JP2016521282A - インフルエンザワクチンにおけるナルコレプシーのリスクの回避 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インフルエンザワクチンの安全性、さらに、特に、アジュバント化ワクチンにおいてナルコレプシーを引き起こすリスクに関連して改善するインフルエンザワクチンおよび方法を提供する。一局面において、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物が提供され、ここで配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合するが、ただし上記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。
Description
この出願は、米国仮出願第61/822,228号(2013年5月10日出願)、同第61/859,113号(2013年7月26日出願)および同第61/862,807号(2013年8月6日出願)ならびに欧州特許出願第13181429.5号(2013年8月23日出願)および同第14158999.4号(2014年3月11日出願)(これらそれぞれの完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
(技術分野)
本発明は、ワクチンレシピエントにおいてナルコレプシーのリスクをさらに低減する、インフルエンザワクチンおよびインフルエンザワクチンを生成するための方法を提供する分野にある。
本発明は、ワクチンレシピエントにおいてナルコレプシーのリスクをさらに低減する、インフルエンザワクチンおよびインフルエンザワクチンを生成するための方法を提供する分野にある。
(背景技術)
2009年のH1N1ブタインフルエンザワクチン接種キャンペーンの後、ナルコレプシーとAS03アジュバント化(adjuvanted)H1N1ワクチン(PandemrixTM,GSK Biologicals)の使用との疫学的関連性が、フィンランドの国立健康福祉研究所によって、小児および4〜19歳の青年で検出された[1−3]。ナルコレプシーの発生率は、非ワクチン接種個体における0.7/100,000と比較すると、ワクチン接種個体において9/100,000であった。その比は、ワクチン接種の約2ヶ月後の始まりとして12.7である[4]。その後、フランス、アイルランド、ノルウェー、スウェーデンおよび英国においても、AS03アジュバント化H1N1ワクチンで同様の報告があった。フィンランドでの詳細な追跡研究は、2011年からの最初の関連をさらに強めた[5]。従って、PandemrixTMとナルコレプシーとの間の統計的関連性は、明らかに実証された。興味深いことに、ナルコレプシーの発生の増大は、同じH1N1インフルエンザ株に対して防御するが、異なる水中油型エマルジョンアジュバントを含むFocetriaTMワクチンを受けた患者では認められなかった。
2009年のH1N1ブタインフルエンザワクチン接種キャンペーンの後、ナルコレプシーとAS03アジュバント化(adjuvanted)H1N1ワクチン(PandemrixTM,GSK Biologicals)の使用との疫学的関連性が、フィンランドの国立健康福祉研究所によって、小児および4〜19歳の青年で検出された[1−3]。ナルコレプシーの発生率は、非ワクチン接種個体における0.7/100,000と比較すると、ワクチン接種個体において9/100,000であった。その比は、ワクチン接種の約2ヶ月後の始まりとして12.7である[4]。その後、フランス、アイルランド、ノルウェー、スウェーデンおよび英国においても、AS03アジュバント化H1N1ワクチンで同様の報告があった。フィンランドでの詳細な追跡研究は、2011年からの最初の関連をさらに強めた[5]。従って、PandemrixTMとナルコレプシーとの間の統計的関連性は、明らかに実証された。興味深いことに、ナルコレプシーの発生の増大は、同じH1N1インフルエンザ株に対して防御するが、異なる水中油型エマルジョンアジュバントを含むFocetriaTMワクチンを受けた患者では認められなかった。
インフルエンザワクチンに応答してナルコレプシーを発生させるリスクは非常に小さいものの、にもかかわらず、ナルコレプシーのリスクをさらに低減することは望ましい。
Zaracostas J.; BMJ. 2011 Feb 9;342:d909
Nohynekら、PLoS One 2012;7(3):e33536
Partinenら、PLoS One 2012;7(3):e33723
(発明の要旨)
本発明は従って、患者がインフルエンザワクチンに応じてナルコレプシーを発生させる可能性をさらに低減する方法およびワクチンを提供する。
本発明は従って、患者がインフルエンザワクチンに応じてナルコレプシーを発生させる可能性をさらに低減する方法およびワクチンを提供する。
PandemrixTMおよびFocetriaTMが異なる水中油型エマルジョンアジュバントを有するという事実から、上記アジュバントがナルコレプシーの発生に関わっている可能性があるという仮説が拡がった。しかし本発明者らは、代わりに、その原因因子が上記2種のワクチンの中の異なる核タンパク質(PandemrixTMの中の核タンパク質は、オレキシンレセプター(図1を参照のこと)を摸倣し得る)であるらしいことを驚くべきことに発見した。ナルコレプシーは、オレキシン(ヒポクレチンとしても公知)を生成するニューロンの喪失と関連づけられた。さらに、PandemrixTM誘発性ナルコレプシーの症例は全て、HLA DQB1*0602ハプロタイプ(MHCクラスIIレセプターβ鎖タンパク質:UniProtKB/Swiss−Prot:P01920.2)を有する患者において見出された。そしてこのような個体は、ナルコレプシーを特に発生させやすい(このハプロタイプは、脱力発作を伴うナルコレプシーと診断された患者のうちの85%超において、およびそれほど重症型ではないナルコレプシーを有する患者のうちの50%において認められている)。理論によって拘束されることは望まないが、本発明者らは従って、観察されたナルコレプシーの増大は、ヒポクレチンシグナルの伝達の妨害を生じる自己免疫反応の引き金となり得る、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターがインフルエンザウイルスのNPタンパク質もしくはそのフラグメントに結合することによって、ならびに/またはオレキシンレセプターを発現する細胞の喪失(従って、ナルコレプシーをもたらす)によって引き起こされ得ることを提唱する。この裏付けとして、本明細書で提供されるデータは、PandemrixTMワクチンで見出される核タンパク質改変体に由来するある種のペプチドが、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの安定な結合を示すのに対して、別の核タンパク質に由来する対応するペプチドは示さないということを示す。このことは、ナルコレプシーと関連しなかった別のHLAサブタイプへのこれら同じペプチドのより安定性が低い結合とは対照をなす。
本発明は従って、ワクチンがナルコレプシーの発生に関与する可能性がある核タンパク質を含むという可能性をさらに低減する方法およびワクチンを提供する。
1つのアプローチは、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの結合が低下したかもしくはないインフルエンザA核タンパク質を選択することである。このようにして得られたワクチン組成物は、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの顕著な結合を示す核タンパク質を欠いており、それによって、感受性のある個体におけるナルコレプシーの発生の引き金となるリスクを低下させる。
よって、第1の局面において、本発明は、インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が配列番号12に示される配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。特定の実施形態において、上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価である。
上記組成物中の(インフルエンザA)核タンパク質の全てが、配列番号12に示される配列を含むかまたはこれに由来する公知のワクチン組成物の例は、FocetriaTMであり、従って、これは具体的に除かれる。
関連する局面において、本発明は、1種以上のインフルエンザAウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質はいずれも、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと等価かまたはそれよりも高い親和性でHLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する配列番号2のアミノ酸106〜126に等価なフラグメントを含まない。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が、配列番号12に示される配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。具体的実施形態において、上記核タンパク質はいずれも、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに関して有する結合親和性の半分、1/3もしくは1/4より高い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する配列番号2のアミノ酸106〜126に等価なフラグメントを含まない。
さらに関連する局面において、本発明はまた、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する。好ましくは、上記組成物中の核タンパク質が、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。特定の実施形態において、上記組成物中のインフルエンザA核タンパク質のうちの全てが、配列番号12に示される配列を含むかもしくはこれに由来するわけではない。
関連する実施形態において、上記組成物中のインフルエンザA核タンパク質のうちの全てが、配列番号3に示される配列を含むわけではない。
上記の種々の局面および実施形態において言及される用語「〜に由来する、〜由来の(derived from)」とは、より短いフラグメントが、例えば、タンパク質分解の結果として存在し得ることを意味する。
本発明者らは、HLA DQB1*0602へのインフルエンザウイルスA核タンパク質の結合に関与するおそらく重要な配列が、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置におけるイソロイシン残基であることを同定した。従って、この位置においてイソロイシンを欠いているワクチン生成の間にインフルエンザA核タンパク質を使用することは望ましい。
よって、本発明はまた、インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないが、ただし、上記組成物中の全核タンパク質が配列番号12に示される配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。
関連する実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物に関し、ここで上記核タンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基もメチオニン残基も有しない。
別の実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、配列番号2もしくは配列番号12に示される配列を含まない。好ましくは、上記核タンパク質はまた、配列番号13に示される配列を含まない。関連する実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号3に示される配列を含まない。別の関連する実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号10として示される配列を含まない。
上記の実施形態のうちの全てにおいて、インフルエンザウイルスA核タンパク質への言及が、上記核タンパク質が単一のもしくは複数の供給源に由来するかに拘わらず、上記組成物中のインフルエンザウイルスA核タンパク質の実質的に全てもしくは全てを意味することは、注意されるべきである。「実質的に全て」は、代表的には、上記組成物が基づくインフルエンザA株由来の核タンパク質が、本明細書で示される要件を満たすべきであるが、他の供給源に由来する核タンパク質が少量存在してもよいことを意味する。従って、「実質的に全て」は、代表的には、上記組成物に存在するインフルエンザウイルスA核タンパク質のうちの少なくとも99%を意味する。
従って、例えば、本発明の第1の局面を表現する別の方法は、以下である:
(i)インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスA核タンパク質に関して、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスA核タンパク質が、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、
(ii)単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な全ての上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスA核タンパク質が、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれらに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、
(iii)単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記核タンパク質は、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントを含み、上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスA核タンパク質の上記フラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全核タンパク質は、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。
(i)インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスA核タンパク質に関して、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスA核タンパク質が、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、
(ii)単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な全ての上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全インフルエンザウイルスA核タンパク質が、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むかもしくはこれらに由来する場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、
(iii)単一もしくは複数の供給源に由来するインフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで上記核タンパク質は、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な上記核タンパク質のフラグメントを含み、上記組成物に存在する全インフルエンザウイルスA核タンパク質の上記フラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する組成物。好ましくは、上記組成物中の全核タンパク質は、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む場合、上記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない。
本明細書で示される知見に基づいて、当業者は、既存のもしくは新たに同定された核タンパク質配列のいずれかを採用し得、得られる核タンパク質が、その未改変核タンパク質と比較して、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの結合を低下させているかもしくは結合しないように改変を行い得る。
よって、本発明はまた、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで上記核タンパク質は、未改変核タンパク質と比較して、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへのその結合を低減するかもしくはその結合をなくすように改変されている。
好ましい実施形態において、上記核タンパク質は、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を変化させるかもしくは欠失するように改変されている。代替の実施形態において、上記核タンパク質は、(a)配列番号2のアミノ酸108に対応する位置において脂肪族アミノ酸がない;および/もしくは(b)配列番号2のアミノ酸110に対応する位置において脂肪族アミノ酸がない;および/もしくは(c)配列番号2のアミノ酸111に対応する位置において疎水性アミノ酸がないように、1以上のアミノ酸を変化もしくは欠失させるように改変されている。これら2つの実施形態はまた、組み合わせられ得る。従って、代表的には、得られる核タンパク質は、野生型核タンパク質配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
ナルコレプシーのリスクを回避もしくは低減する別のアプローチは、最終ワクチン組成物に存在する核タンパク質の量を減らすことである。スプリットビリオンおよび全ワクチンは、特に、残留する核タンパク質のかなりの量を含み得る。
よって、第2の局面において、本発明は、インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物を提供し、ここで(i)上記組成物は、スプリットビリオンワクチンであり、存在するインフルエンザウイルスA核タンパク質の量は、10μgのヘマグルチニンあたり3μg未満の核タンパク質であるか、または(ii)上記組成物は、サブユニットワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、10μgのヘマグルチニンあたり0.5μg未満の核タンパク質である。核タンパク質の所望のレベルに関するさらなるガイダンスは、下記にさらに与えられる。
本発明の第1のおよび第2の局面は、組み合わせられ得る。従って、インフルエンザA核タンパク質の混合物が存在する(多価ワクチン)特定の実施形態では、単に上記核タンパク質の量を、本発明の第1の局面に関して回避されるべきであるその核タンパク質に関して本明細書で特定されるレベル未満まで低減することが必要であり得る。他の核タンパク質(例えば、X−181株のもの)は、例えば、ワクチンの任意の特定のタイプに関して通常のレベルで含まれ得る。従って、この実施形態では、特定の核タンパク質の配列/結合特徴に依存して、ある株の抗原の製造の間には単により厳密な精製手段が適用される必要があり、他の株ではそうではない。従って、本発明は、ある一価のバルクに適用され得、これは、次いで、いずれの特別な手段にも供される必要がない他の一価バルクと合わせられて、異なる核タンパク質を有する多価ワクチンを与え得る。
本発明の第1および第2の局面の特定の実施形態において、上記ワクチン組成物は、アジュバント(例えば、水中油型エマルジョン)をさらに含む。ナルコレプシーの発生率の増大は、GSKのアジュバント化PandemrixTMワクチンにおいて認められたので、この効果は、アジュバントの存在によって増大され得、従って、本発明の教示を、アジュバント化ワクチン(季節性もしくは汎流行性の両方)に適用することは、特に重要であり得る。上記アジュバント(例えば、水中油型エマルジョン)は、GSKのアジュバント化PandemrixTMワクチンで使用されるAS03アジュバントの場合のように、トコフェロールをさらに含み得る。特定の実施形態において、上記水中油型エマルジョンMF59は、アジュバントとして除かれる。
プロセス変更はまた、ある種の核タンパク質の潜在的に有害な効果に対して効果を有し得る。例えば、使用される洗剤のタイプは、影響を有し得る。よって、本発明の第1のおよび第2の局面の一実施形態において、上記ワクチン組成物は、Triton(例えば、Triton X−100もしくはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)もしくはTween(例えば、Tween−80もしくはポリソルベート80)、またはこれらの組み合わせをさらに含む。このようなワクチン組成物は、前段落で記載されるように、アジュバント化されてもよいし、アジュバント化されなくてもよい。
本発明の第1のおよび第2の局面のワクチン組成物は、1以上の汎流行性インフルエンザ株に対する、および/もしくは1以上の季節性インフルエンザ株に対するワクチンであり得る。一実施形態において、上記ワクチン組成物は、一価組成物であり、例えば、1つの汎流行性インフルエンザ株のみを含む。関連する実施形態において、上記ワクチン組成物は、インフルエンザA株のみを含む。
本発明の第1のおよび第2の局面の一実施形態において、上記ワクチンは、四価ワクチンである。
本発明の第1のおよび第2の局面のワクチン組成物は、例えば、全ウイルスワクチン、スプリットビリオンワクチンもしくはサブユニットワクチンであり得る。一実施形態において、上記ワクチン組成物は、スプリットビリオンワクチンである。
本発明のワクチン組成物が汎流行性ウイルスに対する場合の別の実施形態において、上記ワクチン組成物は、リアソータントウイルであるNYMC X−157、X163、X−163A、X−163B、X−173、X−173A、X−173B、X−173C、X−177、X−177A、X−177B、X−179、X−179A、X−181もしくはX−181Bから得られない。
本発明のワクチン組成物が季節性ウイルスに対する場合の別の実施形態において、上記ワクチン組成物は、リアソータントウイルスであるNYMC X−157、X163、X−163A、X−163B、X−173、X−173A、X−173B、X−173C、X−177、X−177A、X−177B、X−179、X−179A、X−181もしくはX−181Bから得られない。
一実施形態において、上記ワクチンは、H1株、H2株、H3株、H4株、H5株、H6株、H7株、H8株もしくはH9株(例えば、汎流行性H1株、H3株、H5株、H6株、H7株もしくはH9株)に対するものである。具体例は、H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3およびH7N1である。
さらなる具体的実施形態は、以下で開示される:
ナルコレプシーとMF59アジュバント化インフルエンザワクチンでの免疫化との間に、有意な関連性は何ら検出されなかった。従って、上記NPタンパク質は、水中油型アジュバントとさらなる免疫刺激剤とが使用される場合に、特にリスクがあり得る。このようなさらなる免疫刺激剤は、例えば、トコフェロール/トコフェロール誘導体(AS03)、もしくはTLRアゴニスト(例えば、合成TLR4アゴニストグルコピラノシルリピドA(GLA;WO2009/143457を参照のこと)のような)であり得る。従って、上記水中油型アジュバントでアジュバント化したインフルエンザワクチンは、好ましくは、インフルエンザA NPタンパク質を含まない必要がある。従って、本発明の一実施形態は、以下である:
(a)インフルエンザA NPタンパク質を含まないか、または上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量で15%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%未満のインフルエンザA NPタンパク質を含む、不活化アジュバント化インフルエンザワクチン。好ましい実施形態において、上記アジュバントは、トコフェロール、トコフェロール誘導体、MPL、GLAもしくば別のTLRアゴニストのようなさらなる免疫刺激剤を含む水中油型エマルジョンである。代替の実施形態において、上記ワクチンは、Alumアジュバント化されており、吸着型TLRアゴニストのような免疫刺激剤を含む。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、サブユニットワクチンもしくはスプリットワクチンである。
ナルコレプシーとMF59アジュバント化インフルエンザワクチンでの免疫化との間に、有意な関連性は何ら検出されなかった。従って、上記NPタンパク質は、水中油型アジュバントとさらなる免疫刺激剤とが使用される場合に、特にリスクがあり得る。このようなさらなる免疫刺激剤は、例えば、トコフェロール/トコフェロール誘導体(AS03)、もしくはTLRアゴニスト(例えば、合成TLR4アゴニストグルコピラノシルリピドA(GLA;WO2009/143457を参照のこと)のような)であり得る。従って、上記水中油型アジュバントでアジュバント化したインフルエンザワクチンは、好ましくは、インフルエンザA NPタンパク質を含まない必要がある。従って、本発明の一実施形態は、以下である:
(a)インフルエンザA NPタンパク質を含まないか、または上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量で15%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%未満のインフルエンザA NPタンパク質を含む、不活化アジュバント化インフルエンザワクチン。好ましい実施形態において、上記アジュバントは、トコフェロール、トコフェロール誘導体、MPL、GLAもしくば別のTLRアゴニストのようなさらなる免疫刺激剤を含む水中油型エマルジョンである。代替の実施形態において、上記ワクチンは、Alumアジュバント化されており、吸着型TLRアゴニストのような免疫刺激剤を含む。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、サブユニットワクチンもしくはスプリットワクチンである。
水中油型エマルジョンの状況において「さらなる免疫刺激剤」は、上記エマルジョンを形成する基油および洗剤に加えて含まれる免疫刺激剤を意味する。上記さらなる免疫刺激剤は、上記エマルジョンのアジュバント効果を増大するために添加される。この特許の目的のために、スクアレン、SpanおよびTweenからなるMF59は、さらなる免疫刺激剤を含まないことが理解される。AS03中に含まれる上記トコフェロールは、さらなる免疫刺激剤であると理解される。この特許の目的のために、上記エマルジョンを形成および/もしくは安定化するために代表的に使用される界面活性剤は、これら洗剤がある種の本質的なアジュバント活性を有しているとしても、「さらなる免疫刺激剤」とみなされない。よって、以下の洗剤は、さらなる免疫刺激剤であると理解されるべきではない:ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(一般にはTweenといわれる)、特に、ポリソルベート20およびポリソルベート80;DOWFAXTM商品名の下で販売されるエチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)、および/もしくはブチレンオキシド(BO)のコポリマー(例えば、直鎖状のEO/POブロックコポリマー);オクトキシノール(これは、反復するエトキシ(オキシ−1,2−エタンジイル)基の数が変動し得る)(オクトキシノール−9(Triton X−100、もしくはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)が特に興味深い);(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA−630/NP−40);リン脂質(例えば、ホスファチジルコリン(レシチン));ノニルフェノールエトキシレート(例えば、TergitolTM NPシリーズ);ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brij界面活性剤として公知)(例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Brij 30));ならびにソルビタンエステル(SPANとして一般に公知)(例えば、ソルビタントリオレエート(Span 85)およびソルビタンモノラウレート))。非イオン性界面活性剤が好ましい。他方で、TLRアゴニストは、それらが油もしくは界面活性剤の化学的形態において添加されるとしても、この特許の目的のためいさらなる免疫刺激剤として数え上げる。特に、以下でアジュバントの節で記載されるTLRアゴニストは、さらなる免疫刺激剤として理解される。
