TW557214B - Attenuated live Neospora vaccine - Google Patents

Description

557214 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明之領域 本發明關於減毒病原性原生動物一 Neospora，和從此減 毒亞變種製備而來抵抗新孢子蟲炎（neosporosis)的活疫苗 。此疫苗可有效預防哺乳動物的臨床疾病和流產。 發明的背景資料

Neospora是一種動物的病原性原生動物寄生蟲，最近已 被確認是造成哺乳動物流產、新生兒死亡、先天感染和腦 炎疾病的主要原因。Dubey and Lindsay，1993,Parasitology Today，9:452-458，N.caninum感染狗，並且造成小狗先天性感 染，常常造成癱瘓。N.caninum的tachyzoite已從天然感染的 小狗體內分離出來。Lindsay and Dubey,1989,J.Parasitol. 75:163- 165。Neospora spp.是造成乳牛流產的主要原因。 Neospora相關的疾病例子*即新孢子蟲炎，已被報導發生於 山羊、羊和馬身上。 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 雖然N.caninum極似Toxoplasma gondii病原菌。但從抗 原性和超構造的分析，已將N.caninum和T.gondii二者區分。 Dubey and Lindsay，1 9 9 3，如上。此外，從流產的牛 胎兒腦部分離得到Neospora-相似原生動物寄生蟲，然後將 其繼續培養於體外的結果顯示，它的抗原性和超構造是不 同於下T.gondii和Hammondia Hammondi，並且大部分與 N.caninum相似。Conrad et al.，1 9 9 3，Parasitology 106 : 239 - 249。而且，核小次單元核糖體 RNA基因分析結果顯示：從牛和狗分離得到的Neospora 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐〉 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 557214 A7 B7 五、發明説明（2 ) spp.之間並無不同的核普酸，但不同於T.gondii。Marsh et al·，1 9 9 5，J · Parasitol 81:530 - 535。 從牛分離得到的Neospora，在牛流產和先天疾病中所扮 演的病原角色已被確認。Barr et al.l 9 9 4，J.Vet.Diag， Invest · 6 : 207 — 215。使用血族交配 BALB/C 小鼠感染N.caninum的新孢子蟲炎中樞神經系統嚙齒類動物 模型已被建立。Lindsay et al·，1 9 9 5，J.Parasitol · 8 1 : 3 1 3 — 3 1 5。此外，在懷孕的異系交配和血族 交配小鼠體內的N.caninum經由胎盤傳染的硏究模型已分別 描述於 Cole et al.，1 9 9 5，J.Parasital.8 1 : 7 3 0 -7 3 2 和 Long et al.，1 9 9 6，J.Parasitol，8 2 : 608 - 6 1 1。而且，相似於自然的後天Neospora誘發牛 流產現象，已利用實驗的N.caninum侏儒山羊模型展示。 Lindsay et al. * 1 9 9 5 1 Am.J.Vet.Res. . 5 6 : 1 1 7 6 - 1 1 8 0。

WO 9 5 2 5 5 4 1關於牛Neospora生物純培養，抗 Neospora抗體和Neospora專一性核酸的偵測法，和含有牛 Neospora抗原和載體做爲疫苗之用的組成物。然而，WO 9 5 2 5 5 4 1並無說明減毒活的Neospora培養物，或可引 發接種動物體內保護性免疫反應的活的疫苗製備法。 發明的槪要 第一點，本發明提供源自於病原性Neospora 1母株的亞 變種細胞培養物。該細胞與母株相比較時，具有減毒的病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ' -5 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

