KR20160030097A - 인플루엔자 백신에서 기면증 위험의 방지 - Google Patents

인플루엔자 백신에서 기면증 위험의 방지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 백신 및 특히 보조된 백신에서 기면증을 유발할 위험에 관하여, 인플루엔자 백신의 안전성을 더 개선하는 방법을 제공한다.

Description

인플루엔자 백신에서 기면증 위험의 방지{AVOIDING NARCOLEPSY RISK IN INFLUENZA VACCINES}
본 출원은 미국 가출원 61/822,228 (2013년 5월 10일에 출원됨), 61/859,113 (2013년 7월 26일에 출원됨), 및 61/862,807 (2013년 8월 6일에 출원됨) 및 유럽 특허 출원 13181429.5 (2013년 8월 23일에 출원됨) 및 14158999.4 (2014년 3월 11일에 출원됨)의 이익을 주장하며, 이것들 각각의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 인플루엔자 백신 및 백신 수령체에서 기면증(narcolepsy)의 위험을 더 감소시키는 인플루엔자 백신을 생산하는 방법을 제공하는 분야에 있다.
2009년 H1N1 돼지 독감 백신 접종 캠페인 후, AS03-보조된 H1N1 백신 (Pandemrix™, GSK Biologicals)의 사용과 기면증의 역학적 연관성이 핀란드 국립 보건복지부에 의해 4-19살의 아동 및 청소년에서 검출되었다 [1-3]. 기면증의 발생률은 백신 접종되지 않은 개체에서의 0.7/100,000과 비교하여 백신 접종된 집단에서 9/100,000이었으며, 백신 접종 후 대략 2개월 후 발병과의 비율은 12.7이다 [4]. 그 후에, 프랑스, 아일랜드, 노르웨이, 스웨덴 및 영국에서 AS03-보조된 H1N1 백신에 관한 유사한 보고가 있었다. 핀란드에서의 상세한 후속 연구는 2011년부터 초기 연관성을 더욱 견고하게 하였다 [5]. 그러므로 Pandemrix™과 기면증 사이의 통계학적 연관성은 명백하게 입증되어 왔다. 흥미롭게도, 같은 H1N1 인플루엔자 균주에 대해서는 보호하지만 다른 수중유 에멀젼 보조제를 포함하는 Focetria™ 백신을 수령한 환자에서는 증가된 기면증 발생이 관찰되지 않았다.
인플루엔자 백신에 반응하여 기면증에 걸릴 위험은 매우 작지만, 그럼에도 불구하고 기면증의 위험을 더 감소시키는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명은 환자가 인플루엔자 백신에 반응하여 기면증에 걸릴 가능성을 더 감소시키는 방법 및 백신을 제공한다.
Pandemrix™ 및 Focetria™이 다른 수중유 에멀젼 보조제를 갖고 있다는 사실은 보조제가 기면증의 발병의 원인이 될 수도 있다는 광범위한 가정으로 이어졌다. 하지만, 발명자들은 놀랍게도 원인 요소가 두 개의 백신에서 다른 핵단백질일 가능성이 크며, 이것들이 Pandemrix™에서 오렉신 수용체를 모방할 수 있다는 것을 발견하였다 (도 1 참조). 기면증은 오렉신 (하이포크레틴으로도 알려져 있음)을 생산하는 뉴런의 손실과 연관성이 있다. 더욱이, Pandemrix™-유발된 기면증의 모든 사례가 HLA DQB1*0602 하플로타입 (MHC 등급 II 수용체 베타-사슬 단백질: UniProtKB/Swiss-Prot: P01920.2)을 가지고 있는 환자에서 발견되었고, 이러한 개체는 기면증에 걸리기 쉽다 (이 하플로타입은 탈력 발작(cataplexy)을 동반한 기면증으로 진단된 환자 중 85% 이상에서 및 덜 심각한 형태의 기면증에 걸린 환자 중 50%에서 보여진다). 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 따라서 발명자들은 관찰된 기면증 증가가 인플루엔자 바이러스의 NP 단백질, 또는 이것의 단편으로, HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체의 결합에 의해 유발될 수 있으며, 이는 하이포크레틴 신호 전송의 방해를 초래하는 및/또는 오렉신 수용체를 발현하는 세포의 손실에 의한 자가면역 반응을 촉발시키고, 따라서 기면증으로 이어질 수 있다고 제안한다. 이것의 지지 하에, 본원에서 제공된 데이터는 Pandemrix™ 백신에서 발견된 핵단백질 변이체로부터 유래된 특정 펩타이드가 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로의 안정한 결합을 나타내는 반면에 또 다른 핵단백질의 해당 펩타이드는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 이는 기면증과 연관성이 없는 또 다른 HLA 서브타입으로 이러한 같은 펩타이드의 훨씬 덜 안정한 결합과 대비를 이룬다.
따라서 본 발명은 백신이 기면증의 발병에 수반될 수도 있는 핵단백질을 포함할 가능성을 더 감소시키는 방법 및 백신을 제공한다.
한 접근법은 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로의 결합이 감소되거나 결합하지 않는 인플루엔자 A 핵단백질을 선택하기 위한 것이다. 결과의 백신 조성물은 그러므로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로의 뚜렷한 결합을 나타내는 핵단백질이 없으며, 이로 인해 민감한 개체에서 기면증의 발병을 촉발할 위험을 감소시킬 것이다.
따라서, 첫 번째 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데, 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181를 기반으로 하지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등하다.
조성물에서 모든 (인플루엔자 A) 핵단백질은 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래된 공지된 백신 조성물의 예는 Focetria™이며, 그러므로 이것은 특별히 제외된다.
관련된 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데 상기 핵단백질(들) 중 아무것도 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드와 같거나 더 높은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 단편을 포함하지 않는다. 바람직하게 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 핵단백질(들) 중 아무것도 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 대하여 갖는 결합 친화도의 절반, 3분의 1 또는 4분의 1의 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 단편을 포함하지 않는다.
추가의 관련 양태에서, 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신을 제공하는데 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 조성물에서 상기 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다. 특정 구체예에서, 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되는 것은 아니다.
관련된 구체예에서, 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 3에서 나타난 서열을 포함하는 것은 아니다.
상기 다양한 양태 및 구체예에서 언급된 용어 "~로부터 유래된"은 더 짧은 단편이, 예를 들어, 단백질 변성의 결과로서 존재할 수도 있다는 것을 의미한다.
발명자들은 HLA DQB1*0602로 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질의 결합에 수반될 가능성이 높은 주요 서열이 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기인 것을 확인하였다. 그러므로 백신 생산 중에 이 위치에서 이소류신이 없는 인플루엔자 A 핵단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데 상기 핵단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않으며, 단 조성물에서 모든 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다.
관련된 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물에 관한 것인데 상기 핵단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 또는 메티오닌 잔기를 갖지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데 상기 핵단백질은 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게 핵단백질은 또한 서열 번호: 13에서 나타난 서열을 포함하지 않는다. 관련된 구체예에서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 3에서 나타난 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 관련된 구체예에서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 10으로 나타난 서열을 포함하지 않는다.
상기 모든 구체예에서 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질에 대한 지시대상은 핵단백질이 단일 또는 다수의 공급원의 것인지 여부에 상관없이, 조성물에 존재하는 실질적으로 모든, 또는 모든 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 의미한다는 것을 주목해야 한다. "실질적으로 모든"은 전형적으로 조성물이 기반으로 하는 인플루엔자 A 균주(들)의 핵단백질(들)이 본원에서 제시된 필요조건을 충족해야 하지만 다른 공급원의 소량의 핵단백질이 있을 수도 있다는 것을 의미한다. 따라서 "실질적으로 모든"은 전형적으로 조성물에 존재하는 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질 중 적어도 99%를 의미한다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 첫 번째 양태를 표현하기 위한 다른 방법으로는:
(i) 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서 조성물에 존재하는 모든 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질에 대하여, 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 조성물에서 모든 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다.
(ii) 단일 또는 다수의 공급원(들)의 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 상기 모든 핵단백질(들)의 단편(들)은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 조성물에서 모든 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로부터 유래되면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다.
(iii) 단일 또는 다수의 공급원(들)의 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질(들)은 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 상기 핵단백질의 단편(들)을 포함하고, 조성물에 존재하는 모든 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질의 상기 단편(들)은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 조성물에서 모든 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는다.
본원에서 제공된 발견에 기초하여, 당업자는 기존의 또는 새로 확인된 핵단백질 서열을 취하고 결과의 핵단백질이 변형되지 않은 핵단백질과 비교하여 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로의 결합이 감소되거나, 결합하지 않도록 변형시킬 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데 핵단백질은 변형되지 않은 핵단백질과 비교하여 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로 그것의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형되었다.
바람직한 구체예에서, 핵단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 변화시키거나 결실시키도폭 변형되었다. 대안의 구체예에서, 핵단백질은 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 108에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산이 없고; 및/또는 (b) 서열 번호: 2의 아미노산 110에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산이 없고; 및/또는 (c) 서열 번호: 2의 아미노산 111에 해당하는 위치에서 소수성 아미노산이 없도록 하나 이상의 아미노산을 변화시키거나 결실시키기 위해 변형되었다. 이 두 개의 구체예는 또한 결합될 수도 있다. 그러므로, 전형적으로, 결과의 핵단백질은 야생형 핵단백질 서열의 다른 아미노산 서열을 가질 것이다.
기면증의 위험을 방지하거나 감소시키기 위한 또 다른 접근법은 최종 백신 조성물에 존재하는 핵단백질의 양을 감소시키는 것이다. 분할 비리온 및 전체 백신은 특히 많은 양의 잔류 핵단백질을 함유할 수도 있다.
따라서, 두 번째 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물을 제공하는데 (i) 조성물은 분할 비리온 백신이고 존재하는 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질의 양은 헤마글루티닌 10μg 당 3μg 미만의 핵단백질이거나 또는 (ii) 조성물은 서브유닛 백신이고 존재하는 핵단백질의 양은 헤마글루티닌 10μg 당 0.5μg 미만의 핵단백질이다. 원하는 수준의 핵단백질에 관한 추가의 안내가 하기 더 제공된다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태는 결합될 수 있다. 따라서 인플루엔자 A 핵단백질의 혼합물이 존재하는 특정 구체예에서 (다원자가 백신), 단지 핵단백질의 양을 본 발명의 첫 번째 양태에 따라 방지되어야 하는 상기 핵단백질에 관하여 본원에서 명시된 수준 이하로 감소시키는 것이 필요할 수도 있다. 다른 핵단백질, 예를 들어, 균주 X-181의 것은, 예를 들어, 어떤 특정 타입의 백신에 대하여 보통 수준으로 포함될 수도 있다. 따라서, 이 구체예에서, 더 엄중한 정제 수단은, 특정 핵단백질의 서열/결합 특성에 따라, 항원의 제조 중에 단지 일부 균주(들)에 대하여 적용될 필요가 있지만, 다른 것들에 대해서는 그렇지 않다. 따라서 본 발명은 1가 벌크에 적용될 수도 있으며, 이것은 그때 다른 핵단백질을 가진 다원자가 백신을 제공하기 위해, 어떤 특별한 수단을 받을 필요가 없는 다른 1가 벌크(들)와 결합될 수도 있다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태의 특정 구체예에서, 백신 조성물은 보조제, 예를 들어, 수중유 에멀젼을 더 포함한다. 증가된 기면증 발생률이 GSK의 보조된 Pandemrix™ 백신에서 나타나기 때문에, 이 효과는 보조제의 존재에 의해 증가될 수도 있으며 그러므로 계절성 또는 유행성 보조된 백신 둘 다에 대한 본 발명의 교시내용을 적용하는 것이 특히 바람직할 수도 있다. 보조제, 예를 들어, 수중유 에멀젼은 GSK의 보조된 Pandemrix™ 백신에서 사용된 AS03 보조제의 경우와 마찬가지로, 토코페롤을 더 포함할 수도 있다. 특정 구체예에서, 수중유 에멀젼 MF59는 보조제로서 제외된다.
공정 변화는 또한 특정 핵단백질의 잠재적 악영향에 대한 효과를 가질 수도 있다. 예를 들어, 사용된 세제의 타입이 영향을 미칠 수도 있다. 따라서 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태의 한 구체예에서, 백신 조성물은 Triton (예를 들어, Triton X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올) 또는 Tween (예를 들어, Tween-80 또는 폴리소르베이트 80), 또는 이것들의 조합을 더 포함한다. 이러한 백신 조성물은 전술된 단락에서 설명된 바와 같이 보조되거나 보조되지 않을 수도 있다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태의 백신 조성물은 하나 이상의 유행성 인플루엔자 균주 및/또는 하나 이상의 계절성 인플루엔자 균주에 대한 백신일 수도 있다. 한 구체예에서, 백신 조성물은 1가 조성물이고, 예를 들어, 하나의 유행성 인플루엔자 균주만을 함유한다. 관련된 구체예에서, 백신 조성물은 인플루엔자 A 균주만을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태의 한 구체예에서, 백신은 4가 백신이다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 양태의 백신 조성물은, 예를 들어, 전체 바이러스 백신, 분할 비리온 백신 또는 서브유닛 백신일 수도 있다. 한 구체예에서, 백신 조성물은 분할 비리온 백신이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물이 유행성 바이러스에 대한 것인 경우, 백신 조성물은 재조합체 바이러스 NYMC X-157, X163, X-163A, X-163B, X-173, X-173A, X-173B, X-173C, X-177, X-177A, X-177B, X-179, X-179A, X-181 또는 X-181B로부터 얻어지는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물이 게절성 바이러스에 대한 것인 경우, 백신 조성물은 재조합체 바이러스 NYMC X-157, X163, X-163A, X-163B, X-173, X-173A, X-173B, X-173C, X-177, X-177A, X-177B, X-179, X-179A, X-181 또는 X-181B로부터 얻어지는 것은 아니다.
한 구체예에서, 백신은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8 또는 H9 균주, 예를 들어, 유행성 H1, H3, H5, H6, H7 또는 H9 균주에 대한 것이다. 구체적인 예는 H1N1, H5N1, H5N3, H7N9, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3 및 H7N1이다
추가적인 특이적 구체예가 하기 개시된다:
뚜렷한 연관성이 기면증과 MF59-보조된 독감 백신으로의 면역화 사이에서 검출되지 않았다. 그러므로 추가적인 면역자극제와 함께 수중유 보조제가 사용되면 NP 단백질은 특히 위험할 수도 있다. 이러한 추가적인 면역자극제는 예를 들어, 토코페롤/토코페롤 유도체 (AS03), 또는 TLR 작용제, 예를 들어, 합성 TLR4 작용제 글루코피라노실 지질 A (GLA; WO2009/143457 참조)일 수 있다. 그러므로, 상기 수중유 보조제로 보조된 독감 백신은 바람직하게 인플루엔자 A NP 단백질이 없어야 한다. 그러므로 본 발명의 한 구체예는 다음과 같다:
(a) 인플루엔자 A NP 단백질을 함유하지 않거나, 또는 백신에서 총 인플루엔자 바이러스 단백질 질량으로 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 인플루엔자 A NP 단백질을 함유하는 비활성화된, 보조된 인플루엔자 백신. 바람직한 구체예에서 보조제는 추가적인 면역자극제, 예를 들어, 토코페롤, 토코페롤 유도체, MPL, GLA 또는 또 다른 TLR 작용제를 함유하는 수중유 에멀젼이다. 대안의 구체예에서, 백신은 Alum 보조되고, 흡착된 TLR 작용제와 같은 면역자극제를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 백신은 서브유닛 또는 분할 백신이다.
수중유 에멀젼의 맥락에서 '추가적인 면역자극제'는 에멀젼을 형성하는 베이스 오일 및 세제(들) 이외에 포함된 면역자극제를 의미한다. 추가적인 면역자극제는 에멀젼의 보조 효과를 증가시키기 위해 추가된다. 본원의 목적을 위해서, 스쿠알렌, Span 및 Tween으로 구성된 MF59는 추가적인 면역자극제를 함유하지 않는 것으로 생각된다. AS03에 함유된 토코페롤은 추가적인 면역자극제인 것으로 생각된다. 본원의 목적을 위해서 전형적으로 에멀젼을 형성하고 및/또는 안정화시키는데 사용되는 계면활성제는 이 세제들이 특정 내재성 보조 활성을 가지고 있음 불구하고 '추가적인 면역자극제'로 간주되지 않는다. 따라서, 하기 세제는 추가적인 면역자극제로서 생각되지 않아야 한다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 (보통 Tween으로 불림), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥시드 (ED), 프로필렌 옥시드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 코폴리머, DOWFAX™ 상표명 하에 판매됨, 예를 들어, 선형 EO/PO 차단 코폴리머; 옥톡시놀, 이것은 반복하는 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 다를 수 있으며, 옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 바람직하다; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들어, 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예를 들어, Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제로 알려져 있음), 예를 들어, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30); 및 소르비탄 에스터 (보통 SPAN으로 알려져 있음), 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 반면에, TLR 작용제는 그것들이 오일 또는 계면활성제의 화학적 형태로 추가됨에도 불구하고 본원의 목적을 위해 추가적인 면역자극제로 간주된다. 특히 하기 보조제 섹션에서 설명된 TLR 작용제는 추가적인 면역자극제로서 이해된다.
대안으로, 인플루엔자 A NP 단백질의 존재가 수중유 에멀젼 또는 Alum 및 추가적인 면역자극제로 보조된 백신에서 완전하게 방지될 수 없으면, Pandemrix™에 함유된 NP 단백질과 다른 NP 단백질이 사용되어야 한다. 그러므로 본 발명의 한 구체예는 다음과 같다:
(b) 인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 함유하는 보조된 인플루엔자 백신으로서, 다음을 특징으로 한다:
(i) NP 단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않고, 및/또는
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118 (전형적으로 아미노산 106 내지 126)과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하며,
보조제는 수중유 에멀젼 또는 Alum 및 추가적인 면역자극제이다.
바람직한 구체예에서, 보조제는 수중유 에멀젼이고 추가적인 면역자극제는 토코페롤, 토코페롤 유도체, GLA, MPL 또는 또 다른 TLR 작용제이다. 대안의 구체예에서 보조제는 Alum (예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트)이고 TLR 작용제를 함유한다.