あるいは、インフルエンザA NPタンパク質の存在が、水中油型エマルジョンもしくはAlumおよびさらなる免疫刺激因子でアジュバント化したワクチンにおいて完全に回避され得ない場合、PandemrixTM中に含まれるNPタンパク質とは異なるNPタンパク質が、使用されるべきである。従って、本発明の一実施形態は、以下である:
(b)インフルエンザAウイルス由来のNPタンパク質を含むアジュバント化されたインフルエンザワクチンであって、以下の点で特徴付けられる:
(i)上記NPタンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
(ii)配列番号2のアミノ酸106〜118(代表的には、アミノ酸106〜126)に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
それによって、上記アジュバントは、水中油型エマルジョンもしくはAlumおよびさらなる免疫刺激剤である。
(b)インフルエンザAウイルス由来のNPタンパク質を含むアジュバント化されたインフルエンザワクチンであって、以下の点で特徴付けられる:
(i)上記NPタンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
(ii)配列番号2のアミノ酸106〜118(代表的には、アミノ酸106〜126)に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
それによって、上記アジュバントは、水中油型エマルジョンもしくはAlumおよびさらなる免疫刺激剤である。
好ましい実施形態において、上記アジュバントは、水中油型エマルジョンであり、上記さらなる免疫刺激剤は、トコフェロール、トコフェロール誘導体、GLA、MPLもしくは別のTLRアゴニストである。代替の実施形態において、上記アジュバントは、Alum(例えば、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム)であり、TLRアゴニストを含む。
NPタンパク質と、PandemrixTM中で使用されるとおりの配列(配列番号2)との存在が回避できない場合(例えば、代替のバックボーンが利用可能でないことが理由で)、上記ワクチンは、単にさらなる免疫刺激剤を含まないアジュバントでアジュバント化されるべきである。これは、特に、以下に当てはまる:(i)スプリットワクチン(これは比較的多量のNPを含む)、(ii)四価もしくはより高い価数のワクチン(NPの量が加算されていくので)、(iii)小児集団および/もしくは青年集団に与えられる予定のワクチン(ナルコレプシー症例の大部分は、これら集団において検出されてきたので)、(iv)インフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体に与えられる予定のワクチン(HLA DQB1*0602を有する被験体に類似;ナルコレプシーは、これら被験体においてのみ起こったので)、ならびに(v)Tritonを含む抗原(ナルコレプシーは、Triton含有抗原に応じて主に出現してきたので)。従って、本発明の一実施形態は、以下のとおりである:
(c)アジュバント化したスプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号2を有する少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって、上記組成物は、Tritonを含む点で特徴付けられる、組成物。
(c)アジュバント化したスプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号2を有する少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって、上記組成物は、Tritonを含む点で特徴付けられる、組成物。
好ましい実施形態において、このワクチンは、小児集団(0〜36ヶ月)および/もしくは青年集団(4〜19歳)において、ならびに/またはインフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体、好ましくは、HLA DQB1*0602を有する被験体において使用するためのものである。
代替の実施形態は、以下である:
(d)0〜72ヶ月の小児および/もしくは青年(4〜19歳)、ならびに/またはインフルエンザワクチン接種に関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体、好ましくは、HLA DQB1*0602を有する被験体の処置のための方法であって、それによって上記の小児および/もしくは青年ならびに/または被験体は、アジュバント化されたスプリットインフルエンザワクチンでワクチン接種され、ここで上記ワクチンは、少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号2を有する少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって上記組成物は、Tritonを含む点で特徴付けられる方法。さらなる実施形態は、以下である:
(e)不活化インフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含むが、(a)核タンパク質を含まないか、もしくは(b)核タンパク質を含むが、核タンパク質の量は、上記ワクチン中のインフルエンザウイルスタンパク質の総質量のうちの1%未満であるかのいずれかである抗原成分を含む、ワクチン、
(f)不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合し得る核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H7N9、H9N2、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される、
(g)汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含むワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される、
(h)汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、配列LXLYXXXIXXXXXX(配列番号9)を含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない(ここでXは、任意のアミノ酸である)抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される。
(d)0〜72ヶ月の小児および/もしくは青年(4〜19歳)、ならびに/またはインフルエンザワクチン接種に関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体、好ましくは、HLA DQB1*0602を有する被験体の処置のための方法であって、それによって上記の小児および/もしくは青年ならびに/または被験体は、アジュバント化されたスプリットインフルエンザワクチンでワクチン接種され、ここで上記ワクチンは、少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号2を有する少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含み、上記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって上記組成物は、Tritonを含む点で特徴付けられる方法。さらなる実施形態は、以下である:
(e)不活化インフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含むが、(a)核タンパク質を含まないか、もしくは(b)核タンパク質を含むが、核タンパク質の量は、上記ワクチン中のインフルエンザウイルスタンパク質の総質量のうちの1%未満であるかのいずれかである抗原成分を含む、ワクチン、
(f)不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合し得る核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H7N9、H9N2、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される、
(g)汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない抗原成分を含むワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される、
(h)汎流行性と関連するインフルエンザ株に対する不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、(i)AS03アジュバント、ならびに(ii)Triton X−100およびTween 80を含み、核タンパク質を含むが、配列LXLYXXXIXXXXXX(配列番号9)を含む核タンパク質もしくは核タンパク質フラグメントを含まない(ここでXは、任意のアミノ酸である)抗原成分を含む、ワクチン。好ましくは、上記ワクチンは、汎流行性と関連するインフルエンザ株に対するものであり、上記インフルエンザ株は、H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、およびH7N1から選択される。
一実施形態において、上記の非アジュバント化ワクチンのうちの抗原成分は、水中油型アジュバントで、特に、AS03での処方のために使用され得る、
(i)インフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含む一価インフルエンザワクチンであって、
(i)上記NPタンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
(ii)配列番号2のアミノ酸106〜118(もしくは106〜126)に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって上記ワクチンは、1用量あたり7.5マイクログラム未満のHA、および必要に応じて、アジュバントを含む、一価インフルエンザワクチン、
(j)少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含むインフルエンザワクチンであって:
a.上記NPタンパク質のいずれも、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
b.配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記少なくとも1種の核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって、上記ワクチンは、必要に応じて、アジュバントを含む、ワクチン、
(k)インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、(i)配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザAウイルス核タンパク質、および(ii)A/California/7/2009(H1N1)由来のNYMC X−181株に由来するインフルエンザAウイルス核タンパク質を含まない、ワクチン。本明細書中の他の箇所で説明されるように、このワクチンは、NYMC X−157株、X163株、X−163A株、X−163B株、X−173株、X−173A株、X−173B株、X−173C株、X−177株、X−177A株、X−177B株、X−179株、X−179A株、X−181株もしくはX−181B株のうちのいずれかに由来する核タンパク質を含まない可能性がある。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント(例えば、MF59もしくはAS03)を含み得る。上記ワクチンは、一価もしくは多価(例えば、三価もしくは四価)であり得る、
(l)インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、(i)配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザAウイルス核タンパク質、および(ii)2013年10月1日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザAウイルス株に由来するヘマグルチニンを含まない、ワクチン。上記ワクチンはまた、(iii)2013年10月1日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザBウイルス株由来のヘマグルチニンを含まない可能性がある。上記WHOの株の推奨は、インターネット上で入手可能であり[6]、2014年の南半球でのインフルエンザ流行期において使用するためのの株は、2013年9月26日にアナウンスされた。FDAのVRBPACからの推奨は、同様にオンラインで入手可能であり[7]、2013/14年のインフルエンザ流行期において使用するための株は、2013年2月27日にアナウンスされた。従って、特徴(ii)によって定義される株は、容易に決定され得る。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント(例えば、MF59もしくはAS03)を含み得る。上記ワクチンは一価であり得るが、好ましくは、多価(例えば、三価もしくは四価)である。上記ワクチンが四価である場合、それは、理想的には、2種のA株および2種のB株に由来するヘマグルチニンを含み、ここで上記2種のA株は、異なるヘマグルチニンサブタイプ(例えば、H1N1株およびH3N2株のように、H1およびH3に由来する)を有し、上記2種のB株は、異なる系統(すなわち、B/Victoria/2/87様株およびB/Yamagata/16/88様株)を有する。以下を参照のこと。
(i)インフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含む一価インフルエンザワクチンであって、
(i)上記NPタンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
(ii)配列番号2のアミノ酸106〜118(もしくは106〜126)に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって上記ワクチンは、1用量あたり7.5マイクログラム未満のHA、および必要に応じて、アジュバントを含む、一価インフルエンザワクチン、
(j)少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来するNPタンパク質を含むインフルエンザワクチンであって:
a.上記NPタンパク質のいずれも、配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しない、および/または
b.配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記少なくとも1種の核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する、
という点で特徴付けられ、それによって、上記ワクチンは、必要に応じて、アジュバントを含む、ワクチン、
(k)インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、(i)配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザAウイルス核タンパク質、および(ii)A/California/7/2009(H1N1)由来のNYMC X−181株に由来するインフルエンザAウイルス核タンパク質を含まない、ワクチン。本明細書中の他の箇所で説明されるように、このワクチンは、NYMC X−157株、X163株、X−163A株、X−163B株、X−173株、X−173A株、X−173B株、X−173C株、X−177株、X−177A株、X−177B株、X−179株、X−179A株、X−181株もしくはX−181B株のうちのいずれかに由来する核タンパク質を含まない可能性がある。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント(例えば、MF59もしくはAS03)を含み得る。上記ワクチンは、一価もしくは多価(例えば、三価もしくは四価)であり得る、
(l)インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むアジュバント化された不活化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで上記ワクチンは、(i)配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有するインフルエンザAウイルス核タンパク質、および(ii)2013年10月1日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザAウイルス株に由来するヘマグルチニンを含まない、ワクチン。上記ワクチンはまた、(iii)2013年10月1日より前に、世界保健機関によって、もしくはワクチンおよび関連生物製剤に関する諮問委員会によってインフルエンザワクチン中に含めることを推奨された任意のインフルエンザBウイルス株由来のヘマグルチニンを含まない可能性がある。上記WHOの株の推奨は、インターネット上で入手可能であり[6]、2014年の南半球でのインフルエンザ流行期において使用するためのの株は、2013年9月26日にアナウンスされた。FDAのVRBPACからの推奨は、同様にオンラインで入手可能であり[7]、2013/14年のインフルエンザ流行期において使用するための株は、2013年2月27日にアナウンスされた。従って、特徴(ii)によって定義される株は、容易に決定され得る。上記ワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバント(例えば、MF59もしくはAS03)を含み得る。上記ワクチンは一価であり得るが、好ましくは、多価(例えば、三価もしくは四価)である。上記ワクチンが四価である場合、それは、理想的には、2種のA株および2種のB株に由来するヘマグルチニンを含み、ここで上記2種のA株は、異なるヘマグルチニンサブタイプ(例えば、H1N1株およびH3N2株のように、H1およびH3に由来する)を有し、上記2種のB株は、異なる系統(すなわち、B/Victoria/2/87様株およびB/Yamagata/16/88様株)を有する。以下を参照のこと。
上記で考察されるように、βサブユニットがHLA DQB1*0602であるMHCクラスIIレセプターヘテロダイマーへの潜在的結合に関して、既存の核タンパク質および特にインフルエンザワクチン製造で使用される新たな潜在的核タンパク質を試験することは、望ましい。
よって、本発明は、ワクチン生成の適性に関してインフルエンザAウイルスを試験するための方法を提供し、上記方法は、上記インフルエンザウイルスの核タンパク質もしくはそのフラグメント、または上記インフルエンザウイルスのゲノムセグメントによってコードされる核タンパク質もしくはそのフラグメントが、H1N1株X−179A由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602に結合し得るか否かを決定する工程を包含し;ここで上記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質が、X−179A由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602に結合し得る場合、ワクチン生成に適している。本明細書全体を通じて、「HLA DQB1*0602への結合」への言及が、βサブユニットがHLA DQB1*0602であるMHCクラスIIレセプターヘテロダイマーへの結合を意味することは、当業者によって理解される。
ワクチン生成の適性に関してインフルエンザAウイルスを試験する方法もまた提供され、上記方法は、(a)上記インフルエンザウイルスの核タンパク質の配列、もしくは上記核タンパク質をコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを決定する工程;および(b)上記核タンパク質が、X−179A株由来の核タンパク質と比較して同じ条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602への結合を可能にする配列を有するか否かを決定する工程を包含し;ここで上記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質が、X−179A株由来の核タンパク質と比較して同じ条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602に結合し得る場合、ワクチン生成に適している。
上記で言及されるように、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの上記ウイルスのNPタンパク質の結合は、疾患発生に関与し得るので、NPタンパク質が、X−179A株(これは、PandemrixTMに使用された)と比較してHLA DQB1*0602に対してより低い結合親和性を有するインフルエンザAウイルスを選択することは、ワクチンにおいて望ましい。このNPタンパク質は、発生期アミノ酸配列である配列番号2を有し、以下の分析から、HLA DQB1*0602を結合するためのこの配列の重要な部分は、RELILYDKEEIRRIWRQANNG(配列番号1)であることが示されている。
FocetriaTMで使用され、ナルコレプシーの引き金とならなかったインフルエンザウイルスのNPタンパク質は、これが配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含まない(図1を参照のこと)という点でPandemrixTMのNPタンパク質とは異なり、従って、この位置においてイソロイシンを有するNPタンパク質を回避することは望ましい。興味深いことに、数千もの公知のNPタンパク質のデータベース配列を本発明者らが分析したところ、この領域が高度の保存を示し、公知のNPタンパク質のうちの大部分、特に、ワクチン製造のために使用されるリアソータントウイルスにおいて見出されるものが、この位置もしくはその等価な位置においてイソロイシンを有するということが示された。
本発明はまた、ワクチン生成の適性に関してインフルエンザAウイルスを試験する方法を提供し、上記方法は、(a)上記インフルエンザAウイルスの核タンパク質の配列もしくは上記核タンパク質をコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントを決定する工程;および(b)配列番号2のアミノ酸116に対応する位置にある上記核タンパク質のアミノ酸を決定する工程を包含し;ここで上記インフルエンザウイルスは、そのNPタンパク質が、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含まない場合に、ワクチン生成に適している。
従って、本発明はまた、本発明のワクチン組成物の調製に適したシードウイルスを提供する。一実施形態において、本発明のシードウイルスは、インフルエンザAウイルス核タンパク質であって、ここで配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記核タンパク質のフラグメントが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する核タンパク質を含む。好ましくは、上記シードウイルスのインフルエンザA核タンパク質が、配列番号12に示される配列を含む場合、上記ウイルスシードは、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株ではない。特定の実施形態において、上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号2のアミノ酸106〜126に等価である。
ワクチン生成に関するインフルエンザAウイルスの適性を評価する場合、上記ウイルスの核タンパク質が、(a)配列番号2のアミノ酸108に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(b)配列番号2のアミノ酸110に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(c)配列番号2のアミノ酸111に対応する位置において疎水性アミノ酸、のうちの1以上を含むか否かをチェックすることは、さらに望ましい。HLA DQB1*0602への結合に関する上記核タンパク質のコア結合モチーフは、配列番号2のアミノ酸108、110、111、113および116にあり、ここで結合は、アミノ酸108および110が脂肪族アミノ酸でありかつ111位のアミノ酸が疎水性アミノ酸である場合に特によく機能する。従って、これら位置においてこのようなアミノ酸を回避すると、上記NPタンパク質がHLA DQB1*0602に結合し得る可能性は減少し得、このことはさらに、上記NPタンパク質がナルコレプシーを引き起こす可能性を減少させる。インフルエンザウイルスは、これが、これら特定のアミノ酸のうちの1つ、2つもしくは全てを含まない場合に、ワクチン生成に特に適していると考えられる。111位における結合ポケットは、結合に特に重要であることが示されており、従って、上記NPタンパク質がこの位置において疎水性アミノ酸を含まないことは、好ましい。上記タンパク質がこの位置においてチロシンを含まないことは、特に好ましい。なぜなら強い結合因子の公知の例は、このアミノ酸を有するからである[8]。108位および/もしくは110位におけるアミノ酸は、好ましくは、ロイシンではない。上記インフルエンザウイルスはまた、これが配列LXLYXXXIXXXXXX(配列番号9)を含まない(ここでXは、任意のアミノ酸である)場合に、ワクチン生成に適していると考えられ得る。
本発明はまた、インフルエンザAウイルスを調製する方法を提供し、上記方法は、(a)本発明の方法によるワクチン生成に関するインフルエンザAウイルスの適性を試験する工程;(b)培養宿主を上記工程(a)のインフルエンザウイルスに感染させる工程;および(c)上記工程(b)の宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程;ならびに必要に応じて、(d)工程(c)で得られたウイルスを精製する工程を包含する。これら方法において、上記ウイルスは、本発明の方法によって評価されるように、ワクチン生成に適していると考えられる場合、ワクチン生成のために使用され得る。
本発明はさらに、インフルエンザA核タンパク質もしくはそのフラグメントを含むワクチンが、ヒトへの投与に適していることを確認する方法を提供し、上記方法は、上記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを有するか否かを決定する工程を包含し;ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質が、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含まない場合に、ヒトへの投与に適していると考えられる。
上記方法は、上記で考察されるように、上記ウイルスの核タンパク質が、(a)配列番号2のアミノ酸108に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(b)配列番号2のアミノ酸110に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(c)配列番号2のアミノ酸111に対応する位置において疎水性アミノ酸、のうちの1以上を含むか否かを試験する工程をさらに包含し得る。上記方法は、上記ウイルスの核タンパク質がこれらアミノ酸のうちの全てを有するか否かを試験する工程を包含し得る。
