CN1533433A - 用于病毒增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒的方法，其中所述痘病毒在37℃以下温度培养。在降低的温度中，该方法使病毒增殖增加。
Description
本发明涉及一种生产痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒的方法，所述痘病毒在低于37℃的温度中培养。在这种降低的温度中，该方法使病毒的增殖增加。
发明背景
痘病毒科包括一大类能在脊椎动物和无脊椎动物细胞质中复制的复杂DNA病毒。痘病毒科可分为脊椎动物痘病毒亚科(脊椎动物痘病毒)和昆虫痘病毒亚科(昆虫痘病毒)(Fields Virology/eds.：Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.；3rd ed/ISBN 0-7817-0253-4/see in particular chapter 83)。
脊椎动物痘病毒亚科包括多种动物痘病毒(分为不同的属)，例如骆驼痘病毒，绵羊痘病毒，山羊痘病毒，或禽痘病毒(Avipoxvirus)，特别是禽痘病毒(fowlpoxvirus)和那些与人类相关的痘病毒例如天花病毒和痘苗病毒。
痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒是人和动物重要的病原体。同时，接种疫苗防止痘病毒感染也有一较长的历史。几乎在两个世纪前，人类就开始预防性接种牛痘病毒用于免疫防治天花。随后，又采用痘苗病毒进行免疫。然而，采用牛痘病毒进行天花预防接种偶尔会导致严重的并发症，例如接种后脑炎，一般性牛痘或接触性感染。于是，Anton Mayr又开发出一种新的不引起这些并发症的牛痘疫苗。该痘病毒疫苗由改良安卡拉痘苗病毒(MVA)组成，在约150000例防治天花的接种中没有产生任何与接种有关的并发症。即使对于那些存在免疫缺陷的儿童也未显示严重的副作用。MVA是使原始安卡拉痘苗病毒在鸡胚成纤维细胞培养物中经过575代，发生突变并筛选获得的。这种MVA的安全性由其生物学，化学和物理学特性来反映。MVA的分子量降低，基因组中存在6处缺失，在哺乳动物细胞中高度减毒，也就是，合成了病毒DNA和蛋白质但事实上没有病毒粒子产生。
防治天花的接种取得了巨大的成功。1979年，世界卫生组织宣布彻底根除了天花。因此，便停止了对儿童的大规模接种疫苗，只有实验室工作人员和一些国家的军队成员才进行预防接种。
随着天花的彻底根除，人类的痘病毒感染的主要原因消除了。但是，一些非人痘病毒降低了其宿主专一性，也就是它们不但感染其典型宿主(例如牛痘病毒感染牛)还可以感染其他的动物，(例如大鼠和猫)。人类也可以由这种途径被感染。由于部分人群不再具有对抗天花的免疫力，感染动物的痘病毒对他们来说也可能存在危险。驯养的动物是人类的主要感染源。因此，对驯养动物进行痘病毒预防接种的重要性日益增加。此外，痘病毒是外源基因表达的重要载体，例如用作疫苗或进行基因治疗，也就是转移核酸序列至靶细胞，并在靶细胞中进行表达。所以，需要提供一种有效的，成本经济的生产痘病毒的方法。
痘病毒能在不同类型的细胞中增殖。例如，脊椎动物痘病毒，特别是MVA可以在原代或次代鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中增殖。这些细胞是从孵化了10至12天的鸡胚中获得的。然后，将这些胚胎细胞分离和纯化。这些原代CEF细胞既可以直接使用也可以在进一步的一次细胞传代后作为次代CEF细胞使用。随后，原代或次代CEF细胞用MVA感染。为了增殖MVA，感染后的细胞将在37℃培养2-3天(参见，例如，Meyer，H.etal.1991；J.of General Virology 72，1031-1038；Sutter etal.1994，Vaccine，Vol.12，No.11，1032-1040)。虽然，其他的脊椎动物痘病毒在不同类型的细胞中增殖，但是在这些方案中都选择了相同的温度37℃。举例来说，培养于HeLa S3细胞(人宫颈癌细胞)中的ATCC(No.VR1354)痘苗病毒也在37℃培养3天(Current protocols in molecular biology 1998，Chapter 16，Unit 16.16，John Wiley & Sons，Inc)。此外，适于在Vero细胞(猴肾细胞)中培养的MVA病毒也在37℃增殖(PCT/EP01/02703)。结果，不论采用何种细胞进行增殖也不论脊椎动物痘病毒是何种属或毒株，这些病毒均在37℃增殖。该选择温度与本领域技术人员的一般常识非常一致：在实验室中几乎排他性增殖的痘病毒是从体温接近于37℃的温血动物中获得的。既然脊椎动物痘病毒适于在所述动物中生长，它们也适于在37℃生长，也就是，它们应该在37℃获得最有效的增殖。