557214 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 ___B7_五、發明説明（3 ) 原性，當它做爲活的疫苗投予哺乳動物時，它可引發動物 體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎。 第二點，本發明提供保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的 疫苗，它包含源自於病原性Neospora母株的免疫有效量活細 胞和獸醫可接受載體。此細胞與母株細胞比較時，具有減 毒的病原性；當它做爲活的疫苗投予哺乳動物時，它可引 發動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎。此外疫苗，也含 有一或更多種其他成份包括，例如：佐藥。本發明疫苗可 投予至任何易受Neospora感染而發生疾病的哺乳動物，包括 (但不限於此）狗、牛、羊、山羊和馬。 第三點，本發明提供做爲疫苗之用源自於病原性 Neospora的減毒細胞培養物製備法。其方法爲將源自於病原 性Neospora的母株細胞修飾；篩選和選殖繁殖這些與母株細 胞相比具有減毒病原性，但做爲活的疫苗投予哺乳動物時 ，可引發動物體內免疫反應抵抗新孢子蟲炎的修飾細胞。 第四點，本發明提供可保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎 的疫苗製備法。其方法爲將源自於病原性Neospora的細胞修 飾：篩選和選殖繁殖這些與母株細胞相比具有減毒病原性 ，但做爲活的疫苗投予哺乳動物時，可引發動物體內免疫 反應抵抗新孢子蟲炎的修飾細胞；和組合此免疫有效量的 減毒細胞和獸醫可接受載體於適合型式，做爲活的疫苗。 第五點，本發明提供哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的疫苗 接種法。其係投予哺乳動物一免疫有效量的疫苗。該疫苗 含有源自於Neospora病原性母株的亞變種活細胞和獸醫可接 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-6 - 557214 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 A7 ___B7_ 五、發明説明（4 ) 受載體。該細胞與母株細胞相比時，具有減毒的病原性； 當它做爲活的疫苗投予哺乳動物時，它可引發動物體內免 疫反應以抵抗新孢子蟲炎。 第六點，本發明提供組合式疫苗，它係包含源自於 Neospora病原性母株的免疫有效量亞變種活細胞；一或更多 種其他可引發免疫反應以保護哺乳動物抵抗疾病或病理狀 況的抗原；和一獸醫可接受載體。該細胞和母株相比時， 具有減毒的病原性；當它做爲活的疫苗投予哺乳動物時， 它可引發動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎。此組合式 疫苗可進一步含有一或更多種其他成份，包括，例如：佐 藥。 發明的詳細描述 · 本發明申請者發現，病原性Neospora母株細胞可以被減 毒，所形成的減毒細胞當做爲活的疫苗投予哺乳動物時， 它可引發動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎。因此，本 發明提供源自於病原性Neospora母株的亞變種細胞培養物。 該細胞與母株比較時，具有減毒的病原性；當它做爲活的 疫苗投予哺乳動物時，它可引發動物體內免疫反應以抵抗 新孢子蟲炎。 本發明進一步提供做爲保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎 疫苗之用，源自於病原性Neospora的減毒細胞培養物製備法 。其方法係將源自於病原性Neospora的細胞藉由多次系列轉 種法或暴露於突變劑或使用重組D N A技術進行基因工程 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局_工消费合作社印褽 557214 A7 __ B7_ 五、發明説明（5 ) 將其修飾；篩選和選殖繁殖一或更多個與母株細胞相比具 有減毒病原性的細胞；並且篩選和選殖繁殖一或更多個與 母株細胞相比具有減毒的病原性，但做爲活的疫苗投予哺 乳動物時，可引發動物體內免疫反應抵抗新孢子蟲炎的減 毒細胞。 此所謂％新孢子蟲炎#意指因Neospora造成的哺乳動物 感染，或與此感染相關的任何臨床徵後群或病理狀況。 此所謂|減毒'意指源自於Neospora母株，但在體內或 體外的感染力或毒力與母株相比時，降低的Neospora細胞、 培養物或亞變種。毒力降低包含任何關於毒力的可偵測減 少，包括在體內或體外的感染力，或任何與感染相關的任 何臨床徵候群或狀況狀嚴重性或進展速度的降低。 此所謂’母株〃意指當投予Neospora至哺乳動物時，其 與源自於此母株經體內或體外一或更多次轉種法和/或一 或更多次減毒步驟得到的減毒亞變種相比時，具有相當高 程度的病原性的Neospora種。 本發明此外包含做爲疫苗之用，源自於Neospora母株但 在特殊哺乳動物體內不具病原性的Neospora亞變種的製備。 此細胞已經過化學或基因方法修飾*它在許多哺乳動物體 內可引發保護性免疫反應。 本發明的減毒活細胞，當做爲活的疫苗經過一或更多 次接種後，可引發哺乳動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲 炎。％保護性免疫反應'的定義是：發生於哺乳動物體內 的任何免疫反應，可能是抗體或細胞媒介免疫作用，或二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 -8 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消费合作社印繁 557214 A7 _B7 五、發明説明（6 ) 者。此免疫反應可預防或降低與新孢子蟲炎相關的感染。 疾病嚴重性，或減緩一或更多種臨床徵候群的進展速度。 ~免疫有效量'意指當投予哺乳動物時，可引發保護性免 疫反應的疫苗或抗原含量或劑量。 • Neospora減毒亞變種的製備 因爲本發明是基於發現病原性Neospora可被減毒。當此 減毒細胞做爲一活的疫苗投予動物時，它可引發免疫反應 以保護哺乳動物抵抗新孢子炎。本發明的實施並不限於任 何特殊的減毒方法。而且，病原性Neospora的減毒細胞的製 備，可利用技藝中已知的任何技術或程序，包括（但不限於 此）多次系列轉種法、暴露於突變劑，或使用重組DNA技 術進行基因工程，或組合方法。 多次系列轉種法的進行係將存在於易感染宿主細胞中 的病原性Neospora細胞，重覆在體外轉種，直到足夠的減毒 作用發生。轉種作用的進行係在特殊環境條件下篩選減毒 細胞。例如：轉種作用的進行可在低於欲接種動物之體溫 下，以篩選對溫度敏感的Neospora亞變種。當此亞變種存在 於疫苗而投予動物時，它將無法生長或生長速率降低。 突變作用的進行係將Neospora細胞暴露於如技藝所述的 化學突變劑或輻射中。可爲本發明有效使用的非限定化學 突變劑實例是N -甲基一 N > -硝基一 N —亞硝基胍（N-me thyl-N 一 -nitro-N-Mtrosoguanidine，MNNG)( Sigma) ’ 它的使 用將描述於下列的實施例1。可選擇紫外光或離子放射線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-9 - 557214 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（7 ) 進行輻射照射。 突變劑暴露程度，即化學突變劑的濃度或輻射程度， 以及暴露時間’宜是可產生一或更多個具減毒病原性的 Neospora生存細胞的量。此細胞當做爲活的疫苗投予哺乳動 物時，它可引發動物的免疫反應以抵抗新孢子蟲炎。突變 劑使用時的適宜參數係使用標準技術經實驗而提知。 病原性Neospora的減毒方法，也可根據技藝中已知的重 組DNA技術而實行。本發明欲包含利用此法製備此修飾 型亞變種和疫苗。本發明可使用但不限定的重組D NA技 術實例包括：基因取代或基因組所使一或更多個基因失去 功能，而形成具有減毒病原性的亞變種。可能被阻斷的基 因包括，例如：一種代謝必需的基因，或可編碼毒力因子 的基因，或可編碼在哺乳動物宿主扮演調節免疫反應的表 面抗原的基因。 可做爲Neospora染色體中被中斷的非限定代謝必需基因 的實例是二氫葉酸還原酶胸苷酸合成酶（dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFR-TS)基因。Titus et al·, 1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92:l0267-10271描述將 DHFR· TS基因中斷以製造一安全，活的萊什蔓體（Leishmania)疫 苗，此文列爲本發明之參考資料。藉由中斷Neospora的 DHFR-TS基因，將會製造具減毒病原性的營養缺失突變種 ，它需要胸苷酸以做爲生長之用。當將此突變種做爲活的 疫苗投予哺乳動物時，它可刺激動物的免疫反應以抵抗新 孢子蟲炎。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 557214 A7 B7 五、發明説明（8 ) 基因取代或基因中斷所使用的重組D N A技術爲該技 藝中爲人所熟知，包括（但不限於此）同質重組作用。例如， 病原性Neospora細胞可被載體（如質體）轉型或轉染。此載體 包括同質核苷酸序列，它一般是位於病原性Neospora代謝必 需基因（宜爲單一拷貝基因）的二側或之內。在同質核苷酸序 列之間或之內，此載體可能包含相對應於病原菌母株核苷 酸序列，但其中有一或更多個核苷酸|非沈默〃改變或缺 失，而形成缺損。病原性細胞與載體的轉型作用是將缺損 的基因序列倂入Neospora染色體，然後取代原始或％野生物 〃序列。因此，轉型細胞中的標的基因失去功能。然後篩 選具有減毒病原性的轉型細胞。將具有減毒病原性的轉型 細胞再一次進行篩選，以選取當其做爲活的疫苗投予哺乳 動物時，可引發動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎的細 胞。 爲了幫助轉型物的篩選，載體可進一步包含可編碼報 導基因產物或其他可選擇標識物的序列。本發明可使用且 爲人所知的報導基因包括，例如：編碼可洛菲尼可乙醯轉 移酶（chloramphenicol acetyl transferase,CAT),或蟲螢光素 酶的基因。其他非限定的報導基因是編碼大腸桿菌iS —半 乳糖甘酶的基因，它可嵌入載體並藉由偵測此酵素將受質 如，- D — L -吡喃半乳糖甘轉換成有顏色產物的活性 ，來確認轉型物。Seeber and BoothroycMQQGtGreneJGQJQ-eS 使用此報導基因來偵測 Toxopasma gondii 內的轉型物 。此 文列爲本發明之參考資料。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -11· 557214 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 ___B7 五、發明説明（9 ) 可編碼篩選性標識物的編碼序列也可做爲本發明之用 ，它包括在此技藝中爲人熟知可編碼出對抗生素或抗代謝 具抗性，或提供營養缺失需要的基因產物。此種序列實施 例包括對濕黴素（hygromycin)、新黴素或菲力黴素（ phleomycin)具抗藥性。在不同病原菌中，使用抗生素抗藥 性標識物的一個實施例是 Messina et al.，1995, Gene ,165:213 - 217，他係使用抗菲力黴素標識物做爲構築存在於T.gondi i的安定性轉型物。此文章例爲本文之參考資料。 做爲報導者基因產物或篩選性標識物的任何編碼序列 宜操縱性與調節元素（regulatory element)編碼序列嵌入載體 。此所謂％調節元素'包括（但不限於此）誘發性和非誘發性 做動子，促進子，操縱基因和本技藝中已知可驅動和/或 調節表現的其他元素。同時，DNA編碼序列是與一或更 多個調節元素操縱性關連。其中調節元素有效調節並促使 DNA編碼系列的轉錄和/或相對應mRNA的轉譯。例 如，做爲在Neospora細胞中篩選性標識物bU表現的載體的 構築，可利用將源自於Neospora或極相近的Apicomplexa, Toxoplasma基因調節區域置於ble開放讀錄（open reading frame，ORF)二側。從不同單一拷貝 Neospora或 Toxoplasma基 因得到的5 >側區域可作爲表現ble之用。Toxoplasma單一 拷貝基因的實例是：（I)SAG1，編碼tachyzoite主要表 面抗原，P 3 0(Burg et al.，1988，J.Immunol.l41:3584-359 1) ;(i i )GRA 1，編碼一分泌蛋白質，023(匸651)1：〇11· Delauw et al. » 1 9 8 9 · Proc.Natl.Acad.Sci. 8 6 : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

• 12 - 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _________B7五、發明説明（1〇 ) 7537 - 7541);和（i i i)GRA2，編碼一分泌 蛋白質，p 2 8(Mercier et al.，1993，Mol.Biochem. Parasitol ，5 8 : 7 1 - 8 2 )。Neospora單一拷貝基因的實例是：（ i)與 Toxoplasma SAG 1，GRA1 和 GRA2 基因同質 ’可使用標準P C R方法，基於（例如）已發表的T〇XOpiasma 序列確認；（i i )編碼N.caninum的tachyzoite主要細胞表面 蛋白質 N C — p 4 3 的基因（HemphIll，1996，Infect.Immun. 64 : 4279 — 4287);和（i i i)編碼免疫主要 17—，29—，30—，和37尺？3排泄1分泌蛋白 質的基因（Bjerkas et al·，1994,Clin.Diag.Lab.Immun. 1:214: 221)。從S A G 1基因得到的3 >側區域可提供做爲腺甘 酸聚合作用序列。做爲嵌入5 >啓動子，b 1 e基因和 3 >腺苷酸聚合作用序列之用的載體骨架，可以是任何標 準的市面上可獲得的質體，如pBLUESCRIPTTM(stratagene)。 一旦構築一適合的載體，它可做爲轉型或轉染一或更 多個源自於Neospora母株的細胞。此載體可根據已知技術將 其送入細胞，包括（但不限於此）電穿孔，微注射，病毒轉染 ，脂質體媒介轉染、微發射撞擊（microprojectile bombardment)等 ° 當載體被送入Neospora細胞，此導入編碼序列（ introduced coding sequeuce)是否存在，整合並維持在宿主 細胞染色體，或成爲游離基因，都可利用標準技術確認和 監測。此標準技術包括（但不限於此）南方雜交分析； P CR分析，包括反轉錄酶P CR(RT - P CR);預期蛋 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（n ) 白質產物的免疫或顏色分析；偵測標識物基因功能存在與 否，如出現新的營養缺失；或檢測病原減毒性。 載體構築、轉型、轉型物的篩選’宿主細胞表現等’ 特別是病原性原生動物，係描述於下列文章，這些文章都 列爲本文之參考資料·· Seeber and Boothroyd.1996;如上； Titus et al·，1995,如上；Messina et al.,1995，Gene ,165:213 -217;Sibley et al.,1994,Proc.Natl.Acad.sci,USA,91:5508-55 1 2 ;Donald and Roos.l994,Mol.Biochem.Parasitol.,63:243:25 3; Kin et al.,1993,Science,262:91 1-914:Ryan et al., 1993,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,90:8609-8613;Soleati and Boothroyd,1993 ，Science,260:349-352;Eid and Sollner-Webb，1991，Proc. Natl. Acad.Sci.USA,88:2118-2121 ;LeBowitz et ah,1990,Proc.Natl. Acad.Sci.USA，87:9736-9740;Lee and Van der Ploeg，1990 , Science,250:15 83- 1 5 86;Asbroek et al;.1990,Nature,348:174-175;Cruz and Beverley，1990，Nature ,348:17 1-173;和 Labanet al.，Nature ,343:572-574。 一般基因重組技術，包括載體構築，轉型作用，轉型 物篩選、宿主細胞表現等，是描述於Maniatis et al.,1989, Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor ,N.Y.;Ausubel et al., 1 989,Current Protocols in Moleuiar Biology,Greene Dublishing Associates & Wiley Interscience,N.Y.;Sambrook et a 1 ·，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 # •14· 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 557214 A7 _____B7 五、發明説明（12 ) N.Y.;Innis et al.(eds), 1995，PCR Strategies,Academic Pressm ，Inc. San.Diegq，Ca·和 Erlich(ed)，1992，PCR Technology,Oxford University Press，New York,這些書都列 爲本文之參考資料。 減毒步驟之後，將具有一或更多種減毒病原性特性的 細胞從培養物中篩選出來，然後經過限定的稀釋作用將其 選殖繁殖。此種減毒病原性特性的實例包括（但不限於此）， 在體外顯現出新的溫度敏感性或新的營養缺失，或毒力的 降低如投予此亞變種細胞於哺乳動物後，與母株造成的感 染相比，其感染力、嚴重性或一或更多種症後群的進展速 度都降低。一種特殊、非限制的溫度敏感性實例是：減毒 亞變種細胞將在3 2 °C生長，而非3 7 °C。此細胞可應用 於本發明。此種溫度敏感亞變種將造成感染的宿主細胞在 3 2 °C溶解，使單層宿主細胞出現缺損或溶菌斑。當細胞 生長在3 7t，減毒亞變種將不會有效率地複製，因此在 單層宿主細胞將無法產生溶菌斑。 減毒的Neospora亞變種可源自於任何具病原性的種類， 包括（但不限於）N.caninum。一種非限定的N.caninum特殊病 原性亞變種實例是N C - 1種，它可做爲衍生減毒亞變種 的母株。此NC - 1種是存在於感染的MARC 1 4 5猴 子腎臟細胞，目前置於 American Type Culture Collection( ATCC)，1 2 3 0 1 » Parklawn Drive Rockville,MD 2 0 8 5 2 USA(ATCC Accession No. CRL- 1 2 2 3 1 )* N C - 1 種也描述於 Dubey et aU1988，J.Am.Vet.Med.Assoc 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