Pandemrix™에서 사용된 서열 서열 번호: 2를 가진 NP 단백질의 존재가 방지될 수 없을 때 (예를 들어, 대안의 백본이 이용 가능하지 않기 때문에), 백신은 추가적인 면역자극제를 함유하지 않는 보조제로 보조되어야만 한다. 이는 특히 (i) 분할 백신 (비교적 많은 양의 NP를 함유함), (ii) 4가 또는 더 높은 원자가 백신 (NP의 양이 더해짐에 따라), (iii) 소아 집단 및/또는 청소년 집단에 주어지는 백신 (기면증 사례의 대부분이 이 집단에서 검출되었기 때문에), (iv) 독감 백신 접종에 관하여 자가면역 질환에 걸릴 유전적 성향을 가진 대상체 (예를 들어, HLA DQB1*0602를 가진 대상체; 기면증이 이 대상체에서만 발생하였기 때문에)에게 주어지는 백신, 및 (v) Triton을 함유하는 항원 (기면증이 주로 Triton 함유 항원에 반응하여 나타나기 때문에)에 적용된다. 그러므로, 본 발명의 한 구체예는 다음과 같다:
(c) 보조된 분할 인플루엔자 백신으로서 백신은 적어도 4개의 다른 인플루엔자 바이러스의 항원 및 서열 번호: 2를 가진 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 함유하며, 보조제는 추가적인 면역자극제를 함유하지 않는 수중유 에멀젼 보조제이며, 조성물은 Triton을 함유하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 이 백신은 소아 집단 (0-36개월) 및/또는 청소년 집단 (4-19살) 및/또는 독감 백신 접종에 관하여 자가면역 질환에 걸릴 유전적 성향을 가진 대상체, 바람직하게 HLA DQB1*0602를 가진 대상체에서 사용되어야 하는 것이다.
대안의 구체예는 다음과 같다:
(d) 0-72개월의 아동, 및/또는 청소년 (4-19살) 및/또는 독감 백신 접종에 관하여 자가면역 질환에 걸릴 유전적 성향을 가진 대상체, 바람직하게 HLA DQB1*0602를 가진 대상체의 치료 방법으로서, 아동 및/또는 청소년 및/또는 대상체는 보조된 분할 인플루엔자 백신으로 백신 접종되며 백신은 적어도 4개의 다른 인플루엔자 바이러스의 항원 및 서열 번호: 2를 가진 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 함유하며, 보조제는 추가적인 면역자극제를 함유하지 않는 수중유 에멀젼 보조제이고, 조성물은 Triton을 함유하는 것을 특징으로 한다. 추가의 구체예는 다음과 같다:
(e) (i) AS03 보조제, 및 (ii) Triton X-100 및 Tween 80을 함유하지만, (a) 핵단백질이 없거나, 또는 (b) 핵단백질을 함유하지만, 백신에서 핵단백질의 양이 인플루엔자 바이러스 단백질의 총 질량의 1% 미만인 항원 구성요소를 함유하는 비활성화된 인플루엔자 백신.
(f) (i) AS03 보조제, 및 (ii) Triton X-100 및 Tween 80을 함유하고, 핵단백질을 함유하지만, HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합할 수 있는 핵단백질 또는 핵단백질 단편을 함유하지 않는 항원 구성요소를 함유하는 비활성화된 분할 인플루엔자 백신. 바람직하게 백신은 유행병과 관련된 인플루엔자 균주에 대한 것이고 인플루엔자 균주는 H1N1, H7N9, H9N2, H5N1, H5N3, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, 및 H7N1로부터 선택된다.
(g) (i) AS03 보조제, 및 (ii) Triton X-100 및 Tween 80을 함유하고 핵단백질을 함유하지만, 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 함유하는 핵단백질 또는 핵단백질 단편을 함유하지 않는 항원 구성요소를 함유하고, 유행병과 관련된 인플루엔자 균주에 대한 비활성화된 분할 인플루엔자 백신. 바람직하게 백신은 유행병과 관련된 인플루엔자 균주에 대한 것이고 인플루엔자 균주는 H1N1, H5N1, H5N3, H7N9, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, 및 H7N1로부터 선택된다.
(h) (i) AS03 보조제, 및 (ii) Triton X-100 및 Tween 80을 함유하고 핵단백질을 함유하지만, 서열 LXLYXXXIXXXXXX (서열 번호: 9)을 함유하는 핵단백질 또는 핵단백질 단편을 함유하지 않는 항원 구성요소를 함유하고, 유행병과 관련된 인플루엔자 균주에 대한 비활성화된 분할 인플루엔자 백신으로서, X는 어떤 아미노산도 된다. 바람직하게 백신은 유행병과 관련된 인플루엔자 균주에 대한 것이고 인플루엔자 균주는 H1N1, H5N1, H5N3, H7N9, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, 및 H7N1로부터 선택된다.
한 구체예에서, 상기 설명된 비-보조된 백신의 항원 구성요소는 수중유 보조제, 특히 AS03과 함께 제형에 사용될 수도 있다.
(i) 인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 함유하는 1가 인플루엔자 백신으로서, 다음을 특징으로 한다:
(i) NP 단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않고, 및/또는
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118 (또는 106 내지 126)과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하며,
백신은 용량 당 7.5 마이크로그램 미만의 HA, 및 선택적으로 보조제를 함유한다.
(j) 적어도 4개의 다른 인플루엔자 바이러스의 항원 및 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스의 NP 단백질을 함유하는 인플루엔자 백신으로서, 다음을 특징으로 한다:
a. NP 단백질 중 아무것도 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않고, 및/또는
b. 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 적어도 하나의 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하며,
백신은 선택적으로 보조제를 함유한다.
(k) 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 보조된 비활성화된 분할 인플루엔자 백신으로서, 백신은 (i) 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 가진 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 및 (ii) A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질이 없다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이 백신은 균주 NYMC X-157, X163, X-163A, X-163B, X-173, X-173A, X-173B, X-173C, X-177, X-177A, X-177B, X-179, X-179A, X-181 또는 X-181B 중 어떤 것의 핵단백질이 없을 수 있다. 백신은 수중유 에멀젼 보조제, 예를 들어, MF59 또는 AS03을 포함할 수 있다. 백신은 1가 또는 다원자가 (예를 들어, 3가 또는 4가)일 수 있다.
(l) 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 보조된 비활성화된 분할 인플루엔자 백신으로서, 백신은 (i) 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 가진 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 및 (ii) 2013년 10월 1일 전에 세계 보건 기구(World Health Organization) 또는 백신 및 관련 생물 제품 자문위원회(Vaccine and Related Biological Products Advisory Committee)에 의해 인플루엔자 백신에 포함되도록 추천된 어떤 인플루엔자 A 바이러스 균주의 헤마글루티닌도 없다. 백신은 또한 (iii) 2013년 10월 1일 전에 세계 보건 기구 또는 백신 및 관련 생물 제품 자문위원회에 의해 인플루엔자 백신에 포함되도록 추천된 어떤 인플루엔자 B 바이러스 균주의 헤마글루티닌이 없을 수도 있다. WHO의 균주 추천은 인터넷 상에서 이용 가능하고 [6], 2014년 남반구 인플루엔자 계절병에 사용된 균주는 2013년 9월 26일에 공표되었다. FDA의 VRBPAC 추천은 유사하게 온라인 상에서 이용 가능하고 [7], 2013/14 인플루엔자 계절병에 사용된 균주는 2013년 2월 27일에 공표되었다. 따라서 특징 (ii)에 의해 한정된 균주는 쉽게 결정될 수 있다. 백신은 수중유 에멀젼 보조제, 예를 들어, MF59 또는 AS03을 포함할 수 있다. 백신은 1가일 수 있지만 바람직하게 다원자가 (예를 들어, 3가 또는 4가)이다. 백신이 4가이면, 그것은 이상적으로 두 개의 A 및 두 개의 B 균주의 헤마글루티닌을 포함하는데, 두 개의 A 균주는 다른 헤마글루티닌 서브타입 (예를 들어, H1 및 H3, 예를 들어, H1N1 균주 및 H3N2 균주)을 갖고 두 개의 B 균주는 다른 계통 (즉, B/Victoria/2/87-유사 균주 및 B/Yamagata/16/88-유사 균주)을 갖는다. 하기 참조.
상기 논의된 바와 같이, 베타-서브유닛이 HLA DQB1*0602인 경우 MHC 등급 II 수용체 헤테로다이머로의 잠재적 결합을 위해 인플루엔자 백신 제조에 사용된 기존의 핵단백질 및 특히 새로운 잠재적 핵단백질을 테스트하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 백신 생산에 대한 적합성에 대하여 인플루엔자 A 바이러스를 테스트하는 방법을 제공하는데, 인플루엔자 바이러스의 핵단백질, 또는 이것의 단편, 또는 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트에 의해 암호화된 핵단백질, 또는 이것의 단편이 H1N1 균주 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며; 인플루엔자 바이러스는 그것의 핵단백질이 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있으면 백신 생산에 적합하다. 명세서 전체에 걸쳐, 'HLA DQB1*0602로의 결합'에 대한 지시대상은 베타-서브유닛이 HLA DQB1*0602인 경우 MHC 등급 II 수용체 헤테로다이머로의 결합을 의미하는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
또한 백신 생산에 대한 적합성에 대하여 인플루엔자 A 바이러스를 테스트하는 방법이 제공되는데, (a) 인플루엔자 바이러스의 핵단백질, 또는 핵단백질을 암호화하는 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트의 서열을 결정하는 단계; 및 (b) 핵단백질이 균주 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하게 하는 서열을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며; 인플루엔자 바이러스는 그것의 핵단백질이 균주 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하면 백신 생산에 적합하다.
상기 언급된 바와 같이, HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로 바이러스의 NP 단백질의 결합은 질환 발병에 수반될 수 있고 그러므로 백신에서 NP 단백질이 균주 X-179A (이것은 Pandemrix™에 사용됨)와 비교하여 HLA DQB1*0602에 대하여 더 낮은 결합 친화도를 갖는 인플루엔자 A 바이러스를 선택하는 것이 바람직하다. 이 NP 단백질은 고유한 아미노산 서열 서열 번호: 2를 가지며, 하기 분석은 HLA DQB1*0602에 결합하는 이 서열의 중요한 부분이 RELILYDKEEIRRIWRQANNG (서열 번호: 1)인 것을 나타낸다.
기면증을 촉발시키지 않은, Focetria™에서 사용된 인플루엔자 바이러스의 NP 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 함유하지 않는다는 점에서 Pandemrix™의 NP 단백질과 다르며 (도 1 참조) 그러므로 이 위치에서 이소류신을 갖는 NP 단백질을 방지하는 것이 바람직하다. 흥미롭게도, 공지된 수천 개의 NP 단백질의 데이터베이스 서열의 발명자들의 분석은 이 영역이 높은 정도의 보존을 나타내고 공지된 NP 단백질 대부분, 특히 백신 제조에 사용된 재조합체 바이러스에서 발견된 것들은 이 위치에서 이소류신 또는 그것의 등가물을 갖는다는 것을 나타냈다.
본 발명은 또한 백신 생산에 대한 적합성에 대하여 인플루엔자 A 바이러스를 테스트하는 방법을 제공하는데, (a) 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질 또는 핵단백질을 암호화하는 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트의 서열을 결정하는 단계; 및 (b) 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 핵단백질의 아미노산을 결정하는 단계를 포함하며; 인플루엔자 바이러스는 그것의 NP 단백질이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 함유하지 않으면 백신 생산에 적합하다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 백신 조성물의 제조에 적합한 종자 바이러스(seed virus)를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 종자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 함유하며 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직하게 종자 바이러스에서 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하면, 그때 바이러스 종자는 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181가 아니다. 특정 구체예에서 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등하다.
백신 생산에 대한 인플루엔자 A 바이러스의 적합성을 평가할 때, 바이러스의 핵단백질이 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 108에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (b) 서열 번호: 2의 아미노산 110에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (c) 서열 번호: 2의 아미노산 111에 해당하는 위치에서 소수성 아미노산 중 하나 이상을 포함하는지 여부를 체크하는 것이 더 바람직하다. HLA DQB1*0602로 결합하는 핵단백질의 코어 결합 모티프(motif)는 서열 번호: 2의 아미노산 108, 110, 111, 113 및 116에 있으며, 아미노산 108 및 110이 지방족 아미노산이고 위치 111의 아미노산이 소수성 아미노산일 때 특히 잘 결합한다. 따라서 이 위치들에서 이러한 아미노산을 방지하는 것은 NP 단백질이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 가능성을 감소시키며, 이것은 NP 단백질이 기면증을 유발할 가능성을 더 감소시킨다. 인플루엔자 바이러스는 그것이 이 특이적 아미노산 중 하나, 둘 또는 모두를 함유하지 않으면 백신 생산에 특히 적합한 것으로 생각된다. 위치 111에서 결합 포켓은 결합에 특히 중요한 것으로 나타났고 그러므로 NP 단백질은 이 위치에서 소수성 아미노산을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질은 강한 바인더의 공지된 예가 이 아미노산을 갖기 때문에 이 위치에서 티로신을 갖는 것은 특히 바람직하지 않다 [8]. 위치 108 및/또는 110의 아미노산은 바람직하게 류신이 아니다. 인플루엔자 바이러스는 또한 그것이 서열 LXLYXXXIXXXXXX (서열 번호: 9)를 포함하지 않으면 백신 생산에 적합한 것으로 생각될 수도 있으며, X는 어떤 아미노산도 된다.
본 발명은 또한 인플루엔자 A 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는데, (a) 본 발명의 방법에 의해 백신 생산에 대한 인플루엔자 A 바이러스의 적합성을 테스트하는 단계; (b) 배양 숙주를 단계 (a)의 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 숙주를 배양하여 추가의 바이러스를 생산하는 단계; 및 선택적으로 (d) 단계 (c)에서 얻어진 바이러스를 정제하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 바이러스는 본 발명의 방법에 의해 평가된 바와 같이, 그것이 백신 생산에 적합한 것으로 생각되면 백신 생산에 사용될 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 A 핵단백질 또는 이것의 단편을 포함하는 백신이 인간에게 투여에 적합한지를 확인하는 방법을 더 제공하는데, 단백질이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며; 백신은 핵단백질이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 함유하지 않으면 인간에게 투여에 적합한 것으로 생각된다.
방법은 상기 논의된 바와 같이, 바이러스 핵단백질이 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 108에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (b) 서열 번호: 2의 아미노산 110에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (c) 서열 번호: 2의 아미노산 111에 해당하는 위치에서 소수성 아미노산 중 하나 이상을 포함하는지 여부를 테스트하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 방법은 바이러스의 핵단백질이 이 아미노산 모두를 갖는지 여부를 테스트하는 단계를 포함할 수도 있다.
상기 논의된 바와 같이, NP 단백질 (또는 이것의 단편)이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있거나, 또는 NP 단백질이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 갖는 인플루엔자 A 바이러스는 기면증과 연관성이 있었다. 따라서 이러한 NP 단백질 또는 단편의 존재를 방지하는 것이 바람직한데 이것이 인플루엔자 A 백신에서 신뢰도를 더 증가시고 또한 백신의 안전성을 더 증가시키기 때문이다. 따라서, HLA DQB1*0602에 결합할 수 있고 및/또는 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 갖는 인플루엔자 A 바이러스가 백신 생산에 사용되면, 결과의 백신이 테스트되어 NP 단백질 (또는 이것의 단편)이 최종 백신에 존재하지 않는다는 것을 보장하는 것이 바람직하다.
그러므로 본 발명은 또한 인플루엔자 백신이 인간으로의 투여에 안전한지를 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 (a) 핵단백질이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, NP가 서열 번호: 2인 균주)로부터 인플루엔자 백신을 제조하는 단계; 및 (b) 핵단백질의 존재에 대하여 백신을 테스트하는 단계를 포함할 수도 있으며; 백신은 그것이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 핵단백질을 함유하지 않으면 인간에게 투여에 안전하다. 대안으로, 그것은 핵단백질이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 갖는 인플루엔자 바이러스로부터 인플루엔자 백신을 제조하는 단계; 및 (b) 핵단백질의 존재에 대하여 백신을 테스트하는 단계를 포함할 수도 있으며; 백신은 그것이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 핵단백질을 함유하지 않으면 인간에게 투여에 안전한 것으로 생각된다.
상기 논의된 바와 같이, Pandemrix™ 백신에 반응하는 기면증의 모든 경우는 HLA DQB1*0602 하플로타입을 가진 환자에서 발생하였으며 그러므로 이 환자 군에 특히 주의를 기울이는 것이 바람직하다. 그러므로 백신을 투여하기 전에 환자의 HLA 하플로타입을 감안하는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명은 또한 백신을 대상체에게 투여하는 방법을 제공하는데; (a) 대상체가 백신에 관하여 자가면역 질환에 걸릴 유전적 성향을 갖는지 여부를 결정하는 단계, 및 대상체가 위험하지 않다고 밝혀지면 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 본 발명은 백신을 대상체에게 투여하는 방법을 제공하는데, (a) 대상체가 특정 HLA 하플로타입을 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 대상체가 상기 하플로타입에 대하여 음성인 것으로 밝혀지면 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특히 본 발명은 인플루엔자 백신을 대상체에게 투여하는 방법을 제공하는데 (a) 대상체가 HLA DQB1*0602 하플로타입을 갖는지 여부를 결정하는 단계, 및 (b) 대상체가 HLA DQB1*0602에 대하여 음성이면 인플루엔자 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체를 면역화하는 방법을 제공하는데 이 방법은 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 백신에 관하여 자가면역 질환에 걸릴 위험을 제기하는 HLA에 대하여 음성이다. 바람직한 구체예에서 백신은 인플루엔자 A 백신이고 및/또는 대상체는 HLA DQB1*0602에 대하여 음성이다.
대안으로, 본 발명은 상기 백신에 관하여 자가면역 질환에 대한 위험을 제기하는 HLA 하플로타입을 가진 대상체에서 사용되는 백신을 제공하며, 백신은 상기 HLA 하플로타입에 결합하는 백신 구성요소가 실질적으로 없다. 바람직한 구체예에서 백신은 인플루엔자 A 바이러스 및 HLA 타입 DQB1*0602에 대한 것이며, 백신은 NP 단백질을 함유하지 않거나, 또는 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않는 NP 단백질을 함유하고, 및/또는 NP 단백질 또는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직한 구체예에서 NP 단백질 또는 이것들의 단편이 제거되었다. 더 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 백신은 재조합 백신이 아니다.
본 발명은 또한 대상체를 인플루엔자에 대하여 면역화하는 방법을 제공하는데 이 방법은 인플루엔자 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 HLA DQB1*0602에 대하여 양성이고, 백신은 인플루엔자 A NP 단백질을 함유하지 않거나, 또는 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않는 인플루엔자 A NP 단백질을 함유하고, 및/또는 NP 단백질 또는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합한다. 바람직한 구체예에서, 백신은 재조합 백신이다.
본 발명은 또한 HLA DQB1*0602를 가진 대상체에서 사용되는 NP를 함유하는 인플루엔자 백신을 제공하며 NP 단백질은 서열 서열 번호: 2를 포함한다.