上記で考察されるように、NPタンパク質(もしくはそのフラグメント)がHLA DQB1*0602に結合し得るか、もしくはNPタンパク質が配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザAウイルスは、ナルコレプシーと関連づけられた。従って、このようなNPタンパク質もしくはフラグメントの存在を回避することは、このことがインフルエンザAワクチンの信頼性をさらに増大させ、上記ワクチンの安全性をもさらに増大させるので、望ましい。従って、HLA DQB1*0602を結合し得るおよび/または配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザAウイルスが、ワクチン生成に使用される場合、上記NPタンパク質(もしくはそのフラグメント)が最終ワクチン中に存在しないことを確実にするために得られるワクチンが試験されることは、好ましい。
従って、本発明はまた、インフルエンザワクチンがヒトへの投与に安全であることを確認するための方法を提供する。上記方法は、(a)インフルエンザワクチンを、核タンパク質がHLA DQB1*0602に結合し得るインフルエンザウイルス(例えば、そのNPが配列番号2である株)から調製する工程;および(b)上記核タンパク質の存在に関して上記ワクチンを試験する工程を包含し得;ここで上記ワクチンは、これがHLA DQB1*0602に結合し得る上記核タンパク質を含まない場合に、ヒトへの投与に安全である。あるいは、上記方法は、(a)インフルエンザワクチンを、核タンパク質が配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを有するインフルエンザウイルスから調製する工程;および(b)上記核タンパク質の存在に関して上記ワクチンを試験する工程を包含し得;ここで上記ワクチンは、これがHLA DQB1*0602に結合し得る上記核タンパク質を含まない場合に、ヒトへの投与に安全であると考えられる。
上記で考察されるように、PandemrixTMワクチンに応じたナルコレプシーの全症例は、HLA DQB1*0602ハプロタイプを有する患者において起こったので、この患者群に特定の注意を喚起することは、望ましい。従って、ワクチンを投与する前に、患者のHLAハプロタイプを考慮に入れることは、望ましい。
従って、本発明はまた、被験体にワクチンを投与する方法を提供し;上記方法は、(a)上記被験体が、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有するか否かを決定する工程、および(b)上記被験体にリスクがないと見出される場合に、上記ワクチンを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、ワクチンを被験体に投与するための方法を提供し、上記方法は、(a)上記被験体がある種のHLAハプロタイプを有するか否かを決定する工程;および(b)上記被験体が上記ハプロタイプに関して陰性であると見出される場合に、上記被験体にワクチンを投与する工程を包含する。特に、本発明は、インフルエンザワクチンを被験体に投与するための方法を提供し、上記方法は、(a)上記被験体が、HLA DQB1*0602ハプロタイプを有するか否かを決定する工程、および(b)上記被験体がHLA DQB1*0602に関して陰性である場合、インフルエンザワクチンを上記被験体に投与する工程を包含する。
本発明はまた、被験体を免疫化する方法を提供し、上記方法は、ワクチンを上記被験体に投与する工程を包含し、ここで上記被験体は、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患を発生させるリスクを負うHLAに関して陰性である。好ましい実施形態において、そのワクチンは、インフルエンザAワクチンであり、そして/または上記被験体は、HLA DQB1*0602に関して陰性である。
あるいは、本発明は、上記ワクチンと関連して自己免疫疾患のリスクを負うHLAハプロタイプを有する被験体における使用のためのワクチンを提供し、それによって、ワクチンは、そのHLAハプロタイプに結合するワクチン成分を実質的に含まない。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、インフルエンザAウイルスおよびHLAタイプDQB1*0602に対するものであり、上記ワクチンは、上記NPタンパク質を含まないか、または配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないNPタンパク質を含むか、そして/または上記NPタンパク質もしくは配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記核タンパク質のフラグメントが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する。好ましい実施形態において、上記NPタンパク質もしくはそのフラグメントは、除去されている。より好ましい実施形態において、上記インフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
本発明はまた、被験体をインフルエンザに対して免疫化する方法を提供し、上記方法は、インフルエンザワクチンを、上記被験体がHLA DQB1*0602に関して陽性である被験体に投与する工程を包含し、それによって上記ワクチンは、インフルエンザA NPタンパク質を含まないか、または配列番号2に示される核タンパク質配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有しないインフルエンザA NPタンパク質を含むか、そして/または上記NPタンパク質もしくは配列番号2のアミノ酸106〜118に等価な上記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、組換えワクチンである。
本発明はまた、HLA DQB1*0602を有する被験体における使用のためのNPを含むインフルエンザワクチンを提供し、それによって上記NPタンパク質は、配列番号2の配列を含む。
本発明はまた、核タンパク質もしくはそのフラグメントがHLA DQB1*0602に結合し得るインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、HLA DQB1*0602に結合し得る核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。好ましい実施形態において、上記インフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
核タンパク質が、配列番号1の配列を含む核タンパク質と比較して、等しいかまたはそれより高い親和性でHLA DQB1*0602に結合する能力に関して試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンがさらに提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質を含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
核タンパク質が、X−179A株由来の核タンパク質と比較して、等しいかまたはそれより高い親和性でHLA DQB1*0602に結合する能力について試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンもまた提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質を含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
核タンパク質もしくはそのフラグメントが、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンの存在に関して試験されたインフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチンもまた提供され、ここで上記ワクチンは、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。好ましい実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、組換えワクチンではない。
本発明はまた、スプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供し、上記ワクチンは、HAに対して、上記PandemrixTMワクチンより少ない量のインフルエンザAウイルス由来の核タンパク質を含む。これは、特に、上記核タンパク質が本明細書で記載されるように試験されなかった場合、重要な安全性尺度であり得る。なぜなら核タンパク質のより低い量が、上記核タンパク質がナルコレプシーの引き金となる可能性を低くするからである。特定の実施形態において、本発明は、存在する核タンパク質の量が、10μgのヘマグルチニンあたり3μg未満の核タンパク質(例えば、10μgのHAあたり3μg未満のNP、10μgのHAあたり2.5μg未満のNP、10μgのHAあたり2μg未満のNP、10μgのHAあたり1.5μg未満のNP、10μgのHAあたり1μg未満のNP、10μgのHAあたり0.5μg未満のNPもしくは10μgのHAあたり0.1μg未満のNP)であるスプリットビリオンワクチン組成物を提供する。
組成物中のタンパク質の量を決定するための方法は、当業者に公知である。しかし、NPおよびNAは実質的に同じ分子量(約60kDa)を有するので、それらは通常、非還元ゲル中で共に移動する(co−migrate)。従って、古典的なSDSゲル電気泳動は、NPの量を決定するために適した方法でないと思われる[9]。ワクチンバルク中のNPの量を決定するための一方法は、2次元電気泳動とその後のデンシトメトリーであり得る。しかし、好ましいのは、参考文献10に記載されるように同位体標識した合成ペプチドを使用する同位体希釈質量分析である。この方法は、複数反応モニタリング(MRM)とともに同位体希釈を使用する液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC−MS/MS)を使用する。この方法は、検体タンパク質に代表的な化学量論としてサンプルのタンパク質分解による消化による、標的となるペプチドの放出を定量する。安定な同位体標識参照ペプチドは、内部標準物質(IS)として上記サンプルの中に加えられる。NPの定量は、上記同位体標識した参照ペプチドのピーク面積と、内因性の標的ペプチドのものとを比較することによって達成される。この方法は、標識されたペプチドが、各特異的な標的のために含まれることを条件として、複数のタンパク質の同時定量を可能にする。
あるいは、標識なし質量分析(LC/MSE)は、定量のために、好ましくは、四重極飛行時間型(Q−Tof)質量分析において使用される[11]。この方法に関して、LC/MS分析の間の低衝突エネルギーおよび高衝突エネルギーの交互のスキャンは、1回の実験で両方のタンパク質の正体および量を得るために使用される。定量は、任意の所定のタンパク質に関して3種の最も強いトリプシンペプチド(tryptic peptide)のLC/MSEによって測定された平均シグナル強度が、タンパク質のタイプおよびサイズに拘わらず、所定の濃度で一定であることを示す実験データに基づく。シグナル強度は濃度に比例するので、混合物中の任意のタンパク質の量は、概算され得る。
本発明はまた、ヘマグルチニンに対する核タンパク質の比が、以下のアッセイによって評価される場合に、1.5未満(例えば、<1.4、<1.3、<1.2、<1.1、もしくはさらに<1.0)であるスプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供する:上記ワクチン中のタンパク質は、沈殿させられ;上記沈殿したタンパク質は、集められ、還元され、プロピオンアミドを使用してアルキル化され;上記アルキル化タンパク質は、37℃において一晩、トリプシンおよびLysC(Lys残基のカルボキシル側において特異的に加水分解するLysobacter enzymogenes由来のセリンエンドプロテイナーゼ)の混合物で消化され;ギ酸で酸性化され;C18逆相樹脂を使用してタンパク質分解フラグメントが精製され;フラグメント化のために15種の最も強力な多重に荷電された前駆イオン(multiply charged precursor ion)を選択するとともに、精製フラグメントのHPLC−MSMS(高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析)が行われ;MSスペクトルピークがインフルエンザウイルスタンパク質にマッチさせられ;10種の最も量の多いタンパク質がMSスペクトルの中で選択され;そしてこれら10種の最も量の多いタンパク質内で、ヘマグルチニンMSシグナルに対する核タンパク質MSシグナルの比が計算される。以下で示されるように、現在のスプリットワクチンにおいて、このアッセイによって評価されるMSに対するNPの比は、1.5より高い。
本発明はまた、ヘマグルチニンに対する核タンパク質の比が、以下のアッセイによって評価される場合に0.3未満(例えば、<0.28、<0.26、<0.25、<0.20、もしくはさらに<0.10)であるスプリットビリオンインフルエンザワクチンを提供する:上記ワクチン中のタンパク質は沈殿させられ;上記沈殿したタンパク質は、集められ、還元され、プロピオンアミドを使用してアルキル化され;上記アルキル化タンパク質は、37℃において一晩、トリプシンおよびLysC(Lys残基のカルボキシル側において特異的に加水分解するLysobacter enzymogenes由来のセリンエンドプロテイナーゼ)の混合物で消化され;ギ酸で酸性化され;C18逆相樹脂を使用してタンパク質分解フラグメントが精製され;フラグメント化のために15種の最も強力な多重に荷電された前駆イオンを選択するとともに、精製フラグメントのHPLC−MSMS(高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析)が行われ;上記ワクチンに存在することが公知の株に対する正確な配列マッチによって、MSスペクトルピークがインフルエンザウイルス核タンパク質およびヘマグルチニン配列にマッチさせられ;10種の最も量の多いタンパク質がMSスペクトルの中で選択され;そしてこれら10種の最も量の多いタンパク質内で、ヘマグルチニンMSシグナルに対する核タンパク質MSシグナルの比が計算される。
本発明はまた、核タンパク質レベルが、行われるさらなる精製工程に起因して、スプリットビリオンワクチンよりサブユニットワクチンにおいてより低いはずであることに注意して、インフルエンザA核タンパク質の低下したレベルを含むサブユニットインフルエンザワクチンを提供する。特に、本発明は、存在する核タンパク質の量が10μgのHAあたり0.5μg未満のNP(例えば、10μgのHAあたり0.1μg未満のNP)であるサブユニットワクチンを提供する。前段落のワクチンは有利である。なぜなら、インフルエンザウイルス(そのNPタンパク質は、ナルコレプシーを引き起こしたインフルエンザワクチンの生成のために使用されたインフルエンザウイルスのNPタンパク質と特徴を共有する)からワクチンが調製されている場合、上記ワクチンが、上記NPタンパク質をナルコレプシーと関連づけられた濃度で含まないことを確実にすることは望ましいからである。
代表的には、前段落で記載されるワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバントでアジュバント化される。このようなワクチン(PandemrixTMのように)において、上記ワクチンを試験することは特に有利である。なぜなら、以下に説明されるように、上記アジュバントは、上記NPペプチドがナルコレプシーの引き金となり得るというより高いリスクをもたらし得るからである。最も好ましい実施形態において、上記水中油型エマルジョンアジュバントは、トコフェロール、トコフェロール誘導体、GLAもしくはTLRアゴニストのようなさらなる免疫刺激剤、特に、α−トコフェロールを含む。
上記インフルエンザワクチンは、前段落で考察される特徴について試験されたインフルエンザウイルスから生成される。この試験工程は、生成プロセスの間の任意のステージで行われ得る。それは、例えば、ワクチンが生成されるウイルス培養を始めるために使用されるシードウイルスに対して行われ得る。それはまた、ウイルス培養物から採取されたサンプルに対して行われ得る。上記試験工程はまた、生成プロセスにおいて使用されないインフルエンザウイルスに対して、例えば、上記試験工程があるウイルス株の1つのバッチを使用して行われ、その同じウイルス株の別のバッチが上記ワクチンの生成のために使用される場合に、行われ得る。上記試験工程は、あらゆる生成サイクルにおいて行われる必要はない。それは、インフルエンザワクチンを生成する同じ実体によって行われる必要もない。例えば、1つの実体が上記ウイルスを試験し、上記試験結果を他の実体に対して、例えば、データベースの中で利用可能にすることは、可能である。この選択肢は、上記試験工程がインフルエンザウイルスの配列情報を得ることによって行われる場合に特に魅力的である。なぜならこのような情報は、公のデータベースにおいて容易に利用可能にされ得るからである。
インフルエンザAワクチンを調製するための方法もまた提供され、上記方法は、(a)第1のプレワクチン組成物を調製する工程;(b)オレキシンレセプター1および/もしくはオレキシンレセプター2を摸倣する組成物構造物の量を、上記第1のワクチンから除去もしくは低減して、第2のプレワクチンを提供する工程;ならびに(c)上記ワクチンを、上記第2のプレワクチンから調製する工程を包含する。好ましくは、オレキシンレセプター1および/もしくはオレキシンレセプター2を摸倣する構造物の量は、90%超、より好ましくは、95%、および最も好ましくは99%超だけ低減される。例として、工程(b)における除去は、クロマトグラフィーによる。本発明はまた、ウイルスからウイルスサブユニットを調製するための方法を提供し、ここで上記サブユニットは、オレキシンレセプター1および/もしくはオレキシンレセプター2を摸倣する構造物を含まずに調製される。上記方法は、上記ワクチンを処方する工程、必要に応じて上記ワクチンとアジュバントとを混合する工程、上記ワクチンを充填し、パッケージングし、ラベルを貼付する工程のようなさらなる工程を包含し得る。
本発明は、核タンパク質配列がアミノ酸配列RELILYDKEEMRRIWRQANNG(配列番号3)を含むインフルエンザウイルスからワクチンを調製するための方法をさらに提供し、上記方法は、上記アミノ酸配列を含むいずれの核タンパク質もしくはそのフラグメントをも除去して、上記ワクチンを提供する工程を包含する。別の実施形態において、本発明のワクチンは、核タンパク質配列がアミノ酸配列RELILYDKEEIRRIWRQANNG(配列番号3)を含むインフルエンザウイルスから、上記アミノ酸配列を含むいかなる核タンパク質もしくはそのフラグメントをも除去して、上記ワクチンを提供する工程を包含して調製される。上記方法は、上記ワクチンを処方する工程、必要に応じて上記ワクチンとアジュバントとを混合する工程、上記ワクチンを充填し、パッケージングし、ラベルを貼付する工程のようなさらなる工程を包含し得る。
本発明はまた、不活化もしくは生の弱毒化インフルエンザAワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、HLA DQB1*0602に結合し得る核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない。本発明はまた、オレキシンレセプター1および/もしくはオレキシンレセプター2を摸倣する核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない、不活化もしくは生の弱毒化インフルエンザAワクチンを提供する。核タンパク質を含むが、上記核タンパク質の量が、10μgのHAあたり3μg未満のNP、10μgのHAあたり2.5μg未満のNP、10μgのHAあたり2μg未満のNP、10μgのHAあたり1.5μg未満のNP、10μgのHAあたり1μg未満のNP、10μgのHAあたり0.5μg未満のNP、もしくは10μgのHAあたり0.1μg未満のNPであるインフルエンザAワクチンもまた、提供される。本発明はまた、核タンパク質もしくはそのフラグメントを含まない不活化インフルエンザAワクチンを提供する。好ましくは、この段に記載されるワクチンは、HLA DQB1*0602に結合し得る核タンパク質もしくはフラグメントを含んだインフルエンザAウイルスから出発して生成されている。さらにもしくは代わりに、上記ワクチンは、水中油型エマルジョン、特に、さらなる免疫刺激因子を含むものでアジュバント化される。
本発明はさらに、インフルエンザAワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、オレキシンレセプター1および/またはオレキシンレセプター2、もしくはそのフラグメントを摸倣する組成物構造物の量を除去もしくは低減する工程を包含する。好ましくは、オレキシンレセプター1および/もしくはオレキシンレセプター2を摸倣する構造物の量は、90%超、より好ましくは、95%および最も好ましくは、99%超だけ低減される。本発明はさらに、インフルエンザAワクチンを調製するための方法を提供し、上記方法は、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントの量を除去もしくは低減する工程を包含する。好ましくは、核タンパク質もしくはフラグメントの量は、90%超程度、より好ましくは、95%程度および最も好ましくは、99%超程度低減される。調製物からタンパク質を除去するための方法は、当該分野で周知である。例として、上記核タンパク質もしくはそのフラグメントの量を除去もしくは低減する工程は、クロマトグラフィーもしくは免疫沈降によって行われ得る。
ナルコレプシーは、小児(0〜36ヶ月)および青年(4〜19歳)の集団において大部分は検出されてきたので、一実施形態において、本明細書で記載されるとおりの本発明の全てのワクチンは、小児(0〜36ヶ月)および青年(4〜19歳)の集団における使用のためのものである。
水中油型エマルジョンが、本明細書で記載される抗原と組み合わせて使用される場合、上記ワクチンの抗原およびアジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前に、そのエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器の中にあってもよい。上記抗原および上記アジュバント成分は、同じ生成場所で生成されてもよいし、異なる生成場所で生成されてもよい。本発明の一局面は、アジュバント成分とともに、キットの中に処方および/もしくはパッケージのための抗原成分の使用である。本発明の別の局面は、抗原成分とともにキットの中に処方および/もしくはパッケージのための上記アジュバントの使用である。
(発明の詳細な説明)
(核タンパク質)
本発明は、当業者が、ワクチン生成に関するインフルエンザAウイルスの適性を、上記ウイルスの核タンパク質のある種の特徴(例えば、HLA DQB1*0602への結合)またはある種のアミノ酸の存在について配列をチェックすることに基づいて評価することを可能にする方法を提供する。
(核タンパク質)
本発明は、当業者が、ワクチン生成に関するインフルエンザAウイルスの適性を、上記ウイルスの核タンパク質のある種の特徴(例えば、HLA DQB1*0602への結合)またはある種のアミノ酸の存在について配列をチェックすることに基づいて評価することを可能にする方法を提供する。
本発明が、核タンパク質を試験(もしくは配列決定、分析など)することによって定義される場合、これは、全長核タンパク質を試験することを包含し得るが、通常は、上記核タンパク質のフラグメントを試験することを包含し得る。なぜなら上記核タンパク質は、抗原提示細胞による細胞内プロセシングの後に、フラグメントとしてMHCクラスIIレセプターに結合して提示されると予測されるからである。これらフラグメントは、200個未満のアミノ酸(例えば、100個未満のアミノ酸、90個未満のアミノ酸、80個未満のアミノ酸、70個未満のアミノ酸、60個未満のアミノ酸、50個未満のアミノ酸、40個未満のアミノ酸、30個未満のアミノ酸、もしくは20個未満のアミノ酸)の長さを有し得る。当業者によって認識されるように、フラグメントは、代表的には、MHCクラスIIレセプターに結合するために少なくとも約12個もしくは13個のアミノ酸の長さであるはずである(例えば、少なくとも18個、19個、20個もしくは21個のアミノ酸の長さ)。本発明の方法が30個未満のアミノ酸の長さを有するフラグメントを使用して実施されることは、このようなフラグメントがより扱いやすいことから好ましい。さらに、上記フラグメントが配列決定される場合、上記方法はまた、より短い配列が分析される場合にはより安価である。
フラグメントが本発明の方法において使用される場合、上記フラグメントは、配列番号2のアミノ酸108〜116、好ましくは、配列番号2のアミノ酸106〜118もしくはアミノ酸106〜126に対応するアミノ酸を含むべきである。なぜならこの配列は、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合するためのコアモチーフであるからである。従って、本発明で使用され得るフラグメントは、9個のアミノ酸という最小の長さを有するが、上記で言及されるように、代表的には、MHCクラスIIレセプターに結合するために少なくとも約12個もしくは13個のアミノ酸の長さである(例えば、少なくとも18個、19個、20個もしくは21個のアミノ酸の長さ)。この状況において配列番号2のアミノ酸108〜116および106〜118および106〜126への言及は、本発明が、配列番号2のアミノ酸108〜116もしくは106〜118もしくは106〜126に示される正確に同じアミノ酸配列を含むフラグメントでのみ実施され得ることを意味しない。代わりに、これは、当業者が他の核タンパク質配列(例えば、X−181株における配列番号3)においてその対応するアミノ酸を見出し、それによって、任意のインフルエンザAウイルスNPにおいても等価なフラグメントを同定するための参照を提供する。
フラグメントが1つの株から使用される場合、別の株との何らかの比較が、その株由来の対応するフラグメントに対しておこなれて、例えば、X−181株由来のより長いもしくはより短い配列と比較するのではなく、配列番号1を有するペプチドと配列番号3を有するペプチドとを比較するべきである。
本発明はまた、前段落に記載されるように、インフルエンザNPタンパク質もしくはフラグメントをコードするゲノムセグメントで実施され得る。従って、タンパク質配列決定なしの方法が行われ得るが、代わりに、核酸配列決定を使用(もしくはさらには別個に得られた配列情報を使用)することによって行われ得る。
上記NPタンパク質もしくはフラグメントは、MHCクラスIIレセプターのβ鎖サブユニットであるHLA DQB1*0602に結合するその能力を試験することによって分析され得る。よって、HLA DQB1*0602への上記NPタンパク質もしくはフラグメントの結合を試験する工程が、上記βサビユニットがHLA DQB1*0602である機能的MHCクラスIIレセプターヘテロダイマーに結合することに基づくことは、当業者によって理解される。そのαサブユニットは、代表的には、DQA1サブユニット(例えば、HLA DQA1*0102(これは、白色人種のアメリカ人においてHLA DQB1*0602と最も共通して関連づけられたDQA1サブユニットである)である。このようなヘテロダイマーは、例えば、組換え発現技術を使用して、試験目的で得られ得る。可溶性MHCクラスIIレセプターヘテロダイマーを発現するために適した方法は、参考文献12に記載される。HLA DQB1*0602のアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss−Prot:P01920)から入手可能である。別の適切な方法は、参考文献13に記載される。
これら実験における参照点は、配列番号2のNPタンパク質、もしくはより代表的には、前段落で考察されるようにその配列のフラグメント(例えば、配列番号1に示されるフラグメント)である。この配列を有するNPタンパク質は、ナルコレプシーと関連づけられた。このタンパク質と比較してより低い親和性で(同じ実験条件下で)HLA DQB1*0602を結合するNPタンパク質は、HLA DQB1*0602に結合する可能性がより低くなり、従って、ナルコレプシーを引き起こす可能性がより低くなる。上記で考察されるように、代表的には、上記比較は、等価なフラグメントで行われる。例えば、上記NPフラグメントが配列番号1に示されるフラグメントである場合、その試験NPフラグメントは、異なるNPタンパク質が正確に同じ長さでない可能性があることおよび欠失もしくは挿入を有し得ることを考慮して、アミノ酸106〜126もしくはその等価な領域から得られる。