•15· 557214 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7_五、發明説明（13 ) 193:1259-63，此文章列爲本文之參考資料。或者，利用如 上述的標準分離技術，我們可從具有新孢子蟲炎臨床症狀 的感染動物的組織，器官或體液得到Neospoira病原性種。源 自於Ncaninum的N C — 1種的非限定，減毒活的亞變種是 NCTS - 8，它是存在於感染的MARC — 14 5猴子 腎臟細胞，目前置於AT C C(AT C C Accession No·’ CRL-12230)。 具有tachyzoite的Neospora母株和減毒性種可培養於任 何易感染的細胞株，宜爲哺乳動物細胞株。可培養Neospora 的tachyzoite的哺乳動物細胞株包括：例如：人類包皮纖維 母細胞（Lindsay et al.，1993.Am.J.Vet.Res,5 4 : 1 0 3 — 1 0 6);牛心肺主動脈內皮細胞（Marsh et al, 1 9 9 5， 如上）；和牛單核白血球（Lindsay and Dubey，l 9 8 9，如 上），及其他。例如，N.caninum的tachyzoite可培養於單層 人類包皮纖維母細胞H s 6 8 (ATCC Accession No. C R L 一 1 6 3 5 )(Lindsay et al.,1 9 9 3，如上）。bradyzoite也 可經過相似地培養和操作。 哺乳動物細胞培養物和感染Neospora的細胞培養物可生 長在本技藝所描述的許多種培養基內。例如，以N.caninum 的tachyzoite感染的靜止期單層牛心肺主動脈內皮細胞培養 物可生長於添加1 0%(ν/ν)熱失活胎牛血淸（fetal bovine serum，FBS)或成年馬血淸（equine serum,ES)， 2 m M L 一榖胺醯胺，50U/ml盤尼西林和50//g /m 1 鏈黴素的Dulbecco’s Miuinum Essential Medium 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 -16· 557214 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（彳4 ) (DMEM:Gibco Laboratories，N.Y.)。單層人類包皮纖維母細 胞Hs68可維持在含2%(v/v)胎牛血淸，1 · 〇mM 丙酮酸鈉，lxl〇4U/ml盤尼西林，lxlO4 /zg/ml鏈黴素，5xlO_2mM2—氫硫基乙醇和 〇 · 3mg/ml L —穀胺醯胺的 RPMI 1640( Gibco)(維持培養基）。感染Neospora的單層人類包皮纖維母 細胞H s 6 8可維持在相同的培養基，但胎牛血淸增至 1 0%(ν/ν)(生長培養基），具有新型營養缺失的減毒