由于相似的原因，昆虫痘病毒在低于37℃的温度中培养：昆虫的体温显著低于37℃，并很大程度上依赖于环境的温度。因此，与脊椎动物痘病毒相比，昆虫痘病毒适于在较低温度中生长。美国专利US 5,721,352和US5,174,993揭示了昆虫痘病毒种Amsacta moorei昆虫痘病毒(AmEPV)的实验室最适培养温度为28℃。然而，这些专利都未揭示在所述温度条件下培养脊椎动物痘病毒。
此外，生产预防其他病毒感染的疫苗一般采用37℃温度。只有一些麻疹疫苗是采用较低温度生产的。在这种情况下，原始培养于37℃并且经常引起严重副作用的麻疹疫苗，通过在32℃连续传代获得减毒株。在32℃经85代传代后毒株减毒，也就是，病毒的致病能力大大降低(Plotkin，Orenstein：Vaccines，3rd edition，230-232)。结论是，温血动物病毒，尤其是痘苗病毒被认为在37℃获得最有效的增殖，因为它们存在于具有上述体温的动物中；只有在低温多次传代才能适应于该低温。此外，适应于低温与减毒相关，并因此通常伴随着病毒复制能力降低。
美国专利US 5,616,487揭示了一种生产稳定病毒，尤其是稳定的逆转录病毒的方法：通过在低于37℃的温度中，在有稳定剂的条件中培养病毒生产细胞。所述稳定剂为脂质或表面活性剂。该专利特别的揭示了PluronicF-68和浓缩脂质作为稳定剂。所述浓缩脂质包括胆固醇，鳕鱼肝油，PluronicF-68，d-α-生育酚乙酸酯和Tween 80。在专利US 5,616,487的可选实施方案中揭示了在低于37℃的条件下，培养特定逆转录病毒生产细胞的方法，所生产的逆转录病毒采用上述稳定剂稳定。
发明目的
本发明的目的是提供一种制备痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒的方法，该方法使病毒粒子/个感染细胞的产量提高。
发明详述
本发明目的是通过制备痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒来实现的，其中病毒生产细胞在低于37℃的条件下培养。
根据本发明记载的方法，令人意外的发现，在低温(低于37℃)条件下，病毒增殖将更有效，因此，相对于一定数量的感染细胞，可以获得更高产量的病毒。所以，生产相同数量的病毒，所需细胞数量减少。该方法对于改良安卡拉痘苗病毒(MVA)来说尤为有利，因为MVA增殖所需的CEF细胞的生产需花费大量劳力，造价昂贵。此外，在扩增痘病毒期间降低培养温度有利于节约能源，并因此降低了生产病毒的成本。
本申请中的术语“痘病毒”优选的指脊椎动物痘病毒(脊椎动物的痘病毒)亚科中的痘病毒(Fields Virology/eds.：Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.；3rd ed/ISBN 0-7817-0253-4/参见第83章)。术语“脊椎动物痘病毒”，“脊椎动物痘病毒亚科”，“脊椎动物的痘病毒”在本发明中可以互换使用。脊椎动物痘病毒优选的为正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，山羊痘病毒属，野兔痘病毒属，猪痘病毒属，软体动物痘病毒属(Molluscipoxvirus)和雅塔痘病毒属(Yatapoxvirus)的痘病毒。最优选为正痘病毒属和禽痘病毒属的痘病毒。
在一优选实施方案中，根据本发明方法生产的痘病毒为可用作疫苗或用作将目的基因导入宿主细胞的基因治疗载体的痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒。适合的毒株为熟练技术人员所公知。适合的毒株可以从例如美国菌种培养保藏中心(ATCC)或欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)获得。
如上文所述，根据本方法生产的痘病毒，尤为优选的是禽痘病毒和正痘病毒。正痘病毒的例子为痘苗病毒，例如痘苗病毒株Elstree，WesternReserve，Wyeth，NYVAC，NYCBOH，Paris，Copenhagen，更优选的为各种MVA株，最优选ECACC保藏号为V00083008的MVA-BN，或其衍生物。MVA-BN及其衍生物在题为“改良安卡拉痘苗病毒变异体”的PCT申请PCT/EP01/13628中作了详细描述。
