ES2224210T3 - Vacuna de neospora viva atenuada. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA CULTIVOS VIVOS ATENUADOS DEL PARASITO PROTOZOO PATOGENO NEOSPORA, Y VACUNAS VIVAS CONTRA NEOSPOROSIS PREPARADAS A PARTIR DEL MISMO QUE SON UTILES EN LA PREVENCION DE ENFERMEDADES CLINICAS Y ABORTOS EN MAMIFEROS.

Description

Vacuna de Neospora viva atenuada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas atenuadas del protozoo patógeno Neospora, y a vacunas atenuadas frente a la neosporosis preparadas a partir de las cepas atenuadas, que son útiles en la prevención de enfermedades clínicas y el aborto en mamíferos.

Antecedentes de la invención

Neospora es un protozoo patógeno parásito de animales que se ha reconocido recientemente como una causa principal del aborto, la muerte neonatal, la infección congénita y la encefalitis en mamíferos. Dubey and Lindsay, 1993, Parasitology Today, 9:452-458. N. caninum infecta a perros e infecta de manera congénita a los cachorros, produciendo frecuentemente parálisis. Los taquizoítos de N. caninum se han aislado de cachorros infectados de forma natural. Lindsay and Dubey, 1989, J. Parasitol. 75: 163-165. Las especies de Neospora son una causa principal del aborto en el ganado lechero. En cabras, ovejas y caballos se han descrito casos de enfermedad relacionada con Neospora, es decir, neosporosis.

Aunque N. caninum es similar superficialmente al patógeno, Toxoplasma gondii, N. caninum y T. gondii se han diferenciado unos de otros de forma antigénica y ultrastructural. Dubey and Lindsay, 1993, citado anteriormente. Además, los parásitos protozoarios similares a Neospora, aislados de los cerebros de fetos bovinos abortados y cultivados in vitro de forma continua mostraron ser antigénica y ultrastructuralmente distintos de T. gondii y Hammondia hammondi, y más parecidos a N. caninum. Conrad et al., 1993, Parasitology 106:239-249. Más aún, el análisis de los genes del ARN ribosómico de la subunidad pequeña nuclear reveló que no había diferencias de nucleótidos entre las especies de Neospora aisladas del ganado y de perros, pero mostró diferencias consistentes frente a T. gondii. Marsh et al., 1995, J. Parasitol. 81:530-535.

Se ha confirmado el papel etiológico de una cepa bovina de Neospora en el aborto y la enfermedad congénita bovinas. Barr et al., 1994, J. Vet. Diag. Invest. 6:207-215. Se ha desarrollado un modelo de neosporosis en el sistema nervioso central de roedores, utilizando ratones BALB/c endogámicos infectados por N. caninum. Lindsay et al., 1995, J. Parasitol. 81:313-315. Además, se han descrito los modelos para estudiar la transmisión transplacentaria de N. caninum en ratones preñados exogámicos y endogámicos por Cole et al., 1995, J. Parasitol. 81:730-732, y por Long et al., 1996, J. Parasitol. 82:608-611, respectivamente. Más aún, se ha mostrado un modelo experimental de cabra enana N. caninum que se asemeja íntimamente al aborto inducido por Neospora en ganado ocurrido de forma natural. Lindsay et al., 1995, Am. J. Vet. Res. 56:1176-1180.

El documento WO 9525541 describe un cultivo biológicamente puro de Neospora bovina, los procedimientos para detectar anticuerpos anti-Neospora y ácidos nucleicos específicos de Neospora, y una composición que contiene un antígeno de Neospora bovina y un vehículo para su uso como vacuna. Sin embargo, el documento WO 9525541 no muestra cultivos vivos atenuados de Neospora, o vacunas atenuadas preparadas a partir de éstas, que son capaces de desencadenar una respuesta inmune protectora en un animal vacunado.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona cultivos celulares de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que protege al mamífero frente a la neosporosis, cuando se administra en forma de vacuna atenuada.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona vacunas para proteger a un mamífero frente a la neosporosis, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que protege al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra en forma de vacuna atenuada, y un vehículo veterinariamente aceptable. Las vacunas de la invención pueden comprender además uno o más componentes incluyendo, por ejemplo, un adyuvante. Las vacunas de la presente invención se pueden administrar a cualquier especie de mamíferos susceptible de infección y enfermedad causada por Neospora incluyendo, pero sin limitarse a perros, vacas, cabras, ovejas y caballos.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de cultivos de células atenuadas a partir de una cepa patógena de Neospora para su uso en una vacuna que proteja a un mamífero frente a la neosporosis, y que comprende la modificación de las células a partir de una cepa original patógena de una especie de Neospora; la selección y propagación clonal de una o más células modificadas que exhiban una patogenia atenuada comparada con las células de la cepa original; y la selección y propagación clonal de una o más células atenuadas que sean capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna atenuada.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de una vacuna que proteja a un mamífero frente a la neosporosis, y que comprende la modificación de células a partir de una cepa original patógena de una especie de Neospora; la selección y propagación clonal de aquellas células modificadas que exhiban una patogenia atenuada comparada con las células de la cepa original pero que sean capaces de desencadenar una respuesta inmune en el mamífero que proteja a frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna atenuada; y la combinación de una cantidad inmunológicamente eficaz de las células atenuadas con un vehículo veterinariamente aceptable de forma adecuada para la administración en forma de vacuna atenuada al mamífero.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para la vacunación un mamífero frente a la neosporosis, comprendiendo la administración al mamífero una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna que comprende células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada, y un vehículo veterinariamente aceptable.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona vacunas mixtas, que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original, pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada; uno o más otros antígenos que desencadenan una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a una enfermedad o un estado patológico; y un vehículo veterinariamente aceptable. Las vacunas mixtas puede comprender además uno o más otros componentes incluyendo, por ejemplo, un adyuvante.

Descripción detallada de la invención

Los Solicitantes han descubierto que se pueden atenuar las células de una cepa patógena de una especie de Neospora, y que las células atenuadas resultantes son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja a mamíferos frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada. Por lo tanto, la presente invención proporciona cultivos celulares de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja a un mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenua-
da.

La presente invención proporciona además procedimientos para preparar cultivos de células atenuadas de una especie de Neospora para su uso en una vacuna que proteja a un mamífero frente a la neosporosis, comprendiendo la modificación de células a partir de una cepa original patógena de una especie de Neospora, por ejemplo, por un número elevado de pases sucesivos, o por exposición a un agente mutágeno, o mediante ingeniería genética utilizando técnicas de ADN recombinante; la selección y propagación clonal de una o más células modificadas que exhiban una patogenia atenuada comparada con las células de la cepa original; y la selección y propagación clonal de una o más células atenuadas que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna atenuada.

Como se usa en la presente memoria, el término "neosporosis" se refiere a la infección de un mamífero por una especie o una cepa de Neospora, o a cualquier síntoma clínico, dolencia, suceso o patología asociados con la infección del mamífero por Neospora.

El término "atenuado" como se usa en la presente memoria describe una célula, un cultivo, o una cepa de Neospora que exhibe una reducción detectable de la infectividad o la virulencia in vitro o in vivo comparada con la de la cepa original de Neospora de la que proceden la célula, el cultivo o la cepa atenuadas. La reducción de la virulencia abarca cualquier disminución detectable en cualquier característica de virulencia, incluyendo la infectividad in vitro o in vivo, o cualquier descenso en la gravedad o en la velocidad de progresión de cualquier síntoma clínico o dolencia asociados con la infección.

El término "cepa original" se refiere a una cepa de Neospora que, cuando se administra a un mamífero, exhibe un grado relativamente mayor de patogenia que una cepa atenuada que procede de aquella por uno o más pases in vivo o in vitro y/o una o más etapas de atenuación.

La presente invención incluye además la preparación y el uso en una vacuna de células de una cepa de Neospora derivada de una cepa o una especie que no es patógena, en una especie concreta de mamíferos, pero cuyas células se han modificado por medios genéticos o químicos para que sean capaces de desencadenar una respuesta inmune protectora en los miembros de esa especie de mamíferos.