結合親和性を試験するために適したアッセイは、当該分野で公知である(例えば、NMR、フィルター結合アッセイ、ゲル遅延度アッセイ(gel−retardation assay)、置換/競合アッセイ(displacement/competition assay)、リバース・ツーハイブリッド法(reverse two−hybrid)、表面プラズモン共鳴および分光法を使用する)。適切なペプチド結合アッセイの例は、参考文献12に記載される。アッセイの特定の例において、試験ペプチド(例えば、X−179A株由来のNPタンパク質フラグメント(例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるかもしくはこれを含むフラグメント)は、検出可能な標識(例えば、ビオチン)で標識され、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプター(代表的には、ヘテロダイマーの他の成分としてHLA DQA1*0102とともに)に結合される。次いで、非標識の試験ペプチドは、レセプター標識ペプチド複合体とともにインキュベートされる。上記試験ペプチドは、上記参照標識ペプチドと結合に関して成功裡に競合するか否かは、なお結合されている標識ペプチドの量を測定することによって決定され得る。上記試験ペプチドが、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに、より低い強さで結合する場合、それは、上記標識された参照ペプチドと結合に関して成功裡に競合しないので、これは、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに、X−179A株由来のNPタンパク質より低い強さで結合するNPタンパク質を同定するための便利な手段を提供する。
他のアッセイは、参考文献13および88に記載される(例えば、合成試験ペプチドがMHC−ペプチド複合体を安定化する能力を測定する、実施例中で使用されるREVEALTM ProImmune技術(ここでMHC−ペプチド複合体の天然のコンフォメーションの存在もしくは非存在は、特異的モノクローナル抗体によって検出される))。
一実施形態において、試験されている上記NPタンパク質(例えば、配列番号2のアミノ酸106〜118に対応するか、または配列番号2のアミノ酸106〜126に対応するフラグメント)は、X−179A由来のNPタンパク質(例えば、配列番号2のアミノ酸106〜118からなるか、もしくは配列番号2のアミノ酸106〜126からなるフラグメント)より、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに関して少なくとも1/2の結合親和性を、例えば、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに関して1/3、1/4、1/5もしくは1/10の結合親和性を有する。好ましくは、上記試験されているMHCクラスIIレセプターは、HLA DQA1*0102およびHLA DQB1*0602のヘテロダイマーである。
上記NPタンパク質はまた、前段落で考察されるように、その配列もしくはフラグメントの配列を決定することによって分析され得る。上記方法はまた、上記NPタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするウイルスセグメントの配列を分析することによって行われ得る。ペプチドおよび核酸を配列決定するために適したアッセイは、当該分野で周知であり、例えば、エドマン分解アッセイおよびサンガー配列決定法が挙げられる。核酸が分析される場合、上記核酸は、配列決定する前に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅され得る。
一実施形態において、上記分析は、上記ウイルスの核タンパク質が、(a)配列番号2のアミノ酸108に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(b)配列番号2のアミノ酸110に対応する位置において脂肪族アミノ酸;および/もしくは(c)配列番号2のアミノ酸111に対応する位置において疎水性アミノ酸のうちの1つ以上を含むか否かに関して行われる。HLA DQB1*0602への結合のための上記核タンパク質のコア結合モチーフは、配列番号2のアミノ酸108、110、111、113および116にあり、ここで結合は、アミノ酸108および110が脂肪族アミノ酸であり、かつ111位のアミノ酸が疎水性アミノ酸である場合に特に良く機能する。従って、これらの位置においてこのようなアミノ酸を回避すると、上記NPタンパク質がHLA DQB1*0602に結合し得る可能性が低減し、このことはさらに、上記NPタンパク質がナルコレプシーを引き起こす可能性を低減する。インフルエンザウイルスは、これが、これら特定のアミノ酸のうちの1つ、2つもしくは全てを含まない場合に、ワクチン生成に特に適していると考えられる。111位の上記結合ポケットは、結合に特に重要であることが示されており、従って、上記NPタンパク質がこの位置において疎水性アミノ酸を含まないことは好ましい。上記タンパク質がこの位置においてチロシンを有しないことは特に好ましい。なぜなら強い結合因子の公知の例は、このアミノ酸を有するからである[8]。108位および/もしくは110位のアミノ酸は、好ましくは、ロイシンではない。上記インフルエンザウイルスはまた、これが配列LXLYXXXIXXXXXX(配列番号9)を含まない(ここでXは、任意のアミノ酸である)場合に、ワクチン生成に適していると考えられ得る。上記タンパク質配列はまた、代替の手段によって分析され得る。例えば、ゲノムセグメントが分析される場合、上記セグメントは、上記結合モチーフに特に関連するアミノ酸を特異的に検出するプローブを使用して分析され得る。同様に、上記NPタンパク質は、免疫化学的方法(例えば、ウェスタンブロット分析もしくは免疫蛍光法)を使用して分析され得る。このような分析法が本発明で使用される場合、これらは、配列LILYDKEEI(配列番号8、配列番号2のアミノ酸108〜116に相当)の特異的検出を可能にする抗体を使用して行われるべきである。上記で考察されるように、上記NPタンパク質が111位においてチロシンを有さず、従って、上記抗体が、111位においてチロシンを特異的に検出する抗体であり得ることは特に好ましい。代わりに、もしくはさらに、上記抗体は、108位および/もしくは110位のロイシンを特異的に検出し得る。関連する配列の間を区別し得る抗体を得るための方法は、当業者に公知である。
(核タンパク質の検出)
いくつかの局面において、本発明は、インフルエンザA核タンパク質を含まない不活化インフルエンザワクチンを提供する。当業者は、最終ワクチンから全NPを除去することはしばしば可能でないこと、およびワクチン(特に、スプリットワクチン)がNPの残留量をなお含むことを認識している。例えば、FocetriaTMワクチンは、ある量のNPタンパク質をなお含んでいたが、これらタンパク質は、問題とはなり得ない。なぜならそれらは、PandemrixTM中にある量より遙かに低い量で存在したからである。
いくつかの局面において、本発明は、インフルエンザA核タンパク質を含まない不活化インフルエンザワクチンを提供する。当業者は、最終ワクチンから全NPを除去することはしばしば可能でないこと、およびワクチン(特に、スプリットワクチン)がNPの残留量をなお含むことを認識している。例えば、FocetriaTMワクチンは、ある量のNPタンパク質をなお含んでいたが、これらタンパク質は、問題とはなり得ない。なぜならそれらは、PandemrixTM中にある量より遙かに低い量で存在したからである。
従って、本発明のワクチンが核タンパク質を含む場合、それは、好ましくは、上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量の15%未満(例えば、<12%、<10%、<8%、<7%、<6%、<5%、<4%、<3%、<2%、もしくは<1%)を構成する。上記ワクチンは、10μgのHAあたり3μg未満のNP、10μgのHAあたり2.5μg未満のNP、10μgのHAあたり2μg未満のNP、10μgのHAあたり1.5μg未満のNP、10μgのHAあたり1μg未満のNP、10μgのHAあたり0.5μg未満のNP、もしくは10μgのHAあたり0.1μg未満のNPを含み得る。上記NPの量は、上記のように決定され得る。
上記で考察されるように、インフルエンザA核タンパク質の混合物が存在する一実施形態では、上記核タンパク質の量を、本発明の第1の局面において与えられる定義に従って回避され得るべきであるその核タンパク質に関して、本明細書で特定されるレベル未満に単に減らすことが必要であり得る。従って、この実施形態において、上記に与えられるNPの量の評価は、このような核タンパク質、例えば、X−179A株の核タンパク質に関して行われる必要があるだけである。他の核タンパク質(例えば、X−181株のもの)は、例えば、ワクチンの任意の特定のタイプに関して通常のレベルで含まれ得る。従って、この実施形態では、単により厳密な精製手段が、特定の核タンパク質の配列/結合特徴に依存して、いくつかの株の製造の間に適用される必要があり、他の株ではそうでない。いったん最終ワクチン組成物へと合わせられると、NPの総量は、上記に与えられた限界を超えることもあるが、ただし減らすことが望ましいNPのタイプの量は、限界を超えない。
組成物中のタンパク質の量を決定するための方法は、当業者に公知である。しかし、NPおよびNAは実質的に同じ分子量を有する(約60kDa)ので、それらは通常、非還元ゲル中で共に移動する。従って、古典的なSDSゲル電気泳動は、NPの量を決定するために適した方法でないと思われる(Chaloupkaら、1996,Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Feb;15(2):121−7を参照のこと)。ワクチンバルク中のNPの量を決定するための一方法は、2次元電気泳動とその後のデンシトメトリーであり得る。しかし、好ましいのは、Williamsら、Vaccine 30 (2012) 2475-2482に記載されるように同位体標識した合成ペプチドを使用する同位体希釈質量分析である。この方法は、複数反応モニタリング(MRM)とともに同位体希釈を使用する液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC−MS/MS)を使用する。この方法は、検体タンパク質に代表的な化学量論としてサンプルのタンパク質分解による消化によって放出される、標的となるペプチドを定量する。安定な同位体標識参照ペプチドは、内部標準物質(IS)として上記サンプルの中に加えられる。NPの定量は、上記同位体標識した参照ペプチドのピーク面積と、内因性の標的ペプチドのものとを比較することによって達成される。この方法は、標識されたペプチドが、各特異的な標的のために含まれることを条件として、複数のタンパク質の同時定量を可能にする。
あるいは、標識なし質量分析(LC/MSE)は、定量のために、好ましくは、四重極飛行時間型(Q−Tof)質量分析において使用される[11]。この方法に関して、LC/MS分析の間の低衝突エネルギーおよび高衝突エネルギーの交互のスキャンは、1回の実験で両方のタンパク質の正体および量を得るために使用される。定量は、任意の所定のタンパク質に関して3種の最も強いトリプシンペプチドのLC/MSEによって測定された平均シグナル強度が、タンパク質のタイプおよびサイズに拘わらず、所定の濃度で一定であることを示す実験データに基づく。シグナル強度は濃度に比例するので、混合物中の任意のタンパク質の量は、概算され得る。
(培養宿主)
上記インフルエンザウイルスは、代表的には、細胞株を使用して生成されるが、初代細胞が代替として使用され得る。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものであるが、トリもしくは昆虫細胞もまた、使用され得る。適切な哺乳動物細胞としては、ヒト、ハムスター、ウシ、霊長類およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である。種々の細胞が使用され得る(例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など)。適切なハムスター細胞の例は、名称BHK21もしくはHKCCを有する細胞株である。適切なサルの細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞(例えば、Vero細胞株のような腎臓細胞[14〜16]である。適切なイヌの細胞は、例えば、CLDKおよびMDCK細胞株のような腎臓細胞である。適切なトリ細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するEBx細胞株、EB45、EB14、およびEB14−074[17]が挙げられる。
上記インフルエンザウイルスは、代表的には、細胞株を使用して生成されるが、初代細胞が代替として使用され得る。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものであるが、トリもしくは昆虫細胞もまた、使用され得る。適切な哺乳動物細胞としては、ヒト、ハムスター、ウシ、霊長類およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である。種々の細胞が使用され得る(例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など)。適切なハムスター細胞の例は、名称BHK21もしくはHKCCを有する細胞株である。適切なサルの細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞(例えば、Vero細胞株のような腎臓細胞[14〜16]である。適切なイヌの細胞は、例えば、CLDKおよびMDCK細胞株のような腎臓細胞である。適切なトリ細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するEBx細胞株、EB45、EB14、およびEB14−074[17]が挙げられる。
さらに適切な細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:CHO;MRC 5;PER.C6[18];FRhL2;WI−38など。適切な細胞は、例えば、American Type Cell Culture(ATCC) Collection[19]から、Coriell Cell Repositories[20]から、もしくはEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)から、広く入手可能である。例えば、上記ATCCは、種々の異なるVero細胞をカタログ番号CCL 81、CCL 81.2、CRL 1586およびCRL−1587の下で供給しており、MDCK細胞をカタログ番号CCL 34の下で供給している。PER.C6は、ECACCから寄託番号96022940の下で入手可能である。
本発明における使用に好ましい細胞は、Madin Darbyイヌ腎臓に由来するMDCK細胞[21〜23]である。元のMDCK細胞は、ATCCからCCL 34として入手可能である。これらの派生物または他のMDCK細胞が使用されることは好ましい。このような派生物は、例えば、参考文献21において記載されており、この参考文献は、懸濁培養における増殖に適合したMDCK細胞(「MDCK 33016」もしくはDSM ACC 2219として寄託された「33016−PF」)を開示している。さらに、参考文献24は、無血清培養において懸濁物中で増殖するMDCK由来の細胞(FERM BP−7449として寄託された「B−702」)を開示している。いくつかの実施形態において、使用されるMDCK細胞株は、腫瘍形成性であり得るが、非腫瘍形成性MDCK細胞を使用することもまた、想定される。例えば、参考文献25は、非腫瘍形成性MDCK細胞(「MDCK−S」(ATCC PTA−6500)、「MDCK−SF101」(ATCC PTA−6501)、「MDCK−SF102」(ATCC PTA−6502)および「MDCK−SF103」(ATCC PTA−6503)が挙げられる)を開示する。参考文献26は、「MDCK.5F1」細胞(ATCC CRL 12042)を含む、非常に感染しやすいMDCK細胞を開示している。
本発明の方法において1種より多くの細胞タイプの混合物を使用することも考えられるが、1つの細胞タイプを使用すること、例えば、モノクローナル細胞を使用することが、好ましい。
本発明の方法において使用される細胞は、好ましくは、ヒトへの投与に使用され得るインフルエンザワクチンを生成するために適した細胞である。このような細胞は、ワクチン製造について承認され、国の管理当局によって登録された細胞バンクシステムから得られなければならず、ワクチン生成について許可された最大継代数内でなければならない(概要については参考文献27を参照のこと)。ワクチン製造について承認された適切な細胞の例としては、MDCK細胞(MDCK 33016のような;参考文献21を参照のこと)、CHO細胞、Vero細胞、およびPER.C6細胞が挙げられる。本発明の方法は、好ましくは、293T細胞を使用しない。なぜなら、これら細胞は、ワクチン製造について承認されていないからである。
好ましくは、上記ウイルスを生成するため、および上記ワクチンを調製するために使用される細胞は、同じ細胞タイプである。例えば、上記細胞は、両方ともMDCK細胞、Vero細胞もしくはPerC6細胞であり得る。これは、承認を1つの細胞株について得る必要しかないので、規制当局の承認を容易にすることから好ましい。それは、競合する培養選択圧もしくは異なる細胞培養条件が回避され得るというさらなる利点を有する。本発明の方法はまた、同じ細胞株をずっと、例えば、MDCK 33016を使用し得る。
上記インフルエンザウイルスはまた、卵の中で増殖され得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在の標準的方法は、SPF孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、その卵の内容物(尿膜腔液)から精製される。ウイルスを卵によって継代し、その後、上記ウイルスを、細胞培養物中で増殖させることもまた可能であり、その逆もまた同様である。
(ウイルス調製)
本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、(a)ワクチン生成に関する上記インフルエンザウイルスの適性を、上記で考察される方法によって試験する工程;(b)培養宿主を、上記工程(a)のインフルエンザウイルスに感染させる工程;および(c)上記工程(b)の宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程;および必要に応じて(d)工程(c)で得られたウイルスを精製する工程を包含する。
本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、(a)ワクチン生成に関する上記インフルエンザウイルスの適性を、上記で考察される方法によって試験する工程;(b)培養宿主を、上記工程(a)のインフルエンザウイルスに感染させる工程;および(c)上記工程(b)の宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程;および必要に応じて(d)工程(c)で得られたウイルスを精製する工程を包含する。
上記培養宿主は、前段落で考察されるように、細胞または孵化鶏卵であり得る。細胞が、本発明のこの局面において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件(例えば、温度、細胞密度、pH値など)が、使用される上記細胞株および上記ウイルスに依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。
好ましくは、上記細胞は、一般的な汚染物質源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞培養のための種々の無血清培地が、当業者に公知である(例えば、イスコフ培地、ウルトラCHO培地(BioWhittaker)、EX−CELL(JRH Biosciences))。さらに、無タンパク質培地が使用され得る(例えば、PF−CHO(JRH Biosciences))。さもなければ、複製のための細胞はまた、特注の血清含有培地(例えば、0.5%〜10%のウシ胎仔血清を有する、MEMもしくはDMEM培地)中で培養され得る。
上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システム(fed−batch system)で、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分(もしくは栄養分の一部)の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のpH値を、pH6.6〜pH7.8の値に、および特に、pH7.2〜pH7.3の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、30℃〜40℃の間の温度で行われる。感染細胞を培養する場合(工程c)、上記細胞は、好ましくは、30℃〜36℃の間の温度もしくは32℃〜34℃の間の温度、または33℃で培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである[28]。
酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、25%〜95%の間の値において、および特には、35%〜60%の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約8〜25×105細胞/mLの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約5〜20×106細胞/mLの細胞密度で行われる。上記細胞は、10−8〜10の間、好ましくは、0.0001〜0.5の間のウイルス用量(MOI値(「感染多重度」;感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応する)で感染させられ得る。
ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。したがって、一部の実施形態において、上記細胞は、懸濁物中での増殖に適合され得る。
本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離も含む。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活化されることも本発明にしたがって好ましい。ウイルス不活化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。
(ワクチン)
インフルエンザワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、本発明で好ましく、これらは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。しかし、それは、一般に核タンパク質を含むインフルエンザワクチンを製造するために特に適している。このようなインフルエンザワクチンは、生のウイルス、全ビリオンもしくはスプリットビリオンインフルエンザワクチンを含む。本発明によって包含されるワクチンは、核タンパク質が1以上のプロセス/製造工程の間に存在し、従って、核タンパク質を最終ワクチン組成物中におそらく含み得るワクチンであり、これは、特定のMHCクラスIIレセプターサブタイプへのNPの結合を低減もしくは回避するための工程が採用されなければ、感受性の個体において自己免疫応答のリスクが増大し得る。
インフルエンザワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、本発明で好ましく、これらは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。しかし、それは、一般に核タンパク質を含むインフルエンザワクチンを製造するために特に適している。このようなインフルエンザワクチンは、生のウイルス、全ビリオンもしくはスプリットビリオンインフルエンザワクチンを含む。本発明によって包含されるワクチンは、核タンパク質が1以上のプロセス/製造工程の間に存在し、従って、核タンパク質を最終ワクチン組成物中におそらく含み得るワクチンであり、これは、特定のMHCクラスIIレセプターサブタイプへのNPの結合を低減もしくは回避するための工程が採用されなければ、感受性の個体において自己免疫応答のリスクが増大し得る。
本発明の第1の局面において、本発明のワクチンは、NPタンパク質(もしくはそのフラグメント)がX−179A株のNPタンパク質(もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号2に示される配列のアミノ酸106もしくは108〜118もしくは120もしくは126からなるかまたはこれを含むフラグメント)より低いHLA DQB1*0602に対する結合親和性を有するインフルエンザA NPタンパク質を有する。他の方法で表すと、このようなワクチンのNPタンパク質は、X−179A株のNPタンパク質(もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号2に示される配列のアミノ酸106もしくは108〜118もしくは120もしくは126からなるかもしくはこれを含むフラグメント)と同じかそれより高い親和性でHLA DQB1*0602に結合する領域を欠いている。
本発明の第2の局面において、本発明のワクチンは、配列番号2のアミノ酸残基116に対応する位置においてイソロイシンを欠いているインフルエンザA NPタンパク質を有する。例えば、上記ワクチン組成物中に存在するインフルエンザA NPタンパク質。
先に考察されるように、本発明は、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへの有意な結合を示し得るNPの存在を回避することが目的であるので、本発明の組成物におけるインフルエンザA核タンパク質への言及が組成物中の全インフルエンザA核タンパク質を考慮せねばならないということは明らかである。不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原(インフルエンザについては、ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む)を含み得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの1つ以上の有効量での処理が挙げられる:洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン(BPL)、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン(C60)、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活化の非化学的方法は、当該分野で公知である(例えば、UV光もしくはγ線照射)。種々の方法の組み合わせを使用してインフルエンザウイルスを不活化することもまた可能である。例えば、BPLおよびUV光の組み合わせは有用である。
これまでは、ナルコレプシー症例は、上記PandemrixTMのDresden抗原(以下を参照のこと)でワクチン接種した被験体においてのみバックグラウンド発生率より高い率で検出された。上記Dresden抗原は、TritonおよびTweenを含む。水中油型エマルジョンアジュバントならびにTweenおよびTriton X−100洗剤を含む抗原を含むインフルエンザワクチンに由来するナルコレプシーのリスクを低減するために、2つの方法が考えられる:(i)サブユニットワクチンにおけるように、NPなし、もしくはNPの量が実質的に低減した抗原成分の使用、または(ii)HLA DQB1*0602に結合し得るNPもしくはそのフラグメントを含まないワクチン生成用のシードウイルスの使用。
従って、本発明の一局面は、インフルエンザA NPタンパク質を含まないか、または上記ワクチン中の総インフルエンザウイルスタンパク質の質量で15%未満、例えば、<12%、<10%、<8%、<7%、<6%、<5%、<4%、<3%、<2%、もしくは<1%のインフルエンザA NPタンパク質を含む、水中油型アジュバント化された不活化インフルエンザワクチンである。一実施形態において、上記アジュバントは、さらなる免疫増強因子であるトコフェロール、GLAもしくはTLRアゴニストを含む。好ましい実施形態において、上記アジュバントは、AS03である。一実施形態において、上記ウイルスは、ホルムアルデヒドで不活化されている。一実施形態において、上記ワクチンは、チメロサールを含む。好ましい実施形態において、上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Tween 80および/もしくはTriton x−100(t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)を含む。好ましくは、Triton X−100とHAとの間の重量/容積比は、1.5〜15の間である。好ましくは、Triton−100TM濃度は、10〜500μg/mlの間である。特に好ましい実施形態において、上記ワクチンは、AS03でアジュバント化された精製サブユニットワクチンである。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、AS03とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