保藏病毒的“衍生物”是指那些生长特性本质相同，尤其是温度依赖性与保藏株相同，但基因组至少有一段不同的病毒。
根据本发明的方法分别可以用野生型病毒，减毒病毒和重组病毒来实施。
“减毒病毒”是指来源于病原性病毒，但相对于非减毒亲本病毒来说，通过感染宿主生物导致致死率和/或发病率降低的病毒。减毒痘病毒的实例为本领域的技术人员所公知。减毒牛痘病毒的一个例子为MVA株，尤其是保藏于ECACC保藏编号为V00083008的病毒株(参见上文)。
术语“重组病毒”指任何在其病毒基因组中插入了异源基因的病毒，其中所述异源基因并非该病毒基因组的天然部分。异源基因可以是治疗基因，编码含有至少一种引起免疫反应的表位的多肽的基因，反义表达盒或核酶基因。构建重组病毒的方法为本领域技术人员公知。最优选的痘病毒载体为MVA，尤其是MVA 575和MVA-BN(参见上文)。
与此前的现有技术教导相反，本发明的发明人发现，在26℃至37℃之间的6个温度中，痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒，在37℃温育(培养)时，扩增效率最低。令人意外的发现，如果使病毒生产细胞在低于37℃培养，则扩增痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒的方法会导致病毒产量提高；优选的温度为36.5℃至26℃之间或大约26℃至大约36℃之间，更优选的为28℃至33℃之间，进一步更优选的为28℃至32℃之间，最优选的为30℃。
另一优选的温度范围为30℃至36.5℃。在30℃至35℃，30℃至33℃和30℃至32℃能获得特别好的结果。最优选的温度为30℃。
与温度值相连的术语“大约”优选的指特别提到的温度以及比该特别提到的温度高或低最多0.5℃的温度。举例来说，“大约”30℃的温度可以理解为温度范围在29.5℃到30.5℃之间。
更普遍的意义上，在根据本发明的方法中，每种痘病毒是在低于作为该痘病毒天然宿主的动物(包括人)的体温的温度条件下培养感染细胞而生产的。至于痘苗病毒，水牛被认为是其天然宿主(Baxby，D.：Jenner’ssmallpox vaccine：the riddle of vaccinia Virus and its origin.London：HeinemannEducational；1981：1-214)。
病毒生产细胞优选培养至少24小时，更优选培养至少2天或至少3天。一般的，无病毒的细胞在37℃培养直至获得足够量的细胞。然后，在该细胞培养物中接种病毒，并将温度降至上述指出的温度。在另一实施方案中细胞培养物在接种病毒前温度即降至上述温度。
感染前细胞培养所采用的培养基和根据本发明方法生产病毒时采用的培养基可以相同或不同。所有的培养基都采用本领域熟练技术人员公知的传统标准培养基。如果需要，可以向其中进一步加入添加剂例如抗生素，附加的氨基酸和/或胎牛血清。
根据优选实施方案，在本发明生产方法中所采用的培养基不含脂质或表面活性剂，以便稳定病毒脂质包膜。更优选的，在本发明方法所采用的培养基不含下述任何稳定剂：Pluronic F-68，Pluronic F-68和Tween-80TM的混合物或含有胆固醇，鳕鱼肝油，Pluronic F-68，d-α-生育酚乙酸酯和Tween 80的浓缩脂质(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD，catalogue no：21900-014)。
就脊椎动物痘病毒而言，根据本发明的方法中可以采用的细胞为本领域的技术人员所公知。所述细胞的类型和特性要求并不严格，只要这些细胞能被各自病毒感染，和只要上述感染细胞能生产子代病毒。优选的，感染复数应小于1。
特别优选的细胞为脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞或禽类细胞。
根据本发明的优选实施方案，可用于本发明方法的适合痘苗病毒，尤其是痘苗病毒株Elstree和MVA的脊椎动物细胞为鸡胚成纤维细胞(CEF)。尤其出人意料之外的是，根据本发明的方法可用于CEF细胞，因为小鸡平均体温为41℃。因此，本发明中所采用的在37℃以下，优选介于36.5℃至26℃之间，更优选的介于28℃至33℃之间，进一步更优选的介于28℃至32℃之间，最优选的为30℃的温度与小鸡的正常体温差别很大，以致于一般认为在这些温度中这些细胞不能用于痘苗病毒增殖。对于30℃至36.5℃，30℃至33℃，30℃至32℃，尤其是30℃的温度范围也会存在相同的考虑。
