルトポキシウイルスである。オルトポキシウイルスの例は、ワクシニアウイルス株エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＣＢＯＨ、Ｐａｒｉｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎのようなワクシニアウイルスであり、より好ましくは種々のＭＶＡ株、もっとも好ましくは、Ｖ０００８３００８下でＥＣＡＣＣに寄託されたＭＶＡ−ＢＮおよびこれらの誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体は、「改変ワクシニアアンカラウイルス変異体（ＭｏｄｉｆｉｅｄＶａｃｃｉｎｉａＡｎｋａｒａＶｉｒｕｓＶａｒｉａｎｔ）」の表題の、ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８号で詳細に記述されている。
【００１７】
寄託されたウイルスの「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」は、寄託された株と本質的に同一の増殖特性、とりわけ、同一の温度依存性を示すが、そのゲノムの少なくとも一部分が異なる可能性のある、ウイルスである。
【００１８】
本発明にしたがった方法は、それぞれ野生型ウイルス、弱毒化ウイルスおよび組換え体ウイルスで実施しうる。
【００１９】
「弱毒化ウイルス（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｖｉｒｕｓ）」は、病原性ウイルスが起源であるが、しかし宿主生物に感染するときに、非弱毒化ウイルスと比較して、より低い生存率および／または疾病率を導くウイルスである。弱毒化ポキシウイルスの例は、当業者によく知られている。弱毒化ワクシニアウイルスに対する例は、株ＭＶＡ、とりわけＶ０００８３００８の寄託番号で、ＥＣＡＣＣに寄託された株である。
【００２０】
語句「組換え体ウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｒｕｓ）」は、ウイルスゲノムの天然の部分ではない、外来遺伝子が、ウイルスゲノム内に挿入された、任意のウイルスである。外来遺伝子は、治療的遺伝子、免疫応答を誘導する少なくとも１つのエピトープを含むペプチドをコードしている遺伝子、アンチセンス発現カセットまたはリボザイム遺伝子であり得る。組換え体ウイルス構築のための方法は、当業者に公知である。もっとも好ましいポキシウイルスベクターは、ＭＶＡ、とりわけＭＶＡ５７５およびＭＶＡ−ＢＮ（以上を参照のこと）である。
【００２１】
先行技術のすべての先行する技術とは対照的に、本発明の発明者らは、２６℃および３７℃の間の６温度の中で、ポキシ−ウイルス、とりわけコルドポキシウイルスは、３７℃のインキュベーション（培養）温度にて、最小の効率で増幅をすることを発見した。ポキシ−ウイルス、とりわけコルドポキシウイルスの増幅のための方法が、ウイルス産生細胞を、少なくとも３７℃以下の温度、好ましくは３６．５℃と２６℃の間、または約２６℃と約３６℃の間、より好ましくは２８℃と３３℃の間、さらに好ましくは、２８℃と３２℃の間、もっとも好ましくは３０℃にて、培養する場合に、より高いウイルス産生を導くことが、驚くべきことにわかった。
【００２２】
他の好ましい温度範囲は、３０℃〜３６．５℃であった。とりわけよい結果が、副範囲、３０℃〜３５℃、３０℃〜３３℃および３０℃〜３２℃で得られた。もっとも好ましい温度は、３０℃であった。
【００２３】
温度の値に関連した語句「約（ａｂｏｕｔ）」は、好ましくは、特に言及した温度を意味し、また、特に言及した温度の０．５℃上、または下の温度を意味する。例としては、「約３０℃（ａｂｏｕｔ３０℃）」は、２９．５℃〜３０．５℃の範囲の温度と解釈される。
【００２４】
もっとも一般的な語句において、本発明にしたがった方法で、各ポキシウイルスは、各ポキシウイルスの天然の宿主である、ヒトを含む動物の体温より低い温度での、感染細胞の培養によって産生される。ワクシニアウイルスが考えられる場合、バッファローが天然の宿主として考えられる（Ｂａｘｂｙ，Ｄ．：「ジェニー天然痘ワクチン：ワクシニアウイルスの謎およびその由来（Ｊｅｎｎｅｒ’ｓｓｍａｌｌｐｏｘｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅｒｉｄｄｌｅｏｆｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｏｒｉｇｉｎ．）」、Ｌｏｎｄｏｎ：ＨｅｉｎｅｍａｎｎＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌ；１９８１：１−２１４）。