本発明の別の局面は、NPタンパク質を含むが、HLA DQB1*0602に結合し得るNPタンパク質もしくはNPフラグメントを含まない、AS03アジュバント化不活化スプリットインフルエンザAワクチンである。これは、Foecetria(X−181)で使用されるものに類似であるが、PandemrixTMで使用されるものとは異なるバックボーンが使用される場合に、達成され得る。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、H1株、H3株、H5株、H7株もしくはH9株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性H1株、H3株、H5株、H7株もしくはH9株に対するものである。一実施形態において、上記ウイルスは、ホルムアルデヒドで不活化されている。一実施形態において、上記ワクチンは、チメロサールを含む;代替の実施形態において、それは、保存剤を含まない。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Tween 80および/もしくはTriton x−100(t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)を含む。好ましくは、Triton X−100とHAとの間の重量/容積比は、1.5〜15の間である。好ましくは、Triton−100TM濃度は、10〜500μg/mlの間である。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でWO2011/051235の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る(以下を参照のこと)。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、AS03とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
本発明の別の局面は、同一条件下でX−179A株由来の核タンパク質と比較してより低い親和性で、HLA DQB1*0602に結合するNPタンパク質を含む、AS03アジュバント化不活化スプリットインフルエンザAワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、H1株、H3株、H5株、H7株もしくはH9株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性H1株、H3株、H5株、H7株、もしくはH9株に対するものである。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Tween 80および/もしくはTriton X−100を含む。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でWO2011/051235の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る(以下を参照のこと)。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、AS03とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
本発明の別の局面は、配列番号2のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを含まないNPタンパク質(図1を参照のこと)を含む、AS03アジュバント化不活化スプリットインフルエンザAワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、H1株、H3株、H5株、H7株もしくはH9株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性H1株、H3株、H5株、H7株、もしくはH9株に対するものである。上記ワクチンの抗原成分は、洗剤、特に、Tween 80および/もしくはTriton X−100を含む。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でWO2011/051235の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る(以下を参照のこと)。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、AS03とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
本発明の別の局面は、配列LXLYXXXIXXXXXX(配列番号9)を含まないNPタンパク質(ここでXは、任意のアミノ酸である)を含む、AS03アジュバント化不活化スプリットインフルエンザAワクチンである。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、H1株、H3株、H5株、H7株もしくはH9株に対するものであり、特に好ましい実施形態では、汎流行性H1株、H3株、H5株、H7株、もしくはH9株に対するものである。上記ワクチンは、類似のもしくは同一の濃度でWO2011/051235の表に示されるとおりの賦形剤を含み得る(以下を参照のこと)。上記ワクチンの上記抗原および上記アジュバント成分は、予め混合されていてもよいし、投与前にエンドユーザー/ヘルスケア提供者が混合するために別個の容器中にあってもよい。本発明の一局面は、水中油型アジュバントとともに、特に、AS03とともに処方するために上記で特定された抗原成分の使用である。
ビリオンは、ウイルス含有流体(例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清)から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤(例えば、エチルエーテル、ポリソルベート 80、デオキシコレート、トリ−N−ブチルホスフェート、Triton X−100、Triton N101、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Tergitol NP9など)で処理して、サブビリオン調製物を生成する(「Tween−エーテル」スプリットプロセスを含む)ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である(例えば、参考文献29〜34などを参照のこと)。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性(例えば、カチオン性)界面活性剤(例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、N,N−ジアルキル−グルカミド、Hecameg、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、NP9、4級アンモニウム化合物、サルコシル、CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)、トリ−N−ブチルホスフェート、Cetavlon、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびDOT−MA)、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えば、Triton界面活性剤(例えば、Triton X−100もしくはTriton N101))、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(Tween界面活性剤)、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。1つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る(例えば、スクロース密度勾配溶液において)。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化(非ビリオン材料を除去するために)、上記採取したビリオンの濃縮(例えば、吸着法(例えば、CaHPO4吸着)を使用して)、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する(例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する)ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過(例えば、限外濾過)を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETMおよびFLUSHIELDTM製品である。
精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチン(糖タンパク質)は、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記FLUVIRINTM、AGRIPPALTMおよびINFLUVACTM製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。精製表面糖タンパク質ワクチンは、スプリットワクチンに対して特に有利であり得る。なぜならそれらは、遙かにより低レベルのNPタンパク質を含むからである。
別の形態の不活化抗原は、ビロソーム[35](核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子)である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。
本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液(例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む)で安定化され得る。生の弱毒化インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である(例えば、参考文献36の第17章および第18章を参照のこと)。生ワクチンとしては、FLUMISTTM製品が挙げられる。
本発明が、生のワクチンに関する場合、組成物中での特定のインフルエンザウイルスA核タンパク質の存在もしくは非存在への言及はまた、上記ワクチン内の株によってコードされる核タンパク質、ならびに上記ワクチン自体の中の核タンパク質に当てはまり得る。例えば、上記インフルエンザA株は、配列番号2のアミノ酸106〜118に等価なフラグメントが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する核タンパク質をコードし得る。X−179Aのように、A/Ann Arbor/6/60バックボーンは、116位にイソロイシンを有する(AY210074を参照のこと)ので、本発明の有用な生ワクチンは、116位においてイソロイシン以外の残基(例えば、メチオニン)を有するNPをコードするインフルエンザAウイルス株を含む。
上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合(cold−adapted)され得る。これら3つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。
HAは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、HAレベルを参照することによって標準化されている(代表的には、SRIDによって測定される)。既存のワクチンは、代表的には、1株あたり約15μgのHAを含むが、より低い用量が、使用され得る(例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合)。分割量(例えば、1/2(すなわち、7.5μg HA/株)、1/4および1/8)が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた(例えば、3×もしくは9×用量[37、38])。従って、ワクチンは、0.1〜150μgの間のHA/インフルエンザ株、好ましくは、0.1〜50μgの間(例えば、0.1〜20μg、0.1〜15μg、0.1〜10μg、0.1〜7.5μg、0.5〜5μgなど)を含み得る。特定の用量としては、1株あたり、例えば、約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約3.75、約1.9、約1.5などが挙げられる。好ましい実施形態において、上記ワクチンは、<30μg/mlの濃度でHAを含む。それはまた、<10μg/単位用量、7.5μg/単位用量;<5μg/単位用量;もしくは3.75μg/単位用量の濃度でHAを含み得る。
生ワクチンに関して、投与は、HA含有量よりむしろ、50%組織培養感染量(median tissue culture infectious dose)(TCID50)によって測定され、1株あたり106〜108の間の(好ましくは、106.5〜107.5の間の)TCID50が、代表的である。
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のHA、もしくは改変HAを有し得る。例えば、HAを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基(例えば、HA1/HA2切断部位の周りの非常に塩基性の領域)を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。
汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。
抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である(例えば、オセルタミビル[39]および/もしくはザナミビルに抵抗性である)株である(耐性汎流行性株を含む[40])。
本発明の組成物は、1つ以上の(例えば、1つ、2つ、3つ、4つもしくはそれより多い)インフルエンザウイルス株(インフルエンザA型ウイルスおよび/もしくはインフルエンザB型ウイルスを含む)に由来する抗原を含み得る。ワクチンが1より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、1より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である(2つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含む)。四価ワクチンもまた有用である[41](2つのインフルエンザA型ウイルス株および2つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または3つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株に由来する抗原を含む)。
インフルエンザワクチンは、季節性インフルエンザ株由来の抗原のみを有してもよいし、汎流行性株由来の抗原のみ(一価)を有していてもよい。従って、上記ワクチン組成物は、1つのA株のみを有する一価の汎流行性のものであり得る。それはまた、季節性および汎流行性両方のインフルエンザ株由来の抗原を有し得る。例えば、上記ワクチンは、3つの季節性インフルエンザ株(例えば、2つのA株および1つのB株)および1つの汎流行性インフルエンザ株由来の抗原を含む四価ワクチンであり得る。三価の季節性インフルエンザワクチンもまた、一価の汎流行性インフルエンザワクチンとともに投与され得る。
1つの好ましい実施形態において、上記ワクチンは、4種以上のインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む。特に好ましい実施形態において、上記ワクチンは、2つのA株および2つのB株を含む。例えば、(i)A/H1N1株;(ii)A/H3N2株;(iii)B/Victoria/2/87様株;および(iv)B/Yamagata/16/88様株。別の特に好ましい実施形態において、上記の株のうちの1種は、例えば、(i)A/H1N1株;(ii)A/H3N2株;および(iii)B株と組み合わせた、H5N1株もしくはH7N9株のような汎流行性株である。上記四価以上のワクチンは、アジュバント化され得る。
インフルエンザAウイルスは、現在18種のHAサブタイプを示す:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、およびH18。それは現在、9種のNAサブタイプを有する:N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8およびN9。2種のインフルエンザAウイルス株を含むワクチンにおいて、これらは通常、異なるHAサブタイプ(例えば、H1およびH3)および異なるNAサブタイプ(例えば、N1およびN2)に由来するので、ワクチンは、例えば、H1N1株およびH3N2株由来の抗原を含み得る。
インフルエンザBウイルスは、現在異なるHAサブタイプを示さないが、インフルエンザBウイルス株は、2つの異なる系統に入る。これら系統は、1980年代後半に出現し、互いに抗原的におよび/もしくは遺伝的に区別され得るHAを有する[42]。本発明のワクチンが2つのインフルエンザB株由来の抗原を含む場合、これらは通常、一方はB/Victoria/2/87様株であり、一方はB/Yamagata/16/88様株である。これら株は通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の差異はまた、上記2系統を区別するために記載されてきた。例えば、B/Yamagata/16/88様株は、アミノ酸残基164(「Lee40」HA配列と比較して番号付けされる)において欠失を有するHAタンパク質をしばしば(しかし常にではない)有する[43]。
(薬学的組成物)
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、1種以上の薬学的キャリアおよび/もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献44で入手される。
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、1種以上の薬学的キャリアおよび/もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献44で入手される。
ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。
ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは2−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである(すなわち、5μg/ml未満)ことが好ましい(例えば、チオメルサールを含まない[33、45])。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る[33]。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。
張度を制御するために、組成物は、生理学的塩(例えば、ナトリウム塩)を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウム(NaCl)が好ましく、塩化ナトリウムは、1〜20mg/mlの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム(disodium phosphate dehydrate)、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
ワクチン組成物は、一般に、200mOsm/kg〜400mOsm/kgの間(好ましくは、240〜360mOsm/kgの間)の質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、290〜310mOsm/kgの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない質量オスモル濃度が以前に報告されている[46]が、この範囲において質量オスモル濃度を維持することは好ましい。
ワクチン組成物は、1種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる:リン酸塩緩衝剤;Tris緩衝剤;ホウ酸塩緩衝剤;コハク酸塩緩衝剤;ヒスチジン緩衝剤(特に、水酸化アルミニウムアジュバントで);またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、5〜20mM範囲で含まれる。
ワクチン組成物のpHは、一般に、5.0〜8.1の間、より代表的には、6.0〜8.0の間(例えば、6.5〜7.5の間、または7.0〜7.8の間)である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのpHを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。
上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である(例えば、1用量あたり<1 EU(エンドトキシン単位、標準的な尺度)、好ましくは、<0.1 EU/用量を含む)。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
本発明のワクチン組成物は、洗剤(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(「Tween」として公知)、オクトキシノール(例えば、オクトキシノール−9(Triton X−100)もしくはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(「CTAB」)、またはデオキシコール酸ナトリウム(特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために))を含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−10およびポリソルベート80の各々について1mg/ml未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質(例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンB)であり得る。
ワクチン組成物は、1回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい(すなわち、「複数用量」キット)。保存剤を含めることは、複数用量の構成(arrangement)において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として(もしくはそれに加えて)、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
インフルエンザワクチンは、代表的には、約0.5mlの投与体積(単位用量)で投与されるが、半用量(すなわち、約0.25ml)が、小児に投与され得る。
組成物およびキットは、好ましくは、2℃〜8℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。
(宿主細胞DNA)
ウイルスが単離され、そして/または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株DNAのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記DNAの量を最小限にすることは、標準的な実施である。
ウイルスが単離され、そして/または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株DNAのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記DNAの量を最小限にすることは、標準的な実施である。
従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、1用量あたり10ng(好ましくは、1ng未満、より好ましくは、100pg未満)の残留宿主細胞DNAを含むが、微量の宿主細胞DNAが存在し得る。
あらゆる残留宿主細胞DNAの平均長が500bp未満(例えば、400bp未満、300bp未満、200bp未満、100bp未満など)であることは、好ましい。
夾雑するDNAは、標準的精製手順(例えば、クロマトグラフィーなど)を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞DNAの除去は、ヌクレアーゼ処理によって(例えば、DNaseを使用することによって)増強され得る。宿主細胞DNA夾雑物を減らすための便利な方法は、2工程処理(第1は、DNase(例えば、Benzonase)(これは、ウイルス増殖の間に使用され得る)を、次いで、カチオン性洗剤(例えば、CTAB)(これは、ビリオン破壊の間に使用され得る)使用する)を含む参考文献47および48において開示される。アルキル化剤(例えば、β−プロピオラクトン)での処理はまた、宿主細胞DNAを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活化するためにも使用され得る[49]。DNaseもしくはアルキル化剤が、DNA除去のために使用される場合、上記DNaseもしくはアルキル化剤(好ましくは、BPL)はまた、生成プロセスの間に1回より多く(例えば、2回)添加され得る。DNA除去はまた、DNaseとアルキル化剤との組み合わせを使用して達成され得る。
(アジュバント)
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答(液性および/もしくは細胞性)を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも1種の油および少なくとも1種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性(代謝可能)かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径5μm未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー(microfluidiser)で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。220nm未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答(液性および/もしくは細胞性)を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも1種の油および少なくとも1種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性(代謝可能)かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径5μm未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー(microfluidiser)で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。220nm未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。
前記エマルジョンは、動物(例えば魚類)供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび1,2−プロパンジオールの6〜10炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が5炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。