Neospora種則需要將培養基做適當的修飾，以支持細胞生長 〇 感染Neospora的單層哺乳動物細胞培養物一般維持在標 準的組織培養條件，如3 7 °C和5 % C 0 2，當培養基內 7 0 - 9 0%的哺乳動物細胞已被感染，則tachyzoite—般 要轉種至其他未感染的單層培養物。使用任何可使 tachyzoite仍保有生存力的標準技術將宿主細胞溶解，然後 從感染的哺乳動物細胞培養物收集tachyzoite，再利用如過 減或離心法收集tachyzoite ^ 疫苗的製備和使用’ 本發明提供抵抗新孢子蟲炎的疫苗，其含有源自於 Neospora病原性母株的免疫有效量亞變種活細胞和獸醫可接 受載體。該細胞與母株相比較時，具有減毒的病原性；當 它做爲活的疫苗投予哺乳動物時，它可引發動物體內免疫 反應以抵抗新孢子蟲炎。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •17- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 557214 A7 __B7 五、發明説明（15 ) 本發明也提供做爲哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的疫苗製 備法。其方法係包括將Neospora病原性母株細胞修飾；篩選 和選殖繁殖這些與母株細胞相比具有減毒病原性，但做爲 活的疫苗投予哺乳動物時，可引發動物體內免疫反應抵抗 新孢子蟲炎的修飾細胞，和組合此免疫有效量的減毒細胞 和獸醫可接受載體於適當型式，成爲活的疫苗。 本發明也提供哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的疫苗接種法 。其係投予哺乳動物一免疫有效量的疫苗。該疫苗含有源 自於Neospora病原性母株的亞變種活細胞和獸醫可接受載體 。該細胞與母株相比時，具有減毒的病原性；當它做爲活 的疫苗投予哺乳動物時，它可引發動物體內免疫反應以抵 抗新孢子蟲炎。 本發明的疫苗含有減毒活的Neospora細胞，它是做爲單 獨抗原成分或與一或更多其他種可引發免疫反應而保護哺 乳動物抵抗與新孢子蟲炎相關或不相關疾病或病理狀況的 病原相組合。因此，本發明進一步提供組合式疫苗。它係 包含源自於Neospora病原性母株的免疫有效量亞變種活細胞 :一或更多其他種可引發免疫反應以保護哺乳動物抵抗疾 病或病理狀況的抗原；和一獸醫可接受載體。該細胞與母 株相比時，具有減毒的病原性；當它做爲活的疫苗投予哺 乳動物時，它可引發動物體內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎 。此組合式疫苗可進一步含有一或更多種其他成分，包括 ，例如佐藥。 此疫苗是經過一般的非經腸道式投予，例如，皮下或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-18- 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 A7 B7________五、發明説明（16 ) 肌肉注射。然而，此疫苗也可經由腹腔或靜脈注射方式給 予，或經由其他途徑，包括口腔、鼻腔、直腸或陰道。因 此，這些疫苗中所含有的獸醫可接受載體需經過適當選擇 。疫苗可僅含有存在於培養液的減毒細胞，然後直接投予 哺乳動物。或者，此疫苗也可含有減毒細胞.並組合獸醫 或藥學可接受載體。載體的選擇係基於疫苗投予途徑和其 維持細胞生存力的能力。此種載體的非限制實例包括水、 生理食鹽水，緩衝性媒介和其他相似物。適宜的其他疫苗 媒介和添加物是爲熟於此技藝的人士熟知。參考如 Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed.，1990,Mack Publishing，此書列爲本文之參考資料。此外，疫苗也可含 有一或更多種其他成分，如免疫調節劑，例如：促白血球 溶菌素- 1，或其他免疫增強物質如獸醫可接受佐藥。非 限制的佐藥實例包括FreuncTs完全和不完全佐藥，礦物質凝 膠包括，例如：氫氧化鋁，和水包油或油包水配方。免疫 調節劑的選擇係基於它們維持減毒Neospora細胞生存力和使 細胞引發接種動物體內保護性免疫反應的能力。 非限制的水包油配方實例，且可做爲本發明疫苗有效 的佐藥，包括如下述的乳化劑1 一 3。乳化劑1組成：（a ) ME620 1(5%v/v 鯊烯，〇 · 1%ν/ν 維生素 E ，和 0 · 8 % v / v TweenTM80 分散劑）;（b) Quil A(QA)植物 皂素製劑（Superfos).(200 //g/ml);和（c)膽固醇（chol) (100 β g/ml)。乳化劑 2 組成：（a)ME6201 ;和（b) Avridine脂胺（lmg/ml)乳化劑 3 組成爲 ME62 1 0(5% (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19 - 經濟部中央橾率局員工消費合作社印製 557214 A7 ___B7_ 五、發明説明（17 ) v/v鯊烯，1%ν/ν維生素E，和〇 · 8%v/v TweenTM80分散劑。 有效劑量的決定係利用一般的方法。剛開始給予低劑 量的減毒細胞，然後增加劑量並監測其效果，以及系統性 改變藥物劑量。當決定每一隻動物的最適劑量時，必需考 慮許多因素。主要因素爲動物種類、體型、年齡、身體狀 況、服用的其他藥物、接種的Neospora毒力和其他相關因素 。實際劑量的選擇最好是參考其他動物硏究的結果。 疫苗攝生法的選擇也是基於上述因素。動物可以在任 何時期接種，包括生育前或生育時。補充注射或加強注射 有其必要性，以達到完全保護作用。是否已達到適當免疫 保護作用的一個偵測方法是，在接種後測定動物之血淸轉 換現象和抗體效價。因此，基於許多因素，本發明疫苗的 接種可在被接種動物的生命史上任何時間，例如在其他動 物爆發新孢子蟲炎時期。本疫苗的接種可以在斷奶期或年 幼期動物，或更成熟動物例如：做爲生育前疫苗，以保護 動物抵抗Neospora相關先天疾病或流產。有效的接種可能只 需要第一次接種，或第一次接種結合一或更多次加強注射 。第一次接種後，可能需要在任何時期加強注射，而其主 要取決於第一次接種後的免疫反應，疾病爆發的嚴重性， 造成疾病爆發的Neospora毒力，接種動物的健康等。如果需 要加強注射，那麼接種的時間和加強注射的次數，最好是 由獸醫依據如上述所有相關因素分析的結果而決定。 疫苗所使用的Neospora細胞宜爲tachyzoite，也可由 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 AT. •20· 557214 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 五、發明説明（18 ) bradyzoite,或卵母細胞，或其組合式所取代。疫苗中，減毒 細胞的濃度範圍宜爲lxl〇3/ml — lxi〇8mi， 最好是2xl06/ml — 2xl07/ml。適合的劑量 爲0·5-lml。一般而言，投予動物的每一疫苗所含 的減毒細胞宜爲1 X 1 〇4 - 2x 1 08，較適合是2 X 1 〇5-2xl07,最好是 1X106 - 1X107。 本發明疫苗可保護動物因Neospora造成的感染或疾病。 此疫苗可有效保護懷孕或無懷孕動物，包括（但不限於此）牛 、羊、犬和馬抵抗因新孢子炎造成的感染、臨床疾病或流 產。％保護〃所指的意義很廣泛，並不制定於絕對預防因N eospora造成的感染，但包括因感染造成的感染力或疾病嚴 重性的降低，可偵測到的因感染造成的一或更多個病理效 應或徵候的降低，或可偵測到的這些病理效應或徵候進展 速度的降低。本發明疫苗也是具安全性，即它不會造成接 種動物疾病或明顯副作用。 以下實施例將提供進一步說明（但不限於此）本發明的組 成物和方法。 實施例1 :溫度敏感的N.caninum亞變種的建立和在 B A L B/C小鼠的疾原性分析 本硏究的目的是建立對溫度敏感的N.caninum亞變種（ temperature-sensitive strains of N.Caninum，NCTS)，並且藉 由分析B A L B/C小鼠的血淸抗體反應，組織囊腫和腦 部損害的產生，及臨床徵候的發展以測試這些亞變種的病 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-*1T 豢 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21- 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 557214 A7 ________B7 五、發明説明（19 ) 原性。我們已知B A L B/C小鼠極易感染新孢子蟲炎。 材料和方法 利用限制稀釋並維持3 7°C，將N.caninum的N C - 1 亞變種的tachyzoite( Dubey等人，1988，如上述），依照Lindsay 和Dubey(1989，如上述）的方法，選殖三次。把tachyzoite置 於2 5 c m2培養皿繁殖並且在含有單層人類包皮纖維母細 胞 H s 6 8 (ATCC Accession No.CRL — 1635 )的 96 孔盤進行選殖（Lindsay等人，1993，如上）°Hs68 細胞事先先培養於含2%(v/v)胎牛血淸，1 · 〇mM丙 酮酸鈉，lxl04U/ml盤尼西林，lxlO4 Mg/ml鏈黴素，5xl〇-2mM2 —氫硫基乙醇和0 • 3mg/ml L型殻胺醯胺的RPMI 1640 (維持 培養基）。感染的單層培養細胞也培養在相同的培養基，但 胎牛血淸增加至1 0 %(v / v )(生長培養基）。分離一個單 一菌落並命名爲NC_ 1 — 2 C亞變種，但此後僅稱爲 N C - 1亞變種。 將N C — 1亞變種的tachyzoite暴露於含0 · 5 // Μ N 一甲基一 Ν < —硝基一 Ν —亞硝基胍（Sigma)生長培養基 24小時，並且生長於32 t，Hs 68細胞3個月，使 其致突變。然後利用限制稀釋選殖tachyzoite。剛.開始分離 得到1 2個亞變種。經過培養於32 · 5 °C，維持培養基 的H s 6 8細胞8個月後，選取其中命名爲NCTS — 4 ，NCTS-8 和 NCTS-1 2(NCTS = N.caninum， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-22- 557214 A7 B7 五、發明説明（20 ) temperature-sensitive)的三個菌落進行進一步硏究。 小鼠的血淸試驗方法如下。使用間接免疫螢光抗體試 驗（immunofluorescent antibody test,IFAT)(Dubey等人， 1 9 8 8，如上述）以分析小鼠血淸是否存在直接抗 N.caninum的抗體。免疫接種之前先採取小鼠血淸。經過病 原性實驗存活的所有小鼠血淸也收集。在雙重稀釋（起始點 爲1 5 0和終點滴定）檢驗血淸。使用tachyzoite做爲抗原。 陽性樣品具有完全tachyzoite表面螢光。陰性樣品則無螢光 或只有前面端有螢光。 在以不同N.caniruim亞變種攻擊的小鼠腦部的損害檢驗 法如下。在驗屍時，將每一隻小鼠腦部取下，然後將第一 個半腦固定於1 〇%(v/v)中性緩衝福馬林溶液以進行組 織病理檢驗。組織部分的製備係使用例行的組織學技術， 並且以蘇木素如伊紅染色，利用顯微鏡觀察損害的區域。 以蘇木素和伊紅染色的腦組織部分的損害區域的計分 方式係根據 Lindsay et al.，1 9 9 5，J.Parasitol.8 1 : 3 13-315所描述的標準。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 # 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 發炎/壞死病 數目 分數 無病 1 1〜5病 2 6 - 1 0 病 3 > 1 0 病 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •23· 557214 A7 B7 五、發明説明（21 ) 病平均尺寸 分數 無 1 100 〜200 /z m 2 200-500 β m 3 >500 β m 4 損害嚴重性 分數 無損害 1 輕微‘ 2 輕度 3 中度 4 明顯 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 使用以上所列的三個數値可得到平均損害分數。一個 正常，無感染的小鼠腦的平均損害分數爲3 . 0。平均損 害分數的評估係使用Kruskal-Wallis無變數試驗，和自由分 布多重比較方法。每一組中有損害的小鼠數目的檢驗係使 用Fisher’s確實試驗。統計上顯著差異點定爲p<〇 . 〇5 〇 從每隻小鼠得到的腦部部分也使用鼠單株抗體-6 G 7 (對N.caninum專一）連接抗生物素一生物素過氧化酶 複合物（A B C )免。疫組織化學試驗法檢驗，以偵測 N.caninum 階段（（Cole et al.l 9 9 3，J.Vet.Diag’Invest 5 : 574 - 589)。 每個小鼠腦的第二半部分以酸性胃蛋白酶水解，然後 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