【００２５】
ウイルス産生細胞の培養は、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも２日間、または少なくとも３日間実施される。通常、ウイルスを含まない細胞は、十分量の細胞が得られるまで３７℃にて増殖する。ついで、細胞培養液に、ウイルスを接種させ、ついで温度を以上で示唆した温度まで減少させた。他の実施様態において、細胞培養は、ウイルスを接種させる前に、上記温度にする。
【００２６】
感染の前の細胞の培養、および本発明にしたがった方法を用いたウイルス産生のために使用する培地は、同一のもの、または異なるものであり得る。すべての培地は、当業者に公知の従来の標準培地である。もし必要ならば、抗生物質、添加アミノ酸および／またはウシ胎児血清のようなさらなる添加物を添加することも可能である。
【００２７】
好ましい実施様態にしたがって、本発明にしたがった方法で使用された培地は、ウイルス脂質エンベロープを安定化させるための、脂質または界面活性剤を含まない。さらに好ましくは、本発明にしたがった方法で使用した培地は、任意の以下の安定剤、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８とＴｗｅｅｎ８０^TMの組み合わせ、またはコレステロール、タラ肝臓油、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８、ｄ−アルファ−トコフェロール酢酸およびＴｗｅｅｎ８０を含むＬｉｐｉｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ番号：２１９００−０１４）を含まない。
【００２８】
コルドポキシウイルス細胞に関して、本発明にしたがった方法で使用できることが、当業者に公知である。細胞の型および性質は、細胞が、それぞれのウイルスで感染される限り、および子孫ウイルスが、感染細胞より産生される限り重要ではない。好ましくは、感染の多重性は、１より小さくあるべきである。
【００２９】
とりわけ好ましい細胞は、脊椎動物細胞、たとえばほ乳類または鳥類細胞である。
【００３０】
好ましい実施様態にしたがって、ワクシニアウイルスに関して、とりわけワクシニアウイルス株ＥｌｓｔｒｅｅおよびＭＶＡに関して、本発明にしたがった方法で使用可能な脊椎動物細胞は、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣｈｉｃｋｅｎＥｍｂｒｙｏＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＣＥＦ）である。ニワトリは、正常平均体温４１℃を持つので、本発明にしたがった方法が、ＣＥＦ細胞に対して使用可能であるとは、特に予想されていなかった。したがって、本発明にしたがって使用する温度、３７℃以下、好ましくは３６．５℃と２６℃の間、より好ましくは、２８℃と３３℃の間、より好ましくは２８℃と３２℃の間、もっとも好ましくは３０℃は、これらの細胞が、これらの温度でのワクシニアウイルスの増殖のために使用できないと推測された、ニワトリの正常体温とは非常に異なる。同様の考慮は、３０℃〜３６．５℃、３０℃〜３３℃、３０℃〜３２℃の範囲、およびとりわけ３０℃の温度で適用される。
【００３１】
さらに、本発明にしたがった方法は、好ましくは固定フラスコ内で実施する。
【００３２】
さらなる利点は、本方法が、温度を下げるための温度感受性変異または長く複雑な弱毒化を必要としない、「正常（ｎｏｒｍａｌ）」ウイルス株で、産生量の増加を導くことである。言い換えれば、ウイルス粒子において、３７℃と比較して、より低い温度で、より高い産生量を達成するために、温度弱毒化または温度感受性変異を使用する必要がないのである。
【００３３】
温度弱毒化ウイルスまたは温度感受性変異体に関して、より低い温度でより増幅するが、しかし、そのような株は通常、非弱毒化、または非温度感受性変異体よりも再産性が少ないことが知られている。したがって、本発明にしたがった方法の大きな利点は、任意の種類の正常な、非常に再産性の高いウイルス株に適用可能であるという事実に基づいている。
【００３４】
本発明にしたがって調製されたウイルスは、好ましくは、ワクチンとして、または遺伝子治療プロとコールで使用される組成物を調製するために、好ましく使用される。ポキシウイルスのそのような適用は、本技術分野でよく確立されている。
図面の簡単な説明
図１において、実験１からの単一の値を、二重に示している（ドットとして表した）。棒は平均値を表している。単一の値を表１と比較している。
【００３５】
図２において、実験１からの単一の値を、二重に示している（ドットとして表した）。棒は平均値を表している。単一の値を表２と比較している。