Las células atenuadas vivas de la invención son capaces de inducir una respuesta inmune que proteja a un mamífero frente a la neosporosis después de una o más administraciones en forma de vacuna atenuada. Una "respuesta inmune protectora" se define como cualquier respuesta inmunológica, bien por un anticuerpo o inmunidad celular, o ambas, que tiene lugar en el mamífero que previene o reduce de manera detectable la infección posterior, o elimina o reduce de manera detectable la gravedad, o ralentiza de forma detectable la velocidad de progresión de uno o más síntomas clínicos o dolencias asociadas con la neosporosis. La expresión "cantidad inmunológicamente eficaz" se refiere a aquella cantidad o dosis de vacuna o antígeno que desencadena una respuesta inmune protectora cuando se administra a un mamífero.

Preparación de cepas atenuadas de Neospora

Debido a que la invención se basa en el descubrimiento de que se pueden atenuar las células de una cepa patógena de Neospora, y que las células atenuadas resultantes son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja a un mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada, la práctica de la invención no está limitada a ningún procedimiento particular de atenuación. Preferiblemente, la atenuación de las células de una cepa patógena de Neospora se puede realizar por cualquier técnica o procedimiento conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, un número elevado de pases sucesivos, o la exposición a un agente mutágeno, o mediante ingeniería genética utilizando la tecnología del ADN recombinante, o por alguna combinación de éstos.

El elevado número de pases sucesivos se puede realizar mediante pases repetidos in vitro de las células de una cepa patógena de Neospora en células huésped susceptibles hasta que tenga lugar la atenuación. Los pases se pueden llevar a cabo en condiciones medioambientales específicas para seleccionar las células atenuadas. Por ejemplo, los pases se pueden llevar a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura corporal del mamífero vacunado pretendido para seleccionar las cepas sensibles a la temperatura de Neospora que no crecerán, o que solamente crecerán a velocidad reducida, cuando se administran al mamífero en una vacuna.

La mutagénesis se puede realizar mediante la exposición de células de Neospora bien a un mutágeno químico o a radiación, como se describe en la técnica. Un ejemplo no limitante de un mutágeno químico útil en la práctica de la invención es la N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) (Sigma), cuyo uso se describe más adelante en el ejemplo 1. La radiación se puede seleccionar bien de la luz ultravioleta bien de la radiación ionizante.

El grado de exposición del mutágeno, esto es, la concentración del mutágeno químico, o el nivel de radiación, así como la duración de la exposición, es preferiblemente aquella cantidad que da lugar a la producción de una o más células viables de Neospora que exhiben un nivel atenuado de patogenia pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja a frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada a un mamífero. Los parámetros apropiados para el uso de agentes mutágenos se puede determinar empíricamente utilizando técnicas estándar.

Las cepas patógenas de Neospora se pueden atenuar también utilizando la tecnología del ADN recombinante según las técnicas conocidas en la técnica, y la presente invención pretende abarcar tales cepas y vacunas modificadas preparadas de este modo. Los ejemplos no limitantes de técnicas de ADN recombinante que se pueden utilizar para practicar la invención incluyen la sustitución de genes o la inexpresión de genes para desactivar uno o más genes, produciendo una cepa con una patogenia atenuada. Los genes que se pueden desactivar incluyen, por ejemplo, un gen metabólico esencial, o un gen que codifica un factor de virulencia, o un gen que codifica un antígeno de superficie que desempeña un papel en la modulación de la respuesta inmune en el huésped mamífero.

Un ejemplo no limitante de un gen metabólico esencial que se puede reconocer de manera útil para su interrupción en el genoma de Neospora es el gen de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS). Titus et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10267-10271, describe la inexpresión del gen de DHFR-TS para producir una vacuna segura atenuada frente a Leishmania. Mediante la interrupción del gen de DHFR-TS en Neospora, se crearán mutantes auxótrofos que necesitan timidina para su crecimiento continuo, que exhiben una patogenia atenuada, y que son capaces de desencadenar una respuesta inmune en un mamífero que proteja a frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada.

Las técnicas de ADN recombinante para la sustitución génica o la inexpresión de genes se conocen en la técnica e incluyen, sin limitarse a, aquellas que utilizan la recombinación homóloga. Por ejemplo, las células de una cepa patógena de Neospora se pueden transformar o transfectar con un vector, tal como un plásmido, que comprende secuencias homólogas de nucleótidos que normalmente flanquean o se localizan dentro de, por ejemplo, un gen metabólico esencial, preferiblemente un gen de copia única, en una cepa patógena de Neospora. Entre o dentro de las secuencias homólogas de nucleótidos, el vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que corresponda con la secuencia de nucleótidos en la cepa patógena, pero que sea defectuosa como resultado, por ejemplo, de un cambio o una deleción "no silente" en uno o más nucleótidos, comparada con la secuencia de la cepa patógena. La transformación de una célula de la cepa patógena con el vector continúa con la integración de la secuencia génica defectuosa en el genoma de Neospora, que también sirve para sustituir la secuencia original o "natural". Por lo tanto, el gen reconocido se desactiva en la célula transformada. Las células transformadas se pueden examinar después para aquellas células que exhiben una patogenia atenuada. Las células transformadas que exhibían una patogenia atenuada se pueden examinar después de nuevo para aquellas células que son capaces de desencadenar una respuesta inmune en un mamífero que proteja a frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada.

Para ayudar en la selección de transformantes, el vector se puede diseñar para comprender además una secuencia codificante de un producto de un gen indicador u otro marcador seleccionable. Los genes indicadores que pueden ser útiles en la invención se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, el gen que codifica la cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) o el gen que codifica la luciferasa. Un ejemplo adicional no limitante de un gen indicador es una secuencia que codifica la beta-galactosidasa de E. coli, la cual se puede insertar en el vector y utilizarse para confirmar transformantes mediante la detección de la actividad enzimática a través de la conversión de un sustrato tal como, por ejemplo, el beta-D-galactopiranósido rojo, hacia un producto coloreado. Seeber and Boothroyd, 1996, Gene, 169:39-45, utilizaron esta enzima indicadora para detectar transformantes en Toxoplasma gondii.

En la técnica se conocen bien las secuencias codificantes que codifican marcadores seleccionables que pueden ser útiles en la invención, e incluyen aquellos que codifican productos de genes que confieren resistencia a antibióticos o a antimetabolitos, o que proporcionan una necesidad auxótrofa. Los ejemplos de tales secuencias incluyen aquellos que confieren resistencia a higromicina, a neomicina o a fleomicina. Un ejemplo del uso de un marcador de resistencia a un antibiótico en un patógeno diferente se presenta en Messina et al., 1995, Gene, 165:213-217, que describe el uso de un marcador de resistencia a fleomicina para construir transformantes estables en T. gondii.