•24- 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（22 ) 做爲接種哺乳動物細胞培養物之用，以偵測是否存在N. canimim組織囊腫。爲了進行水解反應，將小鼠第二個半腦 置於 3 m 1 Hank’s平衡鹽類溶液（Hank’s balanced salt solution HBSS)，並通過2 3號針頭的注射筒二次。將3 ml酸性胃白酶溶液（0 · 52g胃蛋白酶，0 · 50g NaCl，98.6ml H2O，1.4ml cone. HC1, pH8 · 0)加至均質物，於37°C水浴10分鐘。利用離 心去除酸性胃蛋白酶溶液，將沈澱物接種於含有如上述的 單層人類包皮纖維母細胞H s 6 8的單一 2 5 cm2組織培 養燒杯。30分鐘後，去除接種物，淸洗單層Hs 68細 胞並接種於如上述的新鮮維持培養基內。然後觀察培養的 細胞3 0天以偵測是否存在N.caninum(Lindsay and Dubey, 1 9 8 9，如上述）。 NC - 1和三個選取的NCTS亞變種，即NCTS 一 4，NCTS — 8和NCTS — 12的病原性檢測法如 下。BALB/C 小鼠（8 週大，雌性）（Harlan Sprague Dawley(HSD))皮下接種Η B S S (控制組），或存在於 HB S S 中含有 5 x 1 05N.caninum的N C — 1， NCTS - 4，NCTS — 8，或 NCTS - 12 的 。(：1^2〇丨〖6(總體積5-1.21111)。存活小鼠於接種後（ post-inoulation，PI)4 2或5 6天驗屍。在驗屍時收集存活 小鼠的血淸。檢驗這些小鼠腦部以進行損害計分和免疫組 織學試驗，並且一半的腦以酸性胃蛋白酶水解以決定組織 囊腫存在與否。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •25- 557214 A7B7 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 五、發明説明（23 ) 第 1 表，以N.caninum 的 NCTS — 4，NCTS — 8， NCT S — 1 2 或NC — 1 亞變種的 tachyzoite 接 _種B A L B / C小鼠的結果_ 處理組 小鼠數目 N.caninum 亞 變種 結果 1 4 HBSS(控制 組） 無死亡 2 5 NCTS-4 3 5 NCTS-4 4 5 NCTS-8 5 5 NCTS-8 6 5 NCTS-12 7 5 NCTS-12 8 5 NC-1 在約接種後16天出現臨床新孢 子炎；小鼠活動力低於1-7組；有 粗的毛皮。在接種後34天，二 隻小鼠因新孢子炎而安樂死； 另一隻在接種後39天死亡。 9 5 NC-1 臨床徵狀如第8組；小鼠於接種 後26,30,32和41天死亡。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 557214 A7 B7 五、發明説明（24 ) 第2表接種不同N.caninum亞變種的B A L B/C小鼠的平 均損害分數 _ 處理組 有損害的小鼠數目/ 檢驗數目/存活數目 平均損害分數 1(HBSS-控制組） 0/4/4 3.00 2 + 3(NCTS-4) 4/10/10* 4.80 4 + 5(NCTS-8) 6/10/10* 5.50 6 + 7(NCTS-12) 5/10/10* 4.90 8 + 9(NC-l) 8/8/3ab 9.38·.b a =與控制組（HBSS)有顯著差異（p<0.05) 1)=與1^(：丁5-4，1^(：丁5-8和1^(：丁5-12有顯著差異〇<0.05) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂------ 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •27- 557214 A7B7 五 '發明説明（25 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第3表小鼠血淸中的交互抗體效價 交S [抗體效ί 賈 處理組 <50 800 1,600 3,200 6,400 UHBSS-控制組） 42天 PI 2 - - 1(HBSS)56天 PI 2 1 齡 着 纖 2(NCTS-4)42天 PI • • 4 • 3(NCTS-4)56天 PI 5 酿 4(NCTS-8)42天 PI 雜 3 2 _ 5(NCTS-8)56天 PI 娜 嫌 3 2 6(NCTS-12)42天 PI _ 3 2 • 7(NCTS-12)56天 PI 寿 4 1 8(NC-1)56天 PI 2 • 9(NC-1)56天 PI • • 1 • (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 557214 A7 B7 五、發明説明（26 ) 結果 只有接種NC—1亞變種的BALB/C小鼠發生臨 床新孢子蟲炎和死亡（第1表）。10隻接種NC — 1亞變種 的BALB/C小鼠中，只有三雙存活。NCTS — 4， NCTS-8和NCTS-12亞變種並不會造成 BALB/C小鼠死亡。 平均損害分數列於第2表。以N C T S亞變種接種的 某些小鼠腦部發現損害，但平均損害分數與控制組（ Η B S S )相比則無統計上顯著差異。當小鼠接種N C - 1 亞變種與接種HB S S (控制組）或接種N.caniniim的 N C T S亞變種小鼠，比較其平均損害分數和具有損害的 小鼠數目時，其具統計上顯著差異。 血淸抗體效價結果列於第3表。以N C T S亞變種接 種的所有小鼠（3 0 / 3 0 )都偵測到明顯I F A F 效價（24 0 0)。此顯示NCT S亞變種可刺激免疫完全但 基因上易感染動物體內的及細胞反應。在以N C T S攻擊 的小鼠體內的I FAT效價是相等於，或在某些例子中高 於，以NC — 1攻擊的小鼠體內I FAT效價。 使用上述酸胃蛋白酶水解技術法並無偵測到任何腦半 球含有組織囊腫。此顯示組織囊腫（假如存在）在以 N.caninum的NC T S或NC- 1亞變種接種的小鼠腦部出 現數目並不多。

實施例2 : N.caninum的NCTS亞變種在HSD: ICR 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

，1T # -29- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 557214 A7 B7 五、發明説明（27 ) 異系交配小鼠的病原性分析 本硏究的目的是測定N.caninum的NCTS亞變種在 HSD:ICR異系交配小鼠的病原性。此種小鼠是具免 疫活性（immunocompetent)比血族交配的B A L B / C小鼠 對Neospora更具抗性。 材料和方法 本實驗使用HSD: ICR小鼠（4週大，雌鼠）。除了 控制組，所有的H S D - I C R小鼠都接種存在於 Η B S S 中N.caninum適當亞變種的 5 X 1 0 5tachyzoite(總 體積0 · 5 - 1 · 2ml)。控制組小鼠僅接種HBSS。 所有存活的小鼠在接種後5 6天都犧牲。收集血淸以進行 I FAT試驗。收集這些小鼠的腦部，然後取第一個半腦 進行如上述損害計分和免疫組織學試驗。第二個半腦則利 用上述的酸胃蛋白酶消化試驗法偵測組織囊腫。 結果 在HSD - I CR小鼠中，試驗的N.caninum亞變種（包 括N C - 1 )並不會造成其死亡（第4表）；並且與控制組相 比較，在具有損害的小鼠數目或平均損害分數都不具統計 上顯著差異（第5表）。在組織學或AB C染色部分並無觀察 到任何腦組織囊腫。在細胞培養時，並無分離到任何寄生 蟲。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本灵)

*1T % • 30 - 557214 A7 B7 五、發明説明（28 ) 第 4表以 N.caninum 的 NC — 1，NCTS — 4，NCTS 一 8，NCTS-18亞變種的tachyzoite接種的 HSD—ICR小鼠的結果 _ 處理組 小鼠數目 N.caninum亞變種 結果 10 5 HBSS(控制組） 無死亡 12 5 NC-1 13 5 NCTS-4 詩 14 5 NCTS-8 15 5 NCTS-12 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（29 ) 第5表以各種N.caninum亞變種接種HSD - I CR小鼠的 平 均損害分彭 r 處理組 有損害的小鼠數目/ 檢驗數目/存活數目 平均損害分數β 10(HBSS-控制組） 0/5/5 3.0 1 l(NC-l) 3/5/5 6.0 13(NCTS-4) 0/5/5 3.0 14(NCTS-8) 1/5/5 4.0 15(NCTS-12) 0/5/5 3.0 a:處理組間並無顯著差異 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 %· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 557214 B7 五、發明説明（30 ) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 第6表小鼠血淸中的交互抗體效價a 交互抗體效價 處理組 <50 400 800 1,600 3,200 6,400 10(HBSS-控制組） 5 雜 着 馨 ll(NC-l) 雜 • 2 3 齡 13(NCTS-4) 1 3 1 錄 14(NCTS-8) 1 每 2 1 1 讎 15(NCTS-12) 1 • 3 1 摩 • a:在接種後56天測定所有效價 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I訂-----

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • 33 - 557214 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 A7 B7_五、發明説明（31 ) 存活小鼠的抗體效價列於第6表，在以N C T S亞變 種攻擊的大部分小鼠（1 3 / 1 5 )體內可偵測到顯著的 IFAT效價（2400)，此意謂著NCTS亞變種可 誘發免疫完全但基因上具抗性動物體內的B細胞反應。 以組織學，免疫組織學或利用酸胃蛋白酶消化程序都 無法在小鼠腦部偵測到組織囊腫。這些結果確認了上述實 施例1使用BA L B/C小鼠得到的結果。 實施例3 : N.caninum的NCTS亞變種在免疫抑制HSD -ICR小鼠的病原性分析 本硏究的第1個目的是測定N.caninum的N C T S亞變 種在免疫抑制HSD—ICR小鼠的病原性。本硏究的第 2個目的是測定N.caninum的NCTS亞變種經過37 °C試 管轉種後是否發生病原性轉換現象。 材料和方法 在接種前7天，接種當天和接種後7天，以肌肉注射 法注入2 m g甲基去氫皮質脂醇酯酸鹽（methylprednisolone acetate，MPA)(Upjohn-pharmacia)於 H S D - I C R 小鼠（4 週大，雌性），使其免疫抑制。參考Lindsay and Dubey，1989 ，J.Parasitology7 5:772 — 779° 免疫抑制HSD — I CR小鼠以存在於HB S S中的 NC—l，NCTS - 4，NCTS - 8 或NCTS -1 2亞變種或見轉換潛能的控制組一命名爲N C T S — 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • 34- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 557214 A7 __ B7 五、發明説明（32 ) 一 37，NCTS — 8 — 37 或 NCTS — 12 — 37 的 2 X 1 0 5 tachyzoite接種（總體積 〇 · 5 — 1 · 2 m 1 )。然 後利用上述方法檢驗小鼠的血淸學，組織學和臨床學。