본 발명은 또한 핵단백질, 또는 이것의 단편이 HLA DQB1*0602에 결합하는 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신을 제공하는데, 백신은 핵단백질, 또는 이것의 단편을 함유하지 않으며, 이것은 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 백신은 재조합 백신이 아니다.
핵단백질이 서열 번호: 1의 서열을 포함하는 핵단백질과 비교하여 같거나 더 높은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하는 능력에 대하여 테스트된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신이 더 제공되며, 백신은 핵단백질을 포함하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 백신은 재조합 백신이 아니다.
또한 균주 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같거나 더 높은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하는 능력에 대하여 테스트된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루에낮 백신이 제공되며, 백신은 핵단백질을 포함하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 백신은 재조합 백신이 아니다.
또한 핵단백질, 또는 이것의 단편이 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신의 존재에 대하여 테스트된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신이 제공되며, 백신은 핵단백질 또는 이것의 단편을 포함하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 백신은 재조합 백신이 아니다.
본 발명은 또한 Pandemrix™ 백신보다 HA에 관하여 더 적은 양의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 분할 비리온 인플루엔자 백신을 제공한다. 이것은 중요한 안전 대책일 수 있으며, 특히 핵단백질이 본원에서 설명된 바와 같이 테스트되지 않은 경우에 더 적은 양의 핵단백질이, 기면증을 촉발할 가능성을 더 낮게 만들기 때문이다. 특정 구체예에서 본 발명은 분할 비리온 백신 조성물을 제공하며 존재하는 핵단백질의 양은 헤마글루티닌 10μg 당 3μg 미만의 핵단백질, 예를 들어, HA 10μg 당 3μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1μg 미만의 NP, HA 10μg 당 0.5μg 미만의 NP 또는 HA 10μg 당 O.1μg 미만의 NP이다.
조성물에서 단백질의 양을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하지만, NP 및 NA는 실제로 같은 분자량 (대략 60 kDa)을 갖기 때문에, 그것들은 보통 비-환원성 겔에서 동시-이동한다. 그러므로 고전적인 SDS 겔-전기영동은 NP의 양을 결정하는데 적절한 방법은 아닐 수도 있다 [9]. 백신 벌크에서 NP의 양을 결정하기 위한 한 방법은 이후의 농도측정법을 동반한 2차원 전기영동일 수도 있다. 하지만, 참고문헌 10에서 설명된 바와 같이 동위원소로 라벨링된 합성 펩타이드를 사용하는 동위원소 희석 질량 분석법이 바람직하다. 이 방법은 다중 반응 모니터링 (MRM)과 함께 동위원소 희석을 사용하는 액체 크로마토그래피-탠덤(tandem) 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 사용한다. 이 방법은 분석물질 단백질의 화학량론적 대표값으로서 샘플의 단백질 가수분해에 의해 방출된 표적 펩타이드를 정량화한다. 안정한 동위원소-라벨링된 참조 펩타이드는 내부 기준 (IS)으로서 샘플에 고착된다. NP의 정량화는 동위원소로 라벨링된 참조 펩타이드의 피크 영역을 내인성 표적 펩타이드의 그것과 비교함으로써 달성된다.
이 방법은 라벨링된 펩타이드가 각각의 특이적 표적에 대하여 포함되면 다수의 단백질의 동시 정량화를 허용한다.
대안으로, 라벨 없는 질량 분석법 (LC/MSE)은 바람직하게는 4중극 비행 시간 (quadrupole time-of-flight; Q-Tof) 질량 분석계로 정량화에 사용된다 [11]. 이 방법을 위해서, LC/MS 분석 중에 낮은 충돌 에너지 및 높아진 충돌 에너지의 교번적 스캔이 단일 실험에서 단백질 정체성 및 양 둘 다를 얻기 위해 사용된다. 정량화는 실험 데이터를 기반으로 하며 어떤 주어진 단백질에 대해서도 세 개의 가장 강한 트립신 펩타이드의 LC/MSE에 의해 측정된 평균 신호 강도가, 단백질 타입 및 크기에 상관없이, 주어진 농도에서 일정하다는 것을 나타낸다. 신호 강도는 농도에 비례하기 때문에, 혼합물에서 어떤 단백질의 양도 추정될 수 있다.
본 발명은 또한 분할 비리온 인플루엔자 백신을 제공하며 헤마글루티닌에 대한 핵단백질의 비율은 하기 검정에 의해 평가된 바와 같이 1.5 미만 (예를 들어, <1.4, <1.3, <1.2, <1.1, 또는 <1.0)이다: 백신에서 단백질이 침전되고; 침전된 단백질이 수거되고, 환원되고, 프로피온아미드를 사용하여 알칼리화되며; 알칼리화된 단백질은 트립신 및 LysC (특이적으로 Lys 잔기의 카르복실 측기에서 가수분해되는 라이소박터 엔자이모게네스(Lysobacter enzymogenes)의 세린 엔도프로테이나제)의 혼합물로 37℃에서 하룻밤 동안 분해되고; 포름산으로 산성화; C18 역상 레진을 사용하여 단백질 가수분해 단편의 정제; 정제된 단편의 HPLC-MSMS (고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법), 단편화를 위해 15개의 가장 강한 다중 하전된 전구체 이온의 선택; MS 스펙트럼 피크를 인플루엔자 바이러스 단백질과 매치(match); MS 스펙트럼에서 가장 풍부한 단백질 선택; 및 이 10개의 가장 풍부한 단백질 내에서 헤마글루티닌 MS 신호에 대한 핵단백질 MS의 비율 계산. 하기 나타난 바와 같이, 현재의 분할 백신에서 이 검정에 의해 평가된, MS에 대한 NP의 비율은 1.5 이상이다.
본 발명은 또한 분할 비리온 인플루엔자 백신을 제공하며 헤마글루티닌에 대한 핵단백질의 비율은 하기 검정에 의해 평가된 바와 같이 0.3 미만 (예를 들어, <0.28, <0.26, <0.25, <0.20, 또는 <0.10)이다: 백신에서 단백질이 침전되고; 침전된 단백질이 수거되고, 환원되고, 프로피온아미드를 사용하여 알칼리화되며; 알칼리화된 단백질은 트립신 및 LysC (특이적으로 Lys 잔기의 카르복실 측기에서 가수분해되는 리소박터 엔자이모게네스의 세린 엔도프로테이나제)의 혼합물로 37℃에서 하룻밤 동안 분해되고; 포름산으로 산성화; C18 역상 레진을 사용하여 단백질 가수분해 단편의 정제; 정제된 단편의 HPLC-MSMS (고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법), 단편화를 위해 15개의 가장 강한 다중 하전된 전구체 이온의 선택; 백신에 존재하는 것으로 공지된 균주에 대한 정확한 서열 매치에 의해 MS 스펙트럼 피크를 인플루엔자 바이러스 핵단백질 및 헤마글루티닌 서열에 매치; MS 스펙트럼에서 가장 풍부한 단백질 선택; 및 이 10개의 가장 풍부한 단백질 내에서 헤마글루티닌 MS 신호에 대한 핵단백질 MS의 비율 계산.
본 발명은 또한 감소된 수준의 인플루엔자 A 핵단백질을 포함하는 서브유닛 인플루엔자 백신을 제공하며, 수행된 추가적인 정제 단계로 인해 핵단백질의 수준이 분할 비리온 백신보다 서브유닛 백신에서 더 낮아야 한다는 것을 주목해야 한다. 특히, 본 발명은 서브유닛 백신을 제공하며 존재하는 핵단백질의 양은 HA 10μg 당 0.5μg 미만의 NP, 예를 들어, HA 10μg 당 0.1μg 미만의 NP이다. 전술된 단락의 백신이 유리한데 백신이 NP 단백질이 기면증을 유발하는 인플루엔자 백신의 생산에 사용된 인플루엔자 바이러스의 NP 단백질과 특성을 공유하는 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 경우, 백신이 기면증과 연관성이 있는 농도로 NP 단백질을 포함하지 않는다는 것을 보장하는 것이 바람직하기 때문이다.
전형적으로, 전술된 단락에서 설명된 백신은 수중유 에멀젼 보조제로 보조된다. 이러한 백신, 예를 들어, Pandemrix™에서, 백신을 테스트하는 것이 특히 유리한데, 하기 설명된 바와 같이, 보조제는 NP 펩타이드가 기면증을 촉발할 수 있는 더 큰 위험으로 이어질 수도 있기 때문이다. 가장 바람직한 구체예에서, 수중유 에멀젼 보조제는 추가적인 면역자극제, 예를 들어, 토코페롤, 토코페롤 유도체, GLA 또는 TLR 작용제, 특히 α-토코페롤을 포함한다.
인플루엔자 백신은 전술된 단락에서 논의된 특성에 대하여 테스트된 인플루엔자 바이러스로부터 생산된다. 이 테스트 단계는 생산 과정 중에 어떤 단계에서도 수행될 수 있다. 그것은, 예를 들어, 백신이 생산되는 바이러스 배양을 시작하는데 사용된 종자 바이러스에서 수행될 수 있다. 그것은 또한 바이러스 배양으로부터 채취된 샘플에서 수행될 수 있다. 테스트 단계는 또한 생산 과정에서 사용되지 않는 인플루에자 바이러스에서 수행될 수 있는데, 예를 들어, 테스트 단계는 바이러스 균주의 한 배취(batch)를 사용하여 수행되고 같은 바이러스 균주의 또 다른 배취는 백신의 생산에 사용된다. 테스트 단계는 모든 생산 주기에서 수행될 필요는 없다. 그것은 인플루엔자 백신을 생산하는 같은 실체물에 의해 수행될 필요는 없다. 예를 들어, 한 실체물이 바이러스를 테스트하고, 예를 들어, 데이터베이스에서 테스트 결과를 다른 실체물에 이용 가능하게 만드는 것이 가능하다. 이 옵션은 특히 테스트 단계가 인플루엔자 바이러스의 서열 정보를 얻음으로써 수행되는 경우에 특히 바람직한데 이러한 정보는 공개 데이터베이스에서 쉽게 이용 가능해질 수 있기 때문이다.
또한 인플루엔자 A 백신을 제조하는 방법이 제공되는데, (a) 제1 예비 백신 조성물을 제조하는 단계; (b) 제2 예비 백신을 제공하기 위해 제1 백신으로부터 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방하는 조성물 구조의 양을 제거하거나 감소시키는 단계; 및 (c) 제2 예비 백신으로부터 백신을 제조하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방하는 구조의 양은 90% 이상만큼, 더 바람직하게 95%만큼 및 가장 바람직하게 99%만큼 감소된다. 예로서, 단계 (b)에서 제거는 크로마토그래피에 의한 것이다. 본 발명은 또한 바이러스로부터 바이러스 서브유닛을 제조하는 방법을 제공하는데, 서브유닛은 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방하는 구조 없이 제조된다. 방법은 백신을 제형화하는 단계, 선택적으로 백신을 보조제와 혼합시키는 단계, 백신을 채우고, 포장하고 라벨링하는 단계와 같은 추가의 단계들을 포함할 수도 있다.
본 발명은 핵단백질 서열이 아미노산 서열 RELILYDKEEMRRIWRQANNG (서열 번호: 3)을 포함하는 인플루엔자 바이러스로부터 백신을 제조하는 방법을 더 제공하는데, 백신을 제공하기 위해 상기 아미노산 서열을 포함하는 어떤 핵단백질, 또는 이것의 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 백신은 핵단백질 서열이 아미노산 서열 RELILYDKEEIRRIWRQANNG (서열 번호: 3)을 포함하는 인플루엔자 바이러스로부터 제조되며, 백신을 제조하기 위해 상기 아미노산 서열을 포함하는 어떤 핵단백질, 또는 이것의 단편을 제거하는 단계를 포함한다. 방법은 백신을 제형화하는 단계, 선택적으로 백신을 보조제와 혼합시키는 단계, 백신을 채우고, 포장하고 라벨링하는 단계와 같은 추가의 단계들을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 비활성화된 또는 생 약독화된 인플루엔자 A 백신을 제공하는데 백신은 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 핵단백질 또는 이것의 단편을 포함하지 않는다. 본 발명은 또한 핵단백질, 또는 이것의 단편을 함유하지 않는 비활성화된 또는 및 약독화된 인플루엔자 A 백신을 제공하는데, 이것들은 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방한다. 또한 핵단백질을 포함하지만 핵단백질의 양이 HA 10μg 당 3μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1μg 미만의 NP, HA 10μg 당 0.5μg 미만의 NP 또는 HA 10μg 당 0.1μg 미만의 NP인 인플루엔자 A 백신이 제공된다. 본 발명은 또한 핵단백질, 또는 이것의 단편을 함유하지 않는 비활성화된 인플루엔자 A 백신을 제공한다. 바람직하게 이 단락에서 설명된 백신은 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 핵단백질 또는 단편을 함유한 인플루엔자 A 바이러스로부터 시작하여 생산되었다. 이에 더하여, 또는 대안으로, 상기 백신은 수중유 에멀젼, 특히 추가적인 면역자극제를 함유하는 것들로 보조된다.
본 발명은 인플루엔자 A 백신을 제조하는 방법을 더 제공하는데, 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방하는 조성물 구조, 또는 이것의 단편을 제거하거나 감소시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 오렉신 수용체 1 및/또는 오렉신 수용체 2를 모방하는 구조의 양은 90% 이상만큼, 더 바람직하게 95%만큼 및 가장 바람직하게 99%만큼 감소된다. 본 발명은 인플루엔자 A 백신을 제조하는 방법을 더 제공하는데, 핵단백질 또는 이것의 단편의 양을 제거하거나 감소시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 핵단백질 또는 단편의 양은 90% 이상만큼, 더 바람직하게 95%만큼 및 가장 바람직하게 99%만큼 감소된다. 조제물로부터 단백질을 제거하는 방법이 업계에 잘 공지되어 있다. 예로서, 핵단백질 또는 이것의 단편의 양을 제거하거나 감소시키는 단계는 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 실행될 수 있다.
기면증은 대부분 소아 (0-36개월) 및 청소년 (4-19살) 집단에서 검출되었기 때문에, 한 구체예에서는 본원에서 설명된 본 발명의 모든 백신이 소아 (0-36개월) 및 청소년 (4-19살) 집단에서 사용된다.
수중유 에멀젼이 본원에서 설명된 항원과 결합하여 사용될 때, 백신의 항원 및 보조제 구성요소는 미리 혼합될 수도 있거나 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 항원 및 보조제 구성요소는 같거나 다른 생산 부위에서 생산될 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 제형화되고 및/또는 보조제 구성요소와 함께 키트로 포장되는 항원 구성요소의 사용이다. 본 발명의 또 다른 양태는 제형화되고 및/또는 항원 구성요소와 함께 키트로 포장되는 보조제 구성요소의 사용이다.
도 1 표 3의 뉴클레오캡시드 X-179A/X-181 서열 단편과 오렉신 수용체 2 (Ox1R) 및 오렉신 수용체 1 (Ox2R) 사이의 스미스-워터만(Smith-Waterman) 정렬. 인플루엔자 단편과 오렉신 과 서열 사이의 다른 정렬도 0.4 미만은 아니었다. 정렬은 디폴트(default) 파라미터를 이용하는 FASTA 패키지의 프로그램 검색으로 발생되었다. 나타난 정렬에서 Ox2R 및 Ox1R의 영역은 Uniprot에서 세포 외로 주석이 달려 있다.
핵단백질
본 발명은 당업자가 바이러스의 핵단백질의 특정 특성을 기반으로 하는 백신 생산용 인플루엔자 A 바이러스의 적합성을 평가하게 하는 방법, 예를 들어, HLA DQB1*0602로의 결합 또는 특정 아미노산의 존재에 대한 서열의 체크를 제공한다.
본 발명이 핵단백질의 테스트 (또는 시퀀싱, 분석, 등)에 관하여 한정되는 경우에, 이는 전장 핵단백질의 테스트를 수반할 수 있지만, 핵단백질이 항원 제공 세포에 의한 세포 내 처리 후 단편으로서 MHC 등급 II 수용체에 결합된 채로 제공될 것으로 예상되기 때문에 보통은 핵단백질의 단편의 테스트를 수반할 것이다. 이 단편들은 200개 미만의 아미노산, 예를 들어, 100개 미만의 아미노산, 90개 미만의 아미노산, 80개 미만의 아미노산, 70개 미만의 아미노산, 60개 미만의 아미노산, 50개 미만의 아미노산, 40개 미만의 아미노산, 30개 미만의 아미노산, 또는 20개 미만의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 단편은 MHC 등급 II 수용체에 결합하기 위해서 길이가 적어도 대략 12 또는 13개 아미노산, 예를 들어, 길이가 적어도 18, 19, 20 또는 21개 아미노산이어야 한다. 본 발명의 방법은 30개 미만의 아미노산의 길이를 가진 단편을 사용하여 실행되는 것이 바람직한데 이런 단편이 다루기 더 쉽기 때문이다. 게다가, 단편이 시퀀싱되면, 방법은 또한 더 짧은 서열이 분석되는 경우에 더 저렴할 것이다.
단편이 본 발명의 방법에서 사용되는 경우에, 단편은 서열 번호:2의 아미노산 108-116, 바람직하게 서열 번호: 2의 아미노산 106-118 또는 아미노산 106-126에 해당하는 아미노산을 포함해야 하는데, 이 서열이 HLA DQB1*0602를 함유하는 MHC 등급 II 수용체로의 결합에 대한 코어 모티프이기 때문이다. 따라서, 본 발명과 함께 사용될 수 있는 단편은 9개 아미노산의 최소 길이를 갖지만, 상기 언급된 바와 같이 MHC 등급 II 수용체에 결합하기 위해 길이가 전형적으로 대략 12 또는 13개 아미노산, 예를 들어, 길이가 적어도 18, 19, 20 또는 21개 아미노산일 것이다. 이 맥락에서 서열 번호: 2의 아미노산 108-116 및 106-118 및 106-126에 대한 지시대상은 본 발명이 서열 번호: 2의 아미노산 108-116 또는 106-118 또는 106-126에서 나타난 정확히 같은 아미노산 서열을 포함하는 단편으로만 실행될 수 있다는 것을 의미하지는 않는다. 대신에, 이는 당업자에게 다른 핵단백질 서열 (예를 들어, 균주 X-181의 서열 번호: 3)에서 해당 아미노산을 찾기 위한 참조를 제공하며, 이로 인해 어떤 인플루엔자 A 바이러스 NP에서도 동등한 단편을 확인한다.