Cualquier secuencia codificante para un producto de un gen indicador o marcador seleccionable se debería insertar preferiblemente en el vector en asociación operativa con una secuencia que codifique un elemento regulador. Como se usa en la presente memoria, un "elemento regulador" incluye, pero no se limita a, promotores, intensificadores, operadores y otros elementos inducibles y no inducibles conocidos en la técnica que sirven para dirigir y/o regular la expresión. También, como se usa en la presente memoria, una secuencia de ADN codificante se encuentra en "asociación operativa" con uno o más elementos reguladores en los que los elementos reguladores regulan de manera eficaz y permiten la transcripción de la secuencia de ADN codificante y/o la traducción del correspondiente ARNm. Por ejemplo, los vectores para la expresión del marcador seleccionable en las células de Neospora se pueden construir al flanquear el marco de lectura abierto ble (siglas en inglés, ORF) con regiones reguladoras de los genes de Neospora o de las íntimamente relacionadas Apicomplexa y Toxoplasma. Para expresar ble se pueden usar las regiones flanqueantes 5' de diferentes genes de copia única de Neospora o Toxoplasma. Los ejemplos de genes de copia única de Toxoplasma son: (i) SAG1, que codifica el principal antígeno de superficie de taquizoíto, p30. (Burg et al., 1988, J. Immunol. 141:3584-3591); (ii) GRA1, que codifica una proteína secretora, p23 (Cesbron-Delauw et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:7537-7541); y (iii) GRA2, que codifica una proteína secretora, p28 (Mercier et al., 1993, Mol. Biochem. Parasitol. 58:71-82). Los ejemplos de genes de copia única de Neospora incluyen: (i) homólogos de los genes SAG1, GRA1 y GRA2 de Toxoplasma, identificados utilizando procedimientos estándar de PCR de acuerdo con, por ejemplo, las secuencias de Toxoplasma; (ii) el gen que codifica la principal proteína de la superficie celular, NC-p43, de los taquizoítos de N. caninum (Hemphill, 1996, Infect. Immun. 64:4279-4287); y (iii) los genes que codifican las proteínas excretoras/secretoras inmunodominantes de 17, 29, 30 y 37 kDa (Bjerkas et al., 1994, Clin. Diag. Lab. Immun. 1:214-221). La región flanqueante 3' del gen SAG1 se puede utilizar para proporcionar una secuencia de poliadenilación. El vector base para la inserción del promotor 5', el gen ble, y las secuencias de poliadenilación en 3' puede ser cualquier plásmido estándar disponible comercialmente, tal como pBLUESCRIPT™ (Stratagene).

Una vez que se construye un vector apropiado, se usa para transformar o transfectar una o más células a partir de una cepa original de Neospora. El vector se puede introducir en las células de acuerdo con técnicas conocidas, incluidas, pero no limitadas a la electroporación, la microinyección, la transfección vírica, la transfección mediada por liposomas, el bombardeo con microproyectiles, etc.

Una vez que el vector se introduce en las células de Neospora, la presencia, la integración y el mantenimiento de la secuencia codificante introducida en el genoma de la célula huésped, o episómicamente, se puede confirmar y monitorizar mediante técnicas estándar incluyendo, pero sin limitarse a, el análisis por hibridación Southern; el análisis por PCR, incluida la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR); los inmunoensayos o ensayos colorimétricos para el producto proteico esperado; la detección de la presencia o la ausencia de una función de gen marcador, tal como la aparición de un nuevo auxotrofismo; o mediante la detección de una atenuación en la patogenia.

En las siguientes publicaciones se describen los ejemplos de construcción de vectores, transformación, selección de transformantes, expresión en células huésped, etc., aplicados específicamente a los protozoos patógenos: Seeber and Boothroyd, 1996, citado anteriormente; Titus et al., 1995, citado anteriormente; Messina et al., 1995, Gene, 165:213-217; Sibley et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5508-5512; Donald and Roos, 1994, Mol. Biochem. Parasitol., 63:243-253; Kim et al., 1993, Science, 262: 911-914; Ryan et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8609-8613; Soldati and Boothroyd, 1993, Science, 260: 349-352; Eid and Sollner-Webb, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2118-2121; LeBowitz et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9736-9740; Lee and Van der Ploeg, 1990, Science, 250:1583-1586; Asbroek et al., 1990, Nature, 348:174-175; Cruz and Beverley, 1990, Nature, 348:171-173; y Laban et al., Nature, 343:572-574.

Las técnicas generales de recombinación genética, incluyendo construcción de vectores, transformación, selección de transformantes, expresión en células huésped, etc., se describen además en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Innis et al. (editores), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego, Ca.; y Erlich (editor), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, Nueva York.

Después de la etapa de atenuación, las células que exhiben uno o más indicadores de patogenia atenuada se seleccionan del cultivo y se propagan de forma clonal después de limitar la dilución. Los ejemplos de tales indicadores incluyen, pero no se limitan a, la aparición de una nueva sensibilidad a temperatura o un nuevo auxotrofismo in vitro, o una reducción en una característica de virulencia tal como la infectividad o la gravedad o la velocidad de progresión de uno o más síntomas o estados en un mamífero tras la administración de células de la cepa en comparación con la infección con la cepa original, entre otros. Un ejemplo particular no limitante de una sensibilidad a la temperatura que es útil en la práctica de la invención es una en la que las células de la cepa atenuada crecerán a 32ºC, pero no a 37ºC. Tal cepa sensible a la temperatura causará la lisis de las células huésped infectadas a 32ºC, dando lugar a la aparición de lesiones o placas en una monocapa de células huésped. Cuando crecen a 37ºC, la cepa atenuada no se replicará suficientemente y por lo tanto dejará de producir placas en las monocapas de células huésped.

Una cepa atenuada de Neospora puede proceder de cualquier cepa patógena de cualquier especie del género incluyendo, pero no limitada a, N. caninum. Un ejemplo no limitante de una cepa patógena particular de N. caninum a partir de la cual puede proceder de manera útil una cepa atenuada, es la cepa NC-1, que está presente en células de riñón de mono MARC145 infectadas, procedentes de American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. (nº de acceso CRL-12231 en ATCC). La cepa NC-1 también se describe en Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193:1259-63. De manera alternativa, las cepas patógenas de Neospora se pueden obtener a partir de tejidos, órganos o líquidos corporales de animales infectados que presentan los síntomas clínicos de neosporosis, utilizando las técnicas estándar de aislamiento descritas, por ejemplo, en las publicaciones revisadas anteriormente. Un ejemplo no limitante de una cepa atenuada elaborada con células vivas, derivada de la cepa NC-1 de N. caninum es NCTS-8, que está presente en células de riñón de mono MARC145 infectadas, procedentes de la ATCC (nº de acceso CRL-12230 en ATCC).

Tanto las cepas originales como las cepas atenuadas de Neospora se pueden cultivar in vitro por infección de cualquier línea celular sensible, preferiblemente una línea celular de mamífero, con taquizoítos de la cepa de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Las líneas celulares de mamíferos en las que se pueden cultivar taquizoítos de Neospora incluyen, por ejemplo, fibroblastos humanos de prepucio (Lindsay et al., 1993, Am. J. Vet. Res. 54:103-106); células del endotelio aórtico cardiopulmonar de bovino (Marsh et al., 1995, citado anteriormente); y monocitos bovinos (Lindsay and Dubey, 1989, citado anteriormente), entre otros. Por ejemplo, los taquizoítos de N. caninum se pueden cultivar en monocapas de fibroblastos humanos de prepucio Hs68 (nº de acceso CRL-1635 en ATCC) (Lindsay et al., 1993, citado anteriormente). Los bradizoítos se pueden cultivar y manipular de forma similar.

Los cultivos celulares de mamífero se pueden crecer, y los cultivos celulares infectados con Neospora se pueden mantener, en uno cualquiera de los diversos medios de cultivo descritos en la técnica. Por ejemplo, los cultivos estacionarios en monocapa de células del endotelio aórtico cardiopulmonar de bovino infectadas con taquizoítos de N. caninum pueden crecerse en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM: Gibco Laboratories, N.Y.), enriquecido con suero de ternera fetal (STF) o suero de equino adulto (SE) inactivado con calor al 10% (v/v), L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 \mug/ml (Conrad et al., 1993, citado anteriormente). Las monocapas de fibroblastos humanos de prepucio Hs68 se pueden mantener en RPMI 1640 (Gibco) conteniendo suero de ternera fetal al 2% (v/v), piruvato sódico 1,0 mM, penicilina1 x 10^{4} U/ml, estreptomicina 1 x 10^{4} \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-2} mM y L-glutamina 0,3 mg/ml (medio de mantenimiento). Los cultivos en monocapa de fibroblastos humanos de prepucio Hs68 infectados con Neospora se pueden mantener en medios idénticos, pero en los que el suero de ternera fetal está aumentado al 10% (v/v) (medio de crecimiento). Las cepas atenuadas de Neospora con nuevos auxotrofismos necesitarán una modificación apropiada del medio de cultivo para proporcionar crecimiento, como se conoce en la técnica.