此外，根据本发明的方法优选在静止烧瓶(stationary flask)中进行。
另一优点在于该方法使“普通”病毒株产量增加，而不需要为了降低温度而进行温度敏感突变或长时间、复杂的减毒。换句话说，不需要采用温度减毒突变株或温度敏感突变体在低于37℃的温度中产生更多的病毒粒子。
对于温度减毒病毒或温度敏感突变体，已知的是它们在较低温度能更好地增殖，但是，这样的毒株通常比非减毒株或非温度敏感突变体的繁殖力低。因此，本发明方法的优点在于，它可以应用于任何种类的正常、高繁殖力病毒株。
根据本发明制备的病毒优选用作疫苗或用于制备基因治疗方案中使用的组合物。痘病毒的这种应用为本领域现有技术。
附图简述
图1
图1中，来自实验1的每个数值都做双份(以圆点表示)。柱表示平均值。每个数值对应于表1。
图2
图2中，来自实验2的每个数值做双份(以圆点表示)。柱表示平均值。每个数值对应于表2。
图3
图3中的圆点代表来源于采用4个不同温度(实验3)进行的实验所得的单个数值。柱表示平均值。每个数值对应于表3。
图4
图4中的圆点代表来源于采用4个不同温度(实验4)进行的实验所得的单个数值。柱表示平均值。每个数值对应于表4。
图5
图5中柱表示在30℃和37℃下三项平行实验所得的平均值。单个数值对应于表5。
发明简述
本发明涉及如下实施方案：
制备痘病毒，尤其是脊椎动物痘病毒的方法，其特征在于病毒在低于37℃的温度中增殖；
上述制备方法，其特征在于所述病毒在介于大约26℃到大约36℃的培养温度中增殖；
上述制备方法，其特征在于所述病毒在介于大约28℃到大约33℃的培养温度中增殖；
上述制备方法，其特征在于所述病毒在介于大约30℃到大约33℃的培养温度中增殖；
上述制备方法，其特征在于所述病毒在大约30℃的培养温度中增殖；
上述制备方法，其特征在于所述病毒增殖时间至少为24小时；
上述制备方法，其特征在于所述病毒增殖时间至少为2至3天；
上述制备方法，其特征在于所述痘病毒为用作疫苗或基因治疗载体的病毒；
上述制备方法，其特征在于所述痘病毒选自禽痘病毒和正痘病毒；
上述制备方法，其特征在于所述病毒为痘苗病毒；
上述制备方法，其特征在于所述病毒为改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，优选的为保藏于ECACC保藏编号为No.V00083008的MVA-BN病毒或其衍生物；
上述制备方法，其特征在于是在静止烧瓶中进行的；
上述制备方法，其特征在于所述痘病毒不为温度敏感突变病毒；
上述制备方法，其特征在于所述痘病毒不为温度减毒病毒；
上述制备方法，其特征在于所述病毒是在鸡胚成纤维细胞中增殖的；
根据上述任一种方法所制备出的病毒；
一种包含上述病毒的组合物；
一种包含上述病毒的疫苗；
一种用于基因治疗的组合物，包含根据上述任一种方法所制备出的病毒的病毒基因组；
根据上述任一种方法制备的病毒作为疫苗的应用；
根据上述任一种方法处理的病毒在基因治疗中的应用。
实施例
采用进一步的实施例进一步详述本发明。
实施例1：温度对MVA增殖的影响
细胞培养条件
原代CEF-细胞接种于静止烧瓶中，滋养细胞的密度为2×107CEF细胞/185cm2。细胞接种于VP-SFM+4mM L-谷氨酰胺和1％抗生素/抗真菌剂中。接种后第4天，预期细胞密度达到5×107CEF细胞/185cm2。采用RPMI w/oFCS使细胞感染上0.1TCID50/细胞的MVA-BN(保藏于ECACC保藏编号为No.V00083008)。感染，以及随后的72小时培养，都是在30℃和37℃(实验1和实验2，采用两种不同的CEF制剂)，在30℃，33℃，35℃，和37℃(实验3)，在26℃，28℃，30℃，和33℃(实验4)。在每一温度做平行双份实验。通过将细胞刮至培养基中，并在-20℃冷冻培养基和细胞来终止病毒复制。将该混合物另外冻/融两次，使病毒在机械作用下从细胞中释放。在用4种不同感染温度进行的实验中，病毒复制是通过将静止烧瓶置于于-20℃冷冻来终止的。将该混合物另外冻/融三次从而使病毒在机械作用下从细胞中释放。
通过免疫组织化学分析测量每一静止烧瓶中的病毒滴度。感染细胞用痘苗病毒特异性抗体染色。然后，加入对抗痘苗病毒抗体的HRP-偶联抗体。在加入底物后，感染细胞呈蓝色或棕色。用Spearman和Kaerber的公式计算TCID50/ml值(组织培养感染剂量)，以便对上述分析进行评价。所有实验均平行双份。作为滴定结果的可接受的标准，采用已知滴度的MVA-BN标准品作为每次滴定实验的内部对照。只有当整体平均MVA-BN标准品的测量值相对于总体平均值的偏差不超过±0.5logs时，实验测量结果才认为是可接受的。