한 균주의 단편이 사용될 때, 예를 들어, 균주 X-181의 더 길거나 더 짧은 펩타이드 대신에, 서열 번호: 3을 가진 펩타이드와 서열 번호: 1을 가진 펩타이드를 비교하기 위해, 상기 균주의 해당하는 단편에 대하여 또 다른 균주와의 어떤 비교도 이루어져야만 한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 NP 단백질 또는 단편을 암호화하는 게놈 세그먼트로 실행될 수 있으며, 전술된 단락에서 설명된 바와 같다. 그러므로 방법은 단백질 시퀀싱 없이, 하지만 대신에 핵산 서열을 사용함으로써 (또는 별도로 얻어진 서열 정보를 사용함으로써) 수행될 수 있다.
NP 단백질 또는 단편은 HLA DQB1*0602에 결합하는 그것의 능력을 테스트함으로써 분석될 수 있으며, 이것은 MHC 등급 II 수용체의 베타-사슬 서브유닛이다. 따라서, HLA DQB1*0602로 NP 단백질 또는 단편의 결합의 테스트가 베타-서브유닛이 HLA DQB1*0602인 경우 기능적 MHC 등급 II 수용체 헤테로다이머로의 결합을 기반으로 한다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 알파 서브유닛은 전형적으로 DQA1 서브유닛, 예를 들어, HLA DQA1*0102 (이것은 미국 백인에서 HLA DQB1*0602와 가장 흔하게 연관된 DQA1 서브유닛임)일 것이다. 이러한 헤테로다이머는, 예를 들어, 재조합 발현 기술을 사용하여 테스트 목적을 위해 얻어질 수 있다. 가용성 MHC 등급 II 수용체 헤테로다이머를 발현하는데 적합한 방법은 참고문헌 12에서 설명된다. HLA DQB1*0602의 아미노산 서열은 UniProtKB/Swiss-Prot: P01920로부터 이용 가능하다. 또 다른 적합한 방법이 참고문헌 13에서 설명된다.
이 실험의 기준은 서열 번호: 2의 NP 단백질, 또는 더 전형적으로 상기 단락에서 논의된 상기 서열의 단편, 예를 들어, 서열 번호: 1에서 나타난 단편이다. 이 서열을 가진 NP 단백질은 기면증과 연관성이 있다. 이 단백질과 비교하여 더 낮은 친화도로 (같은 실험 조건 하에서) HLA DQB1*0602에 결합하는 NP 단백질은 HLA DQB1*0602에 결합할 가능성이 더 낮고 따라서 기면증을 유발할 가능성이 더 낮다. 상기 논의된 바와 같이, 전형적으로 동등한 단편과의 비교가 수행된다. 예를 들어, NP 단편이 서열 번호: 1에서 나타난 단편인 경우에, 테스트 NP 단편은 아미노산 106-126 또는 동등한 영역으로부터 얻어질 것이며, 다른 NP 단백질은 정확히 같은 길이가 아닐 수도 있고 결실 또는 삽입을 가질 수 있다는 것을 고려한다.
예를 들어, NMR, 필터-결합 검정, 겔-지체 검정(gel-retardation assay), 대체/경쟁 검정, 역 이중-보합법(reverse two-hybrid), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 및 분광법을 사용하는, 결합 친화도를 테스트하는데 적합한 검정이 업계에 공지되어 있다. 적합한 펩타이드-결합 검정의 예는 참고문헌 12에서 설명된다. 검정의 특정 예에서, 테스트 펩타이드, 예를 들어, 균주 X-179A의 NP 단백질 단편 (예를 들어, 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산으로 구성되거나, 또는 이것을 포함하는 단편)은 검출 가능 라벨 (예를 들어, 비오틴)로 라벨링되고 HLA DQB1*0602를 함유하는 (전형적으로 헤테로다이머의 다른 구성요소로서 HLA DQA1*0102와 함께) MHC 등급 II 수용체에 결합된다. 라벨링되지 않은 테스트 펩타이드는 그때 수용체-라벨링된 펩타이드 복합체와 함께 배양된다. 테스트 펩타이드가 참조 라벨링된 펩타이드와의 결합에 대하여 성공적으로 경쟁하는지 여부는 결합되어 있는 라벨링된 펩타이드의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 테스트 펩타이드가 HLA DQB1*0602를 함유하는 MHC 등급 II 수용체에 덜 강하게 결합하면 그때 그것은 표지된 참조 펩타이드와의 결합에 대하여 성공적으로 경쟁하지 않을 것이며 그러므로 이는 균주 X-179A의 NP 단백질보다 HLA DQB1*0602를 함유하는 MHC 등급 II 수용체에 덜 강하게 결합하는 NP 단백질을 확인하기 위한 편리한 수단을 제공한다.
다른 검정은 참고문헌 13 및 참고문헌 88에서 설명된다 (예를 들어, 실시예에서 사용된 REVEAL™ ProImmune 기술로서, 이것은 기본 형태의 MHC-펩타이드 복합체의 존재 또는 부재의 경우에, MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 합성 테스트 펩타이드의 능력을 측정하며, 특이적 단클론성 항체에 의해 검출된다).
한 구체예에서, 테스트되는 NP 단백질 (예를 들어, 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118에 해당하거나 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126에 해당하는 단편)은 HLA DQB1*0602를 함유하는 MHC 등급 II 수용체에 대하여 X-179A의 NP 단백질 (예를 들어, 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118로 구성되거나 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126으로 구성된 단편)보다 HLA DQB1*0602를 함유하는 MHC 등급 II 수용체에 대하여 적어도 2배 더 낮은 결합 친화도, 예를 들어, 3배, 4배, 5배 또는 10배 더 낮은 결합 친화도를 가진다. 바람직하게 테스트되는 MHC 등급 II 수용체는 HLA DQA1*0102 및 HLA DQB1*0602의 헤테로다이머이다.
NP 단백질은 또한 그것의 서열 또는 단편의 서열을 결정함으로써 분석될 수 있으며, 전술된 단락에서 논의된 바와 같다. 방법은 또한 NP 단백질 또는 이것의 단편을 암호화하는 바이러스 세그먼트의 서열을 분석함으로써 수행될 수 있다. 펩타이드 및 핵산을 시퀀싱하는데 적합한 방법은 업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 에드만 분해 검정(Edman degradation assay) 및 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 포함한다. 핵산이 분석되는 경우에, 핵산은 시퀀싱 전에, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭될 수도 있다.
한 구체예에서, 바이러스의 핵단백질이 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 108에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (b) 서열 번호: 2의 아미노산 110에 해당하는 위치에서 지방족 아미노산; 및/또는 (c) 서열 번호: 2의 아미노산 111에 해당하는 위치에서 소수성 아미노산 중 하나 이상을 포함하는지 여부에 대한 분석이 이루어진다. HLA DQB1*0602로의 결합에 대한 핵단백질의 코어 결합 모티프는 서열 번호: 2의 아미노산 108, 110, 111, 113 및 116에 있으며, 결합은 아미노산 108 및 110이 지방족 아미노산이고 위치 111의 아미노산이 소수성 아미노산일 때 특히 잘 작동한다. 따라서 이 위치에서 이러한 아미노산을 방지하는 것은 NP 단백질이 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있을 가능성을 감소시키며, 이것은 NP 단백질이 기면증을 유발할 가능성을 더 감소시킨다. 인플루엔자 바이러스는 그것이 이 특이적 아미노산의 하나, 둘 또는 모두를 함유하지 않으면 백신 생산에 특히 적합한 것으로 고려된다. 위치 111에서 결합 포켓은 결합에 특히 중요한 것으로 나타났고 그러므로 NP 단백질이 이 위치에서 소수성 아미노산을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질은 이 위치에서 티로신을 갖지 않는 것이 특히 바람직한데 강한 바인더의 공지된 예가 이 아미노산을 갖기 때문이다 [8]. 위치 108 및/또는 110에서 아미노산은 바람직하게 류신이 아니다. 인플루엔자 바이러스는 또한 그것이 서열 LXLYXXXIXXXXXX (서열 번호: 9)를 포함하지 않으면 백신 생산에 적합한 것으로 고려될 수도 있으며, X는 어떤 아미노산도 된다. 단백질 서열은 또한 대안의 수단에 의해 분석될 수도 있다. 예를 들어, 게놈 세그먼트가 분석되는 경우에, 세그먼트는 결합 모티프에서 특히 적절한 아미노산을 특이적으로 검출하는 프로브를 사용하여 분석될 수 있다. 유사하게, NP 단백질은 웨스턴 블롯 분석 또는 면역 형광법과 같은 면역화학적 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 분석적 방법이 본 발명과 함께 사용되는 경우, 이것들은 서열 LILYDKEEI (서열 번호: 8, 서열 번호: 2의 아미노산 108-116에 해당함)의 특이적 검출을 허용하는 항체를 사용하여 수행되어야 한다. 상기 논의된 바와 같이, NP 단백질이 위치 111에서 티로신을 갖지 않는 것이 특히 바람직하고 그러므로 항체는 위치 111에서 티로신을 특이적으로 검출하는 항체일 수 있다. 대안으로, 또는 이에 더하여 항체는 위치 108 및/또는 110에서 류신을 특이적으로 검출할 수도 있다. 관련된 서열들을 구별할 수 있는 항체를 얻는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
핵단백질의 검출
일부 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 A 핵단백질을 포함하지 않는 비활성화된 인플루엔자 백신을 제공한다. 당업자는 최종 백신으로부터 모든 NP를 제거하는 것이 종종 가능하지 않고 백신 (특히 분할 백신)은 NP의 잔류량을 여전히 함유한다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, Focetria™ 백신은 특정 양의 NP 단백질을 함유하지만 이 단백질들은 그것들이 Pandemrix™에 있는 것보다 훨씬 더 적은 양으로 존재하기 때문에 문제가 될 수 없다.
따라서, 본 발명의 백신이 핵단백질을 포함하면, 그것은 바람직하게 백신에서 총 인플루엔자 바이러스 단백질의 질량으로 15% 미만, 예를 들어, <12%, <10%, <8%, <7%, <6%, <5%, <4%, <3%, <2%, 또는 <1%을 구성한다. 백신은 HA 10μg 당 3μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 2μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1.5μg 미만의 NP, HA 10μg 당 1μg 미만의 NP, HA 10μg 당 0.5μg 미만의 NP 또는 HA 10μg 당 0.1μg 미만의 NP를 포함할 수도 있다. NP의 양은 상기 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 한 구체예에서 인플루엔자 A 핵단백질의 혼합물이 존재하는 경우에, 단지 핵단백질의 양을 본 발명의 첫 번째 양태에서 주어진 정의에 따라 방지되어야 하는 상기 핵단백질에 관하여 본원에서 명시된 수준 이하로 감소시키는 것만이 필요할 수도 있다. 따라서 이 구체예에서, 상기 주어진 NP의 양의 평가는 이러한 핵단백질, 예를 들어, 균주 X-179A의 핵단백질에 관해서만 이루어지면 된다. 다른 핵단백질, 예를 들어, 균주 X-181의 것은, 예를 들어, 어떤 특정 타입의 백신에 대하여 보통 수준으로 포함될 수도 있다. 따라서, 이 구체예에서, 더 엄충한 정제 수단은 특정 핵단백질의 서열/결합 특성에 따라 다른 것들이 아니라 일부 균주의 제조 중에만 적용되면 된다. 최종 백신 조성물로 결합되면, NP의 총량은 상기 주어진 한계를 초과할 수도 있으며, 단 감소하는 것이 바람직한 타입의 NP의 양은 그렇지 않다.
조성물에서 단백질의 양을 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하지만, NP 및 NA는 실제로 같은 분자량을 갖기 때문에 (대략 60 kDa), 그것들은 보통 비-환원성 겔에서 동시-이동한다. 그러므로 고전적인 SDS 겔-전기영동은 NP의 양을 결정하는데 적절한 방법은 아닐 수도 있다 (Chaloupka et al., 1996, Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Feb; 15(2): 121-7. 참조). 백신 벌크에서 NP의 양을 결정하기 위한 한 방법은 이후의 농도측정법을 동반한 2차원 전기영동일 수도 있다. 하지만, Williams et ah, Vaccine 30 (2012) 2475-2482에서 설명된 바와 같이 동위원소로 라벨링된 합성 펩타이드를 사용하는 동위원소 희석 질량 분석법이 바람직하다. 이 방법은 다중 반응 모니터링 (MRM)과 함께 동위원소 희석을 사용하는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 사용한다. 이 방법은 이 방법은 분석물질 단백질의 화학량론적 대표로서 샘플의 단백질 가수분해에 의해 방출된 표적 펩타이드를 정량화한다. 안정한 동위원소-라벨링된 참조 펩타이드는 내부 기준 (IS)으로서 샘플에 고착된다. NP의 정량화는 동위원소로 라벨링된 참조 펩타이드의 피크 영역을 내인성 표적 펩타이드의 그것과 비교함으로써 달성된다. 이 방법은 라벨링된 펩타이드가 각각의 특이적 표적에 대하여 포함되면 다수의 단백질의 동시 정량화를 허용한다.
대안으로, 라벨 없는 질량 분석법 (LC/MSE)이 바람직하게는 4중극 비행 시간 (Q-Tof) 질량 분석계로 정량화에 사용된다 [11]. 이 방법을 위해서, LC/MS 분석 중에 낮은 충돌 에너지 및 높아진 충돌 에너지의 교번적 스캔이 단일 실험에서 단백질 정체성 및 양 둘 다를 얻기 위해 사용된다. 정량화는 실험 데이터를 기반으로 하며 어떤 주어진 단백질에 대해서도 세 개의 가장 강한 트립신 펩타이드의 LC/MSE에 의해 측정된 평균 신호 강도가, 단백질 타입 및 크기에 상관없이, 주어진 농도에서 일정하다는 것을 나타낸다. 신호 강도는 농도에 비례하기 때문에, 혼합물에서 어떤 단백질의 양도 추정될 수 있다.
배양 숙주
인플루엔자 바이러스는 전형적으로 세포주를 사용하여 생산되지만, 1차 세포가 대안으로 사용될 수도 있다. 세포는 전형적으로 포유동물이지만, 조류 또는 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 세포는 인간, 햄스터, 소, 영장류 및 개 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포는 인간 비-신장 세포 또는 비-인간 세포이다. 다양한 세포들, 예를 들어, 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포, 등이 사용될 수도 있다. 적합한 햄스터 세포의 예는 명칭 BHK21 또는 HKCC를 가진 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는, 예를 들어, 아프리가 녹색 원숭이(African green monkey) 세포, 예를 들어, Vero 세포주에서와 같은 신장 세포이다 [14-16]. 적합한 개 세포는, 예를 들어, CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같은 신장 세포이다. 적합한 조류 세포는 닭 배아 줄기 세포로부터 유래된 EBx 세포주, EB45, EB14, 및 EB14-074를 포함한다.
추가의 적합한 세포는 CHO; MRC 5; PER.C6 [18]; FRhL2; WI-38; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 세포는, 예를 들어, American Type Cell Culture (ATCC) 컬렉션 [19], Coriell Cell Repositories [20], 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)로부터 널리 이용 가능하다. 예를 들어, ATCC는 제품 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에 다양한 다른 Vero 세포를 공급하고, 그것은 제품 번호 CCL 34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 이용 가능하다.
본 발명에서 사용에 바람직한 세포는 MDCK 세포이며 [21-23], Madin Darby 개 신장으로부터 유래된다. 원래의 MDCK 세포는 CCL 34로서 ATCC로부터 이용 가능하다. 이 또는 다른 MDCK 세포의 유도체가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 유도체는, 예를 들어, 현택 배양으로 성장에 적응된 MDCK 세포 ('MDCK 33016' 또는 '33016-PF', DSM ACC 2219로 기탁됨)를 개시하는 참고문헌 21에서 설명되었다. 게다가, 참고문헌 24는 혈청 없는 배양에서 현탁 배양으로 성장하는 MDCK-유래 세포 ('B-702', FERM BP-7449로 기탁됨)를 개시한다. 일부 구체예에서, 사용된 MDCK 세포주는 종양 형성성일 수도 있지만, 비-종양 형성성 MDCK 세포를 사용하는 것 또한 구상되고 있다. 예를 들어, 참고문헌 25는 'MDCK-S'S (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503)을 포함하는 비-종양 형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 26은 감염에 대하여 높은 민감도를 갖는 MDCK 세포를 개시하며, 'MDCK.5F1 ' 세포 (ATCC CRL 12042)를 포함한다.
본 발명의 방법에서 하나 이상의 세포 타입의 혼합물을 사용하는 것이 가능하지만, 단일 세포 타입을 사용하는 것, 예를 들어, 단클론성 세포의 사용이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용된 세포는 바람직하게는 인간에게 투여에 사용될 수 있는 인플루엔자 백신을 생산하는데 적합한 세포이다. 이러한 세포는 백신 제조에 대하여 승인되고 국립 규제 기관에 등록된 세포 은행 시스템으로부터 유래되어야 하고, 백신 생산이 허용된 최대 계대배양 횟수 내에 있어야 한다 (요약을 위해 참고문헌 27 참조). 백신 제조에 대하여 승인된 적합한 세포의 예는 MDCK 세포 (예를 들어, MDCK 33016; 참고문헌 21 참조), CHO 세포, Vero 세포, 및 PER.C6 세포를 포함한다. 본 발명의 방법은 바람직하게 293T 세포를 사용하지 않는데 이 세포들이 백신 제조에 대하여 승인되지 않았기 때문이다.
바람직하게, 바이러스 제조 및 백신 제조에 사용된 세포는 같은 세포 타입이다. 예를 들어, 세포는 둘 다 MDCK, Vero 또는 PerC6 세포일 수도 있다. 이는 그것이 단지 단일 세포주에 대해서만 얻어져야 하는 승인 요구로서 규제 승인을 용이하게 하기 때문에 바람직하다. 경쟁 배양 선택압 또는 다른 세포 배양 조건이 방지될 수 있다는 것은 또한 추가의 유리함을 갖는다. 본 발명의 방법은 또한, 예를 들어, MDCK 33016에 걸쳐 같은 세포주를 사용할 수도 있다.
인플루엔자 바이러스는 또한 계란에서 증식될 수도 있다. 백신용 인플루엔자 바이러스 성장을 위한 현재의 표준 방법은 배아화된(embryonated) SPF 암탉 계란을 사용하며, 바이러스는 계란 내용물 (요막액)으로부터 정제된다. 또한 계란을 통해 바이러스를 계대배양하고 나중에 세포 배양으로 그것을 증식시키는 것 및 그 반대도 가능하다.