【００３６】
図３において、二重に行った４つの異なる温度（実験３）での実験からの単一の値である。棒は平均値を表している。単一の値を表３と比較している。
【００３７】
図４において、二重に行った４つの異なる温度（実験４）での実験からの単一の値である。棒は平均値を表している。単一の値を表４と比較している。
【００３８】
図５において、棒は、３０℃および３７℃で三重に実施した実験の平均値を表している。単一の値を表５と比較している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は以下の実施様態に関する。
【００４０】
３７℃以下の培養温度にて、ウイルスを培養液中で増殖させることを特徴とする、ポキシウイルス、とりわけコルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）を調製する方法。
【００４１】
前記コルドポキシウイルスを、約２６℃〜約３６℃の培養温度にて増殖させることを特徴とする、上記の方法。
【００４２】
前記コルドポキシウイルスを、約２８℃〜約３３℃の培養温度にて増殖させることを特徴とする、上記の方法。
【００４３】
前記コルドポキシウイルスを、約３０℃〜約３３℃の培養温度にて増殖させることを特徴とする、上記の方法。
【００４４】
前記コルドポキシウイルスを、約３０℃の培養温度にて増殖させることを特徴とする、上記の方法。
【００４５】
ウイルス増殖を少なくとも２４時間実施することを特徴とする、上記の方法。
【００４６】
ウイルス培養を、少なくとも２〜３日間実施することを特徴とする、上記の方法。
【００４７】
前記ポキシ−ウイルスが、ワクチンまたは遺伝子治療ベクターとして有用なウイルスであることを特徴とする、上記の方法。
【００４８】
前記ポキシ−ウイルスが、アビポキシウイルスまたはオルトポキシ−ウイルスからなる群より選択されることを特徴とする、上記の方法。
【００４９】
前記ウイルスが、ワクチンウイルスであることを特徴とする、上記の方法。
【００５０】
前記ウイルスが、改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）、好ましくは、第Ｖ０００８３００８号にてＥＣＡＣＣに寄託されたようなＭＶＡ−ＢＮ、またはその誘導体から選択されることを特徴とする、上記の方法。
【００５１】
前記方法を、固定フラスコ内で実施することを特徴とする、上記の方法。
【００５２】
前記ポキシ−ウイルスが、温度感受性変異ウイルスではないことを特徴とする、上記の方法。
【００５３】
前記ポキシ−ウイルスが、温度弱毒化ウイルスではないことを特徴とする、上記の方法。
【００５４】
前記ウイルスを、ニワトリ胚繊維芽細胞内で増殖させることを特徴とする、上記の方法。
【００５５】
上記方法のいずれか一項にしたがって調製したウイルス。
【００５６】
上記のようなウイルスを含む組成物。
【００５７】
上記のようなウイルスを含むワクチン。
【００５８】
上記の方法のいずれか一項にしたがって調製したウイルスのウイルスゲノムを含む、遺伝子治療での使用のための組成物。
【００５９】
ワクチンとしての、上記方法のいずれか一項にしたがって調製したウイルスの使用。
【００６０】
遺伝子治療での、上記方法のいずれか一項にしたがって調製したウイルスの使用。
【００６１】
以下の実施例が、本発明をさらに例示している。
【実施例１】
【００６２】
ＭＶＡの増幅における温度の影響
細胞培養条件
初代ＣＥＦ−細胞を、２×１０⁷ＣＥＦ細胞／１８５ｃｍ²の細胞濃度で、固定フラスコ内に蒔いた。細胞は、ＶＰ−ＳＦＭ＋４ｍＭＬ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗かび剤内で蒔いた。シーディングの４日後の時点で、５×１０⁷ＣＥＦ−細胞／１８５ｃｍ²の細胞濃度が確認された。この細胞に、ＲＰＭＩｗ／ｏＦＣＳを用いて、０．１ＴＣＩＤ₅₀／細胞ＭＶＡ−ＢＮ（寄託番号第Ｖ０００８３００８号にてＥＣＡＣＣに寄託されている）を感染させた。感染、および続く７２時間のインキュベーションは、３０℃および３７℃（２つの異なるＣＥＦ調製物による実験１および２）、３０、３３、３５および３７℃（実験３）、および２６、２８、３０および３３℃（実験４）にて実施した。実験は、各温度で二重に行った。ウイルス複製を、培地中の細胞をこすり取ること、および−２０℃での培地と細胞一緒での凍結によって停止させた。この混合液を、さらに２回、凍結／融解して、機械的にウイルスを細胞から放出させた。４つの異なる感染温度での実験に関して、ウイルス複製は、−２０℃で固定フラスコを凍結させることで停止させた。この混合液を、さらに３回凍結／融解させて、機械的にウイルスを細胞から放出させた。