结果
为了包括原代CEF细胞的可能的生长变异，在比较30℃和37℃感染温度时，采用了两种不同的细胞制剂进行实验。该两组独立感染实验的结果在表1-2和图1-2中列出。
实验1和2的结果显示了同37℃条件下比较，在30℃条件下病毒产量明显增加。实验1中增加量为0.5logs，实验2中增加量为0.7logs。
表1：表1显示了来源于实验1的测量值。
| 病毒滴度[TCID50/ml]，30℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]，37℃ | |
| 烧瓶a | 7,50E+07 | 3,20E+07 |
| 烧瓶b | 1,30E+08 | 3,20E+07 |
| 平均值 | 1,00E+08 | 3,20E+07 |
表2：表2显示了来源于实验2的测量值。
| 病毒滴度[TCID50/ml]，30℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]，37℃ | |
| 烧瓶a | 1,30E+08 | 3,20E+07 |
| 烧瓶b | 1,30E+08 | 2,40E+07 |
| 平均值 | 1,30E+08 | 2,70E+07 |
前两个实验的数据充分表明，通过在感染后降低培养温度，可使MVA产量提高。因此，决定继续进行实验并尝试其他的温度条件，从而选出最佳感染温度。所采用的温度为30℃，33℃，35℃和37℃。该实验的结果显示在表3和图3中。
比较37℃和其他低感染温度(35℃，33℃，30℃)的产量，结果显示在较低温中产量明显增加。在本实验中30℃感染温度中获得最佳病毒滴度[TCID50/ml]，与37℃相比滴度增加了0.8logs。
表3：表3显示了来源于30℃，33℃，35℃和37℃条件下的病毒滴度[TCID50/ml]。
| 病毒滴度[TCID50/ml]30℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]33℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]35℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]37℃ | |
| 烧瓶a | 1,30E+08 | 5,60E+07 | 3,20E+07 | 3,20E+07 |
| 烧瓶b | 1,30E+08 | 1,00E+08 | 7,50E+07 | 1,30E+07 |
| 平均值 | 1,30E+08 | 7,50E+07 | 4,90E+07 | 2,10E+07 |
在接下来在静止烧瓶中进行的实验中，测试低于30℃的温度，以确定30℃是否真的是在CEF细胞中增殖MVA的最佳温度。因此，采用了26℃，28℃，30℃和33℃的温度。该实验的结果显示在表4和图4中。
表4：表4显示了来源于26℃，28℃，30℃和33℃条件下的病毒滴度[TCID50/ml]。
| 病毒滴度[TCID50/ml]26℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]28℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]30℃ | 病毒滴度[TCID50/ml]33℃ | |
| 烧瓶a | 3,20E+07 | 1,00E+08 | 4,20E+08 | 1,80E+08 |
| 烧瓶b | 1,00E+08 | 1,80E+08 | 2,40E+08 | 1,00E+08 |
| 平均值 | 5,60E+07 | 1,30E+08 | 3,20E+08 | 1,30E+08 |
实验显示在感染后培养温度在30℃时获得最高产量。比较本实验结果与以前实验(30℃至37℃间的4个温度)结果表明，对于在静止烧瓶中的CEF细胞中增殖培养MVA来说，感染后在30℃培养为最佳温度。
分析这两个实验中每一温度中的病毒滴度，结果清楚表明，在所用的6个温度中，37℃的病毒产量最低。不同温度的产量排序如下：
30℃＞33℃/28℃＞35℃/26℃＞37℃。
实施例2：温度对痘苗病毒株Elstree增殖的影响