바이러스 제조
본 발명은 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공하며, (a) 상기 논의된 방법에 의해 백신 생산에 대한 인플루엔자 A 바이러스의 적합성을 테스트하는 단계; (b) 배양 숙주를 단계 (a)의 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 숙주를 배양하여 추가의 바이러스를 생산하는 단계; 및, 선택적으로 (d) 단계 (c)에서 얻어진 바이러스를 정제하는 단계를 포함한다.
배양 숙주는 세포 또는 배아화된 암탉 계란일 수도 있으며, 상기 단락에서 논의된 바와 같다. 세포가 본 발명의 이 양태에서 배양 숙주로서 사용된 경우, 세포 배양 조건 (예를 들어, 온도, 세포 밀도, pH 값, 등)은 이용된 세포주 및 바이러스를 대상으로 하는 넓은 범위에 걸쳐 가변적이고 본원의 요구사항에 적용될 수 있다. 그러므로 하기 정보는 단지 가이드라인을 제공할 뿐이다.
바람직하게, 세포는 오염물질의 공통 공급원을 방지하기 위해 혈청의 부재 하에 배양된다. 진핵세포 배양을 위한 다양한 무혈청 배지, 예를 들어, 이스코브 배지(Iscove's medium), 울트라 CHO 배지 (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)은 당업자에게 알려져 있다. 게다가, 무단백질 배지, 예를 들어, PF-CHO (JRH Biosciences)가 사용될 수도 있다. 그렇지 않으면, 복제용 세포는 또한 관례적인 혈청-함유 배지 (예를 들어, 0.5% 내지 10%의 태아 소 혈청이 들어있는 MEM 또는 DMEM 배지)에서 배양될 수 있다.
세포의 증식은 업계에서 당업자에게 공지되어 있는 방법에 따라 실행될 수 있다. 예를 들어, 이 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 일상적인 지원 방법을 사용하는 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 더욱이, 세포는 본 발명에 따라 감염 전에 유가 배양 시스템(fed-batch)에서 증식될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 배양 시스템은 세포는 초기에는 배취 시스템에서 배양되고 배지의 영양소 (또는 영양소의 일부) 고갈은 농축된 영양소의 제어된 피딩(feeding)에 의해 보충되는 유가 배양 시스템으로 불린다. 감염 전 세포의 증식 중에 배지의 pH 값을 pH 6.6 내지 pH 7.8의 값 및 특히 pH 7.2 내지 pH 7.3의 값으로 조정하는 것이 유리할 수 있다. 세포의 배양은 바람직하게 30 내지 40℃의 온도에서 일어난다. 감염된 세포를 배양할 때 (단계 c), 세포는 바람직하게 30℃ 내지 36℃ 또는 32℃ 내지 34℃의 온도에서 또는 33℃에서 배양된다. 이는 특히 바람직한데, 이 온도 범위에서 감염된 세포의 배양액이 백신으로 제형화될 때 그것이 개선된 효험을 발생시키는 바이러스의 생산을 초래하는 것으로 나타났기 때문이다 [28].
산소 부분압은 감염 전 배양 중에 바람직하게 25% 내지 95%의 값 및 특히 35% 내지 60%의 값으로 조정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 진술된 산소 부분압에 대한 값은 공기의 포화도에 기초한다. 세포의 감염은 배취 시스템에서는 바람직하게 약 8-25x105 세포/mL 또는 관류 시스템에서는 바람직하게 약 5-20x106 세포/mL의 세포 밀도에서 발생한다. 세포는 10-8 내지 10, 바람직하게 0.0001 내지 0.5의 바이러스 용량 (MOI 값, "감염 다중도"; 감염 시 세포 당 바이러스 유닛의 수에 해당함)으로 감염될 수 있다.
바이러스는 부착 배양 또는 현탁 배양으로 세포에서 키워질 수도 있다. 미립담체 배양법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 따라서 세포는 현택 배양에서의 성장에 적응될 수도 있다.
본 발명에 따르는 방법은 또한 그것들에 의해 생성된 바이러스 또는 단백질의 수득 및 분리를 포함한다. 바이러스 또는 단백질의 분리 중에, 세포는 분리, 여과 또는 한외 여과와 같은 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 분리된다. 바이러스 또는 단백질은 이어서 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피, 등과 같이 당업자에게 충분히 공지된 방법에 따라 농축되고, 이어서 정제된다. 또한 바이러스는 정제 중에 또는 후에 비활성화되는 것이 본 발명에 따라 바람직하다. 바이러스 비활성화는 정제 공정 내 어떤 시점에서도, 예를 들어, β-프로피오락톤 또는 포름알데하이드에 의해 일어날 수 있다.
백신
인플루엔자 백신은 일반적으로 생 바이러스 또는 비활성화된 바이러스를 기반으로 한다. 비활성화된 백신은 본 발명에서 바람직하며, 이것들은 전체 비리온, '분할' 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 기반으로 할 수도 있다. 항원은 또한 비로솜의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명은 이 타입의 백신 중 어떤 것의 제조에도 사용될 수 있다. 그것은 인플루엔자 백신의 제조에 특히 적합하지만, 이것은 일반적으로 핵단백질을 포함한다. 이러한 인플루엔자 백신은 생 바이러스, 전체 비리온 또는 분할 비리온 인플루엔자 백신을 포함한다. 본 발명에 의해 포함된 백신은 하나 이상의 공정/제조 단계 중에 핵단백질이 존재하는 것이며, 그러므로 생각건대 단계가 특정 MHC 등급 II 수용체 서브타입으로 NP의 결합을 감소시키거나 방지하기 위해 수행되지 않으면 민감한 개체에서 자가면역 반응의 위험을 증가시킬 수 있는 최종 백신 조성물에서 핵단백질을 함유할 수 있다.
본 발명의 첫 번째 양태에서, 본 발명의 백신은 인플루엔자 A NP 단백질을 가지며, NP 단백질 (또는 그것들의 단편)은 균주 X-179A의 NP 단백질 (또는 그러므로 단편, 예를 들어, 서열 번호: 2에서 나타난 서열의 아미노산 106 또는 108 내지 118 또는 120 또는 126으로 구성되거나 이것들을 포함하는 단편)보다 HLA DQB1*0602에 대하여 더 낮은 결합 친화도를 갖는다. 다른 방식으로 발현되면, 이러한 백신의 NP 단백질은 균주 X-179A의 NP 단백질 (또는 그러므로 단편, 예를 들어, 서열 번호: 2에서 나타난 서열의 아미노산 106 또는 108 내지 118 또는 120 또는 126으로 구성되거나 이것들을 포함하는 단편)과 같거나 더 높은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하는 영역이 없다.
본 발명의 두 번째 양태에서, 본 발명의 백신은 서열 번호:2의 아미노산 잔기 116에 해당하는 위치에서 이소류신이 없는 인플루엔자 A NP 단백질을 갖는다. 예를 들어, 백신 조성물에 존재하는 인플루엔자 A NP 단백질
상기 논의된 바와 같이, 의도가 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 뚜렷한 결합을 나타낼 수 있는 NP의 존재를 방지하는 것이기 때문에, 비활성화된 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원 (인플루엔자에 대한, 헤마글루티닌 포함 및, 보통은 뉴라미니다제 또한 포함)을 포함할 수도 있는 것은 분명할 것이다. 바이러스를 비활성화시키는 화학적 수단은 하기 약제 중 하나 이상의 유효량의 투여를 포함한다: 세제, 포름알데하이드, β-프로피오락톤 (BPL), 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시퓰러렌 (C60), 2원 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이것들의 조합. 바이러스 비활성화의 비-화학적 방법, 예를 들어, UV 광 또는 감마선이 업계에 공지되어 있다. 또한 다른 방법들의 조합을 사용하여 인플루엔자 바이러스를 비활성화시키는 것이 가능하다. 예를 들어, BPL 및 UV 선의 조합이 유용하다.
지금까지 기면증 사례는 Pandemrix™ (하기 참조)의 Dresden 항원으로 백신 접종된 대상체의 배경 발생률보다 더 높은 비율로만 검출되어 왔다. Dresden 항원은 Triton 및 Tween을 함유한다. 수중유 에멀젼 보조제를 함유하는 독감 백신, 및 Tween 및 Triton X-100 세제를 함유하는 항원으로부터 유래된 기면증의 위험을 감소시키기 위해서, 두 가지 방법이 생각된다: (i) 서브유닛 백신에서와 같이, NP가 없거나 또는 실질적으로 감소된 양의 NP를 가진 항원 구성요소의 사용, 또는 (ii) HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 NP, 또는 이것의 단편을 함유하지 않는 백신 생산을 위한 종자 바이러스의 사용.
따라서, 본 발명의 한 양태는 인플루엔자 A NP 단백질을 함유하지 않거나, 또는 백신에서 총 인플루엔자 바이러스 단백질의 질량으로 15% 미만, 예를 들어, <12%, <10%, <8%, <7%, <6%, <5%, <4%, <3%, <2%, 또는 <1%을 함유하는 수중유 보조된, 비활성화된 인플루엔자 백신이다. 한 구체예에서 보조제는 추가적인 면역강화제 토코페롤, GLA 또는 TLR 작용제를 함유한다. 바람직한 구체예에서 보조제는 AS03이다. 한 구체예에서 바이러스는 포름알데하이드 비활성화된다. 한 구체예에서, 백신은 티메로살을 함유한다. 바람직한 구체예에서 백신의 항원 구성요소는 세제, 특히 Tween 80 및/또는 Triton x-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 함유한다. 바람직하게 Triton X-100과 HA 사이의 중량/부피 비율은 1.5 내지 15이다. 바람직하게 Triton-100™ 농도는 10 내지 500μg/ml이다. 특정 바람직한 구체예에서, 백신은 AS03으로 보조된 정제된 서브유닛 백신이다. 백신의 항원 및 보조제 구성요소는 미리 혼합될 수도 있거나 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 수중유 보조제와 함께, 특히 AS03과 함께 제형화되는 상기 명시된 항원 구성요소의 사용이다.
본 발명의 또 다른 양태는 NP 단백질을 함유하지만, HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는 NP 단백질 또는 NP 단편을 함유하지 않는, AS03 보조된, 비활성화된, 분할 인플루엔자 A 백신이다. 이것은 Foecetria (X-181)에서 사용된 것과 유사하지만, Pandemrix™의 것과는 다른 백본이 사용되면 달성될 수 있다. 바람직한 구체예에서 백신은 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주, 특정 바람직한 구체예에서는 유행성 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주에 대한 것이다. 한 구체예에서, 바이러스는 포름알데하이드 비활성화된다. 한 구체예에서 백신은 티메로살을 함유한다; 대안의 구체예에서 그것은 보존제가 없다. 백신의 항원 구성요소는 세제, 특히 Tween 80 및/또는 Triton x-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 함유한다. 바람직하게 Triton X-100과 HA의 중량/부피 비율은 1.5 내지 15이다. 바람직하게 Triton-100™ 농도는 10 내지 500μg/ml이다. 백신은 유사하거나 동일한 농도로 WO2011/051235의 표에서 나타난 부형제 (하기 참조)를 함유할 수도 있다. 본 발명의 항원 및 보조제 구성요소는 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 수중유 보조제와 함께, 특히 AS03과 함께 제형화되는 상기 명시된 항원 구성요소의 사용이다.
본 발명의 또 다른 양태는 균주 X- 179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합하는 NP 단백질을 함유하는, AS03 보조된, 비활성화된, 분할 인플루엔자 A 백신이다. 바람직한 구체예에서 백신은 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주, 특정 바람직한 구체예에서 유행성 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주에 대한 것이다. 백신의 항원 구성요소는 세제, 특히 Tween 80 및/또는 Triton X-100을 함유한다. 백신은 유사하거나 동일한 농도로 WO2011/051235의 표에서 나타난 부형제 (하기 참조)를 함유할 수도 있다. 백신의 항원 및 보조제 구성요소는 미리 혼합될 수도 있거나 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 수중유 보조제와 함께, 특히 AS03과 함께 제형화되는 상기 명시된 항원 구성요소의 사용이다.
본 발명의 또 다른 양태는 NP 단백질을 함유하지만 서열 번호: 2의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 함유하지 않는, AS03 보조된, 비활성화된, 분할 인플루엔자 A 백신이다 (도 1 참조). 바람직한 구체예에서 백신은 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주, 특히 바람직한 구체예에서 유행병 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주에 대한 것이다. 백신의 항원 구성요소는 세제, 특히 Tween 80 및/또는 Triton X-100을 함유한다. 백신은 비슷하거나 동일한 농도로 WO2011/051235의 표에서 나타난 부형제 (하기 참조)를 함유할 수도 있다. 백신의 항원 및 보조제 구성요소 미리 혼합될 수도 있거나 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 수중유 보조제와 함께, 특히 AS03과 함께 제형화되는 상기 명시된 항원 구성요소의 사용이다.
본 발명의 또 다른 양태는 NP 단백질을 함유하지만 서열 LXLYXXXIXXXXXX (서열 번호: 9)를 함유하지 않는, AS03 보조된, 비활성화된, 분할 인플루엔자 A 백신이며, X는 어떤 아미노산도 된다. 바람직한 구체예에서 백신은 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주, 특히 바람직한 구체예에서 유행병 H1, H3, H5, H7 또는 H9 균주에 대한 것이다. 백신은 유사하거나 동일한 농도로 WO2011/051235의 표에서 나타난 부형제 (하기 참조)를 함유할 수도 있다. 백신의 항원 및 보조제 구성요소 미리 혼합될 수도 있거나 투여 전에 최종 사용자/의료 제공자에 의한 혼합을 위해 별도의 용기에 있을 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 수중유 보조제와 함께, 특히 AS03과 함께 제형화되는 상기 명시된 항원 구성요소의 사용이다.
비리온은 다양한 방법에 의해 바이러스-함유 유동체, 예를 들어, 요막액 또는 세포 배양 상층액으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제 공정은 비리온을 분열시키기 위해 세제를 포함하는 선형 수크로스 구배 용액을 사용하는 띠 원심분리를 수반할 수도 있다. 항원은 선택적 희석 후, 이어서 정용 여과에 의해 정제될 수도 있다.
분할 비리온은 서브비리온 조제물을 생산하기 위해 정제된 비리온에 세제 (예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9, 등)를 처리함으로써 얻어지며, 'Tween-에테르' 분할 공정을 포함한다.
인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법은 예를 들어, 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 참고문헌 29-34, 등 참고하면 된다. 바이러스의 분할은 전형적으로 분할제의 분열 농도로 감염성 또는 비-감염성인지 여부에 상관없이, 전체 바이러스를 방해하거나 단편화함으로써 수행된다. 분열은 바이러스의 완전한 또는 부분적 가용화를 일으키며, 바이러스의 온전함을 변화시킨다. 바람직한 분할제는 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, Hecameg, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사코실, CTAB (세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, Cetavlon, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton 계면활성제, 예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 (Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스터, 등이다. 한 유용한 분할 과정은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데하이드의 연속적인 효과를 사용하고, 분할은 초기 비리온 정제 중에 일어날 수 있다 (예를 들어, 수크로스 밀도 구배 용액에서). 따라서 분할 공정은 비리온-함유 물질의 정화 (비-비리온 물질을 제거하기 위해), 수득된 비리온의 농축 (예를 들어, 흡착 방법, 예를 들어, CaHP04 흡착을 사용하여), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 사용하여 비리온의 분할 (예를 들어, 나트륨 데옥시콜레이트와 같은 분할제를 함유하는 수크로스 구배를 사용하여), 및 이어서 원하지 않는 물질을 제거하기 위한 여과 (예를 들어, 한외 여과)를 수반할 수 있다. 분할 비리온은 유용하게 나트륨 포스페이트-완충된 등장성 나트륨 클로라이드 용액에서 재현탁될 수 있다. 분할 인플루엔자 백신의 예는 BEGRIVAC™, FLUAPJX™, 플루존™ 및 FLUSHIELD™ 제품이다.
정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 (당단백질) 백신은 표면 항원 헤마글루티닌 및, 전형적으로, 또한 뉴라미니다제를 포함한다. 정제된 형태로 이 단백질들을 제조하는 공정은 업계에 잘 공지되어 있다. 플루비린™, AGRIPPAL™ 및 인플루박™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다. 정제된 표면 당단백질 백신은 그것들이 훨씬 더 낮은 수준의 NP 단백질을 포함하기 때문에 분할 백신에 비해 특히 유리할 수 있다.
비활성화된 항원의 또 다른 형태는 비로솜 (핵산이 없는 바이러스-유사 리포솜 입자)이다 [35]. 비로솜은 세제로 바이러스의 가용화에 이은 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 막의 재구성에 의해 제조될 수 있다. 비로솜을 제조하는 대안의 방법은 막에서 바이러스 단백질을 가진 리포솜을 제공하기 위해 바이러스 막 당단백질을 과도한 양의 인지질에 추가하는 단계를 수반한다.
본 발명의 방법은 또한 생 백신을 생산하는데 사용될 수도 있다. 이러한 백신은 보통 비리온-함유 유동체로부터 비리온을 정제함으로써 제조된다. 예를 들어, 유동체는 원심분리에 의해 정화될 수도 있고, 버퍼 (예를 들어, 수크로스, 칼륨 포스페이트, 및 모노나트륨 글루타메이트 함유)로 안정화될 수도 있다. 다양한 형태의 생 약독화된 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 이용 가능하다 (예를 들어, 참고문헌 36의 17 & 18장 참조). 생 백신은 FLUMIST™ 제품을 포함한다.
본 발명이 생 백신과 관련된 경우, 조성물에서 특정 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질의 존재 또는 부재에 대한 지시대상은 또한 백신 내에서 균주에 의해 암호화된 핵단백질, 뿐만 아니라 백신 자체의 핵단백질에 적용될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 균주는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 118과 동등한 단편이 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하는 핵단백질을 암호화할 수도 있다. X-179A와 유사하게, A/Ann Arbor/6/60 백본은 위치 116에서 이소류신을 갖고 (AY210074 참조), 그래서 본 발명의 유용한 생 백신은 위치 116에서 이소류신 이외의 잔기, 예를 들어, 메티오닌을 가진 암호화하는 인플루엔자 A 바이러스 균주를 포함한다. 바이러스는 약독화될 수도 있다. 바이러스는 온도-민감성일 수도 있다. 바이러스는 저온-적응될 수도 있다. 이 세 가지 특징은 항원으로서 생 바이러스를 사용할 때 특히 유용하다.