いくつかの実施形態に関して別の好ましい油は、α−トコフェロールである。D−α−トコフェロールおよびDL−α−トコフェロールは両方とも使用され得、好ましいα−トコフェロールは、DL−α−トコフェロールである。上記トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、種々の塩および/もしくは異性体をとり得る。塩としては、有機塩(例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など)が挙げられる。このトコフェロールの塩が使用されるべき場合、好ましい塩は、コハク酸塩である。AS03アジュバントで認められるように、スクアレンおよびa トコフェロール(例えば、DL−α−トコフェロール)を含む油の組み合わせが使用され得る。しかし、上記で説明されるように、いくつかの実施形態において、エマルジョンはいかなるさらなる免疫刺激剤をも含まない。その場合、上記エマルジョンは、α−トコフェロールを含まない。
スクアレンを含む水中油型エマルジョンは、本発明での使用に最も好ましいアジュバントである(例えば、MF59もしくはAS03(またはトコフェロールを欠く改変型AS03))。従って、好ましいエマルジョンは、(i)水もしくは緩衝液、(ii)スクアレン、ならびに(iii)ポリソルベート80および/もしくはソルビタントリオレエートから本質的になり得る。
油の混合物を使用することができる。
界面活性剤をそれらの「HLB」(親水親油バランス)によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、およびさらに好ましくは少なくとも16のHLBを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(一般にTweenと呼ばれる)、特にポリソルベート20およびポリソルベート80;商品名DOWFAXTMで販売されている、エチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)および/またはブチレンオキシド(BO)のコポリマー、例えば、線状EO/POブロックコポリマー;反復エトキシ(オキシ−1,2−エタンジイル)基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−9(Triton X−100、すなわちt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)が特に興味深い;(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA−630/NP−40);リン脂質、例えばホスファチジルコリン(レシチン);ノニルフェノールエトキシレート、例えばTergitolTMNPシリーズ;ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brij界面活性剤として公知)、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Brij 30);ならびにソルビタンエステル(一般にSPANとして公知)、例えばソルビタントリオレエート(Span 85)およびソルビタンモノラウレートを含む(しかしこれらに限定されない)界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Tween 80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)、Span 85(ソルビタントリオレエート)、レシチンおよびTriton X−100である。
界面活性剤の混合物、例えばTween 80/Span 85混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)、およびオクトキシノール、例えばt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X−100)、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス9とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含む。
界面活性剤の好ましい量(重量%)は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(例えば、Tween 80)0.01%から1%、特に約0.1%;オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えば、Triton X−100、またはTritonシリーズの他の洗剤)0.001%から0.1%、特に0.005%から0.02%;ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ラウレス9)0.1%から20%、好ましくは0.1%から10%および特に0.1%から1%または約0.5%である。
上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび/もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。遊離界面活性剤は、存在し得るいかなる非スプリットビリオンの凝集をもさらに妨げ得る。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る[50]。
好ましいエマルジョンは、<1μmの平均液滴サイズ(例えば、≦750nm、≦500nm、≦400nm、≦300nm、≦250nm、≦220nm、≦200nm、もしくはこれより小さい)を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化(microfluidisation)のような技術によって達成され得る。
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
・スクアレン、Tween 80、およびSpan85のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約5% スクアレン、約0.5% ポリソルベート80および約0.5% Span 85であり得る。重量では、これらの比は、4.3% スクアレン、0.5% ポリソルベート80および0.48% Span 85になる。このアジュバントは、引用文献54の第10章および引用文献55の第12章により詳細に記載されるように、「MF59」として公知である[51〜53]。上記MF59エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン(例えば、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液)を含む。
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート80を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、体積で2〜10% スクアレン、2〜10% トコフェロールおよび0.3〜3% ポリソルベート80を有し得、スクアレン:トコフェロールの重量比は、好ましくは、<1(例えば、0.90)である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート80は、約5:2の体積比もしくは約11:5の重量比で存在し得る。それゆえ、これら3種の成分(スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート80)は、1068:1186:485またはおおよそ55:61:25の重量比で存在し得る。1つのこのようなエマルジョン(「AS03」[56])は、1用量あたり(もしくはその一部であるが、質量比を維持する)、例えば、0.5ml容積において、4.86mg ポリソルベート80、10.69mg スクアレンおよび11.86mg α−トコフェロールを有する。AS03は、Tween 80をPBS中に溶解して、2%溶液を与え、次いで、この溶液90mlと、(5gのDL−α−トコフェロールおよび5ml スクアレン)の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する(microfluidise)ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、100〜250nmの間、好ましくは、約180nmの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、3−脱−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3−de−O−acylated monophosphoryl lipid A)(3d−MPL)を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、例えば、上記で検討した比で0.5〜10mg スクアレン、0.5〜11mg トコフェロール、および0.1〜4mg ポリソルベート80を含み得る[57]。
・スクアレン、トコフェロール、およびTriton洗剤(例えば、Triton X−100)のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、3d−MPL(下記を参照のこと)を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート(例えば、ポリソルベート80)、Triton洗剤(例えば、Triton X−100)およびトコフェロール(例えば、α−トコフェロールスクシネート)を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約75:11:10(例えば、750μg/ml ポリソルベート80、110μg/ml Triton X−100および100μg/ml α−トコフェロールスクシネート)の質量比でこれら3種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、3d−MPL(下記を参照のこと)を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアラン、ポリソルベート80およびポロキサマー401(「PluronicTM L121」)のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「SAF−1」アジュバント中でトレオニル−MDPとともに使用されてきた[58](0.05〜1% Thr−MDP、5% スクアラン、2.5% Pluronic L121および0.2% ポリソルベート80)。このエマルジョンはまた、「AF」アジュバントでのように[59](5% スクアラン、1.25% Pluronic L121および0.2% ポリソルベート80)、上記Thr−MDPなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル)および疎水性非イオン性界面活性剤(例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル(mannide ester)(例えば、ソルビタンモノオレエート(monoleate)もしくは「Span 80」))を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして/または上記油滴のうちの少なくとも90%(体積で)が、200nm未満のサイズを有する[60]。上記エマルジョンはまた、アルジトール;凍結保護剤(cryoprotective agent)(例えば、糖(例えば、ドデシルマルトシドおよび/もしくはスクロース));および/またはアルキルポリグリコシドのうちの1種以上を含み得る。上記エマルジョンは、TLR4アゴニストを含み得る[61]。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
・スクアレン、ポロキサマー105およびAbil−Careのエマルジョン[62]。アジュバント化ワクチン中のこれら成分の最終濃度(重量)は、5% スクアレン、4% ポロキサマー105(プルロニックポリオール)および2% Abil−Care 85(ビス−PEG/PPG−16/16 PEG/PPG−16/16ジメチコン;カプリル/カプリントリグリセリド)である。
・0.5〜50%の油、0.1〜10%のリン脂質、および0.05〜5%の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献63に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
・非代謝性の油(例えば、軽油(light mineral oil))および少なくとも1種の界面活性剤(例えば、レシチン、Tween 80もしくはSpan 80)のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る(例えば、QuilAサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体(例えば、参考文献64に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン(desacylsaponin)に添加することにより生成されるGPI−0100)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(dimethyidioctadecylammonium bromide)および/もしくはN,N−ジオクタデシル−N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)プロパンジアミン)。
・サポニン(例えば、QuilAもしくはQS21)およびステロール(例えば、コレステロール)が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン[65]。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤(例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび/もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)を含むエマルジョン[66]。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤(例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび/もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)を含むエマルジョン[66]。
いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン(使用時に最終処方物の準備ができている)では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント化形態(liquid adjuvanted form)においてパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、2種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記2種の液体の体積比は、変動し得る(例えば、5:1〜1:5の間)が、一般に、約1:1である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。
本発明の組成物は、さらなる免疫刺激剤を含み得る。好ましい実施形態において、上記さらなる免疫刺激剤は、TLRアゴニスト(すなわち、Toll様レセプターを刺激し得る化合物)である。最も好ましくは、TLRアゴニストは、ヒトTLRのアゴニストである。上記TLRアゴニストは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9もしくはTLR11のうちのいずれかを活性化し得る;好ましくは、それは、ヒトTLR4もしくはヒトTLR7を活性化し得る。
本発明の組成物は、1種より多くのTLRアゴニストを含み得る。これらの2種のアゴニストは互いに異なり、それらは、同じTLRもしくは異なるTLRを標的とし得る。
任意の特定のToll様レセプターに対する化合物のアゴニスト活性は、標準的アッセイによって決定され得る。ImgenexおよびInvivogenのような企業は、ヒトTLR遺伝子およびNFκBと、適切なレポーター遺伝子とで安定に共トランスフェクトされる細胞株を、TLR活性化経路を測定するために供給する。それらは、感度、広い作業範囲ダイナミクスのために設計され、ハイスループットスクリーニングのために使用され得る。1種以上の特定のTLRの構成的発現は、このような細胞株において代表的である。多くのTLRアゴニストは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第4,666,886号は、TLR2アゴニストであるある種のリポペプチド分子を記載し、WO2009/118296、WO2008/005555、WO2009/111337およびWO2009/067081は各々、TLR7の低分子アゴニストのクラスを記載し、WO2007/040840およびWO2010/014913は、疾患の処置のためのTLR7およびTLR8アゴニストを記載する。
本発明で使用され得るTLR7アゴニストは、ベンゾナフチリジン、例えば、式T1:
ここでR1は、H、C1−C6アルキル、−C(R5)2OH、−L1R5、−L1R6、−L2R5、−L2R6、−OL2R5、もしくは−OL2R6であり;
L1は、-C(O)−もしくは-O−であり;
L2は、C1−C6アルキレン、C2−C6アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレンもしくは−((CR4R4)pO)q(CH2)p−であり、ここでL2のC1−C6アルキレンおよびC2−C6アルケニレンは、1〜4個のフルオロ基で必要に応じて置換されており;
各L3は、C1−C6アルキレンおよび−((CR4R4)pO)q(CH2)p−から独立して選択され、ここでL3のC1−C6アルキレンは、1〜4個のフルオロ基で必要に応じて置換されており;
L4は、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり;
R2は、HもしくはC1−C6アルキルであり;
R3は、C1−C4アルキル、-L3R5、−L1R5、−L3R7、−L3L4L3R7、−L3L4R5、−L3L4L3R5、−OL3R5、−OL3R7、−OL3L4R7、−OL3L4L3R7、−OR8、−OL3L4R5、−OL3L4L3R5および−C(R5)2OHから選択され;
各R4は、Hおよびフルオロから独立して選択され;
R5は、−P(O)(OR9)2であり;
R6は、-CF2P(O)(OR9)2もしくは−C(O)OR10であり;
R7は、-CF2P(O)(OR9)2もしくは−C(O)OR10であり;
R8は、HもしくはC1−C4アルキルであり;
各R9は、HおよびC1−C6アルキルから独立して選択され;
R10は、HもしくはC1−C4アルキルであり;
各pは、1、2、3、4、5および6から独立して選択され、そして
qは、1、2、3もしくは4である。
これら化合物のさらなる詳細は、WO2011/049677において考察されており、本発明は、その中の化合物1〜28のうちのいずれかを使用し得る。式T1の化合物の好ましい例としては、以下が挙げられる:
本発明で使用され得るTLR2アゴニストは、式T2:
R1は、H、−C(O)−C7−C18アルキルもしくは-C(O)−C1−C6アルキルであり;
R2は、C7−C18アルキルであり;
R3は、C7−C18アルキルであり;
L1は、−CH2OC(O)−、−CH2O−、−CH2NR7C(O)−もしくは−CH2OC(O)NR7−であり;
L2は、−OC(O)−、−O−、−NR7C(O)−もしくは−OC(O)NR7−であり;
R4は、−L3R5もしくは−L4R5であり;
R5は、-N(R7)2、−OR7、−P(O)(OR7)2、−C(O)OR7、−NR7C(O)L3R8、−NR7C(O)L4R8、−OL3R6、−C(O)NR7L3R8、−C(O)NR7L4R8、−S(O)2OR7、−OS(O)2OR7、C1−C6アルキル、C6アリール、C10アリール、C14アリール、O、SおよびNから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5〜14個の環員のヘテロアリール、C3−C8シクロアルキルまたはO、SおよびNから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5〜6個の環員のヘテロシクロアルキルであり、ここでR5のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは各々置換されていないか、またはR5のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは、−OR9、−OL3R6、−OL4R6、−OR7、および−C(O)OR7から独立して選択される1〜3個の置換基で各々置換されており;
L3は、C1−C10アルキレンであり、ここでL3のC1−C10アルキレンは置換されていないか、またはL3のC1−C10アルキレンは、1〜4個のR6基で置換されているか、またはL3のC1−C10アルキレンは2個のC1−C6アルキル基で置換され、これらが結合されるその炭素原子上で一緒になって、C3−C8シクロアルキルを形成し;
L4は、−((CR7R7)pO)q(CR10R10)p−もしくは−(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p−であり、ここで各R11は、C1−C6アルキル基であり、これは結合される炭素原子と一緒になって、C3−C8シクロアルキルを形成し;
各R6は、ハロ、C1−C6アルキル、1〜2個のヒドロキシル基で置換されたC1−C6アルキル、−OR7、−N(R7)2、−C(O)OH、−C(O)N(R7)2、−P(O)(OR7)2、C6アリール、C10アリールおよびC14アリールから独立して選択され;
各R7は、HおよびC1−C6アルキルから独立して選択され;
R8は、-SR7、−C(O)OH、−P(O)(OR7)2、ならびにOおよびNから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む5〜6個の環員のヘテロシクロアルキルから選択され;
R9はフェニルであり;
各R10は、Hおよびハロから独立して選択され;
各pは、1、2、3、4、5および6から独立して選択され、そして
qは、1、2、3もしくは4である。
これら化合物のさらなる詳細は、WO2011/119759において考察されており、本発明は、そこで開示される化合物のうちのいずれか(例えば、その実施例1〜92)、およびその請求項17に列挙される化合物を使用し得る。別の有用なTLR2アゴニストは、パルミトイル−Cys(2[R],3−ジラウロイルオキシ−プロピル)−Abu−D−Glu−NH2(ここで:Cysは、システイン残基であり、Abuは、アミノ酪酸残基であり、Gluは、グルタミン酸残基である)である。この化合物は、米国特許第4,666,886号の実施例16で開示され,式T3a:
式T1もしくはT2もしくはT3aのアゴニストは、薬学的に受容可能な塩、薬学的に受容可能な溶媒和物(例えば、水和物)として、N−オキシド誘導体として、異性体(互変異性体もしくはエナンチオマーを含む)または異性体の混合物などとして存在し得る。1つの特に有用な塩は、化合物T1cのアルギニン塩であり、これは、アルギニン塩一水和物として使用され得る。
他の有用なTLRアゴニストは、以下の化合物である:
(i)3d−MPL(すなわち、3−O−脱アシル化モノホスホリルリピドA;3−de−O−アシル化モノホスホリルリピドAもしくは3−O−デスアシル−4’−モノホスホリルリピドAとしても公知)。エンドトキシンの上記モノホスホリルリピドA部分のこの誘導体は、グルコサミンの還元末端の3位が脱アシル化されている。それは、Salmonella minnesotaのヘプトースなし変異体から調製されており、リピドAに化学的に類似であるが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠いている。3d−MPLの調製は、最初にGB−A−2220211に記載され、上記生成物は、Corixa Corporationによって製造および販売されている。それは、GSKの「AS04」アジュバント中に存在する。さらなる詳細は、Myersら、(1990) Cellular and molecular aspects of endotoxin reactionsの第145〜156頁、Johnsonら、(1999) J Med Chem 42:4640−9;Baldrickら、(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398−413)に見出され得る
(ii)グルコピラノシルリピドA(GLA)(Colerら、(2011) PLoS ONE 6(1):e16333)もしくはそのアンモニウム塩、例えば、
好ましいTLR4アゴニストは、モノホスホリルリピドA(MPL)のアナログである。
さらなる免疫増強因子はまた、TLRを通じて作用しない免疫増強因子(SMIP)を含み得る。特に、本発明で使用され得るSMIPは、TLRよりむしろ(もしくはこれに加えて)C型レクチンレセプター(CLR)もしくはCD1dを刺激し得る。従って、本開示は、TLRアゴニズムを参照して上記で記載されるとおりの本発明を含むが、TLRアゴニスト(もしくは類似のもの)への言及は、CLRアゴニストもしくはCD1dアゴニストいずれかへの言及によって置き換えられる。
CLRアゴニストとしては、トレハロース−6,6’−ジミコレート(TDM)、その合成アナログD−(+)−トレハロース−6,6’−ジベヘネート(TDB)、およびトレハロースおよび脂肪酸の他の6,6’−ジエステルが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、CLRアゴニストである、トレハロースエステルおよびジアシルトレハロースに適用され得る。これらアゴニストは、式(C):
ここでR1C(O)−およびR2C(O)−は、同じかもしくは異なっており、アシル基である。適切なアシル基は、飽和であっても不飽和であってもよい。それらは、ミコール酸、コリノミコール酸、2−テトラデシル−3−ヒドロキシオクタデカン酸、2−エイコシル−3−ヒドロキシテトラコサン酸、ブルゲアン酸(bourgeanic acid)、ベヘン酸、パルミチン酸などのアシル残基から選択され得る。有用なミコール酸としては、シス形態もしくはトランス形態のα−、メトキシ−、およびケト−ミコール酸が挙げられる。
CD1dアゴニストとしては、α−グリコシルセラミド(De Liberoら、Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485−496;米国特許第5,936,076号;Okiら、J. Clin. Investig., 113: 1631−1640 US2005/0192248;Yangら、Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43: 3818−3822;WO2008/047249;WO2008/047174)(例えば、α−ガラクトシルセラミド)が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、CD1dアゴニストであるグリコシルセラミドに適用され得る(α−ガラクトシルセラミド(α−GalCer)、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、[(2S,3S,4R)−1−O−(α−D−ガラクトピラノシル)−2−(N−ヘキサコサノイルアミノ)−1,3,4−オクタデカントリオール(octadecanetriol)]、OCH、KRN7000 CRONY−101、3”−O−スルホ−ガラクトシルセラミドなどが挙げられる)。
いくつかの実施形態において、本発明は、「Alum」アジュバント(例えば、上記のように、TLRアゴニストと組み合わせて)を使用する。用語「Alum」とは、本明細書ではアルミニウム塩をいい、有用なアルミニウム塩としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。このような塩は、例えば、参考文献54の第8&9章に記載される。ヒドロキシドイオンを含むアルミニウム塩は、本発明での使用に好ましいアルミニウム塩である(例えば、水酸化アルミニウムおよび/もしくはリン酸アルミニウム(これは、アルミニウムヒドロキシホスフェートを含む))。水酸化アルミニウムアジュバントは、最も好ましい。組成物は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含み得る。患者に投与するための組成物中のAl+++の濃度は、好ましくは、1mg/ml未満であり、最大0.85mg/単位用量が好ましい。