另一方面，除了MVA-BN外，还测试了痘苗病毒株Elstree对温度的依赖性。MVA-BN和Elstree在CEF-细胞中增殖。在本实验中，原代CEF-细胞接种于静止烧瓶中培养，滋养细胞的密度为2E+07CEF细胞/175cm2。细胞接种在培养基+4mM L-谷氨酰胺和1％抗生素/抗真菌剂中。接种后第4天，预期细胞浓度达到5E+07CEF细胞/175cm2。用RPMI w/o FCS使细胞感染0.1TCID50/细胞的MVA-BN，或者使细胞感染Elstree。感染以及随后的72小时培养都是在30℃和37℃进行。每一温度进行平行3份实验。通过将静止烧瓶置于于-20℃冷冻来使病毒复制停止。该混合物另外冻/融三次从而使病毒在机械作用下从细胞中释放。根据SOP/MVA/04滴定法测量每一静止烧瓶中的病毒滴度。作为滴定结果的可接受的标准，采用已知滴度的MVAF6标准品作为每一滴定实验的内部对照。只有当MVA F6标准品的测量值偏差不超过±0.5logs，实验结果才认为是可接受的。
感染试验的结果见表5和图5。
采用MVA-BN进行的实验结果显示，相对于37℃，30℃条件下病毒产量明显提高(0.667logs)。在采用Elstree进行的实验中，相对于37℃，30℃条件下病毒产量提高1.125logs。
表5：表5显示了在30℃和37℃条件中MVA-BN和痘苗病毒株Elstree的病毒滴度[log10TCID50/ml]。
| MVA30℃ | MVA37℃ | Elstree30℃CEF细胞 | Elstree37℃CEF细胞 | |
| 烧瓶a | 9,0 | 7,88 | 7,25 | 6,375 |
| 烧瓶b | 8,0 | 8,0 | 8 | 6,5 |
| 烧瓶c | 8,25 | 7.38 | 7,5 | 6,5 |
| 平均值 | 8,42 | 7,75 | 7,583 | 6,458 |
Claims (23)
1.一种制备脊椎动物痘病毒的方法，其特征在于病毒以低于37℃的温度在培养基中增殖。
2.根据权利要求1的方法，所述的脊椎动物痘病毒在约26℃至约36℃增殖。
3.根据权利要求1到2中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒在约30℃至约35℃增殖。
4.根据权利要求1到3中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒在约30℃增殖。
5.根据权利要求1到4中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒增殖至少24小时。
6.根据权利要求1到5中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒增殖至少2到3天。
7.根据权利要求1到6中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒为用作疫苗或基因治疗载体的病毒。
8.根据权利要求1到7中的任何一项的方法，所述的脊椎动物痘病毒选自包括禽痘病毒和正痘病毒的一组病毒。
9.根据权利要求8的方法，所述的正痘病毒为痘苗病毒。
10.根据权利要求9的方法，所述痘苗病毒选自毒株Elstree和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，优选保藏于ECACC保藏编号为No.V00083008的MVA-BN或其衍生物。
11.根据权利要求1到10中的任何一项的方法，所述方法是在静止烧瓶中进行的。
12.根据权利要求1到11中的任何一项的方法，所述痘病毒不为温度敏感突变病毒。
13.根据权利要求1到12中的任何一项的方法，所述痘病毒不为温度减毒病毒。
14.根据权利要求1到13中的任何一项的方法，所述痘病毒在鸡胚成纤维细胞中增殖。
15.根据权利要求1到14中的任何一项的方法，其中未向培养基中添加脂质或表面活性剂。
16.根据权利要求1到15任何一项限定的方法所制备出的病毒。
17.包含根据权利要求16所述病毒的组合物。
18.包含根据权利要求16所述病毒的疫苗。
19.根据权利要求17所述的组合物，用作疫苗或在基因治疗中应用。
20.包含根据权利要求16所述病毒的病毒基因组的组合物。
21.根据权利要求20所述组合物，在基因治疗中应用或用作疫苗。
22.根据权利要求16所述的病毒或根据权利要求17或20之一所述组合物作为疫苗的应用。
23.根据权利要求16所述的病毒或根据权利要求17或20之一所述组合物在基因治疗中的应用。
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