爲了檢験 NCTS/ — 4，NCTS — 8 和NCTS - 1 2菌落是否見病原性轉換現象，我們將這些菌落培養 於 3 7 °C 8 8天（2 5細胞培養轉種），然後接種於免疫抑制H S D -I CR小鼠（具轉換潛能的亞變種命名爲NCTS - 4一3 7，NCTS - 8 - 37，NCTS-12 - 37)。 結果 N.caninum 的 NC-1，NCTS-4 - 37 和 NCTS-12-37亞變種會造成免疫抑制HSD— I CR小鼠100%死亡率（第7表PNCTS — 4， NCTS-8，NCTS-12 和 NCTS - 8 - 37 亞 變種對免疫抑制HSD — I CR小鼠有較低的病原性，並 且只造成0 - 2 0%死亡率平均損害分數的結果列於第8 表。在接種後5 6天，利用酸胃白蛋酶消化法在所有小鼠 體內並無偵測到任何tachyzoite。 存活小鼠的抗體效價列於第9表。接種後5 6天，在 NCTS - 4，NCTS-12 和 NCTS - 8 - 37 小 鼠體內偵測到明顯的I F AT效價（2 8 0 0)。此意謂這些 亞變種可刺激免疫抑制但基因上具抗性動物體內的Θ細胞 反應。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 •35· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

557214 B7 五、發明説明（33 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第 7表以 N.caninum 的 NC — 1，NCTS - 4，NCTS 一8，NCTS - 12或具轉換潛能的亞變種的 _tachyzoite接種免疫抑制HSD— I CR小鼠的結果 處理組 小鼠數目 N.caninum亞變種 結果 16 5 HBSS(控制組） 無死亡 17 5 NC-1 在接種後20天，3隻小鼠 死亡或安樂死*;在接種 後22和23天各有1隻小 鼠死亡 18 5 NCTS-4 無死亡 19 5 NCTS-8 在接種後20天，1隻小鼠 安樂死* 20 5 NCTS-12 在接種後22天，1隻小鼠 死亡 21 5 NCTS-4-37 在接種後13，14(2)，16和 21天，所有小鼠死亡或 安樂死* 22 5 NCTS-8-37 在接種後29天，1隻小鼠 死亡 23 5 NCTS-12-37 在接種後14天，1隻小鼠 死亡，4隻小鼠安樂死* * =小鼠由於臨床新孢子蟲腦炎使其瀕死，基於人道理由將 其安樂死。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -36- 557214

7 7 A B 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（34 ) 第8表以各種N.caninum亞變種接種免疫抑制H S D - I C R小鼠的平均提 丨害分數 處理組 有損害的小鼠數目/ 檢驗數目/存活數目 平均損害分數 16(HBSS-控制組） 0/5/5 3.0 17(NC-1) 4/4/0a 9.8a 18(NCTS-4) 1/5/5 3.6 19(NCTS-8) 2/5/4 5.2 20(NCTS-12) 3/5/4 6.2 2KNCTS-4-37) 3/3/08 8.7 22(NCTS-8-37) 5/5/4* 8.2 23(NCTS-12-37) 4/4/0* 9.5a a:與控制組（第16組）有顯著差異（ρ<0·05)。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •37· 557214 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35 ) 第9表小鼠與血淸中的交互抗體效價a 交互抗體效價 處理組 <50 100 800 1,600 3,200 6,400 12,800 16(HBSS-控制 組） 5 - - - - 18(NCTS-4) 1 1 1 1 1 • 19(NCTS-8) • 2 1 1 • 20(NCTS-12) 1 2 2 • 22(NCTS-8-37) • • 1 1 1 a:在接種後56天測定所有效價 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂l· % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 557214 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（36 ) 在免疫抑制HSD — I CR小鼠體內，NCTS亞變 種比NC-1，NCTS-4-37 和NCTS — 12 — 3 7亞變種有較小的病原性。接種NCTS - 8 - 3 7轉 換亞變種的小鼠有極高的存活率（4/5)，而接種N C T S 一 4 一 3 7或NCTS — 1 2 — 3 7轉換亞變種的小鼠則 有1 0 0%死亡率。此意謂經過在3 7 °C—系列轉種法， NCTS-8-37轉換亞變種仍保有減毒病原性。基於 此顯示的減毒病原性保留現象，我們選擇N.caninum的 N C T S - 8亞變種做爲具疫苗潛力的候選者，並進行如 下述的進一步硏究。 實施例4 :抵抗N.caninum誘發腦炎的BALB/C小鼠接 種法 本硏究的第一個目的是決定是否接種一活的對溫度敏 感的N.caninum亞變種可提供抵抗因病原性亞變種，如 N.caninum的N C - 1亞變種，引起的疾病。本硏究的第二 個目的是測定B A L B/C小鼠接種殺死的（冷凍）N C T S 一 8 tachyzoite，然後以N.caninum的N C - 1亞變種攻擊時 ，此接種疫苗可提供多少保護效果。 材料和方法 ,B A L B/C小鼠（9週大，雌性）皮下注射接種 HB S S(控制組）（5m 1)，或存在於HB SS中5 X 1 0 5 NCTS — 8 亞變種的活的 tachyzoite( 0 · 5 m 1 ) 产請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Λ—訂 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -39· 557214 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 五、發明説明（37 ) ，或存在於HBSS中2X106殺死的（冷凍）tachyzoite( 0 · 5ml)(第10表）。在接種後21天，以第一次注射 的相同材料進行加強注射。然後在加強注射後1 4天藉由 皮下注射方式，將存在於Η B S S的1 X 1 0 6N.caninum 的NC — 1亞變種的tachyzoite，或單獨Η B S S (控制組）（ 總體積0 · 5 m 1 )攻擊小鼠。 利用上述的實驗法，使用I FAT對存活小鼠血淸進 行測試：是否血淸中含有抗N.caninum抗體。在驗屍時取出 每一隻小鼠的腦。第一個半腦做爲組織病理學和免疫組織 學之用，和第二個半腦做爲酸胃蛋白酶消化之用。 tachyzoite經過冷凍後，其生存九的測試係將其接種於如上 述的單層人類包皮纖維母細胞Hs 68。 結果 經過第一次或加強注射接種，並無任何試驗組小鼠死 亡。1 0隻接種Η B S S (控制組）小鼠中的2隻小鼠和1 0 隻接種殺死的NCTS — 8 tachyzoite小鼠中的3隻小鼠， 在以N C — 1 tachyzoite攻擊後死亡。存活小鼠的平均損 害分數列於第1 1表。 存活小鼠的交互抗體效價列於第1 2表。接種活的 N C T S — 8 tachyzoite小鼠，在加強注射後*可偵測到明 顯的I FAT效價（$800)，此確認先前描述的結果。相 反地，在攻擊前接種殺死的NCTS — 8 tachyzoite的小鼠 身上，並無偵測到任何明顯的I FAT效價。顯示殺死的 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） • 40· 557214 A7 B7_ _ __ 五、發明説明（38 ) t achy zoite無法在基因易感染宿主體內誘發明顯的抗體反應 〇 從2隻接種僞疫苗，攻擊的小鼠（2 4組，小鼠編號1 和2)和1隻接種殺死的NCTS - 8 tachyzoite的小鼠（3 1組，小鼠編號5 )的經酸性胃蛋白酶水解腦組織接種的培 養物中分離得到N.caninum tachyzoite。其他與小鼠腦組織 接種的培養物，則無分離出任何tachyzoite。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

—訂 # 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 - 557214 A7B7 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 五、發明説明（39 ) 第10表B A L B / C小鼠的接種和攻擊計畫 處理組 小鼠數目 接種和加強注射 攻擊 24 5 HBSS NC-1 25 5 HBSS NC-1 26 5 NCTS-8(活） HBSS 27 5 NCTS-8(活） HBSS 28 5 NCTS-8(活） NC-1 29 5 NCTS-8(活） NC-1 30 5 NCTS-8(殺死） NC-1 31 5 NCTSK殺死） NC-1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -一口 r— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -42 - 557214