(ワクチン組成物のパッケージング)
本発明の組成物(もしくはキット成分)に適した容器としては、バイアル、シリンジ(例えば、使い捨てシリンジ)、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。
本発明の組成物(もしくはキット成分)に適した容器としては、バイアル、シリンジ(例えば、使い捨てシリンジ)、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。
組成物/成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、1用量より多い用量(「複数用量」バイアル)、例えば、10用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ(例えば、ルアーロック)を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得(例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために)、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル(safety needle)が好ましい。1インチ 23ゲージ、1インチ 25ゲージおよび5/8インチ 25ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび/もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Tip−Lok」TMの下で市販されるものである。
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、0.5ml用量を含むシリンジは、0.25ml体積を示す印を有し得る。
ガラス容器(例えば、シリンジもしくはバイアル)が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
キットもしくは組成物は、(例えば、同じボックスの中に)上記ワクチンの詳細(例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など)を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告(例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど)を含み得る。
(処置方法、および上記ワクチンの投与)
一局面において、本発明は、HLA DQB1*0602ハプロタイプに関して陰性であることが見出された患者にインフルエンザワクチンを、好ましくは、少なくとも1種のインフルエンザAウイルスを含むワクチンを投与するための方法を提供する。2009年に、PandemrixTMワクチンの投与後にナルコレプシーの症状を発生させた全ての患者は、この表現型を有することが見出され、従って、この患者群に特定の注意を喚起することは望ましい。
一局面において、本発明は、HLA DQB1*0602ハプロタイプに関して陰性であることが見出された患者にインフルエンザワクチンを、好ましくは、少なくとも1種のインフルエンザAウイルスを含むワクチンを投与するための方法を提供する。2009年に、PandemrixTMワクチンの投与後にナルコレプシーの症状を発生させた全ての患者は、この表現型を有することが見出され、従って、この患者群に特定の注意を喚起することは望ましい。
上記患者の試験および上記インフルエンザワクチンの投与は、実質的に同時に(例えば、ヘルスケア専門家への同じ訪問の間に)行われ得る。しかし、ときおり、上記インフルエンザワクチンを受ける前に上記患者が試験されることは、より一般的である。例えば、上記試験工程および上記投与工程は、互いから数日、数ヶ月もしくはさらに数年離れて行われ得る。
上記HLA DQB1*0602ハプロタイプに関して患者を試験する方法は、当該分野で公知である。このような方法は、例えば、上記ハプロタイプの配列決定もしくは上記HLAのうちの少なくとも一部のPCR増幅を要し得る。それはまた、種々のHLAハプロタイプを区別し得るハプロタイプ特異的プローブを使用して(例えば、サザンブロットアッセイで)行われ得る。上記患者は、HLA DQB1*0602に関してホモ接合性であり得るか;または上記患者は、HLA DQB1*0602ハプロタイプに関してヘテロ接合性であり得る。この場合、このような患者がインフルエンザワクチンを受けることから排除することはなお有利であり得る。
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体(例えば、ブタまたはトリ)への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。
これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答(好ましくは、防御的抗体応答)を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する(約30〜40の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約50%防御を与える)ことが示された[67]。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散(single radial immunodiffusion)(SRID)によって、および/もしくは単一放射溶血(SRH)によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射(例えば、腕もしくは脚への)によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内[68〜70]、経口[71]、皮内[72、73]、経皮的(transcutaneous)、経皮的(transdermal)[74]などが挙げられる。
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、6ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、1歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳、もしくは少なくとも55歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢(例えば、≧50歳、≧60歳、および好ましくは、≧65歳)、若年齢(例えば、≦5歳)、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける7日前までに抗ウイルス化合物(例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物;以下を参照のこと)を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。
好ましい本発明の組成物は、効力についてCPMP基準のうちの1つ、2つもしくは3つを満たす。成人(18〜60歳)において、これら基準は、以下である:(1)≧70%血清保有率(seroprotection);(2)≧40%セロコンバージョン;および/もしくは(3)GMT増加≧2.5倍。高齢者(>60歳)において、これら基準は、以下である:(1)≧60%血清保有率;(2)≧30%セロコンバージョン;および/もしくは(3)GMT増加≧2倍。これら基準は、少なくとも50名の患者でのオープンラベル研究に基づく。
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび/もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る(例えば、非経口の初回免疫(prime)および粘膜の追加免疫(boost)、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など)。1より多くの用量の投与(代表的には、2用量)は、免疫学的に経験したことがない患者(例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して)において、または新たなHAサブタイプ(汎流行性アウトブレイクにおけるような)に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも1週間空けて(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)投与される。
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン(例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、結合体化B型インフルエンザワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン(例えば、四価A−C−W135−Yワクチン)、RSウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど)と実質的に同時(例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に)に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび/もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物(例えば、オセルタミビルおよび/もしくはザナミビル)と実質的に同時(例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に)に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター(例えば、(3R,4R,5S)−4−アセチルアミノ−5−アミノ−3(1−エチルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボン酸もしくは5−(アセチルアミノ)−4−[(アミノイミノメチル)−アミノ]−2,6−アンヒドロ−3,4,5−トリデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクトノン−2−エノン酸(enonic acid)(そのエステル(例えば、そのエチルエステル)およびその塩(例えば、そのリン酸塩)を含む)が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、(3R,4R,5S)−4−アセチルアミノ−5−アミノ−3(1−エチルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート(1:1)(オセルタミビルホスフェート(TAMIFLUTM)としても公知)である。
(一般)
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」および「からなる(consisting)」を含み、例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい(例えば、X+Y)。
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」および「からなる(consisting)」を含み、例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい(例えば、X+Y)。
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、完全にYを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
数値xに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、x±10%を意味する。
2つのアミノ酸もしくはアミノ酸配列に関連して用語「対応する」とは、配列がペアワイズアラインメントアルゴリズムによってアラインメントされる場合に、互いにアラインメントされるアミノ酸に言及する。「対応する」アミノ酸を同定するにあたって使用するための好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する(例えば、EBLOSUM62スコア付けマトリクスを使用して、ギャップオープンペナルティー=10.0、およびギャップ伸長ペナルティー=0.5で)、Needleman−Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム[75]である。このアルゴリズムは、便利なことには、EMBOSSパッケージにおけるニードルツールで実施される[76]。同じ原理が、配列比較に関連して、すなわち、所定の配列が、配列番号1もしくは2のアミノ酸106〜126に等価な配列を有するか否かを決定(これは、上記に記載されるとおりのアラインメントを代表的には要する)するために本明細書で使用される場合に、用語「等価な」に当てはまる。
別段示されなければ、2種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。3つの成分が存在する場合、2つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第3の成分と合わせられ得るなど。
上記方法の種々の工程は、同時もしくは種々の時点で、同じもしくは異なる地理上の位置(例えば、国)で、そして同じもしくは異なる人々もしくは実体によって行われ得る。
動物(および特にウシ)の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症(TSE)を含まない、特に、ウシ海綿状脳症(BSE)を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。
2つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインメントされた場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記2つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム(例えば、参考文献77の第7.7.18節において記載されるもの)を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー12およびギャップ伸長ペナルティー2、BLOSUMマトリクス62を使用するSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献78に教示される。
2つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、アラインメントされた場合、塩基のパーセンテージが、上記2つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム(例えば、参考文献77の第7.7.18節において記載されるもの)を使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーター(これは、以下のとおりである:オープンギャップ=3;伸長ギャップ=1)を使用する、GCG Gap(Genetics Computer Group,Wisconsin,Suite Version 10.1)である。
(実施例)
(ナルコレプシーおよびH1N1汎流行性)
分子摸倣(molecular mimicry)は、ウイルスおよび細菌が、身体を騙して、それらの宿主組織への自由なアクセスを認めさせようとすることによる進化的適応である。このような摸倣は、自己に似ているアミノ酸の免疫系の拡がり(immune system stretch)を示すことによって機能する。微生物に応答して、免疫系は、その対応する自己成分を攻撃するように刺激される(例えば、アデノウイルスタイプ2および多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質)。
(ナルコレプシーおよびH1N1汎流行性)
分子摸倣(molecular mimicry)は、ウイルスおよび細菌が、身体を騙して、それらの宿主組織への自由なアクセスを認めさせようとすることによる進化的適応である。このような摸倣は、自己に似ているアミノ酸の免疫系の拡がり(immune system stretch)を示すことによって機能する。微生物に応答して、免疫系は、その対応する自己成分を攻撃するように刺激される(例えば、アデノウイルスタイプ2および多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質)。
(自己免疫疾患および天然の感染)
自己免疫疾患を有する患者を管理する臨床医が一般に観察するのは、天然の感染が引き金となって自己免疫疾患活性の重症度を高め得ることである。同様に、天然の感染は、遺伝的に感受性の宿主において疾患を誘発することにおいて主要な役割を果たすと考えられる。H1N1汎流行性の状況において、153名の被験体が、中国の北京で2009年5月までにH1N1に感染した。このことが、2009年11月までに概算で118万人の感染被験体へと増大した。11月までに、非アジュバント化H1N1ワクチンの136万用量が、1700万人の集団に投与された(すなわち、人口の0.8%がワクチン接種された)。H1N1感染ピークの6ヶ月後には、北京コホートにおいて新たなナルコレプシー症例が3〜4倍増大したという報告があった(n=142)。ここでは5.6%の患者がワクチン接種を受けていると報告したに過ぎない。このことは、本発明者らに、PandemrixTM処置患者において認められたナルコレプシーが、H1N1株自体に、おそらく分子摸倣に起因して関連している可能性があることを示唆した。
自己免疫疾患を有する患者を管理する臨床医が一般に観察するのは、天然の感染が引き金となって自己免疫疾患活性の重症度を高め得ることである。同様に、天然の感染は、遺伝的に感受性の宿主において疾患を誘発することにおいて主要な役割を果たすと考えられる。H1N1汎流行性の状況において、153名の被験体が、中国の北京で2009年5月までにH1N1に感染した。このことが、2009年11月までに概算で118万人の感染被験体へと増大した。11月までに、非アジュバント化H1N1ワクチンの136万用量が、1700万人の集団に投与された(すなわち、人口の0.8%がワクチン接種された)。H1N1感染ピークの6ヶ月後には、北京コホートにおいて新たなナルコレプシー症例が3〜4倍増大したという報告があった(n=142)。ここでは5.6%の患者がワクチン接種を受けていると報告したに過ぎない。このことは、本発明者らに、PandemrixTM処置患者において認められたナルコレプシーが、H1N1株自体に、おそらく分子摸倣に起因して関連している可能性があることを示唆した。
(PandemrixTMワクチン抗原に関連した病理摸倣)
上記で言及されるように、上記PandemrixTMワクチンは、ナルコレプシーと関連づけられた一方で、ナルコレプシーの増大はFocetriaTMでのワクチン接種後に認めらることはできなかった。PandemrixTMに使用されるワクチン抗原の供給源は、高収量A H1N1リアソータントX−179Aである一方で、FocetriaTMに使用されるのは、高収量A H1N1リアソータントX−181である。
上記で言及されるように、上記PandemrixTMワクチンは、ナルコレプシーと関連づけられた一方で、ナルコレプシーの増大はFocetriaTMでのワクチン接種後に認めらることはできなかった。PandemrixTMに使用されるワクチン抗原の供給源は、高収量A H1N1リアソータントX−179Aである一方で、FocetriaTMに使用されるのは、高収量A H1N1リアソータントX−181である。
汎流行性H1N1ワクチン調製のために、X−179A(PandemrixTMに使用される)を、高収量株X−157を、A/Puerto Rico/8/1934(PR8)に対して追跡可能な内部タンパク質と、表面抗原HAおよびNAを与えるA/California/07/2009 (H1N1サブタイプ)と、および内部タンパク質PB1とを交差させることによって生成した。不適切な収量の懸念に起因して、32倍収量のX−179Aを、2009年7月14日にX−157へと再び交差させることによってリアソートしたところ、64倍収量のX−181の生成がもたらされた(FocetriaTMおよび他の季節性ワクチンで使用した)。この機能差は、リアソータント由来の遺伝子セグメント組み合わせのみならず、卵宿主(in ovo接種)への適応の間に選択される既存の改変体およびウイルス変異にも関連する。類似の結果が、1976年のブタインフルエンザワクチン(これは、抗原的に区別可能でなかったが、16倍程度収量を増大させたX−53aのHA遺伝子において単一のアミノ酸変化を有した)のために調製したX−53およびX−53aリアソータントでも起こった。従って、PandemrixTMに使用したX−179Aは、以下で説明されるように、FocetriaTMに使用したX−181と比較して、他の質的差異を有する可能性がある。
PandemrixTMおよびFocetriaTMの精製プロセスは、明確な差異を有する。スプリットビリオンワクチン(PandemrixTMのように)およびサブユニットワクチン(FocetriaTMのように)は、以下のように、インフルエンザワクチンの生成技術に関する世界保健機関の文書に定義されている:
インフルエンザワクチンの大部分は、「スプリット」ワクチンであり、これは、洗剤処理精製インフルエンザウイルスによって生成される。そのスプリットプロセスは、ウイルスを壊し、関連抗原が部分的に精製されるようにする(p.8)…全ウイルス調製物と比較すると、スプリットワクチンは、よりよく特徴付けされ、オボアルブミンの含有量が少なく、反応原性(reactogenic)が低いと主張されている(p.13)。サブユニットもしくは表面抗原ワクチンは、スプリットウイルスに関して生成されるが、そのワクチンが最小限のN、マトリクスタンパク質、核タンパク質および脂質が夾雑する非常に精製されたHAおよびNAからほとんどもっぱらなるように、より徹底的な精製が行われる。
インフルエンザワクチンの大部分は、「スプリット」ワクチンであり、これは、洗剤処理精製インフルエンザウイルスによって生成される。そのスプリットプロセスは、ウイルスを壊し、関連抗原が部分的に精製されるようにする(p.8)…全ウイルス調製物と比較すると、スプリットワクチンは、よりよく特徴付けされ、オボアルブミンの含有量が少なく、反応原性(reactogenic)が低いと主張されている(p.13)。サブユニットもしくは表面抗原ワクチンは、スプリットウイルスに関して生成されるが、そのワクチンが最小限のN、マトリクスタンパク質、核タンパク質および脂質が夾雑する非常に精製されたHAおよびNAからほとんどもっぱらなるように、より徹底的な精製が行われる。
無傷のインフルエンザウイルス中の核タンパク質およびマトリクスタンパク質内容物の量は、HAのものに対して、それぞれ2倍および6倍高く、このことから、これら2つの内部タンパク質がHAおよびNAを富化するために使用される精製プロセスのタイプに依存して持ち越される可能性は最も高い。実際に、以前の調査は、スプリットビリオンワクチンFluzoneおよびMFV−Ject、ならびに精製抗原/サブユニットインフルエンザワクチンFluvirinおよびInfluvac(これらは、1992年に英国で入手可能であった)を特徴付けた[79]。電子顕微鏡に基づいて、ウイルス核タンパク質は、スプリットビリオンワクチンにおいて容易に明らかであり、SDS−PAGEゲルによれば、全てのワクチンの中で種々のレベルまで検出可能である(スプリットビリオン>精製抗原/サブユニット)。
オレキシンレセプターの変異およびオレキシン細胞の喪失がナルコレプシーに関係していたので、本発明者らは、PandemrixTM中のワクチン抗原が、特有の特徴を有し得、オレキシン(ヒポクレチン)もしくはそのレセプターのいずれかでの分子摸倣をもたらすと仮説を立てた。従って、X−179A、X−181由来のインフルエンザタンパク質およびオレキシン関連配列(オレキシン、オレキシンA、オレキシンB、オレキシンレセプター1、オレキシンレセプター2およびHLA−DQB1)に対して配列分析を行った。PandemrixTM株X−179Aは、ナルコレプシー症例と関係していたが、FocetriaTMはそうではなかったので、上記インフルエンザタンパク質を、ワクチンウイルス株X−179A(Pandremix関連)とX−181(FocetriaTM関連)との間の、ナルコレプシーとの関連性を説明し得る差異を最初に比較した。ワクチン調製物中に存在すると予測されたタンパク質のみが、先に記載した電子顕微鏡およびSDS−PAGE研究によって示唆されるように含まれた(HA、NA、NPおよびM1)。
潜在的なアミノ酸変化を決定するために、インフルエンザ配列を、適切な株名(X−179A、X−181、A/California/07/2009(H1N1))によって問い合わせてNCBIのInfluenza VIrus Resource[80]から検索し、重複する配列を除外した。ワクチン調製物中に存在すると予測される各インフルエンザタンパク質(HA、NP、M1、M2、NA)を、株にわたって比較して、X−179Aが少なくとも1残基程度X−181とは異なる配列を同定した。3つのアミノ酸差異が見出され、HA中には1つ、およびNP中には2つあった(表1):
PandemrixTMと関連したナルコレプシーを有する患者は、もっぱらHLA DQB1*0602である。従って、スウェーデンにおいて、全28名のナルコレプシーのワクチン接種後の症例は、HLA DQB1*0602であった。フィンランドでは、2010年にPandemrixTMをワクチン接種した全34名のHLAタイプ分けしたナルコレプシー患者は、HLA DQB1*0602であった。HLA DQB1*0602についての結合モチーフは公知である。HLA DQB1*0602のコア結合モチーフは、1位、3位、4位、6位、および9位にある。このモチーフを、1位および3位に脂肪族アミノ酸、ならびに4位に疎水性アミノ酸を有するペプチドLILYDKEEIRRIWRQANNG(配列番号10)に十分適合させる、オレキシンレセプター1および2のペプチドに関する記載事項がある。6位は上記モチーフに合わないが、9位は脂肪族であり、良好な適合を提供する[82]。ナルコレプシーにおいて、最大の容積を有するP4結合ポケットは、感受性にとって重要であり、0602への強い結合因子のいくつかの公知の例は、P4においてチロシンを有する[8]。
上記PandemrixTMワクチンは、ナルコレプシーをもたらす自己抗原(ヒポクレチンもしくはそのレセプターのうちの1つ)の分子摸倣物に対する免疫応答を担うH1N1感染因子のある種の成分をさらに含んでいた可能性がある。しかし、AS03アジュバント化PandemrixTMワクチンおよびAS03アジュバント化H1N1汎流行性ワクチンArepanrix(カナダで投与されたが、ワクチン接種と関連したナルコレプシーの増大という報告はなかった)と関連したナルコレプシー徴候における不一致が原因で、決定的な結論を引き出す前になお適切に用心しなければならない。これは、単に病原性の抗原が存在しても、単独では上記関連性を説明するには十分ではないと思われることを示唆し得るか、または代わりに、製造現場(PandemrixTMに関してはドレスデン、およびカナダについてはケベック)のスプリット/精製プロセスの差異に起因して、AS03アジュバント化ワクチン中のスプリットワクチン抗原の存在もしくは提示に差異があり得る。ドレスデンで製造されたGSK AS03アジュバント化H1N1ワクチンの概算で3080万用量が、2009年10月に始まって47を超える国で使用され、フィンランド、スウェーデン、ノルウェー、およびアイルランドを含む数カ国では適用範囲は高かった。ケベックで製造されたGSK AS03アジュバント化H1N1ワクチンは、カナダでは高い適用範囲で使用された(Arepanrix)。ここでは概算で1200万用量が投与され、他の数カ国でも投与された。カナダで進行中である疫学研究では、ナルコレプシーとAS03アジュバント化H1N1ワクチン(Arepanrix)との間には何らかの関連性があるとの報告がそのうちされる予定である。