HA는 비활성화된 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신 용량은 전형적으로 SRID에 의해 측정된 HA 수준을 참조하여 표준화된다. 기존의 백신은 전형적으로 균주 당 약 15μg의 HA를 함유하지만, 예를 들어, 아동에게, 또는 유행병 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때는 더 적은 용량이 사용될 수 있다. ½ (즉, 균주 당 7.5μg HA), ¼ 및 ⅛과 같은 단편적인 용량이 사용됨에 따라, 더 높은 용량 (예를 들어, 3x 또는 9x 용량 [37,38])이 사용되었다. 따라서, 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150μg HA, 바람직하게 0.1 내지 50μg, 예를 들어, 0.1-20μg, 0.1-15μg, 0.1-10μg, 0.1-7μg, 0.5-5μg, 등을 포함할 수도 있다. 특정 용량은, 예를 들어, 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 백신은 <30μg/ml의 농도로 HA를 포함한다. 그것은 또한 단위 용량 당 <10μg, 단위 용량 당 7μg; 단위 용량 당 <5μg; 또는 단위 용량 당 3.75μg의 농도로 HA를 포함할 수도 있다.
생 백신에 대하여, 투여량은 HA 함량 대신에 중간 조직 배양 감염 용량 (TCID50)에 의해 측정되고, 균주 당 106 내지 108 (바람직하게 106.5-107. 5)의 TCID50이 전형적이다.
본 발명과 함께 사용된 인플루엔자 균주는 야생형 바이러스에서 발견된 천연 HA, 또는 변형된 HA를 가질 수도 있다. 예를 들어, 그것은 조류 종에서 바이러스를 고도로 병원성이 되게 하는 결정요인 (예를 들어, HA1/HA2 분열 부위 주위의 초염기성 영역)을 제거하도록 HA를 변형시키는 것으로 공지되어 있다. 역 유전학의 사용은 이러한 변형을 용이하게 한다.
본 발명의 조성물은 유행기 기간 균주에 대하여 면역화하는데 적합할 뿐만 아니라, 유행성 또는 잠재적-유행성 균주에 대하여 면역화하는데 특히 유용하다. 본 발명은 인간, 뿐만 아니라 비-인간 동물을 백신 접종하는데 적합하다.
항원이 유용하게 조성물에 포함될 수 있는 다른 균주는 항바이러스 요법에 대하여 저항성 (예를 들어, 오셀타미비르 [39] 및/또는 자나미비르에 대하여 저항성)인 균주이며, 저항성 유행성 균주를 포함한다 [40].
본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 균주의 항원(들)을 포함할 수도 있다. 백신이 인플루엔자의 하나 이상의 균주를 포함하는 경우, 다른 균주는 전형적으로 별도로 성장되고 바이러스가 수득된 후 혼합되었고 항원이 제조되었다. 따라서 본 발명의 공정은 하나 이상의 인플루엔자 균주의 항원을 혼합하는 단계를 포함할 수도 있다. 3가 백신이 전형적이며, 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함한다. 4가 백신이 또한 유용하며 [41], 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원, 또는 세 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함한다.
인플루엔자 백신은 계절성 인플루엔자 균주들만의 항원을 가질 수도 있거나, 단 하나의 유행성 균주의 항원 (1가)을 가질 수도 있다. 따라서 백신 조성물은 단 하나의 A 균주를 가진 1가 유행성일 수도 있다. 그것은 또한 계절성 및 유행성 인플루엔자 균주 둘 다의 항원을 가질 수도 있다. 예를 들어, 백신은 계절성 인플루엔자 균주 (예를 들어, 두 가지 A 및 한 가지 B 균주) 및 유행성 인플루엔자 균주의 항원을 포함하는 4가 백신일 수도 있다. 3가 계절성 인플루엔자 백신은 또한 1가 유행성 인플루엔자 백신과 동시-투여될 수도 있다.
한 바람직한 구체예에서 백신은 4가지 이상의 인플루엔자 바이러스 균주의 항원을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서 백신은 2개의 A 및 2개의 B 균주, 예를 들어 (i) A/H1N1 균주; (ii) A/H3N2 균주; (iii) B/Victoria/2/87-유사 균주; 및(iv) B/Yamagata/16/88-유사 균주를 함유한다. 또 다른 특히 바람직한 구체예에서 균주 중 하나는, 예를 들어, (i) A/H1N1 균주; (ii) A/H3N2 균주; 및 (iii) B 균주와 결합된, H5N1 또는 H7N9 균주와 유사한 유행성 균주이다. 4가 이상의 백신은 보조될 수도 있다.
인플루엔자 A 바이러스는 현재 18개의 HA 서브타입, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18을 나타낸다. 그것은 현재 9개의 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9를 가진다. 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주를 포함하는 백신에서, 이것들은 보통 다른 HA 서브타입 (예를 들어, H1 및 H3) 및 다른 NA 서브타입 (예를 들어, N1 및 N2)의 것일 것이며, 그래서 백신은 예를 들어, H1N1 균주 및 H3N2 균주의 항원을 포함할 수 있다.
인플루엔자 B 바이러스는 현재 다른 HA 서브타입을 드러내지 않지만, 인플루엔자 B 바이러스 균주는 두 개의 별개의 계통으로 나누어진다. 이 계통들은 1980년대 후반에 등장하였고 서로 항원과 관련하여 및/또는 유전적으로 구별될 수 있는 HA를 갖고 있다 [42]. 본 발명의 백신이 두 가지 인플루엔자 B 균주의 항원을 포함하는 경우, 이것들은 보통 하나의 B/Victoria/2/87-유사 균주 및 하나의 B/Yamagata/16/88-유사 균주일 것이다. 이 균주들은 보통 항원에 관련하여 구별되지만, 두 가지 계통을 구별하기 위한 아미노산 서열의 차이가 또한 설명되는데, 예를 들어, B/Yamagata/16/88-유사 균주는 종종 (항상은 그런 것은 아님) 'Lee40' HA 서열에 관하여 넘버링된 아미노산 잔기 164에서 결실을 가진 HA 단백질을 갖는다 [43].
약학적 조성물
본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능하다. 그것들은 보통 항원 이외의 구성요소를 포함하는데, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함한다. 하기 설명된 바와 같이, 보조제가 또한 포함될 수도 있다. 이러한 구성요소의 철저한 논의는 참고문헌 44에서 이용 가능하다.
백신 조성물은 일반적으로 수성 형태로 되어 있을 것이다. 하지만, 일부 백신은 패치 상에서 건조 형태, 예를 들어, 주사 가능한 고체 또는 건조된 또는 폴리머화된 조제물의 형태로 되어 있을 수도 있다.
백신 조성물은 티오머살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수도 있다. 하지만, 백신은 수은 물질이 실질적으로 없는 (즉, 5μg/ml 미만), 예를 들어, 티오머살이 없는 것이 바람직하다 [33,45]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물에 대한 대안으로서 포함될 수 있다 [33]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.
장성을 제어하기 위해, 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직한데, 예를 들어, 나트륨 염, 나트륨 클로라이드 (NaCl)가 바람직하며, 이것은 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수도 있다. 존재할 수도 있는 다른 염은 칼륨 클로라이드, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, 디나트륨 포스페이트 디하이드레이트, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 등을 포함한다.
백신 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 및 400 mOsm/kg, 바람직하게 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위 내에 있을 것이다. 삼투압은 백신 접종에 의해 유발된 통증에 대하여 영향이 없는 것으로 보고되었지만 [46], 그럼에도 불구하고 이 범위 내에서 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.
백신 조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수도 있다. 전형적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; 트리스(Tris) 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼 (특히 알루미늄 하이드록사이드 보조제와 함께); 또는 시트레이트 버퍼를 포함한다. 버퍼는 전형적으로 5-20mM 범위에 포함될 것이다.
백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로 6.0 내지 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 그러므로 본 발명의 공정은 포장 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함한다.
백신 조성물은 바람직하게 멸균된다. 백신 조성물은 바람직하게 바람직하게 비-발열원성이고, 예를 들어, 용량 당 <1 EU (내독소 유닛, 표준 측정값), 및 바람직하게 용량 당 <0.1 EU를 함유한다. 백신 조성물은 바람직하게 글루텐이 없다.
본 발명의 백신 조성물은 세제, 예를 들어, 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대하여 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 ('Tween'으로 알려져 있음), 옥톡시놀 (예를 들어, 옥톡시놀-9 (Triton X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수도 있다. 세제는 미량으로만 존재할 수도 있다. 따라서 백신은 각각 1 mg/ml 미만의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수도 있다. 미량 중 다른 잔류 구성요소는 항생제 (예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다.
백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수도 있거나, 다중 면역화를 위한 물질을 포함할 수도 있다 (즉, '다회수 용량' 키트). 보존제의 포함은 다회수 용량 방식에서 바람직하다. 다회수 용량 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서 (또는 이에 더하여), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터(adaptor)를 가진 용기에 함유될 수도 있다.
인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5 ml의 투약 부피(단위 용량)로 투여되지만, 아동에게는 절반 용량 (즉, 약 0.25 ml)이 투여될 수도 있다.
조성물 및 키트는 바람직하게 2℃ 내지 8℃에서 저장된다. 그것들은 얼지 않아야 한다. 그것들은 이상적으로는 직사광선을 피해서 보관해야 한다.
숙주 세포 DNA
바이러스가 세포주에서 분리되고 및/또는 성장되는 경우, DNA의 어떤 잠재적인 종양 형성 활성도 최소화하기 위해서 최종 백신에서 잔류 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 방식이다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 바람직하게 용량 당 10ng 미만 (바람직하게 1ng 미만, 및 더 바람직하게 100pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하지만, 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수도 있다.
어떤 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이도 500bp 미만, 예를 들어, 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100bp 미만, 등이다.
오염성 DNA는 표준 정제 과정, 예를 들어, 크로마토그래피, 등을 사용하여 백신 제조 중에 제거될 수 있다. 잔규 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예를 들어, DNase를 사용함으로써 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위해 편리한 방법은 참고문헌 47 & 48에서 개시되며, 2-단계 처리를 수반하는데, 먼저 바이러스 성장 중에 사용될 수도 있는 DNase (예를 들어, 벤조나제)에 이어서, 비리온 분열 중에 사용될 수도 있는 양이온성 세제 (예를 들어, CTAB)를 사용한다. 알킬화제, 예를 들어, β-프로피오락톤의 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하는데 사용될 수 있고, 또한 유리하게 비리온을 비활성화시키는데 사용될 수도 있다 [49]. DNase 또는 알킬화제가 DNA 제거에 사용되는 경우, DNase 또는 알킬화제 (바람직하게 BPL)는 또한 생산 공정 중에 한 번 이상 (예를 들어, 두 번) 추가될 수도 있다. DNA 제거는 또한 DNase 및 알킬화제의 조합을 사용하여 달성될 수도 있다.
보조제
본 발명의 조성물은 유리하게 보조제를 포함할 수도 있으며, 이것은 조성물을 받는 대상체에서 유도된 면역 반응 (체액성 및/또는 세포성)을 향상시키는 기능을 할 수 있다. 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼을 포함한다. 다양한 이러한 보조제가 공지되어 있고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생분해성 (대사성) 및 생체 적합성이다. 에멀젼에서 오일 방울은 일반적으로 지름이 5μm 미만이고, 이상적으로 1마이크론 미만의 지름을 가지며, 이 작은 크기는 안정한 에멀젼을 제공하기 위해 미세유동화기에 의해 달성된다. 220 nm 미만의 크기를 가진 방울은 그것들이 여과 멸균을 받을 수 있기 때문에 바람직하다.
에멀젼은 오일, 예를 들어, 동물성 (예를 들어, 물고기) 또는 식물성 공급원의 것들을 포함할 수 있다. 식물성 오일에 대한 공급원은 견과류, 종자 및 곡물을 포함한다. 가장 흔히 이용 가능한 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일이 견과류 오일을 예시한다. 예를 들어, 호호바(jojoba) 콩으로부터 얻어진 호호바 오일(Jojoba oil)도 이용될 수 있다. 종자 오일은 홍화유, 면실유, 해바라기씨 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 곡물 군에서, 옥수수 오일은 가장 쉽게 이용 가능하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프(teff), 라이밀(triticale) 등과 같은 다른 곡물의 오일이 또한 사용될 수 있다. 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개 탄소 지방산 에스터는 종자 오일에서 자연적으로 발생하지 않는 한편, 견과류 및 종자 오일에서 시작하는 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스터화에 의해 제조될 수도 있다. 포유동물 우유의 지방 및 오일은 대사 가능하며 그러므로 본 발명의 실행에 사용될 수도 있다. 분리, 정제, 사포닌화 과정 및 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 얻는데 필요한 다른 수단은 업계에 잘 공지되어 있다. 대부분의 물고기는 쉽게 회수될 수도 있는 대사 가능 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간 오일, 상어 간 오일, 및 경랍과 같은 고래 오일은 본원에서 사용될 수도 있는 여러 물고기 오일을 예시한다. 많은 분지형 사슬 오일은 5-탄소 이소프렌 유닛에서 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드로 불린다. 상어 간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로 알려져 있는, 분지형, 불포화 테르페노이드를 함유하는데, 이것은 본원에서 특히 바람직하다. 스쿠알란, 스쿠알렌에 대한 포화 유사체는 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 물고기 오일은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능하거나 업계에 공지된 방법에 의해 얻어질 수도 있다.
일부 구체예를 위한 또 다른 바람직한 오일은 α-토코페롤이다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤 둘 다가 사용될 수 있고, 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이다. 토코페롤은 여러 형태, 예를 들어, 다른 염 및/또는 이소머를 취할 수 있다. 염은 유기 염, 예를 들어, 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트, 등을 포함한다. 이 토코페롤의 염이 사용되어야 하면, 바람직한 염은 숙시네이트이다. 스쿠알렌 및 토코페롤 (예를 들어, DL-α-토코페롤)을 포함하는 오일 조합이 사용될 수 있으며, AS03 보조제에서 보여지는 바와 같다. 하지만, 상기 설명된 바와 같이, 일부 구체예에서 에멀젼은 어떤 추가적인 면역자극제도 포함하지 않으며, 이 경우에 에멀젼은 α-토코페롤을 포함하지 않는다.
스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼, 예를 들어, MF59 또는 AS03 (또는 토코페롤이 없는 변형된 AS03)이 본 발명과 함께 사용을 위해 가장 바람직한 보조제이다. 따라서 바람직한 에멀젼은 본질적으로 (i) 물 또는 버퍼, (ii) 스쿠알렌, 및 (iii) 폴리소르베이트 80 및/또는 소르비탄 트리올레에이트로 구성될 수 있다.
오일의 혼합물이 사용될 수 있다.
계면활성제는 그것들의 'HLB' (친수성기/친유성기 균형)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게 적어도 15, 및 더 바람직하게 적어도 15, 및 더 바람직하게 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 (보통 Tween으로 불림), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥시드 (ED), 프로필렌 옥시드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 코폴리머, DOWFAX™ 상표명 하에 판매됨, 예를 들어, 선형 EO/PO 차단 코폴리머; 옥톡시놀, 이것은 반복하는 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 다를 수 있으며, 옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 바람직하다; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들어, 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예를 들어, Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로 부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제로 알려져 있음), 예를 들어, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30); 및 소르비탄 에스터 (보통 SPAN으로 알려져 있음), 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), Span 85 (소르비탄 트리올레에이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.
계면활성제의 혼합물, 예를 들어, Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80) 및 옥톡시놀, 예를 들어, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100)의 조합이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 라우레쓰 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
계면활성제의 바람직한 양 (중량%)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 (예를 들어, Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들어, 라우레쓰 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게 0.1 내지 10% 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.
백신이 분할 바이러스를 함유하는 경우, 그것이 수상에 유리 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 이것은 유리 계면활성제가 '분할 효과'를 나타낼 수 있으며, 이로 인해 달리 존재할 수도 있는 어떤 비분할 비리온 및/또는 비리온 집합체도 분열시킬 수 있기 때문에 유리하다. 유리 계면활성제는 존재할 수도 있는 어떤 비분할 비리온의 응집도 더 막을 수 있다. 이는 분할 바이러스 백신의 안전성을 개선할 수 있다 [50].
바람직한 에멀젼은 <1μm, 예를 들어, <750nm, <500nm, <400nm, <300nm, <250nm, <220nm, <200nm, 또는 더 작은 평균 방울 크기를 갖는다. 이 방울 크기는 편의상 미세 유동화와 같은 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 유용한 수중유 에멀젼 보조제는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 1마이크론 미만의 에멀젼. 에멀젼의 조성은 부피 기준으로 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량 측면에서, 이 비율은 4.3%> 스쿠알렌, 0.5%> 폴리소르베이트 80 및 0.48%> Span 85가 된다. 이 보조제는 'MF59'로 알려져 있으며 [51-53], 참고문헌 54의 10장 및 참고문헌 55의 12장에서 더 상세히 설명된다. MF59 에멀젼은 유리하게 시트레이트 이온, 예를 들어, 10mM 나트륨 시트레이트 버퍼를 포함한다.
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충된 식염수를 포함할 수도 있다. 이 에멀젼은 부피 기준으로 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 폴리소르베이트 80을 가질 수도 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게 <1 (예를 들어, 0.90)인데 이는 더 안정한 에멀젼을 제공할 수 있기 때문이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 제공될 수도 있다. 따라서 세 개의 구성요소 (스쿠알렌, 토코페롤, 폴리소르베이트 80)는 1068:1186:485 또는 대략 55:61:25의 중량비로 존재할 수도 있다. 이러한 하나의 에멀젼 ('AS03' [56])은, 예를 들어, 0.5ml 부피에서 용량 당 4.86 mg 폴리소르베이트 80, 10.69 mg 스쿠알렌 및 11.86 mg α-토코페롤 (또는 이것들의 단편, 하지만 질량비를 유지함)을 갖는다. AS03은 PBS에서 Tween 80을 녹여서 2% 용액을 제공하고, 이어서 이 용액 90ml을 (5g DL α 토코페롤 및 5ml 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합하고, 이어서 혼합물을 미세 유동화함으로써 만들어질 수 있다. 결과의 에멀젼은, 예를 들어, 100 내지 250nm, 바람직하게 약 180nm의 평균 지름을 가진 1마이크론 미만의 오일 방울을 가질 수도 있다. 에멀젼은 또한 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3d MPL)를 포함할 수도 있다. 이 타입의 또 다른 유용한 에멀젼은, 예를 들어, 상기 논의된 비율로, 인간 용량 당, 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수도 있다 [57].
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수도 있다 (하기 참조). 에멀젼은 포스페이트 버퍼를 함유할 수도 있다.
● 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 약 75:11:10의 질량비로 이 세 가지 구성요소를 포함할 수도 있고 (예를 들어, 750μg/ml 폴리소르베이트 80, 110μg/ml Triton X-100 및 100μg/ml α-토코페롤 숙시네이트), 이 농도는 항원의 이 구성요소들의 어떤 기여도 포함해야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수도 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수도 있다 (하기 참조). 수상은 포스페이트 버퍼를 함유할 수도 있다.