Los cultivos en monocapa de células de mamífero, infectadas con Neospora, se mantienen típicamente en condiciones estándar de cultivo tisular tales como, por ejemplo, a 37ºC y CO_{2} al 5%. Los taquizoítos se introducen generalmente en cultivos en monocapa sin infectar cuando el 70-90% de las células de mamífero en cultivo se han infectado, lo cual se puede determinar mediante microscopia utilizando técnicas estándar. Los taquizoítos se pueden recoger de los cultivos celulares mamíferos infectados mediante la lisis de las células huésped utilizando técnicas estándar que permitan a los taquizoítos mantener la viabilidad, y recogiendo los taquizoítos por filtración o por centrifugación, por ejemplo.

Preparación y uso de vacunas

La presente invención proporciona vacunas frente a la neosporosis, que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada, y un vehículo veterinariamente aceptable.

La presente invención proporciona además procedimientos para preparar una vacuna que proteja a un mamífero frente a la neosporosis, comprendiendo la modificación de células a partir de una cepa original patógena de una especie de Neospora; la selección y propagación clonal de aquellas células modificadas que exhiban una patogenia atenuada comparada con las células de la cepa original pero que sean capaces de desencadenar una respuesta inmune en el mamífero que proteja a frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna atenuada; y la combinación de una cantidad inmunológicamente eficaz de las células atenuadas con un vehículo veterinariamente aceptable, de forma adecuada para la administración en forma de vacuna atenuada al mamífero.

La presente invención proporciona además procedimientos de vacunación de un mamífero frente a la neosporosis, comprendiendo la administración al mamífero una cantidad inmunológicamente eficaz de una vacuna que comprende células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada, y un vehículo veterinariamente aceptable.

La vacuna de la invención comprende células vivas de una cepa atenuada de Neospora, bien como el único componente antigénico o combinado con uno o más otros antígenos que desencadenan una respuesta inmune que proteja a un mamífero frente a una enfermedad o un estado patológico que pueda estar o no relacionado con la neosporosis. Por lo tanto, la presente invención proporciona además vacuna mixtas, que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna atenuada; uno o más otros antígenos que desencadenan una respuesta inmune que proteja al mamífero frente a una enfermedad o un estado patológico; y un vehículo veterinariamente aceptable. Las vacunas mixtas pueden comprender además uno o más otros componentes incluyendo, por ejemplo, un adyuvante.

La vacuna se administra convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, bien por inyección subcutánea o intramuscular. Sin embargo, la vacuna se puede administrar también mediante vía intraperitoneal o intravenosa, o por otras vías, incluyendo la vía oral, intranasal, rectal o vaginal, y cuando la vacuna se administra de este modo, se selecciona de forma apropiada un vehículo veterinariamente aceptable. La vacuna puede comprender simplemente células atenuadas en el líquido de cultivo, que se administran directamente al mamífero. Alternativamente, la vacuna puede comprender células atenuadas combinadas con un vehículo veterinaria o farmacéuticamente aceptable seleccionado de los conocidos en la técnica, en función de la vía de administración y la capacidad para mantener la viabilidad celular. Los ejemplos no limitantes de tales vehículos incluyen el agua, la solución salina, los vehículos tamponados y similares. Otros vehículos y aditivos adecuados para vacunas se conocen, o serán evidentes, para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 18ª edición, 1990, Mack Publishing.

La vacuna puede comprender además uno o más otros componentes tales como un agente inmunomodulador incluyendo, por ejemplo, la interleucina 1, u otra sustancia inmunoestimulante tal como un adyuvante veterinariamente aceptable. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen los adyuvantes completos e incompletos de Freund, geles minerales incluyendo, por ejemplo, hidróxido de aluminio y formulaciones de aceite en agua o agua en aceite. Los agentes inmunomoduladores se seleccionan en función de su capacidad para mantener tanto la viabilidad de las células atenuadas de Neospora como la capacidad de las células para desencadenar una respuesta inmune protectora en el mamífero vacunado.

Los ejemplos no limitantes de formulaciones de aceite en agua que son útiles como adyuvantes en las vacunas de la invención incluyen las emulsiones 1 a 3, como sigue. La emulsión 1 estaba constituida por: (a) ME6201 (escualeno al 5% v/v, vitamina E al 1,0% v/v, y dispersante Tween™ 80 al 0,8% v/v); (b) preparación de saponina Quil A (QA) (Superfos) (200 \mug/ml); y (c) colesterol (col.) (100 \mug/ml). La emulsión 2 estaba constituida por: (a) ME6201; y (b) amina lipoidal Avridine (1 mg/ml). La emulsión 3 estaba constituida por ME6201 (escualeno al 5% v/v, vitamina E al 1,0% v/v, y dispersante Tween™ 80 al 0,8% v/v).

Mediante métodos convencionales se puede determinar una dosificación eficaz, comenzando con una dosis baja de células atenuadas y aumentando después la dosificación al tiempo que se monitorizan los efectos, y se varía de forma sistemática la dosificación de forma adicional. Cuando se determina una dosificación óptima por animal se tienen que considerar numerosos factores. Entre éstos son primordiales la especie, el tamaño del animal, la edad del animal, el estado general del animal, la presencia de otros fármacos en el animal, la virulencia de una cepa particular de Neospora frente a la cual se está vacunando al animal, y similares. La dosis actual se elegiría preferiblemente después de la consideración de los resultados de otros estudios animales.

Las pautas de vacunación se seleccionan también en función de los factores descritos anteriormente. Los animales se pueden vacunar en cualquier momento, incluyendo justo antes o en el momento de la reproducción. Las administraciones suplementarias, o revacunaciones, pueden ser necesarias para una completa protección. Un procedimiento para detectar si se ha conseguido una protección inmune adecuada es determinar la seroconversión y los valores de anticuerpos en el animal después de la vacunación. Por lo tanto, la vacuna de la invención se puede administrar en cualquier momento durante la vida de un animal concreto a vacunar, dependiendo de varios factores, que incluyen, por ejemplo, el desarrollo cronológico de una epidemia de neosporosis entre otros animales, etc. La vacuna se puede administrar a animales en edad de destete o más jóvenes, o a animales más maduros, por ejemplo, en forma de vacuna pregestacional para proteger frente a la enfermedad congénita o al aborto relacionados con Neospora. La vacunación eficaz puede requerir solamente una primovacunación, o una primovacunación con una o más vacunaciones de refuerzo. Las vacunaciones de refuerzo se pueden administrar en cualquier momento tras la primovacunación dependiendo, por ejemplo, de la respuesta inmune tras la primera vacunación, la gravedad de la epidemia, la virulencia de la cepa de Neospora causante de la epidemia, la salud del vacunado, etc. El desarrollo cronológico de vacunación y el número de revacunaciones, si hubiera, se determinará preferiblemente por un veterinario de acuerdo con el análisis de todos los factores relevantes, algunos de los cuales se han descrito anteriormente.

Las células de Neospora utilizadas en la vacuna son preferiblemente taquizoítos, pero en su lugar pueden ser bradizoítos, u ovoquistes, o alguna combinación de éstos. La concentración de células atenuadas en la vacuna preferiblemente oscila de aproximadamente 1 x 10^{3}/ml a aproximadamente 1 x 10^{8}/ml, y más preferiblemente de aproximadamente 2 x 10^{6}/ml a aproximadamente 2 x 10^{7}/ml. Un volumen adecuado de dosificación oscila de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,0 ml. Por lo general, respecto a un sistema por dosis, el número de células atenuadas administradas a un animal es preferiblemente de aproximadamente 2 x 10^{4} a aproximadamente 2 x 10^{8}; más preferiblemente de aproximadamente 2 x 10^{5} a aproximadamente 2 x 10^{7}; y lo más preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{6} a aproximadamente 1 x 10^{7}.