【００６３】
各固定フラスコからのウイルスタイターを、免疫組織学的アッセイを用いて決定した。ワクシニアウイルス特異的抗体で感染細胞を染色した。次に、種痘ウイルス抗体に結合する、ＨＲＰ−結合抗体を添加した。基質の添加の後、感染細胞は青色または茶色で現れる。アッセイの評価は、ＳｐｅａｒｍａｎおよびＫａｅｒｂｅｒの式を用いて行い、ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ（組織培養感染用量）を決定した。実験は二重に実施した。滴定結果のための受容基準として、公知のタイターでのＭＶＡ−ＢＮ標準を、各滴定実験に対して内部標準として使用した。実験からの結果は、ＭＶＡ−ＢＮ標準からの値が、総平均より±０．５ログ以上異ならなかった場合にのみ採用した。
（結果）
初代ＣＥＦ細胞の可能な増殖変化を含めるために、実験は、３０℃と３７℃の感染温度を比較する時に、２つの異なる細胞調製物で実施した。２つの独立した感染実験からの結果を、表１−２および図１−２で示している。
【００６４】
実験１および２の結果は、３７℃に比べて３０℃にてウイルス産生量が明らかに増加することを示している。実験１において、０．５ログの増加、実験２において約０．７ログの増加が達成された。
【００６５】
【表１】

【００６６】
【表２】

【００６７】
最初の２つの実験からのデータは、ＭＶＡの産生量の増加が、感染後のインキュベーション温度の減少によって達成されうるということで、非常に有望である。したがって、先に進み、他の温度もまた試して、最適な感染温度を見つけることが決定された。使用した温度は、３０、３３、３５および３７℃である。この実験からの結果を、表３および図３で示している。
【００６８】
３７℃およびそれより低い感染温度（３５、３３、３０℃）での産生量の比較によって、より低い温度で、明らかな増加があることが示された。もっともよいウイルスタイター［ＴＣＩＤ５０／ｍｌ］が、３０℃の感染温度での本実験で得られ、３７℃と比較して、０．８ログ高かった。
【００６９】
【表３】

【００７０】
固定フラスコでの次の実験において、３０℃よりも低い温度を試験して、３０℃がＣＥＦ細胞中でのＭＶＡの複製に関して、最適な温度であるかを見た。したがって、２６、２８、３０および３３℃を使用した。この実験からの結果を表４および図４で示している。
【００７１】
【表４】

【００７２】
本実験でのもっとも高い収量は、３０℃でのインキュベーション温度にて見られた。以前の実験（３０℃と３７℃の間の４温度）からのデータと、本実験のデータを比較すると、固定フラスコ内でのＣＥＦ細胞におけるＭＶＡの増幅に対する、感染の後のインキュベーションに対する最適温度が、３０℃であることが同定された。
【００７３】
これらの２つの実験からの単一温度のウイルスタイターの解析により、３７℃でのインキュベーションが、６つの使用した温度からのウイルス産生で最も低いものであることが明らかになった。使用した温度での収量に関する観察された順番は以下のようなものである。
３０℃＞３３℃／２８℃＞３５℃／２６℃＞３７℃
【実施例２】
【００７４】
ワクシニアウイルス株エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）の複製における温度の影響
他のアプローチにおいて、ワクシニアウイルス株エラストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）を、温度依存性に関して、ＭＶＡ−ＢＮとともに試験した。ＭＶＡ−ＢＮおよびＥｌｓｔｒｅｅを、ＣＥＦ細胞上で増殖させた。実験に関して、初代ＣＥＦ−細胞を、２Ｅ＋０７ＣＥＦ細胞／１７５ｃｍ²の細胞濃度で、固定フラスコ内に蒔いた。細胞を、培養培地＋４ｍＭＬ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗かび剤中で蒔いた。シーディングの４日後の時点で、５Ｅ＋０７ＣＥＦ−細胞／１７５ｃｍ²の細胞濃度が確認された。この細胞に、それぞれＲＰＭＩｗ／ｏＦＣＳおよびＥｌｓｔｒｅｅを用いて、０．１ＴＣＩＤ₅₀／細胞ＭＶＡ−ＢＮを感染させた。感染、および続く７２時間のインキュベーションは、３０℃および３７℃にて実施した。実験は、各温度で三重で行った。ウイルス複製を、−２０℃で固定フラスを凍結によって停止させた。この混合液を、さらに３回、凍結／融解して、機械的にウイルスを細胞から放出させた。各固定フラスコからのウイルスタイターは、ＳＯＰ／ＭＶＡ／０４にしたがった滴定によって測定した。滴定結果のための受容基準として、公知のタイターでのＭＶＡＦ６標準を、各滴定実験に対して内部標準として使用した。実験からの結果は、ＭＶＡＦ６標準からの値が、総平均より±０．５ログ以上異ならなかった場合にのみ採用した。