● 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401의 에멀젼 ("Pluronic™ L121"). 에멀젼은 포스페이트 완충된 식염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩타이드에 대한 유용한 전달 비히클(vehicle)이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다 [58] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 그것은 또한 "AF" 보조제에서와 같이 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다 [59] (5% 스쿠알란, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세 유동화가 바람직하다.
● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스터 또는 만니드 에스터, 예를 들어, 소르비탄 모놀레에이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게 열 가역적이고 및/또는 적어도 90%의 200 nm 미만의 크기를 가진 오일 방울 (부피 기준)을 갖는다 [60]. 에멀젼은 또한 알디톨; 동결방지제 (예를 들어, 당, 예를 들어, 도데실말토시드 및/또는 수크로스); 및/또는 알킬폴리글리코시드 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수도 있다 [61]. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수도 있다.
● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼 [62]. 보조된 백신에서 이 구성요소의 최종 농도 (중량)은 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 (플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프르 트리글리세리드)이다.
● 0.5-50% 오일, 0.1-10% 인지질, 및 0.05-5% 비-이온성 계면활성제를 가진 에멀젼. 참고문헌 63에서 설명된 바와 같이, 바람직한 인지질 구성요소는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카디오리핀이다. 1마이크론 미만의 방울 크기가 유리하다.
● 비-대사 가능 오일 (예를 들어, 백색 미네랄 오일) 및 적어도 하나의 계면활성제 (예를 들어, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 1마이크론 미만의 수중유 에멀젼. 첨가제, 예를 들어, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성기 컨쥬게이트(conjugate) (예를 들어, GPI-0100, 참고문헌 64에서 설명됨, 글루쿠론산의 카르복시 기를 통해 데스아실사포닌으로 지방족 아민의 추가에 의해 생산됨), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수도 있다.
● 사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셸(micelle)로서 연관된 에멀젼 [65].
● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡시화된 지방 알콜, 및 비-이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡시화된 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 차단 코폴리머)를 포함하는 에멀젼 [66].
● 미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡시화된 지방 알콜, 및 비-이온성 친유성 계면활성제 (예를 들어, 에톡시화된 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 차단 코폴리머)를 포함하는 에멀젼 [66].
일부 구체예에서 에멀젼은 전달 시에, 즉석으로 항원과 혼합될 수도 있으며, 따라서 보조제 및 항원은 포장된 또는 분산된 백신으로 별도로 보관될 수도 있으며, 사용 시 최종 제형이 준비된다. 다른 구체예에서 에멀젼은 제조 중에 항원과 혼합되며, 따라서 조성물은 액체 보조된 형태로 포장된다. 항원은 일반적으로 백신이 두 가지 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조되도록 수성 형태로 되어 있을 것이다. 혼합되는 두 가지 액체의 부피비는 다를 수 있지만 (예를 들어, 5:1 내지 1:5) 일반적으로 약 1:1이다. 구성요소의 농도가 특이적 에멀젼의 상기 설명에서 주어지는 경우, 이 농도들은 희석되지 않은 조성물에 대한 것이며, 따라서 항원 용액과 혼합 후 농도가 감소할 것이다.
본 발명의 조성물은 추가적인 면역자극제를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 추가적인 면역자극제는 TLR 작용제, 즉, Toll-유사 수용체를 작용시킬 수 있는 화합물이다. 더 바람직하게, TLR 작용제는 인간 TLR의 작용제이다. TLR 작용제는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR11 중 어떤 것도 활성화시킬 수 있고; 바람직하게 그것은 인간 TLR4 또는 인간 TLR7을 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 TLR 작용제를 포함할 수 있다. 이 두 가지 작용제는 서로 다르며 그것들은 같은 TLR 또는 다른 TLR을 표적으로 할 수 있다.
어떤 특정 Toll-유사 수용체에 대한 화합물의 작용제 활성은 표준 검정에 의해 결정될 수 있다. Imgenex 및 Invivogen과 같은 회사는 TLR 활성화 경로를 측정하기 위해 인간 TLR 유전자 및 NFKB, 플러스 적합한 리포터 유전자로 동시-트랜스펙션된 세포주를 공급한다. 그것들은 민감도, 넓은 동작 범위 역학에 대하여 설계되고 고성능 스크리닝에 사용될 수 있다. 하나 또는 두 개의 특이적 TLR의 구성요소의 발현은 이러한 세포주에서 전형적이다. 많은 TLR 작용제가 업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, US-4,666,886은 TLR2 작용제인 특정 지존 펩타이드 분자를 설명하고, WO2009/118296, WO2008/005555, WO2009/111337 및 WO2009/067081 각각은TLR7의 소분자 작용제 등급을 설명하고, WO2007/040840 및 WO2010/014913은 질환의치료를 위한 TLR7 및 TLR8 작용제를 설명한다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 TLR7 작용제는 벤조나프티리딘, 예를 들어, 식 T1:
Figure pct00001
을 가진 것일 수 있으며
여기에서
R1은 H, C1-C6알킬, -C(R5)2OH, -L1R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, 또는 -OL2R6이고;
L1은 -C(O)- 또는 -0-이고;
L2는 C1-C6알킬렌, C2-C6알케닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-이며, L2의 C1-C6알킬렌 및 C2-C6알케닐렌은 선택적으로 1 내지 4개의 플루오로 기로 치환되고:
각 L3은 독립적으로 C1-C6알킬렌 및 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-로부터 선택되며,
L3의 C1-C6알킬렌은 선택적으로 1 내지 4개의 플루오로 기로 치환되고; L4는 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이고;
R2는 H 또는 C1-C6알킬이고;
R3은 C1-C4알킬, -L3R5, -L1R5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 및 - C(R5)2OH로부터 선택되고
각 R4는 독립적으로 H 및 플루오로로부터 선택되고;
R5는 -P(0)(OR9)2이고,
R6은 -CF2P(0)(OR9)2 또는 -C(0)OR10이고;
R7은 -CF2P(0)(OR9)2 또는 -C(0)OR10이고;
R8은 H 또는 C1-C4알킬이고;
각 R9는 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R10은 H 또는 C1-C4알킬이고;
각 p는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고,
q는 1, 2, 3 또는 4이다.
이 화합물들의 더 상세한 설명은 WO2011/049677에서 개시되고, 본 발명은 그 안에 화합물 1 내지 28 중 어떤 것도 사용할 수 있다. 식 T1의 화합물의 바람직한 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00002
다른 유용한 TLR7 작용제는 WO2009/111337에서 개시된 화합물 1 내지 247 중 어떤 것, 또는 WO2012/031140의 화합물 1 내지 102 중 어떤 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 TLR2 작용제는 화학식 T2:
Figure pct00003
를 가진 지질펩타이드일 수 있으며
여기에서:
R1은 H, -C(0)-C7-C18알킬 또는 -C(O)-C1-C6알킬이고;
R2는 C7-C18알킬이고;
R3은 C7-C18알킬이고;
L1은 -CH2OC(0)-, -CH2O-, -CH2NR7C(0)- 또는 -CH2OC(0)NR7-이고;
L2는 -OC(O)-, -0-, -NR7C(0)- 또는 -OC(0)NR7-이고;
R4는 -L3R5 또는 -L4R5이고;
R5는 -N(R7)2, -OR7, -P(0)(OR7)2, -C(0)OR7, -NR7C(0)L3R8, -NR7C(0)L4R8, -OL3R6, -C(0)NR7L3R8, -C(0)NR7L4R8, -S(0)2OR7, -OS(0)2OR7, C1-C6알킬, C6아릴, C10아릴, C14아릴, O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 14개 고리 멤버 헤테로아릴, O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 3개의 해테로원자를 함유하는 C3-C8사이클로알킬 또는 5 내지 6개 고리 멤버 헤테로사이클로알킬로서, R5의 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및 R5의 헤테로사이클로알킬은 각각 치환되지 않거나 또는 R5의 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및 R5의 헤테로사이클로알킬은 각각 독립적으로 -OR9, -OL3R6, -OL4R6, -OR7, 및 - C(0)OR7로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환되고;
L3은 C1-C10알킬렌이며, L3의 C1-C10알킬렌이 치환되지 않거나, L3의 C1-C10알킬렌은 1 내지 4개의 R6 기로 치환되거나, 또는 L3의 C1-C10알킬렌은 같은 탄소 원자에서 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께 C3-C8사이클로아킬을 형성하는 2개의 C1-C6알킬 기로 치환되고;
L4는 -((CR7R7)pO)q(CR10R10)p- 또는 -(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-이며, 각 R11은 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께 C3-C8사이클로아킬을 형성하는 C1-C6알킬 기이고;
각 R6은 독립적으로 할로, C1-C6알킬, 1-2개의 하이드록실 기로 치환된 C1-C6알킬, -OR7, -N(R7)2, -C(0)OH, -C(0)N(R7)2, -P(0)(OR7)2, C6아릴, C10아릴 및 C14아릴로부터 선택되고;
각 R7은 독립적으로 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
R8은 -SR7, -C(0)OH, -P(0)(OR7)2, 및 O 및 N으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 6개의 고리 멤버 헤테로사이클로알킬로부터 선택되고;
R9는 페닐이고;
각 R10은 독립적으로 H 및 할로로부터 선택되고;
각 p는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고,
q는 1, 2, 3 또는 4이다.
이 화합물들의 추가의 상세한 설명은 WO2011/119759에서 개시되고, 본 발명은 그 안에, 예를 들어, 그것들의 실시예 1-92에 개시된 화합물 중 어떤 것, 및 그것의 청구범위 제17 항에 나열된 화합물도 사용할 수 있다. 또 다른 유용한 TLR2 작용제는 팔미토일-Cys(2[R],3-디라우로일옥시-프로필)-Abu-D-Glu-NH2이며, 여기에서 Cys는 시스테인 잔기이고, Abu는 아미노부티르산 잔기이고 Glu는 글루탐산 잔기이다. 이 화합물은 US-4,666,886의 실시예 16에서 개시되고, 식 T3a:
Figure pct00004
를 갖는다.
식 T1 또는 T2 또는 T3a의 작용제는 약학적으로 허용 가능한 염, 약학적으로 허용 가능한 용매 화합물 (예를 들어, 하이드레이트), N-옥시드 유도체, 이소머 (호변체 또는 거울상체 포함) 또는 이소머의 혼합물, 등으로서 존재할 수 있다. 한 특히 유용한 염은 화합물 T1c의 아르기닌 염이며, 이것은 아르기닌 염 모노하이드레이트로서 사용될 수 있다.
다른 유용한 TLR 작용제는 다음 화합물이다:
Figure pct00005
다양한 유용한 TLR4 작용제는 업계에 공지되어 있으며, 이것들 중 다수는 내독소 또는 지질다당류 (LPS), 또는 모노포스포릴 지질 A ('MPLA')의 유사체이다. 예를 들어, 본 발명과 함께 사용된 TLR4 작용제는 다음과 같을 수 있다:
(i) 3d-MPL (즉, 3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A 또는 3-0-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A로도 공지되어 있음). 내독소의 모노포스포릴 지질 A 일부의 이 유도체는 글루코사민의 환원성 말단의 탈아실화된 위치 3을 갖는다.그것은 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 헵토스가 없는 돌연변이로부터 제조되었고, 지질 A와 화학적으로 유사하지만 산-불안정한 포스포릴 기 및 염기-불안정한 아실 기가 없다. 3d-MPL의 제조는 원래 GB-A-2220211에서 설명되었고, 제품은 Corixa Corporation에 의해 제조되고 판매되었다. 그것은 GSK의 'AS04' 보조제에 존재한다. 추가의 상세한 설명은 Myers et al. (1990) Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions, Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-9의 페이지 145-156; Baldrick et al. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413)에서 발견될 수 있다.
(ii) 글루코피라노실 지질 A (GLA) (Coler et al. (2011) PLoS ONE 6(1):e16333) 또는 그것의 암모늄 염, 예를 들어,
Figure pct00006
(iii) 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트, 예를 들어, RC-529 또는 CRX-524 (Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2213-221%; Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccine 2:219-229; Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278; Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccine 2:219-229; Bazin et al. (2006) Tetrahedron Lett 47:2087-92). RC-529 및 CRX-524는 하기 구조:
Figure pct00007
를 가지며, 그것들의 R2 기가 다르다.
(iv) 포스페이트-함유 비고리형 백본에 결합된 지질을 함유하는 화합물, 예를 들어, E5564 (Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43 (7): 735-42; US2005/0215517.)
Figure pct00008
(v) WO03/105769에서 한정된 식 I, II 또는 III의 화합물, 또는 이것들의 염, 예를 들어, 화합물 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 803022', 'ER 804764' 또는 'ER 804057'. ER 804057은 E6020으로도 공지되어 있고 그것은 하기 구조:
Figure pct00009
를 갖는 반면에
ER 803022는 하기 구조:
Figure pct00010
를 갖는다.
(vi) Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccine 2:285-93에서 개시된 폴리펩타이드 리간드 중 하나.
바람직한 TLR4 작용제는 모노포스포릴 지질 A (MPL)의 유사체이다
추가적인 면역강화제는 또한 TLR을 통해 작용하지 않는 면역강화제 (SMIP)를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 SMIP는 TLR 대신에 (또는 이에 더하여) C-타입 렉틴 수용체 (CLR) 또는 CD1d를 작용시킬 수도 있다. 따라서 본 개시물은 TLR 아고니즘(agonism)에 관하여 상기 설명된 본 발명을 포함하지만, TLR 작용제에 대한 지시대상 (또는 유사한 것)은 CLR 작용제 또는 CD1d 작용제에 대한 지시대상에 의해 대체된다.
CLR 작용제는 트레할로스-6,6'-디마이콜레이트 (TDM), 그것의 합성 유사체 D-(+)-트레할로스-6,6'-디베헤네이트 (TDB), 및 트레할로스의 다른 6,6'-디에스터 및 지방산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명은 CLR 작용제인 트레할로스 에스터 및 디아실 트레할로스에 적용될 수 있다. 이 작용제들은 식 (C):
Figure pct00011
를 가질 수도 있으며
여기에서 R1C(0)- 및 R2C(0)-는 같거나 다르고 아실 기이다. 적합한 아실 기는 포화될 수도 있거나 불포화될 수도 있다. 그것들은 미콜산, 코리노미콜산, 2-테트라데실-3-하이드록시옥타데칸산, 2-에이코실-3-하이드록시테트라코산산, 부르게안산, 베헨산, 팔미트산, 등의 아실 잔기로부터 선택될 수도 있다. 유용한 미콜산은 씨스(cis)- 및/또는 트랜스(trans)-형태의 알파-, 메톡시-, 및 케토-미콜산을 포함한다.
CD1d 작용제는 α-갈락토실세라미드와 같은 α-글리코실세라미드 (De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496; 미국 특허 5,936,076; Oki et al, J. Clin. Investig., 113: 1631-1640 US2005/0192248; Yang et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43: 3818-3822; WO2008/047249; WO2008/047174)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명은 CD1d 작용제인 글리코실세라미드에 적용될 수 있으며, α-갈락토실세라미드 (α-GalCer), 피토스핑고신-함유 α-글리코실세라미드, [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데칸트리올], OCH, KR 7000 CRONY-101, 3"-0-술포-갈락토실세라미드, 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 'Alum' 보조제 (예를 들어, TLR 작용제와 결합하여, 상기 설명됨)를 사용한다. 용어 'Alum'은 본원에서 알루미늄 염을 나타내며, 유용한 알루미늄 염은 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 염은, 예를 들어, 참고문헌 54의 8 & 9장에서 설명된다. 하이드록사이드 이온을 포함하는 알루미늄 염은 본 발명과 함께 사용에 대하여 바람직한 알루미늄 염, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 및/또는 알루미늄 포스페이트 (이것은 알루미늄 하이드록시포스페이트를 포함함)이다. 알루미늄 하이드록사이드 보조제가 가장 바람직하다. 조성물은 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트 둘 다의 혼합물을 포함할 수 있다. 환자에게 투여되는 조성물 중 Al+++의 농도는 바람직하게 1mg/ml 미만이고, 단위 용량 당 최대 0.85mg이 바람직하다.
백신 조성물의 포장
본 발명의 조성물에 적합한 용기 (또는 키트 구성요소)는 바이알, 주사기 (예를 들어, 1회용 주사기), 비강 스프레이, 등을 포함한다. 이 용기들은 멸균되어 있어야 한다.
조성물/구성요소가 바이알에 위치하는 경우, 바이알은 바람직하게 유리 또는 플라스틱 물질로 만들어진다. 바아일은 바람직하게 조성물이 그것에 추가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 방지하기 위해, 바이알은 바람직하게 라텍스가 없는 마개로 밀봉되고, 모든 포장 물질 중에 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 일회 용량의 백신을 포함할 수도 있거나, 그것은 일회 이상의 용량 ('다회수 용량' 바이알), 예를 들어, 10회 용량을 포함할 수도 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다.
바이알은 미리 채워진 주사기가 캡(cap)으로 삽입될 수 있도록 개조된 캡 (예를 들어, 루어 록(Luer lock))을 가질 수 있고, 주사기의 내용물은 바이알을 통해 방출될 수 있고 (예를 들어, 그 안에서 동결건조된 물질을 재구성하기 위해), 바이알의 내용물은 주사기로 다시 제거될 수 있다. 바이알로부터 주사기의 제거 후에, 이어서 바늘이 부착될 수 있고 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 캡이 접근하기 전에 씰(seal) 또는 커버(cover)가 제거되도록 캡은 바람직하게 씰 또는 커버 내에 위치한다. 바이알은 특히 다회수 용량 바이알에 대하여 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용하는 캡을 가질 수도 있다.
구성요소가 주사기에 포장되는 경우, 주사기는 그것에 부착된 바늘을 가질 수도 있다. 바늘이 부착되어 있지 않으면, 별도의 바늘이 조립하여 사용되는 주사기와 함께 공급될 수도 있다. 이러한 바늘은 피복될 수도 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 기록 관리를 용이하게 하기 위해 로트 번호, 인플루엔자 계절 및 내용물의 유효 기간이 인쇄될 수도 있는 필-오프(peel-off) 라벨이 있는 주사기가 제공될 수도 있다. 주사기의 플런져(plunger)는 바람직하게 플런져가 흡입 중에 실수로 제거되는 것을 방지하기 위해 마개를 갖고 있다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런져를 가질 수도 있다. 1회용 주사기는 1회 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘 부착 전에 끝을 밀봉하기 위해 팁 캡(tip cap)을 가질 것이고, 팁 캡은 바람직하게 부틸 고무로 만들어진다. 주사기 및 바늘이 별도로 포장되면 그때 바늘에 바람직하게 부틸 고무 실드(shield)가 장착된다. 바람직한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"™ 하에서 시판된 것들이다.