上記Dresden抗原は、ポリソルベート80(Tween 80)およびTriton X−100を含む一方で、上記ケベック抗原は、これら賦形剤を含まない。これら洗剤は、ナルコレプシーの発生に対して影響を有し得ると推測された(Assessment report Immunological differences between pandemic vaccines EMA/687578/2012を参照のこと)。従って、Dresden抗原におけるように、Tween 80および/もしくはTriton X−100を含む抗原から生成されたワクチン中のNPタンパク質の存在を回避することは、特に重要であり得る。これは、特に、MF59もしくはAS03のような水中油型エマルジョンでアジュバント化されたワクチンに当てはまる。なぜならナルコレプシーは、Dresden抗原に由来する非アジュバント化季節性ワクチンにおいては出現しなかったからである(以下を参照のこと)。
以下の表2は、ドレスデンで調製された2種の異なる不活化スプリットビリオンH1N1抗原成分の組成を示す(WO2011/051235 p 41)。
GSKによって製造された汎流行性および季節性両方のインフルエンザワクチンは、同じH1N1抗原を含む一方で、上記アジュバントによる過剰な免疫刺激がナルコレプシーの原因になると推測するように即座に導き得る、季節性ワクチン中の非アジュバント化H1N1抗原で報告されたナルコレプシー徴候は存在しない。しかし、上記スプリットウイルスワクチンにおいて明らかにされている潜在的な抗原に関する以前の考察に鑑みれば、改善された抗原提示が任意のアジュバントでの望ましくかつ期待される効果であるということを念頭に置いて、上記AS03アジュバントによって免疫系に優先的にもしくはより効率的に提示される病的抗原のレザバに対する一貫しないナルコレプシー関連性もまた十分に説明され得る。アジュバントは、以下を含むいくつかの方法で作用し得る:1)抗原を免疫系に送達する、2)抗原提示細胞(APC)による抗原の取り込みを増強する、または3)ワクチン内の抗原の構造的コンフォメーションを変化させて、それによって、進行性放出、遅延型のクリアランスおよび免疫系へのより良好な曝露を可能にする。水中油型エマルジョンの作用様式は、よりよく理解されており、現在は、先天的な炎症応答の調節、APC動員および活性化、注射部位での抗原残存の増強、免疫能のある細胞への抗原提示の調節、ならびに種々のサイトカインパターンの誘発を伴うと考えられる。
(免疫学的説明)
Immune Epitope Database and Analysis Resources(IEDB)を使用してインフルエンザAウイルスの抗体およびT細胞エピトープに関する2007年に公開された保存分析からの適切な知見によれば、T細胞エピトープと比較して、抗体エピトープは不足しており、最多数のT細胞エピトープは、ヘマグルチニンタンパク質および核タンパク質に由来する[83]。さらに、T細胞エピトープは、抗体エピトープよりも保存されており、50%は、ヒトH1N1株において80%の同一性レベルで保存されている。このことは、インフルエンザのT細胞エピトープの株間交叉反応性の重大なレベルを示唆する。インフルエンザAの核タンパク質は、クラスIおよびクラスII主要組織適合遺伝子複合体によって効率的に提示され、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子を分泌するCD8+およびCD4+特異的エフェクターTリンパ球の両方を増殖させ得る[84]。それは、交叉反応性抗インフルエンザA細胞傷害性リンパ球(CTL)に対する主要標的抗原であり、PR8核タンパク質遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、強い二次的交叉反応性CTL応答を刺激および感作(prime)し得る[85]。まさにこれが理由で、非表面タンパク質のかなりの量を含むスプリットビリオンインフルエンザワクチンが、より純粋なサブユニットワクチンと比較して、細胞媒介性免疫応答を増大させると予測される。しかし、これは、諸刃の剣である。なぜならウイルス(もしくはワクチン改変)核タンパク質の規定されたエピトープに対して強い交叉反応性CTL応答を生じる同じ免疫学的機構が、宿主組織(例えば、オレキシンレセプター)を摸倣する場合には問題となり得、遺伝的に感受性の宿主(例えば、DBQ1*0602)において変性するT細胞媒介性自己免疫性を自己免疫疾患(例えば、ナルコレプシー)へと導くからである。上記PandemrixTM核タンパク質フラグメントと、上記オレキシンレセプターとのアラインメントは、明瞭なナルコレプシー症候群がまた、オレキシン2レセプターノックアウトマウスおよびオレキシンノックアウトマウスにおいて生じた(おそらく、欠損オレキシンを通じてオレキシン1レセプターへのシグナル伝達)ので興味をそそる[86]。興味深いことに、微量の免疫原性核タンパク質がFocetriaTMに存在した場合、これを、PandemrixTM核タンパク質およびH1N1感染(そのうちの両方ともイソロイシンを有する)のものと区別する、オレキシンレセプターとアラインメントしている核タンパク質フラグメント中に1個のアミノ酸置換(メチオニン)の存在がある。FocetriaTMに含まれる核タンパク質(X−181ワクチン株から受け継がれる)の中のこのアミノ酸置換は、核タンパク質中の多くのアミノ酸置換が、非常に保存されているマトリクスタンパク質とは対照的に、CTL媒介性免疫監視機構から逃れることを可能にするインフルエンザウイルスのアミノ酸置換に機能的に類似であり得る[87]。
Immune Epitope Database and Analysis Resources(IEDB)を使用してインフルエンザAウイルスの抗体およびT細胞エピトープに関する2007年に公開された保存分析からの適切な知見によれば、T細胞エピトープと比較して、抗体エピトープは不足しており、最多数のT細胞エピトープは、ヘマグルチニンタンパク質および核タンパク質に由来する[83]。さらに、T細胞エピトープは、抗体エピトープよりも保存されており、50%は、ヒトH1N1株において80%の同一性レベルで保存されている。このことは、インフルエンザのT細胞エピトープの株間交叉反応性の重大なレベルを示唆する。インフルエンザAの核タンパク質は、クラスIおよびクラスII主要組織適合遺伝子複合体によって効率的に提示され、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子を分泌するCD8+およびCD4+特異的エフェクターTリンパ球の両方を増殖させ得る[84]。それは、交叉反応性抗インフルエンザA細胞傷害性リンパ球(CTL)に対する主要標的抗原であり、PR8核タンパク質遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、強い二次的交叉反応性CTL応答を刺激および感作(prime)し得る[85]。まさにこれが理由で、非表面タンパク質のかなりの量を含むスプリットビリオンインフルエンザワクチンが、より純粋なサブユニットワクチンと比較して、細胞媒介性免疫応答を増大させると予測される。しかし、これは、諸刃の剣である。なぜならウイルス(もしくはワクチン改変)核タンパク質の規定されたエピトープに対して強い交叉反応性CTL応答を生じる同じ免疫学的機構が、宿主組織(例えば、オレキシンレセプター)を摸倣する場合には問題となり得、遺伝的に感受性の宿主(例えば、DBQ1*0602)において変性するT細胞媒介性自己免疫性を自己免疫疾患(例えば、ナルコレプシー)へと導くからである。上記PandemrixTM核タンパク質フラグメントと、上記オレキシンレセプターとのアラインメントは、明瞭なナルコレプシー症候群がまた、オレキシン2レセプターノックアウトマウスおよびオレキシンノックアウトマウスにおいて生じた(おそらく、欠損オレキシンを通じてオレキシン1レセプターへのシグナル伝達)ので興味をそそる[86]。興味深いことに、微量の免疫原性核タンパク質がFocetriaTMに存在した場合、これを、PandemrixTM核タンパク質およびH1N1感染(そのうちの両方ともイソロイシンを有する)のものと区別する、オレキシンレセプターとアラインメントしている核タンパク質フラグメント中に1個のアミノ酸置換(メチオニン)の存在がある。FocetriaTMに含まれる核タンパク質(X−181ワクチン株から受け継がれる)の中のこのアミノ酸置換は、核タンパク質中の多くのアミノ酸置換が、非常に保存されているマトリクスタンパク質とは対照的に、CTL媒介性免疫監視機構から逃れることを可能にするインフルエンザウイルスのアミノ酸置換に機能的に類似であり得る[87]。
(HLAハプロタイプ結合アッセイ)
種々のHLA−DRB1*ハプロタイプへのペプチドの結合を、無細胞REVEALTMクラスII結合技術を使用することによって分析した(参考文献88を参照のこと)。この技術は、合成試験ペプチドがMHC−ペプチド複合体を安定化する能力を測定する。検出は、特異的モノクローナル抗体によって検出される上記MHC−ペプチド複合体の天然のコンフォメーションの存在もしくは非存在に基づく。各ペプチドは、公知のT細胞エピトープである陽性コントロールペプチドに対してスコアを与えられる。上記スコアは、上記陽性コントロールペプチドと比較して、上記試験ペプチドによって生成されるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。スコアは、時間ゼロでおよび24時間後に再び評価される。その分析はまた、各ペプチドと、試験されているMHC II複合体との結合の安定性を表す安定性指数を与える。
種々のHLA−DRB1*ハプロタイプへのペプチドの結合を、無細胞REVEALTMクラスII結合技術を使用することによって分析した(参考文献88を参照のこと)。この技術は、合成試験ペプチドがMHC−ペプチド複合体を安定化する能力を測定する。検出は、特異的モノクローナル抗体によって検出される上記MHC−ペプチド複合体の天然のコンフォメーションの存在もしくは非存在に基づく。各ペプチドは、公知のT細胞エピトープである陽性コントロールペプチドに対してスコアを与えられる。上記スコアは、上記陽性コントロールペプチドと比較して、上記試験ペプチドによって生成されるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。スコアは、時間ゼロでおよび24時間後に再び評価される。その分析はまた、各ペプチドと、試験されているMHC II複合体との結合の安定性を表す安定性指数を与える。
合計18個のペプチドと陽性コントロールとを試験した:
結合結果は、以下のとおりであった:
一般に、全ペプチドの結合安定性は、上記DQB1*0501ハプロタイプでより弱い。ペプチド#1は、それでもよく結合するが、24時間後には明らかに安定性が低下する。ペプチド#3(ペプチド#1のより短いバージョン)は、DQB1*0602よりもこのハプロタイプに良好に結合するのに対して、#4(#2のより短いバージョン)は、上記0501ハプロタイプで不十分な結合因子のままである。従って、ナルコレプシー患者と明らかに関連するDQB1*0602と比較して、上記NPペプチドは、ナルコレプシーの発生から保護するようであるハプロタイプ(DQB1*0501)にはより不十分に結合した。
15merのオレキシンフラグメント(#10)は、いずれのHLAハプロタイプにも結合しなかったが、Thr→Ile変位を有するこのペプチドの改変バージョン(#11)は、強い結合因子であった。ペプチド#10の結果は、上記フラグメントがDQB1*06:02 HLAとの「複合体形成を促進」するために15アミノ酸のリンカーを必要としたという参考文献8の報告に鑑みれば、驚くべきことではない。上記Thr→Ile変異が上記ペプチドを強い結合因子へと変換する能力は、DQB1*06:02 HLAハプロタイプに対して親和性を付与するにあたって、X179−A株のNP中のイソロイシンの重要性を裏付ける。
ペプチド#12での結果は、ペプチド#10中のスレオニンをメチオニンに変化させることが、HLA DQB1*0602(ナルコレプシーと関連する対立遺伝子)への結合を可能にしもしないし改善もしないことを示し、従ってDQB1*0602に関してペプチド#1および#2で認められた結果を確認する。
全体的に、これら結果は、ペプチド#1および#2が、HLA−DQA1*01:02 DQB1*06:02への顕著に異なる結合を示すことを示す。ペプチド#1は、この対立遺伝子に対して良好な結合を示し、その高い安定性スコアは上記結合が強いことを示唆する。対照的に、ペプチド#2は、低い初期の結合を示し、非常に少量の複合体が24時間後に残っているに過ぎない。このことは、短い結合半減期、および不安定な複合体を示唆する。従って、ペプチド#1(X−179A核タンパク質のアミノ酸106〜126であり、アミノ酸位置116においてイソロイシン残基を含む)は、ペプチド#2(X−181核タンパク質のアミノ酸106〜126であり、アミノ酸位置116においてメチオニン残基を含む)よりも強くかつ良好な安定性で結合した。よって、これらデータは、X−179A核タンパク質が、HLA−DQB1*06:02ハプロタイプを有する個体に特異的な自己免疫応答に関与し得るが、X−181核タンパク質は関与しないという本発明者らの仮説を裏付ける。
(オレキシンとのペプチド相互作用のモデリング)
上記オレキシン(ヒポクレチン)フラグメント1〜13(配列番号16)は、HLA DQB1*0602と強く相互作用することが公知である[8]。分析から、Leu−3、Thr−6およびVal−8が、相互作用にとって重要な残基であることが示される。これら3つの残基は、インフルエンザNPペプチドと逆方向でX−179A核タンパク質フラグメントの12merフラグメント(配列番号17)と良好な3D構造アラインメントを与え、ここでは、Ile−6はオレキシンThr−6とアラインメントし、Ile−9は、Leu−3とアラインメントする。上記NP Ile−6は、配列番号1(X−179A)と配列番号3(X−181)との間で異なる残基である。コンピューターモデリングから、配列番号17は、DQ0602結晶構造の結合溝において非常に良好な適合を示すことが示される。X−179AにおけるIle−6残基は、オレキシンのThr−6に対してHLAタンパク質の結合空間(binding cavity)中によく適合するが、配列番号3のその対応する12merフラグメント中のX−181Aメチオニン残基は、HLAタンパク質との激しい空間的な衝突を与える。
上記オレキシン(ヒポクレチン)フラグメント1〜13(配列番号16)は、HLA DQB1*0602と強く相互作用することが公知である[8]。分析から、Leu−3、Thr−6およびVal−8が、相互作用にとって重要な残基であることが示される。これら3つの残基は、インフルエンザNPペプチドと逆方向でX−179A核タンパク質フラグメントの12merフラグメント(配列番号17)と良好な3D構造アラインメントを与え、ここでは、Ile−6はオレキシンThr−6とアラインメントし、Ile−9は、Leu−3とアラインメントする。上記NP Ile−6は、配列番号1(X−179A)と配列番号3(X−181)との間で異なる残基である。コンピューターモデリングから、配列番号17は、DQ0602結晶構造の結合溝において非常に良好な適合を示すことが示される。X−179AにおけるIle−6残基は、オレキシンのThr−6に対してHLAタンパク質の結合空間(binding cavity)中によく適合するが、配列番号3のその対応する12merフラグメント中のX−181Aメチオニン残基は、HLAタンパク質との激しい空間的な衝突を与える。
このモデリングのために、PDBファイル1uvqを、PyMol(Schrodinger Inc)とともに使用した。ヒポクレチンペプチド(配列番号16)と上記HLAタンパク質との間の分子間相互作用の分析を、視覚的にかつSiteMapソフトウェア(Schrodinger Inc)の使用を通じて詳細に行った。上記ペプチドのX線構造から3つの残基を、上記HLAタンパク質への、最も可能性の高いのは、疎水性相互作用(Leu−3、Thr−6およびVal−8)を通じて、結合を駆動するために重要であると同定した。
上記核タンパク質のフラグメント(配列番号17)のアラインメントを行ったところ、逆方向で合体するまで、多くの衝突を示し、結合を示しそうになかった。推定上の結合様式は、極性およびファン・デル・ワールス衝突(van der Waals clash)の点から、HLA−DQB1*0602の結合部位に対して評価したところ、Ile−6がオレキシンThr−6とアラインメントし、NP Ile−9がLeu−3とアラインメントした場合に、良好な適合が認められた。アラインメント評価にノイズもしくはバイアスを入り込むのを回避するために、以下を行った:(i)上記オレキシンペプチドを、PyMolの変異モジュールを使用して、上記NPペプチドの中に残基毎に変異させた;(ii)各位置において、上記NPペプチドの各残基の最良の配座異性体(conformer)を、上記HLAタンパク質のファン・デル・ワールス表面へのその近接によって、結合ポケットに適合するかもしくはその中に入り込まないことを評価した。上記表面を、PyMolで、デフォルトの通常の外表面を使用して生成した;(iii)上記NPペプチドに対して生成したモデルは、上記オレキシンテンプレートの位置に可能な限り近く適合するはずである。満足のいくモデルを、この方法によって生成した。アラインメント(NP Glu−4 対 オレキシンVal−8)に端を発する1つの極性ミスマッチをさらに評価したが、Glu残基は、上記HLAタンパク質の結合溝の中で空間的に許容される(上記タンパク質の表面との衝突は認められない)。
この結合仮説をさらに分析するために、上記Ile/Met変異(配列番号1および配列番号3)を、上記で詳述した同じ原理に従って結合ポケットにおいて評価した。上記Ile残基がMetに変異されると、上記HLAタンパク質の表面と激しく衝突しないMetの配座異性体を見出すことはできなかった。この分析から、Met変異は提唱される構造アラインメント内ではこのポケットの中で許容され得ないと結論づけられる。
並行して、両方の配列(すなわち、Ile改変体およびMet改変体)を、DQB1*0302(PDB 1jk8)においてモデリングしたところ、この残基を収容する(そして公開された配列の中のインスリン由来のTyr残基と適合する)ポケットは可撓性であるので、IleとMetとの間を区別しないはずである。
同様に、NP配列およびオレキシンフラグメントの両方を、HLA−DQ2構造(PDB 1s9v)においてモデリングした。上記オレキシンペプチドは、DQ2溝に緩い適合および激しい衝突なしで適合する。対照的に、両方のNPペプチドは、上記DQ2表面を突出して非常に激しい衝突を有し、この衝突は、いずれの回転異性体でも矯正できなかった。
従って、これらモデリング研究は、上記MHCペプチド結合研究と一致する:モデリングした3種のHLA分子のうち、DQB1*0602のみが、Ile/Metバリエーションによって異なるNPペプチド間を区別し得る。
よって、MHCペプチド結合研究およびモデリング研究はともに、DQB1*0602への(しかし他のHLAサブタイプではない)、X−181核タンパク質由来ペプチドに対してある種のX−179Aの差次的結合の証拠となる。
さらに、この種のインシリコモデリングは、DQB1*0602ハプロタイプへの強い結合を回避するはずであるNP内のアミノ酸置換を同定するために使用され得る。
(インフルエンザワクチンの質量分析)
質量分析法を使用して、X−179A株由来のHAを含む5種の不活化スプリットインフルエンザワクチン内のNPを同定および定量した。
質量分析法を使用して、X−179A株由来のHAを含む5種の不活化スプリットインフルエンザワクチン内のNPを同定および定量した。
ワクチンの100μlサンプルを、10μL 50% ギ酸水を添加することによって酸性化した。ワクチンをボルテックスにかけ、超音波処理ウォーターバス中で10分間超音波処理した。500μLの−80℃アセトンを添加してタンパク質沈殿を行い、−80℃で2時間貯蔵した。サンプルを、4℃、10,000rpmにおいて15分間遠心分離にかけた。その上清を廃棄し、タンパク質ペレットを10分間、speed vac中で乾燥させた。ワクチンを、20μL 8M 尿素、50mM 炭酸水素アンモニウムおよび20μL 0.5% プロテアーゼ、50mM 炭酸水素アンモニウム中で再構成した。DTTを使用して、終濃度5mMへと還元を行い、55℃で30分間還元した。上記サンプルを室温にし、終濃度10mM、室温において30分間でプロピオンアミドを使用してアルキル化した。60μLの50mM 炭酸水素アンモニウムを各サンプルに添加し、続いて、300ngのトリプシン/LysCミックスを添加した。上記サンプルを、37℃において一晩消化し、続いて、水中で10% ギ酸を10μL添加することによって酸性化した。上記ペプチドを、C18マイクロスピンカラムで精製し、speed vac中で3μL未満に乾燥させた。
次いで、各サンプルを、15μL 0.2% ギ酸、2% アセトニトリル 97.8% 水の中でHPLC−MSMS用に再構成し、自己充填の石英ガラス25cm C18逆相カラムに注入した。流速は、8% 移動相Bから50% 移動相Bへの90分間にわたる直線勾配を用いる300nL/分であった。質量分析器は、15種の最も強力な多重に荷電された前駆イオン(ここでこれらイオンは、60秒間排除リストに置かれた)をフラグメント化するためのデータ依存取得(data dependent acquisition)(DDA)モードに設定したLTQ Orbitrap Velosであった。結果を、上記前駆イオンに対して10ppmおよび上記フラグメントイオンに対して0.25Daの公差設定でByonicTMを使用して、配列データベース上で検索した。リバースデコイデータベースアプローチを使用する1% FDRを採用した。上記データベースは、NCBIからの全てのワクチン関連タンパク質配列(310,490)を含んでいた。各ワクチンに関して、上記タンパク質を、スペクトルカウントによってソートし、相対的存在量の計算を、各ワクチンにおけるスペクトルカウントによって同定した上位10種のタンパク質の強度を合計することによって行った。上位10種のタンパク質の各々に関して報告された強度は、これら10種に関して合計した強度で除算し、100を乗算し、上位10種の存在量のパーセンテージとして表した。
X−179株由来のNPおよびHAに関するスペクトルカウントおよびパーセンテージ存在量の値は、以下であった:
Claims (20)
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで配列番号2のアミノ酸106〜126に等価な前記核タンパク質のフラグメントは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより低い親和性で、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合するが、ただし前記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、組成物。
- インフルエンザAウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質のいずれも、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと等価かまたはそれより高い親和性でHLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターに結合する配列番号2のアミノ酸106〜126に等価なフラグメントを含まないが、ただし前記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が配列番号12に示される配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、組成物。
- 前記組成物中の前記核タンパク質のうちの全てが配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むわけではない、請求項1または2に記載のインフルエンザワクチン組成物。
- 前記組成物中の前記核タンパク質のうちの全てが配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むわけではない、請求項3に記載のインフルエンザワクチン組成物。
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基を有さないが、ただし前記組成物中の全インフルエンザA核タンパク質が配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む場合、前記ワクチン組成物は、A/California/7/2009(H1N1)株由来のNYMC X−181株に基づかない、組成物。
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシンを有さないが、ただし前記核タンパク質のうちの全てが配列番号2に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸116に対応する位置においてメチオニンを含む場合、前記核タンパク質は、配列番号12として示される配列を有しない、組成物。
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号2に示される核タンパク質アミノ酸配列のアミノ酸116に対応する位置においてイソロイシン残基もメチオニン残基も有しない、組成物。
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、配列番号2、配列番号12、もしくは配列番号13に示されるアミノ酸配列を含まない、組成物。
- インフルエンザウイルスA核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで前記核タンパク質は、改変されていない前記核タンパク質と比較して、HLA DQB1*0602を含むMHCクラスIIレセプターへのその結合を低減するかもしくはその結合をなくすように改変されている、組成物。
- インフルエンザウイルス核タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物であって、ここで(i)前記組成物は、スプリットビリオンワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、10μgのヘマグルチニンあたり3μg未満の核タンパク質であるか、または(ii)前記組成物は、サブユニットワクチンであり、存在する核タンパク質の量は、10μgのヘマグルチニンあたり0.5μg未満の核タンパク質である、組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 前記アジュバントは、水中油型エマルジョンである、請求項11に記載のワクチン組成物。
- 前記アジュバントは、トコフェロールをさらに含む、請求項12に記載のワクチン組成物。
- TritonもしくはTween、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 1以上の汎流行性インフルエンザ株に対するワクチンである、請求項1〜14のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 一価ワクチン組成物である、請求項11〜14のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- スプリットビリオンワクチンである、請求項1〜16のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- アジュバント化スプリットインフルエンザワクチンであって、ここで前記ワクチンは、少なくとも4種の異なるインフルエンザウイルスに由来する抗原および配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも1種のインフルエンザAウイルスに由来する核タンパク質を含み、前記アジュバントは、さらなる免疫刺激剤を含まない水中油型エマルジョンアジュバントであり、それによって、前記組成物は、Tritonを含むという点で特徴付けられる、ワクチン。
- 小児集団(0〜36ヶ月)および/もしくは青年集団(4〜19歳)において、ならびに/またはインフルエンザワクチン接種と関連して自己免疫疾患を発生させる遺伝的素因を有する被験体において使用するための、請求項1〜18のいずれか1項に記載のワクチンもしくはワクチン組成物。
- ワクチン生成の適性に関してインフルエンザAウイルスを試験する方法であって、前記方法は、前記インフルエンザウイルスの核タンパク質もしくはそのフラグメントが、H1N1株X−179A由来の核タンパク質と比較して、同じ条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602に結合し得るか否かを決定する工程を包含し;ここで前記インフルエンザウイルスは、その核タンパク質がX−179A株由来の核タンパク質と比較して、同一条件下でより低い親和性でHLA DQB1*0602に結合し得る場合にワクチン生成に適している、方法。
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