La vacuna de la invención protege a un mamífero frente a la infección o enfermedad causada por Neospora. La vacuna es útil para proteger tanto a los mamíferos preñados como a los no preñados, incluyendo, pero sin limitarse a especies bovinas, ovinas, caprinas, caninas y equinas, frente a la infección, la enfermedad clínica o el aborto resultantes de la neosporosis. El término "protección" se usa ampliamente y no se limita a la prevención absoluta de la infección por Neospora, pero incluye una reducción en la infectividad, o en la gravedad de una enfermedad o estado derivado de la infección, incluyendo una reducción detectable de uno o más de los efectos o síntomas patológicos derivados de la infección, o una reducción detectable en la velocidad de progresión de uno o más de dichos efectos o síntomas patológicos. La vacuna de la invención es también segura, esto es, no produce enfermedad o efectos secundarios significativos en el mamífero vacunado.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar adicionalmente, pero no limitar, las composiciones y procedimientos de la invención.

Ejemplo 1 Creación de cepas sensibles a la temperatura de N. caninum y análisis de la patogenia en ratones BALB/c

El objeto de este estudio fue la creación de cepas sensibles a la temperatura de N. caninum (NCTS), y el ensayo de la patogenia de estas cepas mediante el análisis de la respuesta de anticuerpos en suero, los quistes tisulares y la producción de lesiones cerebrales, y el desarrollo de los síntomas clínicos en ratones BALB/c, que son conocidos por ser elevadamente susceptibles a la neosporosis.

Materiales y procedimientos

Los taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum (Dubey et al., 1988, citado anteriormente) se clonaron dos veces mediante dilución limitante y se mantuvieron a 37ºC, como se ha descrito (Lindsay and Dubey, 1989, citado anteriormente). Los taquizoítos se propagaron en matraces de 25 cm^{2} y se clonaron en placas de 96 pocillos que contenían monocapas de fibroblastos humanos de prepucio Hs68 (nº de acceso CRL-1635 en ATCC) (Lindsay et al., 1993, citado anteriormente). Las células Hs68 se crecieron previamente en RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal al 2% (v/v), piruvato sódico 1,0 mM, penicilina 1 x 10^{4} U/ml, estreptomicina 1 x to^{4} \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-2} mM y L-glutamina 0,3 mg/ml (medio de mantenimiento). Las monocapas de cultivos celulares infectados se mantuvieron en un medio idéntico, pero en el que el suero de ternera fetal estaba aumentado al 10% (v/v) (medio de crecimiento). Se aisló un clon y se designó en el laboratorio como la línea NC-1-2C, pero de aquí en adelante se menciona simplemente como la cepa NC-1.

Los taquizoítos de la cepa NC-1 se mutagenizaron mediante la exposición a N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (Sigma) 0,5 \muM en medio de crecimiento durante 24 horas, y después se crecieron a 32,5ºC durante 3 meses en células Hs68 en medio de mantenimiento, tras lo cual se clonaron los taquizoítos por dilución limitante. Inicialmente se aislaron doce clones. Para un estudio posterior se seleccionaron tres clones, designados como NCTS-4, NCTS-8 y NCTS-12 (NCTS = N. caninum ,termosensible), después de mantenerse en células Hs68 en cultivo continuo a 32,5ºC durante más de 8 meses en medio de mantenimiento.

El ensayo serológico de los ratones se realizó como sigue. Se usó un ensayo indirecto de anticuerpo immunofluorescente (siglas en inglés, IFAT) (Dubey et al.,1988, citado anteriormente) para analizar los sueros de ratones para la presencia de anticuerpos dirigidos frente a N. caninum. Los sueros de ratón se obtuvieron inmediatamente antes de la inoculación de exposición en los estudios de vacunación. El suero también se obtuvo a partir de todos ratones que sobrevivieron a los experimentos de patogenia. Los sueros se examinaron en diluciones dobles comenzando en 1:50 y se evaluó el criterio de valoración. Los taquizoítos se utilizaron como antígenos. Las muestras positivas exhibieron una completa fluorescencia de superficie para los taquizoítos. Las muestras negativas no mostraron fluorescencia o solamente una fluorescencia en el extremo anterior.

La presencia de lesiones en los cerebro de ratones expuestos a diferentes cepas de N. caninum se determinó como sigue. El cerebro de cada ratón se extrajo en la necropsia, y una primera mitad se fijó en una solución de formol tamponado neutro al 10% v/v para el examen histopatológico. Las secciones de tejido se prepararon utilizando técnicas histológicas habituales, y se tiñeron con hematoxilina y eosina para detectar la presencia de lesiones de forma microscópica.

La evaluación de la lesión de las secciones de cerebro teñidas con hematoxilina y eosina se realizó según los criterios descritos en Lindsay et al, 1995, J. Parasitol. 81:313-315.

1

2

3

Se obtuvo una puntuación media de lesión utilizando los tres valores enumerados antes. Un cerebro de ratón normal y no infectado tendría una puntuación media de lesión de 3,0. Las puntuaciones medias de lesión se evaluaron utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y procedimientos de comparación por distribución libre múltiple. El número de ratones en cada grupo con lesiones se examinó utilizando la prueba exacta de Fisher. La significación estadística se estableció en un límite de P<0,05.

Las secciones de cerebro de cada ratón se examinaron también utilizando un anticuerpo monoclonal murino, 6G7, específico para N. caninum, junto con una ensayo inmunohistoquímico con el complejo de avidina-biotina peroxidasa (ABC), para detectar los estadios de N. caninum (Cole et al., 1993, J. Vet. Diag. Invest. 5:574-589).

La segunda mitad de cada cerebro de ratón se digirió en pepsina-ácido y se usó para inocular cultivos celulares de mamífero para detectar la presencia de quistes tisulares de N. caninum. Para digerir la segunda mitad del cerebro de ratón se introdujo en 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (siglas en inglés, HBSS) y se pasó dos veces a través de una jeringa con una aguja de 0,6 mm de diámetro. Se añadieron tres ml de la solución pepsina-ácido (0,52 g de pepsina, 0,50 g de NaCI, 98,6 ml de H_{2}O destilada, 1,4 ml de HCI concentrado, pH 0,8), al homogeneizado y se incubó durante 10 minutos a 37ºC en un baño de agua. La solución de pepsina ácida se separó por centrifugación y el precipitado, que representa la segunda mitad cerebral completa, se inoculó en un único matraz de cultivo tisular de 25 cm^{2} que contenía una monocapa de fibroblastos humanos de prepucio Hs68 cultivados como se ha descrito antes. Tras 30 minutos, el inóculo se retiró y se lavó la monocapa celular Hs68 y se incubó en medio de mantenimiento reciente como antes. A continuación se examinaron los cultivos celulares durante 30 días para detectar la presencia de N. caninum (Lindsay and Dubey, 1989, citado anteriormente). La patogenia de NC-1 y de las tres cepas NCTS seleccionadas, es decir, NCTS-4, NCTS-8 y NCTS-12, de N. caninum se determinó como sigue. Se inocularon por vía subcutánea ratones BALB/c (8 semanas, hembra) (Harlan Sprague Dawley (HSD)) con HBSS (control), o con 5 x 10^{5} taquizoítos de cada cepa NC-1, NCTS-4, NCTS-8 o NCTS-12 de N. caninum en HBSS (0,5 a 1,2 ml de volumen total). Los ratones supervivientes se examinaron en la necropsia a los 42 ó 56 días post-inoculación (PI) (véase la tabla 1). El suero se extrajo de los ratones supervivientes en la necropsia. Los cerebros de estos ratones se examinaron para la evaluación de la lesión e inmunohistología, y una mitad de cada cerebro se usó para la digestión pepsina-ácido para determinar la presencia de quistes tisulares, como se ha descrito antes.

TABLA 1

4

TABLA 2

5

	a = diferente significativamente respecto al control (HBSS) (P < 0,05).
	b = diferente significativamente respecto a NCTS-4, NCTS-8 y NCTS-12 (P< 0,05).

TABLA 3

6

Resultados

La neosporosis clínica y la mortalidad sucedieron solamente en ratones BALB/c inoculados con la cepa NC-1 (Tabla 1). Solamente uno de cada 10 ratones BALB/c sobrevivieron a la infección por la cepa NC-1. Las cepas NCTS-4, NCTS-8 y NCTS-12 no produjeron mortalidad en ratones BALB/c.