7 7 A B 五、發明说明（40 ) 第11表被接種，攻擊白 勺B A L B/C小鼠的平均損害分數 處理組 有損害的小鼠數目/ 檢驗數目/存活數目 平均損害分數 24 + 25 8/8/8 9.3 26 + 27 1/10/10 3.4a，b 28 + 29 1/10/10 3.3a，b， 30 + 31 6/7/7 7.7 a =與24 + 25組相比具顯著差異（p<0.05) b =與30 + 31組相比具顯著差異 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -43- 557214 A7 B7 五、發明説明（41 )笔12表攻擊前和後小鼠血淸的交互抗體效價 處理組 攻擊前 或後 交互抗f 屋效價 <50 50 100 400 800 1,600 3,200 6,400 24+25(HBSS-控制組） 前 10 24+25(HBSS·控制組） 後 1 4 3 26+27(NCTS-8,活;HBSS) 前 1 4 4 11 26+27(NCTS-8,活;HBSS) 後 3 4 3 28+29(NCTS-8,活;NC-1) 前 1 9 28+29(NCTS-8,活;NC-1) 後 1 8 1 30+3KNCTS-8,殺死;NC-1) 前 6 2 2 30+3UNCTS-8,殺死;NC-1) 後 • • • 1 1 2 2 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（42 ) 以N.caninum的NCTS - 8亞變種的活的tachyzoite接 種小鼠，並不會使其死亡或出現臨床疾病徵候。小鼠接種 NCTS亞變種的活的tachyzoite，然後以NC-1亞變種 的tachyzoite攻擊（第11表，28 + 29組），其損害分數 幾乎相等於接種N C T S — 8亞變種的活的tachyzoite，然 後施予HBSS (第1 1表，26 + 27組）的小鼠的損害分 數。此顯示以N C T S - 8亞變種的活的〖&(：1^2〇^接種法 可提供實際保護作用，以抵抗因N.caniruim的N C - 1亞變 種感染造成的疾病。接種NCT S — 8亞變種的殺死 tachyzoite則提供極低的預防新孢子蟲炎（第1 1表，3 0 + 3 1 組）。 實施例5 :以低劑量N.caninum的NCTS — 8亞變種的 BALB/C小鼠接種法 本硏究的目的是決定是否低劑量，即5 X 1 04 N.caninumN C T S — 8亞變種的tachyzoite可提供預防攻擊 的感染。 材料和方法 BALB/C小鼠（7週大，雌性）皮下接種HBSS， 或存在於 HBSS 含 5xl04 N.caninum N C T S — 8 亞變種的 tachyzoite(0 · 5 m 1 )(第 1 3 表）。tachyzoite 的 劑量是先前實施例所使用量的十分之一。在接種後2 1天 ’以第一次注射相同的材料進行加強注射。然後在加強注 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4/—

、1T •45· 557214 at ______ B7 五、發明説明（43 ) 射後14天，以1X106 N.caninum NC-1亞變種的 tachyzoite攻擊小鼠。 使用I F A T測試從存活小鼠體內得到的血淸，以決 定是否存在如上述抵抗N.caninum的抗體。在驗屍時，取出 每一隻小鼠的腦部。第一個半腦進行組織病理學和免疫組· 織學，剩餘的第2個半腦進行酸胃蛋白酶消化。 結果 一隻控制組小鼠（僅給予Η B S S)經過N.caninum的 N C - 1亞變種的tachyzoite攻擊後死亡。小鼠接種低劑量 的 N.caninum N C T S — 8 亞變種的 tachyzoite，然後以 N C - 1亞變種的tachyzoite攻擊後，但並無任何小鼠死亡 。控制組僅接種Η B S S的小鼠，其平均損害分數和具有 損害的小鼠數目明顯高於接種低劑量N C T S — 8亞變種 的小鼠（第1 4表）。交互抗體效價結果顯示於第1 5表。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） -46· 557214 A7 B7 五、發明説明（44 ) 第13表B A L B / C小鼠0 勺低劑量接種和攻擊計畫 處理組 小鼠數目 接種和加強注射 攻擊 32 5 HBSS NC-1 36 5 NCTS-8(5 X 104 tachyzoite NC-1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47- 557214 A7 B7 五、發明説明（45 ) 第14表小鼠平均 損害分數 處理組 含有損害的存活小鼠數 平均損害分數 目/存活小鼠數目 32(HBSS/NC-1) 4/4 10.25· 36(NCTS-8/NC· 2/5 4.50 1) a =與36組有顯著差異（p<0.05) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -48- 557214 A7B7 五、發明説明（46 ) 第15表攻擊接種之前小鼠血淸內的交互抗體效價 交互抗1 效價 處理組 <50 400 800 1,600 3,200 6,400 32(HBSS)抗-Neospor a效價 10 - - - - 36(NCTS-8)抗一 Neospora 效價 - 3 4 3 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •49- 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 557214 A7 B7 五、發明説明（47 ) 實施例6:含或不含佐藥的疫苗效力 本硏究的目的是測定添加一佐藥到修飾型活的Neospora 疫苗的功效和其抗新孢子蟲炎的成效。 材料和方法 先前試管實驗結果（資料並未刊出）顯示至少一種修飾型 活的N.caninum亞變種，即NCTS — 8的tachyzoite，當其 與許多不同水包油配方中的一種共同反應時，仍保留部分 生存力和試管內的感染性。基於這些試管內實驗結果，選 取三種特殊配方做爲佐藥，評估其在體內的功效。 每組含10隻15週大BALB/C雌小鼠，於第0 天（第一次接種）和接種後2 1天（加強注射），以皮下注射方 式接種只含HB S S(控制組），或存在於HB S S中5 X 1 0 5 N.caninum N C T S — 8 亞變種的 tachyzoite，或 存在於下列三種水包油乳化劑中任一種的5 X 1 0 5 N.caninum N C T S — 8 亞變種的 tachyzoite。 乳化劑1組成：（）M E 6 2 0 1 ( 5 % v / v鯊烯，〇 • 1%ν/ν 維生素 E，和 0 · 8%v/v Tween™ 80 分散劑；（b) Quil A 植物皂素製劑（QA)( Superfos).(200 /zg/ml);和（c)膽固醇（chol) (100#g/ml)。 乳化劑 2 組成··（a )M E 6 2 0 1 ;和（b ) Avridine脂 胺（1 mg/ml) o 乳化劑3組成·· ME6 20 l(5%v/v鯊烯’ 1 · 維生素 E，和 0 · 8%v/v TweenTM80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂l· -50· 557214 A7 B7 五、發明説明（48 ) 分散劑） JW ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •51 · 557214

7 7 A B 五、發明説明（49 ) 第16表含或不含佐藥的疫苗配方試驗計畫 處理組 疫苗 乳化劑 38 HBSS 無 39 NCTS-8 無 40 HBSS 1 41 NCTS-8 1 42 HBSS 2 43 NCTS-8 2 44 HBSS 3 45 NCTS，8 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

,ιτ % 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -52- 557214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（5〇 ) 在接種後3 5天，所有小鼠皮下注射存在於HB S S 中的 1 X 6 6 N.caninum N C — 1 亞變種的 tachyzoite( 0 · 2ml)。在接種後49天和63天，將每組3 — 5隻 小鼠犧牲，以評估疫苗效力。 從第0天開始，依照死亡率，毛皮的外觀，不合常理 移動、骨盆腋癱瘓和虛弱情形，評估疾病的狀況。 組織病理學分析的方法如下。在接種後4 9天，收集 肺樣品，固定於1 0 % ( v / v )中性緩衝性福馬林，然後組 織切片並使用一般組織學技術染色。將蘇木素和伊紅染色 的肺切片編碼，然後在不知編組方式之下評估損害分數。 肺炎損害的計分使用下列系統：0 :無：1 :輕度，2 : 中度；3:明顯；4:嚴重。 結果 小鼠接種含有 N.caninum N C T S — 8 tachyzoite 和佐 藥的疫苗時，其經過N.caninum NC-1亞變種攻擊後， 肺炎發生率（3 3 % )明顯低於僅接種Η B S S的控制組小鼠 (56%)(Ρ<0.01)。經N C T S - 8接種且被攻擊的小鼠，在 接種後9週檢査時，並無發現任何腦炎疾病的徵候寄生蟲（ 資料並未顯示），此確認了給予小鼠N C T S — 8並不會造 成臨床疾病。 此結果顯示含減毒活Neospora tachy zoite和佐藥的配 方，和不含佐藥的配方一樣有效和安全，並可做爲抗新孢 子蟲炎之用（第1 7表）。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規待（210X297公釐） -53· 557214 Α7Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（51 )

第17表經過投予含或不含佐藥的疫苗和以N.caninum N G - 1亞變種攻擊，小鼠肺組織的病理分^ \Jr 處理情形 處理組號碼 有肺損害的小鼠數 目/檢驗小鼠數目 控制組小鼠 (僅接種HBSS) 38 3/5 40 3/4 42 2/4 44 2/5 小鼠接種含NCTS-8 不含佐藥的疫苗 39 0/4 小鼠接種含NCTS-8 和佐藥的疫苗 41 1/4 43 0/4 45 3/4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 命