【００７５】
感染実験からの結果を、表５および図５で示している。
【００７６】
ＭＶＡ−ＢＮでの実験のデータは、３７℃と比較して３０℃にて、ウイルス収量の明らかな増加を示している（０．６６７ログ）。Ｅｌｓｔｒｅｅでの実験において、３７℃と比較した３０℃での１．１２５ログの増加が見られた。
【００７７】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、実験１からの単一の値を、二重に示す。
【図２】図２は、実験１からの単一の値を、二重に示す。
【図３】図３は、二重に行った４つの異なる温度（実験３）での実験からの単一の値を示す。
【図４】図４は、二重に行った４つの異なる温度（実験４）での実験からの単一の値を示す。
【図５】図５は、棒は、３０℃および３７℃で三重に実施した実験の平均値を示す。

Claims

３７℃以下の培養温度にて、ウイルスを培養液中で増殖させることを特徴とする、コルドポキシウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）を調製する方法。
前記コルドポキシウイルスを、約２６℃〜約３６℃の培養温度にて増殖させる、請求項１に記載の方法。
前記コルドポキシウイルスを、約３０℃〜約３５℃の培養温度にて増殖させる、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
前記コルドポキシウイルスを、約３０℃の培養温度にて増殖させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
ウイルス増殖を少なくとも２４時間実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記ウイルス培養を、少なくとも２〜３日間実施する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記コルドポキシウイルスが、ワクチンまたは遺伝子治療ベクターとして有用なウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記コルドポキシウイルスが、アビポキシウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）またはオルトポキシ−ウイルスからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記オルトポキシウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）が、ワクシニアウイルスである、請求項８に記載の方法。
前記ワクシニアウイルスが、株エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）および改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）、好ましくは、第Ｖ０００８３００８号にてＥＣＡＣＣに寄託されたようなＭＶＡ−ＢＮ、またはその誘導体から選択される、請求項９に記載の方法。
前記方法を、固定フラスコ内で実施する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ポキシ−ウイルスが、温度感受性変異ウイルスではない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記ポキシ−ウイルスが、温度弱毒化ウイルスではない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記ポキシウイルスを、ニワトリ胚繊維芽細胞内で増殖させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
脂質または界面活性剤を、培養液に加えない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法にしたがって調製したウイルス。
請求項１６に記載のウイルスを含む組成物。
請求項１６に記載のウイルスを含むワクチン。
ワクチンとしての使用、または遺伝子治療で使用のための、請求項１７に記載の組成物。
請求項１６に記載のウイルスのウイルスゲノムを含む組成物。
遺伝子治療での使用のため、またはワクチンとしての使用のための、請求項２０に記載の組成物。
ワクチンとしての、請求項１６に記載のウイルスの使用、または請求項１７または２０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
遺伝子治療での、請求項１６に記載のウイルスの使用、または請求項１
７または２０のいずれか一項に記載の組成物の使用。