Las puntuaciones medias de lesión se presentan en la Tabla 2. Se encontraron lesiones en los cerebros de algunos ratones inoculados con las cepas NCTS, pero las puntuaciones medias de lesión no fueron estadísticamente significativas al compararlas con el control (HBSS). Se descubrió una diferencia significativa en las puntuaciones medias de lesión y el número de ratones con lesiones cuando se compararon los ratones inoculados con la cepa NC-1 con los ratones inoculados con HBSS (control) o con cualquiera de las cepas NCTS de N. caninum.

Los valores de anticuerpo en suero se presentan en la Tabla 3. En todos los ratones expuestos (30/30) a cepas NCTS se detectaron valores significativos de IFAT (> 400). Esto indica que las cepas NCTS son capaces de estimular una respuesta de linfocitos B en un animal inmunológicalmente intacto, pero genéticamente susceptible. Los valores de IFAT en ratones expuestos a NCTS fueron iguales a, o en algunos caso mayores, que los de los ratones expuestos a NC-1.

Los quistes tisulares no se detectaron en ninguna de las mitades cerebrales utilizando la técnica de digestión pepsina-ácido descrita antes. Esto indica que los quistes tisulares, si existen, son pocos en número en los ratones inoculados con las cepas NCTS o NC-1 de N. caninum.

Ejemplo 2 Análisis de la patogenia de las cepas NCTS de N. caninum en ratones exogámicos HSD:ICR

El objeto de este estudio fue determinar la patogenia de las cepas NCTS de N. caninum en ratones exogámicos HSD:ICR, que son inmunocompetentes y más resistentes a Neospora que los ratones BALB/c endogámicos.

Materiales y procedimientos

En este experimento se usaron ratones HSD:ICR (4 semanas, hembras). Todos los ratones HSD:ICR, excepto los controles, se inocularon con 5 x 10^{5} taquizoítos de la cepa apropiada de N. caninum en HBSS (volumen total 0,5 a 1,2 ml). Los ratones de control se inocularon sólo con HBSS. Todos los ratones supervivientes se sacrificaron a los 56 días PI. El suero se recogió para el ensayo IFAT. Los cerebros de estos ratones se extrajeron y se usó una primera mitad para la evaluación de la lesión e inmunohistología, como antes. La segunda mitad de cada cerebro se usó en la digestión pepsina-ácido para detectar los quistes tisulares, como se ha descrito anteriormente.

Resultados

Ninguna de las cepas analizadas de N. caninum, incluyendo NC-1, produjeron mortalidad en ratones HSD:ICR (Tabla 4), y no se observaron diferencias significativas en una serie de ratones con lesiones o en las puntuaciones medias de lesión, comparadas con los controles no expuestos (Tabla 5). No se observaron quistes en el tejido cerebral en las secciones histológicas o teñidas con ABC. No se aislaron parásitos en los cultivos celulares.

TABLA 4

7

TABLA 5

8

a = No se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento.

TABLA 6

9

a = Todos los valores se determinaron a día 56 PI.

Los valores de anticuerpos de ratones supervivientes se presentan en la tabla 6. Los valores significativos de IFAT (> 400) se detectaron en la mayoría de los ratones (13/15) expuestos a las cepas NCTS, indicando que estas cepas son capaces de inducir una respuesta de linfocitos B en animales inmunológicalmente intactos, pero genéticamente resistentes.

Los quistes tisulares no se detectaron en la región del cerebro examinada histológicamente, inmunohistológicamente o usando el procedimiento de digestión pepsina-ácido. Estos resultados confirman los mostrados en el anterior ejemplo 1, usando ratones BALB/c.

Ejemplo 3 Análisis de la patogenia de cepas NCTS de N. caninum en ratones HSD:ICR inmunodeprimidos

Un primer objeto de este estudio era determinar la patogenia de las cepas NCTS de N. caninum en ratones HSD:ICR inmunodeprimidos. Un segundo objeto de este estudio era determinar si la reversión de la patogenia sucedía después de los pases in vitro de las cepas NCTS de N. caninum a 37ºC.

Materiales y procedimientos

Se inmunodeprimieron ratones HSD:ICR (4 semanas, hembras) mediante la administración intramuscular de 2 mg de acetato de metilprednisolona (siglas en inglés, MPA) (Upjohn-Pharmacia) a los días -7, 0, y 7 PI. Véase Lindsay and Dubey, 1989, J. Parasitology 75:772-779.

Los ratones HSD:ICR inmunodeprimidos se inocularon a día 0 con 2 x 10^{5} taquizoítos de cualquiera de las cepas NC-1, NCTS-4, NCTS-8 o NCTS-12, o uno de los controles de reversión potencial, designadas NCTS-4-37, NCTS-8-37 ó NCTS-12-37, en HBSS (volumen total de 0,5 a 1,2 ml). Posteriormente se examinaron los ratones serológica, histológica y clínicamente, como se ha descrito antes.

Los clones NCTS-4, NCTS-8 y NCTS-12 se examinaron para la reversión de la patogenia por el crecimiento a 37ºC durante 88 días (25 pases del cultivo celular), seguido de la inoculación en ratones HSD:ICR inmunodeprimidos (las cepas de reversión potencial se designan como NCTS-4-37, NCTS-8-37, NCTS-12-37).

Resultados

Las cepas NC-1, NCTS-4-37 y NCTS-12-37 de N. caninum produjeron un 100% de mortalidad en ratones HSD:ICR inmunodeprimidos (Tabla 7). Las cepas NCTS-4, NCTS-8, NCTS-12 y NCTS-8-37 fueron menos patógenas para los ratones HSD:ICR inmunodeprimidos y produjeron solamente del 0% al 20% de mortalidad. Las puntuaciones medias de lesión se presentan en la tabla 8. No se detectaron taquizoítos las digestiones pepsina-ácido de cualquier ratón examinado en la necropsia a los 56 días PI.

Los valores de anticuerpos de los ratones supervivientes se presentan en la tabla 9. Los valores significativos de IFAT (> 800) se detectaron en ratones NCTS-4, -8 y -12, y NCTS-8-37 a los 56 días después de la exposición, lo que indica que estas cepas son capaces de estimular una respuesta de linfocitos B en un animal inmunodeprimido, pero genéticamente resistente.

TABLA 7

10

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * = Los ratones que estaban moribundos debido a la neosporosis
encefalítica clínica se sacrificaron por\cr  razones
humanitarias.\cr}

TABLA 8

12

a = diferente significativamente respecto al control (grupo 16) (P< 0,05).

TABLA 9

13

a = Todos los valores se determinaron a día 56 PI.

Las cepas NCTS fueron menos patógenas en los ratones HSD:ICR inmunodeprimidos que en las cepas NC-1, NCTS-4-37 y NCTS-12-37. La relativamente alta tasa de supervivencia (4/5) de los ratones inoculados con la cepa de reversión NCTS-8-37 comparada con la tasa de mortalidad del 100% de los ratones inoculados con las cepas de reversión NCTS-4-37 ó NCTS-12-37 indica que la cepa de reversión NCTS-8-37 retuvo una patogenia atenuada tras pases sucesivos a 37ºC. De acuerdo con esta retención demostrada de la patogenia atenuada, la cepa NCTS-8 de N. caninum se seleccionó como un candidato potencial de vacuna y se usó en estudios posteriores, como se describe a continuación.

Ejemplo 4 Vacunación de ratones BALB/c frente a la encefalitis inducida por N. caninum

Un primer objetivo de este estudio fue determinar si la vacunación con una cepa atenuada y sensible a la temperatura de N. caninum puede proporcionar una protección frente a la enfermedad causada por la posterior exposición a una cepa patógena, por ejemplo, NC-1, de N. caninum. Un segundo objetivo de este estudio fue determinar el nivel de protección proporcionado por la vacunación de ratones BALB/c con taquizoítos muertos (congelados) de NCTS-8 que se expusieron posteriormente a la cepa NC-1 de N. caninum.