> II— I 、1T

本紙張尺度適用不國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -54- 557214 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（52 ) 實施例7:侏儒山羊預防新孢子蟲炎 本硏究的目的是測定是否侏儒山羊接種減毒活 N.caninum亞變種可抵抗新孢子蟲炎。更特別地，我們測試 含有N.caninum N C T S — 8亞變種活的tachyzoite的疫苗 是否可保護侏儒山羊抵抗因Neospora誘發的流產。 材料和方法 將2 — 5歲的侏儒山羊隨機編成A - E組（第1 8表）。 A — C組中每一隻山羊接種由所顯示亞變種的4 X 1 06 tachyzoite所組成的疫苗。在第0天（第一次）和2 1天（加強 注射）皮下接種（1 · 0 m 1 /劑量）之後，於第2 8和2 9 天，同步使用LUTALYSEtm前列腺素製劑（Upjohn-Pharmacia) (10mg/山羊，肌肉注射）。山羊於第5 2 — 5 6天之間自然 生育。在4 1至5 5天懷孕期之間，利用超音波觀察懷孕 山羊。 A - D組的山羊，以頸靜注射方式施予存在於不含血 淸維持培養基的N.caninum 1^(：-1亞變種的4\106 tachyzoite( 0 · 45ml)。然後利用超音波，攻擊後7天 之內每天測量體溫，和每天肉眼觀察二次和攻擊後每週抽 血一次方式監測山羊。 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂l· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -55- 557214

7 7 A B 五、發明説明（53 ) 第18表懷孕1 朱儒山羊處理組 組 山羊數目 疫苗亞變種 佐藥 攻擊亞變種 A 4 NC-1 /rrr ΙΙΙΓ NC-1 B 5 NCTS-8 4τττ. 面HC J\\\ 歸 C 4 NCTS-8 乳化劑2β D 6 Μ J 1 \\ 乳化劑 E 2 迦 y 1 \\ Jhrr 雷MI: J\\\ 4rrr. 無 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L^i. —訂 % 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -56- 557214 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 _______B7_____ 五、發明説明（54 ) 結果 所有接種活的N.caninum NC-1亞變種（A組）或活 的減毒N.caninum NCTS-8亞變種（B、C組）的山羊 出現血淸轉換現象，並在加強注射後1 〇天測量I FAT 效價（第1 9表）。這些資料顯示NC - 1和NCTS - 8在 懷孕山羊體內是可產生免疫性。對A組來說GMT値，是 高於B和C組，此意謂NC — 1亞變種在宿主內的複製作 用高於減毒NCTS—8亞變種。 第2 0表顯示含有活的減毒Neospora tachyzoite的疫 苗，保護侏儒山羊抵抗Neospora誘發流產的能力。接種活的 NC—1亞變種並以NC—1攻擊的所有4隻山羊都發生 流產現象（A )(%保護）。接種僞疫苗然後以N C - 1攻擊的 6隻山羊（D)中，有5隻發生流產現象（1 7%保護）。相反 地，接種NCTS — 8然後以NC — 1攻擊的5隻山羊（B) 中，僅2隻發生流產（6 0%保護），和接種含佐藥的NCT S - 8然後以NC — 1攻擊的4隻山羊（C)中，僅2隻發生 流產（5 0 %保護）。 這些結果顯示：懷孕侏儒山羊接種減毒活的N.caninum N C T S — 8亞變種的tachyzoite可保護其抵抗因Neospora 誘發的流產。這是第一次顯示利用接種活的、減毒源自於 病原性Neospora的tachyzoite而保護懷孕哺乳動物抵抗因 Neospora誘發流產的例子。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -57· 557214 A7 B7 五、發明説明（S5 ) 第19表侏儒山羊加強注射10天後平均交互抗體效價數値 (geometric mean reciprocal antibody titers(GMT) _ 組 交互抗體效價（G Μ T ) 範圍 A 566 200-6,400 B 283 100-800 C 259 100-400 D <50 <50 E <50 <50 M濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •58- 557214

A B 五、發明説明（56 ) 第20表減毒活疫苗保護侏儒山羊抵抗因Neospora誘發的胎兒 流產 _ 組 疫苗 流產數目/被 攻擊數目 保護百分率 A NC-1 4/4 0 B NCTS-8 2/5 60 C 含佐藥的NCTS-8 2/4 50 D 僞 5/6 17 E 懷孕控制組 無攻擊 無分析 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -59- 557214 A7 B7 五、發明説明（57) 生物材料的存在 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以下的生物材料存放於A m e r i c a η T y p e C u 11 u 1· e C ο 11 e c t i ο η (A T C C )在 1 2 3 0 1 Parklawn Drive，Rockville,MD.20852: USA於1996年11月6日，接受號碼如下： 1 ·於M A R C 1 4 5猴子腎臟細胞的Neospora caninum的 N C — 1 亞變種，AT C C Accession No. CRL- 1223 0，其亦於1998年2月9日寄存於台灣食品工業發展 硏究所，寄存編號爲CCRC 980001。 2 ·於M A R C 1 4 5猴子腎臟細胞的Neospora caninum 的 NCTS — 8 亞變種，ATCC Accession No.CRL- 1 223 1，其亦於1 998年2月9日寄存於台灣食品工業發 展硏究所，寄存編號爲CCRC 980002。 以上引用所有專利、專利申請案和文獻都列爲本文之參 考資料。 經濟部智慈財產局g(工消費合作社印製 本發明並不限於所描述的特殊具體實例範圍，它們只是 說明本發明的各個槪念。功能相同的組成份和方法都是屬於 本發明範圍。事實上，除了上述的實施例，本發明的各種修 飾情形，對於熟於微生物學、寄生蟲學、免疫學、分子生物 學、獸醫學和以上提及相關領域的人士而言，都是顯而易見 。此種修飾情形都將落於所附的申請專利範圍之內。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -60-

Claims (1)

1. 55Τ2ΡίΓ 月 Β 補充

   A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件2a : 第861 1 6844號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國92年8月1 5日修正 1 . 一種源自犬新孢子蟲（Neospora caninum)病原性母 株種的細胞培養物，此細胞與母株相比時，具有減毒的病 原性，當其做爲活的疫苗投予哺乳動物時，可引發動物體 內免疫反應以抵抗新孢子蟲炎，且此細胞對溫度敏感。 2 .如申請專利範圍第1項之培養物，其中犬新.孢子 蟲母株種是N C — 1 ，其係存在於M A R C 1 4 5猴子腎 臟細胞（A T C C寄存號碼 CRL- 1 223 1 ; CCRC寄存號碼 980002)中。 3 .如申請專利範圍第2項之培養物，其中該減毒細 胞株是N C T S - 8，其係存在於M A R C 1 4 5猴子腎 臟細胞（A T C C寄存號碼CRL- 1 2230 ; CCRC寄存號碼 980001 )中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 . 一種保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的疫苗，其包 含源自新孢子蟲病原性母株的免疫有效量活細胞和獸醫上 可接受之載體；其中該細胞對溫度敏感且與母株細胞相比較 時，具有減毒的病原性，當其作爲活疫苗投予哺乳動物時， 可引發免疫反應保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎。 5 .如申請專利範圍第4項之疫苗，其中該細胞係定 義於申請專利範圍第1至3項中之任一項。 6 .如申請專利範圍第4或5項中任一項之疫苗，其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 557214 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 另包含佐藥。 7 ·如申請專利範圍第6項之疫苗，其中該佐藥是水 包油乳化劑。 8 · —種新孢子蟲減毒細胞培養物的製備方法，該培 養物可作爲疫苗以保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎；其中該 方法包括修飾源自新孢子蟲病原性母株細胞；篩選和選殖 繁殖一或更多個對溫度敏感且與母株細胞相比具有減毒病 原性的細胞；及篩選和選殖繁殖一或更多個減毒細胞，此 細胞作爲活疫苗投予哺乳動物時，可引發免疫反應保護哺 乳動物抵抗新孢子蟲炎。 9 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中該細胞係定 義於申請專利範圍第1至3項中之任一項。 1〇· 一種保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的疫苗之製 備方法，其中該方法包括修飾源自新孢子蟲病原性母株細 胞；篩選和選殖繁殖這些對溫度敏感且與母株細胞相比具 有減毒病原性，但作爲活疫苗投予哺乳動物時，可引發免 疫反應保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎的修飾細胞；及組合 此免疫有效量的減毒細胞和獸醫上可接受之載體於適合之 型式以作爲活疫苗投予哺乳動物。 1 1 ·如申請專利範圍第1 0項之方法，其中該細胞 係定義於申請專利範圍第1至3項中之任一項。 1 2 · —種組合疫苗，其包含源自新孢子蟲病原性母 株的免疫有效量活細胞，其中該細胞對溫度敏感且與母株 相比時，具有減毒的病原性；當其作爲活疫苗投予哺乳動 (請先閲讀背面之注意事項再本頁} |裝· 本 、1Τ ,辦| 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A#見格（2】0Χ297公釐） 557214 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 物時，可引發免疫反應保護哺乳動物抵抗新孢子蟲炎；一 或更多種其他可引發免疫反應保護哺乳動物抵抗疾病或病 理狀況的抗原；及獸醫上可接受之載體。 經濟部智慧財1局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（2】0/29*7公釐）