Materiales y procedimientos

Los ratones BALB/c (9 semanas, hembras) se vacunaron mediante inyección subcutánea tanto con HBSS (control) (0,5 ml), como con 5 x 10^{5} taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 en HBSS (0,5 ml), o con 2 x 10^{6} taquizoítos muertos (congelados) en HBSS (0,5 ml) (Tabla 10). Los vacunados se revacunaron a los 21 días PI con el mismo material que en la primoinyección. Los ratones se expusieron después por administración subcutánea de 1 x 10^{6} taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum en HBSS, o sólo con HBSS (control) (volumen total de 0,5 ml), 14 días después de la revacunación.

El IFAT se usó para analizar los sueros de los ratones que sobrevivieron al experimento para la presencia de los anticuerpos frente a N. caninum, como se ha descrito antes. En la necropsia se extrajo el cerebro de cada ratón. La primera mitad se usó para histopatología e inmunohistología, y la segunda mitad se usó para la digestión pepsina-ácido, como se ha descrito antes. La viabilidad de los taquizoítos después de la congelación se determinó mediante la inoculación de cultivos en monocapa de fibroblastos humanos de prepucio Hs68, como se ha descrito antes.

Resultados

Ninguno de los ratones en ningún grupo de ensayo murió tras la primovacunación o la revacunación. Dos de 10 ratones vacunados con HBSS (controles), y 3 de 10 ratones vacunados con taquizoítos muertos de NCTS-8, murieron tras ser expuestos a taquizoítos de NC-1. Las puntuaciones medias de lesión de ratones que sobrevivieron se presentan en la tabla 11.

Los valores recíprocos de anticuerpos de ratones supervivientes se presentan en la tabla 12. Los valores significativos de IFAT (\geq 800) se detectaron en ratones vacunados con taquizoítos vivos de NCTS-8 tras la revacunación, lo que confirma los resultados previos descritos antes. En cambio, no se mostraron valores significativos de IFAT en ninguno de los ratones vacunados con taquizoítos muertos de NCTS-8 antes de la exposición, lo que demuestra que los taquizoítos muertos no pueden inducir una respuesta significativa de anticuerpos en un huésped genéticamente susceptible.

Los taquizoítos de N. caninum se aislaron a partir de cultivos celulares inoculados con tejido cerebral digerido con pepsina-ácido de dos ratones expuestos y vacunados con placebo (grupo 24, ratones nº 1 y 2), y a partir de un ratón vacunado con taquizoítos muertos de NCTS-8 (grupo 31, ratón nº 5). No se aislaron taquizoítos de los cultivos inoculados con tejido cerebral a partir de ningún otro ratón.

TABLA 10

14

TABLA 11

15

	a = diferente significativamente respecto a los grupos 24 + 25 (P < 0,05).
	b = diferente significativamente respecto a los grupos 30 + 31 (P < 0,05).

TABLA 12 Valor recíproco de anticuerpos en suero de ratón pre- y post-exposición

16

Los ratones vacunados con taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 de N. caninum no murieron ni desarrollaron los síntomas de la enfermedad clínica. Los ratones vacunados con taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 y expuestos posteriormente a los taquizoítos de la cepa NC-1 (Tabla 11, grupos 28 + 29) tenían valores de lesión que eran casi idénticos a los de los ratones vacunados con taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 tras la administración de HBSS (Tabla 11, grupos 26 + 27). Esto indica que vacunación con taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 proporciona una protección sustancial frente a la enfermedad causada por la infección con la cepa NC-1 de N. caninum. La vacunación de ratones con taquizoítos muertos de la cepa NCTS-8 ofreció poca protección ante la neosporosis (Tabla 11, grupos 30 + 31).

Ejemplo 5 Vacunación de ratones BALB/c con una dosis baja de la cepa NCTS-8 de N. caninum

El objeto de este estudio fue determinar si una dosis baja, esto es, 5 x 10^{4} taquizoítos, de la cepa NCTS-8 de N. caninum puede proporcionar protección frente a una infección por una exposición posterior.

Materiales y procedimientos

Los ratones BALB/c (7 semanas, hembras) se vacunaron por vía subcutánea tanto con HBSS como con 5 x 10^{4} taquizoítos de la cepa NCTS-8 de N. caninum en HBSS (0,5 ml) (Tabla 13). Esta dosis de taquizoítos es la décima parte de la cantidad utilizada en los ejemplos previos. Los ratones se revacunaron a los 21 días PI con el mismo material que en la primoinyección. Los ratones se expusieron 14 días después de la revacunación a 1 x 10^{6} taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum.

El IFAT se usó para analizar los sueros de los ratones que sobrevivieron al experimento para anticuerpos frente a N. caninum ,como se ha descrito antes. En la necropsia se extrajo el cerebro de cada ratón. Una primera mitad se usó para histopatología e inmunohistología, y la otra segunda mitad se usó para la digestión pepsina-ácido, como se ha descrito antes

Resultados

Un ratón de control (administrado sólo HBSS) murió tras la posterior exposición a taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum. Ninguno de los ratones vacunados con la dosis baja de taquizoítos de la cepa NCTS-8 de N. caninum murieron tras la exposición posterior con taquizoítos de la cepa NC-1. Las puntuaciones medias de lesión y el número de ratones con lesiones fueron significativamente mayores en los ratones de control vacunados falsamente sólo con HBSS que en ratones vacunados con una dosis baja de la cepa NCTS-8 (Tabla 14). Los valores recíprocos de anticuerpos se muestran en la tabla 15.

TABLA 13

17

TABLA 14

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a = diferente significativamente respecto al grupo 36 (P < 0,05).

TABLA 15

19

Ejemplo 6 Eficacia de las vacunas con y sin adyuvante

El objeto de este estudio fue determinar el efecto de añadir un adyuvante a una vacuna atenuada y modificada de Neospora y el grado de protección obtenido a partir de ésta frente a la neosporosis.

Materiales y procedimientos

Los anteriores resultados in vitro (datos no mostrados) indicaron que los taquizoítos de al menos una cepa atenuada modificada de N. caninum, esto es, NCTS-8, retenía la infectividad y la viabilidad parcial in vitro cuando se coincubaba con una de varias formulaciones diferentes de aceite en agua. Basándose en estos resultados in vitro, se seleccionaron tres formulaciones específicas para la evaluación in vivo como adyuvantes.

Se vacunaron por vía subcutánea (0,2 ml) grupos de diez ratones BALB/c hembra de 15 semanas a días 0 (primovacunación) y 21 (de refuerzo) PI, bien con sólo HBSS (control), o con 5 x 10^{5} taquizoítos de la cepa NCTS-8 de N. caninum en HBSS, o con 5 x 10^{5} taquizoítos de la cepa NCTS-8 de N. caninum en una de las tres siguientes emulsiones de aceite en agua.

La emulsión 1 estaba constituida por: (a) ME6201 (escualeno al 5% v/v, vitamina E al 1,0% v/v, y dispersante Tween™ 80 al 0,8% v/v); (b) preparación de saponina Quil A (QA) (Superfos) (200 \mug/ml); y (c) colesterol (col.) (100 \mug/ml).

La emulsión 2 estaba constituida por: (a) ME6201; y (b) amina lipoidal Avridine (1 mg/ml).

La emulsión 3 estaba constituida por ME6201 (escualeno al 5% v/v, vitamina E al 1,0% v/v, y dispersante Tween™ 80 al 0,8% v/v).

TABLA 16

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Al día 35 PI, se expusieron todos los ratones mediante una administración subcutánea de 1 x 10^{6} taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum en HBSS (0,2 ml). Se sacrificaron grupos de 3 a 5 ratones a los días 49 y 63 PI para evaluar la eficacia de la vacuna.

Al comienzo del día 0, se evaluó la enfermedad basándose en la mortalidad, así como en la aparición de rizos en las capas del pelo, movimientos irregulares, parálisis de las extremidades inferiores y debilidad generalizada.

El análisis histopatológico se llevó a cabo como sigue. Las muestras de pulmón se obtuvieron a día 49, se fijaron en formol tamponado neutro al 10 (v/v), y el tejido se seccionó y tiñó utilizando técnicas histológicas habituales. Las secciones de pulmón teñidas con hematoxilina y eosina se codificaron, y las lesiones se evaluaron con ocultación, sin conocimiento de los grupos de tratamiento. Las lesiones de neumonía se evaluaron utilizando el siguiente sistema:
0 = ninguna; 1 = leve; 2 = moderada; 3 = notable; 4 = severa.

Resultados

Los ratones vacunados con una formulación que comprendía taquizoítos de la cepa NCTS-8 de N. caninum y un adyuvante tuvieron una incidencia significativamente menor de neumonía leve (33%) después de la exposición con la cepa NC-1 de N. caninum que los ratones de control vacunados sólo con HBSS (56%) (p<0,01). Ninguno de los ratones vacunados con NCTS-8 y no expuestos mostraron señal alguna de la encefalitis o de parásitos cuando se les examinó a las 9 semanas tras la vacunación (datos no mostrados), confirmando que la administración de NCTS-8 no produce la enfermedad clínica.

Los resultados indicaron que la formulación que comprendía los taquizoítos vivos y atenuados de Neospora y un adyuvante es al menos tan eficaz y segura para su uso como vacuna frente a la neosporosis, como la misma formulación sin adyuvante (Tabla 17).

TABLA 17

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Ejemplo 7 Protección de cabras enanas frente a la neosporosis

El objeto de este estudio fue determinar si la vacunación de cabras enanas con una cepa atenuada elaborada con células vivas de N. caninum podía proteger a las cabras frente a la neosporosis. Más específicamente, se analizó la capacidad de una vacuna que comprende taquizoítos vivos de la cepa NCTS-8 de N. caninum para proteger a las cabras enanas hembra frente al aborto inducido por Neospora.

Materiales y procedimientos

Las cabras enanas hembra de una edad aproximada entre 2-5 años se asignaron aleatoriamente en los grupos
A-E (Tabla 18). La dosis en cada administración de auténticas vacunas (grupos A-C) estaba compuesta por 4 x 10^{6} taquizoítos de la cepa indicada. Tras la vacunación subcutánea (1,0 ml/dosis) a día 0 (principal) y a día 21 (refuerzo), las hembras se sincronizaron utilizando la preparación de prostaglandinas LUTALYSE™ (Upjohn-Pharmacia) (10 mg/cabra, vía intramuscular) en los días 28 y 39. Las hembras se quedaron embarazadas de forma natural entre los días 52 y 56. Las hembras preñadas se determinaron por ecografía y fueron entre los 41 y 55 días de gestación a la hora de la exposición.

Se expusieron hembras en los grupos A-D con 4 x 10^{6} taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum en medio de mantenimiento sin suero (0,45 ml) administrado por vía intravenosa a través de la vena yugular. A continuación se monitorizaron las hembras por ecografía, por temperatura obtenida diariamente durante los 7 días después de la exposición, y por observación visual dos veces al día, y se obtuvieron muestras de sangre una vez a la semana tras la exposición.

TABLA 18

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Resultados

Todas las cabras vacunadas bien con la cepa NC-1 atenuada de N. caninum (grupo A) o bien con la cepa NCTS-8 atenuada, elaborada con células vivas de N. caninum (grupos B, C) seroconvirtieron y presentaron valores de IFAT medibles a los 10 días después de la revacunación (Tabla 19). Estos datos demuestran que NC-1 y NCTS-8 son inmunogénicas en cabras preñadas. El valor GMT para el grupo A fue numéricamente mayor que para los grupos B y C, lo que sugiere una replicación aumentada en el huésped de la cepa NC-1 comparada con la cepa atenuada NCTS-8.

La tabla 20 demuestra la capacidad de una vacuna que comprende taquizoítos vivos y atenuados de Neospora para proteger cabras enanas hembra frente al aborto inducido por Neospora. Las 4 cabras hembra vacunadas con la cepa atenuada NC-1 (A) sufrieron un aborto después de la exposición con NC-1 (0% de protección). Cinco de las 6 cabras hembra que se vacunaron con placebo (D) sufrieron un aborto después de la exposición con NC-1 (17% de protección). En cambio, solamente 2 de entre 5 cabras hembra vacunadas con NCTS-8 (B) abortaron después de la exposición con NC-1 (60% de protección), y sólo 2 de entre 4 cabras hembra vacunadas con NCTS-8 con adyuvante (C) abortaron después de la exposición con NC-1 (50% de protección).

Estos resultados demuestran que las cabras enanas hembra preñadas están protegidas sustancialmente frente al aborto inducido por Neospora mediante la vacunación con taquizoítos vivos y atenuados de la cepa NCTS-8 de N. caninum. Esta es la primera demostración de la protección de una mamífero preñado frente al aborto inducido por Neospora mediante la vacunación con taquizoítos vivos y atenuados derivados de una cepa patógena de Neospora.

TABLA 19

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TABLA 20

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Depósito de materiales biológicos

Los siguientes materiales biológicos se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. 20852, EE.UU., el 6 de noviembre de 1996, y se les asignó los siguientes números de acceso:

1. Cepa NC-1 de Neospora caninum en células de riñón de mono MARC145, nº de acceso CRL-12231 en ATCC.

2. Cepa NCTS-8 de Neospora caninum en células de riñón de mono MARC145, nº de acceso CRL-12230 en ATCC.

Claims (14)

1. Un cultivo celular de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteje a un mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna viva.

2. Un cultivo como se reivindica en la reivindicación 1, cuyas células son sensibles a la temperatura.

3. Un cultivo como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la especie de la cepa original es N. caninum.

4. Un cultivo como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la cepa original de N. caninum es NC-1, la cual está presente en las células de riñón de mono MARC145, con nº de acceso CRL-12231 en ATCC.

5. Un cultivo como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la cepa de células atenuadas es NCTS-8, la cual está presente en las células de riñón de mono MARC145, con nº de acceso CRL-12230 en ATCC.

6. Una vacuna para proteger a un mamífero frente a la neosporosis, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteje al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna viva, y un vehículo veterinariamente aceptable.

7. Una vacuna como se reivindica en la reivindicación 6, en la que las células son como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

8. Una vacuna como se reivindica en la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante.

9. Una vacuna como se reivindica en la reivindicación 8, en la que el adyuvante es una emulsión de aceite en agua.

10. Un procedimiento para preparar un cultivo de células atenuadas de una especie de Neospora para su uso en una vacuna que proteje a un mamífero frente a la neosporosis, que comprende la modificación de células a partir de una cepa original patógena de una especie de Neospora; la selección y propagación clonal de una o más células modificadas que exhiben una patogenia atenuada comparada con la de las células de la cepa original; y la selección y propagación clonal de una o más células atenuadas que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteje al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna viva.

11. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 10, en el que las células son como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

12. Un procedimiento para preparar una vacuna para proteger a un mamífero frente a la neosporosis, que comprende la modificación de células a partir una cepa original patógena de una especie de Neospora; la selección y propagación clonal de aquellas células modificadas que exhiban una patogenia atenuada comparada con la de las células de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune en el mamífero que le proteja frente a la neosporosis cuando se administra en una vacuna viva; y la combinación una cantidad inmunológicamente eficaz de las células atenuadas con un vehículo veterinariamente aceptable de forma adecuada para la administración en forma de vacuna viva al mamífero.

13. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 12, en el que las células son como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

14. Una vacuna de combinación, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas de una cepa derivada de una cepa original patógena de una especie de Neospora, cuyas células exhiben una patogenia atenuada comparada con la de la cepa original pero que son capaces de desencadenar una respuesta inmune que proteje al mamífero frente a la neosporosis cuando se administra como vacuna viva; uno o más otros antígenos que desencadenan una respuesta inmune que proteje al mamífero frente a una enfermedad o un estado patológico; y un vehículo veterinariamente aceptable.