용기는, 예를 들어, 아동에게 전달을 용이하게 하기 위해 절반 용량을 나타내도록 표시될 수도 있다. 예를 들어, 0.5ml 용량을 함유하는 주사기는 0.25ml 부피를 나타내는 표시를 가질 수도 있다.
유리 용기 (예를 들어, 주사기 또는 바이알)이 사용되는 경우, 그때 소다 석회 유리 대신에 보로실리케이트 유리로 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
키트 또는 조성물은 백신의 상세한 설명, 예를 들어, 투여용 설명서, 백신 내 항원의 상세한 설명, 등을 포함하는 리플릿(leaflet)과 함께 포장될 수도 있다 (예를 들어, 같은 상자에). 설명서는 또한 경고, 예를 들어, 백신 접종 후 아드레날린 용액을 초과민 반응의 경우에 쉽게 이용 가능하도록 유지하기 위한 경고, 등을 함유할 수도 있다.
치료 방법, 및 백신 투여
한 양태에서, 본 발명은 HLA DQB1*0602 하플로타입에 음성인 것으로 발견된 환자에게 인플루엔자 백신, 바람직하게 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 백신을 투여하는 방법을 제공한다. 2009년에, Pandemrix™ 백신 투여 후 기면증의 증상에 걸린 모든 환자들은 이 표현형을 갖는 것이 발견되었고 그러므로 이 환자 군에 특히 주의를 기울이는 것이 바람직하다.
환자의 테스트 및 인플루엔자 백신의 투여는 실질적으로 동시에 (예를 들어, 의료 전문가에게 동시 방문 중에) 일어날 수도 있다. 하지만, 환자들은 인플루엔자 백신을 받기 전에 가끔 테스트받는 것이 더 일반적이다. 예를 들어, 테스트 단계 및 투여 단계는 서로 몇 일, 몇 개월 또는 몇 년 간격으로 수행될 수도 있다.
HLA DQB1*0602 하플로타입에 대하여 환자를 테스트하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 하플로타입의 시퀀싱 또는 HLA의 적어도 일부의 PCR 증폭을 수반할 수도 있다. 그것은 또한 다른 HLA 하플로타입을 구별할 수 있는 하플로타입 특이적 프로브를 사용하여 (예를 들어, 서던 블롯 검정에서) 실행될 수 있다. HLA DQB1*0602에 대하여 동형 접합성일 수도 있거나; 또는 환자는 HLA DQB1*0602 하플로타입에 대하여 이형 접합성일 수도 있으며, 이 경우에 이러한 환자를 인플루엔자 백신 수령으로부터 제외하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 제조된 백신을 제공한다. 이 백신 조성물들은 인간 또는 비-인간 동물 대상체, 예를 들어, 돼지 또는 조류로의 투여에 적합하고, 본 발명은 대상체의 면역 반응을 일으키는 방법을 제공하는데, 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용되는 본 발명의 조성물을 제공하고, 대상체의 면역 반응을 일으키는 의약의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.
이 방법 및 사용에 의해 일어난 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게 보호적 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 백신 접종 후 항체 반응, 중화 능력 및 보호를 평가하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가가 보호와 연관성이 있다는 것을 나타냈다 (약 30-40의 혈청 샘플 헤마글루티닌화-억제 역가는 상동성 바이러스에 의한 감염으로부터 대략 50% 보호를 제공한다) [67]. 항체 반응은 전형적으로 헤마글루티닌화 억제에 의해, 미세 중화법에 의해, 일원 방사성 면역확산법 (single radial immunodiffusion; SRID)에 의해, 및/또는 일원 방사상 용혈법 (single radial hemolysis; SRH)에 의해 측정된다. 이 검정 기술들은 업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 조성은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육 내 주사에 의한 것이지만 (예를 들어, 팔 또는 다리로), 다른 이용 가능한 경로는 피하 주사, 비강 내 [68-70], 경구 [71], 피 내 [72,73], 경피성(transcutaneous), 경피성(transdermal) [74], 등의 주사를 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 백신은, 6개월부터, 아동 및 성인을 치료하는데 사용될 수도 있다. 인플루엔자 백신이 현재 소아 및 성인 면역화에 사용에 대하여 추천된다. 따라서 인간 대상체는 1살 미만, 1-5살, 5-15살, 15-55살, 또는 적어도 55살일 수도 있다. 백신의 수령에 대하여 바람직한 대상체는 노인 (예를 들어, >50살, >60살, 및 바람직하게 >65살), 아이들 (예를 들어, <5살), 입원한 대상체, 의료계 종사자, 군인 및 군 관계자(armed service and military personnel), 임신한 여성, 만성 질환자, 면역 결핍 대상체, 백신 수령 전 7일 내에 항바이러스 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 섭취한 대상체, 계란 알러지가 있는 사람 및 해외 여행한 사람이다. 백신은 이 군에 대해서만은 적합하지 않지만, 집단에서 더 일반적으로 사용될 수도 있다. 유행성 균주에 대하여, 모든 연령 군에 투여가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 조성물은 효능에 대하여 CPMP 기준의 1, 2 또는 3을 만족시킨다. 성인 (18-60살)에서, 이 기준은 (1) >70% 혈청 방어율; (2) >40% 혈청 전환률; 및/또는 (3) >2.5배의 GMT 증가이다. 노인 (>60살)에서, 이 기준은 (1) >60% 혈청 방어율; (2) >30% 혈청 전환률; 및/또는 (3) >2배의 GMT 증가이다. 이 기준은 적어도 50명의 환자와 함께한 개방 연구에 기초한다.
치료는 일회 투여 일정 또는 다회수 투여 일정에 의한 것일 수 있다. 다회수 용량은 1차 면역화 일정 및/또는 촉진 면역화 일정에서 사용될 수도 있다. 다회수 투여 일정에서 다양한 용량이 같거나 다른 경로, 예를 들어, 비경구 제1 및 점막 촉진, 점막 제1 및 비경구 촉진, 등에 의해 제공될 수도 있다. 일회 이상의 용량 (전형적으로 2회 용량)의 투여는 면역학적으로 고유한 환자에서, 예를 들어, 새로운 HA 서브타입에 대한 백신 접종 전에, 또는 도중에 인플루엔자 백신을 받은 적이 없는 사람에 대하여 특히 유용하다 (유행병 발병과 같음). 다회수 용량은 전형적으로 적어도 1주 (예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주, 등) 간격으로 투여될 것이다.
본 발명에 의해 생산된 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 같은 의료 상담 또는 전문 의료 센터 또는 백신 접종 센터 방문 중에), 예를 들어, 홍역(measles) 백신, 볼거리(mumps) 백신, 풍진(rubella) 백신, MMR 백신, 수두(varicella) 백신, MMRV 백신, 디프테리아(diphtheria) 백신, 파상풍(tetanus) 백신, 백일해(pertussis) 백신, DTP 백신, 컨쥬게이션된 헤모필루스 인플루엔재(H.influenzae) 타입 b 백신, 비활성화된 폴리오바이러스(poliovirus) 백신, B형 간염(hepatitis B) 바이러스 백신, 수막염균(meningococcal) 컨쥬게이트 백신 (예를 들어, 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus) 백신, 폐렴구균(pneumococcal) 컨쥬게이트 백신, 등과 실질적으로 동시에 환자에게 투여될 수도 있다. 폐렴 구균 백신 및/또는 수막염균 백신과 실질적으로 동시에 투여는 노인 환자에게 특히 유용하다.
유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 및 특히 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)에 대하여 활성인 항바이러스 화합물과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 같은 의료 상담 또는 전문 의료 센터 방문 중에) 환자에게 투여될 수도 있다. 이 항 바이러스제는 뉴라미니다제 억제제, 예를 들어, (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복시산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안히드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산을 포함하며, 이것들의 에스터 (예를 들어, 에틸 에스터) 및 이것들의 염 (예를 들어, 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스제는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스터, 오셀타미비르 포스페이트 (TAMIFLU™)로도 공지된 포스페이트 (1:1)이다.
일반
용어 "포함하는"은 "포함하는", 뿐만 아니라 "로 구성된"을 포함하는데, 예를 들어, X를 "포함하는 조성물은 단지 X로만 구성될 수도 있거나 추가적인 어떤 것, 예를 들어, X + Y를 포함할 수도 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 제외하지는 않는데, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수도 있다.
수치 x에 관하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, x+10%를 의미한다.
두 개의 아미노산 또는 아미노산 서열에 관하여 용어 "해당하는"은 서열이 쌍별 정렬 알고리즘에 의해 정렬될 때 서로에 맞춰 정렬되는 아미노산을 나타낸다. "해당하는" 아미노산(들)을 확인하는데 사용되는 바람직한 쌍별 정렬 알고리즘은 니들맨-분쉬 전체 정렬 알고리즘(Needleman-Wunsch global alignment algorithm)이며 [75], 디폴트 파라미터를 사용한다 (예를 들어, 갭 오프닝 패널티(Gap opening penalty) = 10.0, 및 갭 연장 패널티(Gap extension penalty) = 0.5로, EBLOSUM62 스코어링 매트릭스(scoring matrix) 사용). 이 알고리즘은 편의상 EMBOSS 패키지의 바늘로 시행된다 [76]. 같은 원칙이 서열 비교에 관하여 본원에서 사용된 용어 "동등한"에 적용되고, 즉, 주어진 서열이 서열 번호: 1 또는 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 서열을 갖는지 결정하는 것은 전형적으로 상기 설명된 정렬을 수반한다.
구체적으로 진술되지 않으면, 둘 이상의 구성요소를 혼합하는 단계를 포함하는 공정은 혼합의 어떤 특정 순서를 필요로 하지는 않는다. 따라서 구성요소는 어떤 순서로도 혼합될 수 있다. 세 가지 구성요소가 있는 경우 두 가지 구성요소는 서로 조합될 수 있고, 그때 조합은 제3 구성요소, 등과 조합될 수도 있다.
방법의 다양한 단계는 동시에 또는 다른 시점에, 같거나 다른 지리적 위치, 예를 들어, 국가에서, 및 같거나 다른 사람 또는 실체물에 의해 수행될 수도 있다.
동물 (및 특히 소) 재료가 세포의 배양에 사용되는 경우, 그것들은 전파성 해면 양뇌증 (transmissible spongiform encephalopathy; TSE), 및 특히 광우병 (bovine spongiform encephalopathy; BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 종합적으로 동물-유래 재료의 완전한 부재 하에 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되는 경우 상기 화합물은 대안으로 적합한 프로드러그(prodrug)에 의해 대체될 수도 있다.
두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성에 대한 지시대상은, 정렬될 때, 아미노산의 상기 퍼센트가 두 서열의 비교에 있어서 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 참고문헌 77의 섹션 7.7.18에서 설명된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 오픈 패널티 12 및 갭 연장 패널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 아핀 캡 검색(affine gap search)을 사용하는 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
두 핵산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성에 대한 지시대상은, 정렬될 때, 염기의 상기 퍼센트가 두 서열의 비교에 있어서 같다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 참고문헌 77의 섹션 7.7.18에서 설명된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬 프로그램은 GCG Gap (Genetics Computer Group, Wisconsin, Suite Version 10.1)이며, 바람직하게는 다음과 같은 디폴트 파라미터를 사용한다: 오픈 갭 = 3; 연장 갭 = 1.
실시예
기면증 및 H1N1 유행병
분자적 의태(molecular mimicry)는 바이러스 및 박테리아가 신체를 속여서 그것들이 숙주 조직으로 자유로운 접근을 허용하게 하는 진화적 적응이다. 이러한 의태는 그 자체와 유사해 보이는 아미노산의 면역 시스템 스트레치(stretch)를 나타냄으로써 작동한다. 미생물에 반응하여, 면역 시스템은 해당하는 자가-구성요소 (예를 들어, 다발성 경화증(multiple sclerosis)에서 아데노바이러스(adenovirus) 타입 2 및 수초 염기성 단백질)을 공격할 준비가 된다.
자가면역 질환 및 자연 감염
자가면역 질환에 걸린 환자를 관리하는 임상의에 의해 흔히 관찰되는 것은 자연 감염이 자가면역 질환 활성을 촉발하고 그것의 심각도를 증가시킬 수 있다는 것이다. 유사하게, 자연 감염은 유전적으로 민감한 숙주에서 질환을 유발하는데 있어서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. H1N1 유행병의 맥락에서, 2009년 5월까지 153명의 대상체가 중국 베이징(Beijing, China)에서 H1N1으로 감염되었으며, 이것은 2009년 11월까지 추정상 118만 명의 감염된 대상체로 증가하였다. 11월까지, 보조되지 않는 H1N1 백신의 136만 용량을 1700만의 집단에게 투여하였다 (즉, 집단의 0.8%가 백신 접종되었다). H1N1 감염의 피크 후 6개월에, 단지 5.6%의 환자들이 백신 접종된 것으로 보고된 베이징 코호트(cohort)에서 새로운 기면증 사례 (n=142)의 3 내지 4배 증가의 보고가 있었다. 이는 발명자들에게 Pandemrix™-처리된 환자에서 보이는 기면증이 아마도 분자 의태로 인해 H1N1 균주 자체와 연관될 수도 있다는 것을 제안하였다.
Pandemrix ™ 백신 항원과 관련된 병리학적 의태
상기 언급된 바와 같이, Pandemrix™ 백신은 기면증과 연관되어 있는 한편 기면증의 증가는 Focetria™로의 백신 접종 후에는 나타날 수 없다. Pandemrix™에 사용된 백신 항원의 공급원은 고수율 A H1N1 재조합체 X-179A인 한편 Focetria™에 사용된 것은 더 높은 수율의 A H1N1 재조합체 X-181이다.
유행성 H1N1 백신 제조를 위해, X-179A (Pandemrix™에 사용됨)를 A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)에서 유래된 내부 단백질, 표면 항원 HA 및 NA에 기여하는 A/California/07/2009 (H1N1 서브타입), 및 내부 단백질 PB1과 고수율 균주 X-157의 교배에 의해 발생시켰다. 불충분한 수율의 문제로 인해, 2009년 7월 14일에 64배 수율 X-181 (Focetria™ 및 다른 계절성 백신에서 사용됨)의 발생으로 이어지는 X-157로의 재교배에 의해 32배 수율 X-179A를 재배열하였다. 이 기능적 차이는 재배열의 유전자 세그먼트 조합, 뿐만 아니라 계란 숙주에 적응 (계란 내 접종) 중에 선택된 기존의 변종 및 바이러스 돌연변이에 관한 것이다. 항원에 관련하여 구별할 수 없지만 16배 이하로 수율을 증가시키는 X-53a의 HA 유전자의 단일 아미노산 변화를 갖는 1976년의 돼지 독감 백신을 위해 제조된 X-53 및 X-53a 재조합체로도 유사한 결과가 일어났다. 따라서, Pandemrix™에 사용된 X-179A는 하기 설명되는 바와 같이 Focetria™에 사용된 X-181과 비교하여 다른 질적 차이를 가질 가능성이 크다.
Pandemrix™ 및 Focetria™에 대한 정제 공정은 뚜렷한 차이를 갖는다. 분할-비리온 백신 (예를 들어, Pandemrix™) 및 서브유닛 백신 (예를 들어, Focetria™)은 세계 보건 기구(World Health Organization) 문서에서 인플루엔자 백신에 대한 생산 기술에 대하여 다음과 같이 한정된다:
대부분의 인플루엔자 백신은 '분할' 백신이며, 이것들은 세제-처리 정제된 인플루엔자 바이러스에 의해 생산된다. 분할 공정은 적절한 항원이 부분적으로 정제되게 하는 바이러스를 깬다 (p. 8).전체 -바이러스 조제물과 비교하여, 분할 백신은 더 잘 특성화되고, 더 적은 오발부민을 함유하며 덜 반응 유발성인 것으로 주장된다 (p.13). 서브유닛 또는 표면 표면 -항원 백신은 분할 바이러스로서 생산되지만, 백신이 최소 오염성 N, 매트릭스 단백질, 핵단백질 및 지질을 가진 고도로 정제된 HA 및 NA로만 거의 독점적으로 구성되도록 더 엄격한 정제가 수행된다.
온전한 인플루엔자 바이러스에서 핵단백질의 양 및 매트릭스 단백질 함량은 이 두 가지 내부 단백질이 HA 및 NA를 풍부하게 하는데 사용된 정제 공정의 타입에 따라 이어질 가능성이 가장 크게 만드는 HA의 그것보다 각각 2배 및 6배 더 높다. 실제로, 선행 조사는 1992년 영국에서 이용 가능했던 분할-비리온 백신 플루존 및 MFV-Ject 및 정제된 항원/서브유닛 인플루엔자 백신 플루비린(Fluvirin) 및 인플루박(Influvac)을 특징으로 하였다 [79]. 전자 현미경법에 기초하여, 바이러스 핵단백질은 분할-비리온 백신에서 쉽게 분명해질 수 있고 SDS-PAGE 겔에 의해 모든 백신에서 다양한 수준으로 검출 가능하다 (분할-비리온 > 정제된 항원/서브유닛).
오렉신 수용체의 돌연변이 및 오렉신 세포의 손실이 기면증의 원인이 되기 때문에, 발명자들은 Pandemrix™의 백신 항원은 오렉신 (하이포크레틴) 또는 그것의 수용체로의 분자 의태로 이어지는 독특한 특성을 가질 수 있다고 가정하였다. 그러므로, 서열 분석을 X-179A, X-181 및 오렉신-관련 서열의 인플루엔자 단백질 (오렉신, 오렉신 A, 오렉신 B, 오렉신 수용체 1, 오렉신 수용체 2 및 HLA-DQB1)에서 수행하였다. Pandemrix™ 균주로서 X-179A는 기면증 사례의 원인이 되지만 Focetria™은 아니며, 인플루엔자 단백질을 기면증과의 연관성에 대하여 설명할 수 있는 백신 바이러스 균주 X-179A (Pandremix-관련) 및 X-181 (Focetria™-관련)의 차이에 대하여 비교하였다. 상기 설명된 전자 현미경법 및 SDS-PAGE 연구에 의해 제안된 바와 같이 백신 조제물에 존재할 것으로 예상된 단백질 (HA, NA, NP 및 M1)만이 포함된다.
잠재적 아미노산 변화를 결정하기 위해서, 인플루엔자 서열을 2배수 서열이 제거된 적절한 균주명 (X-179A, X-181, A/California/07/2009(H1N1))으로 조회되는 NCBI의 Influenza Virus Resource로부터 회수하였다 [80]. 백신 조제물에 존재하는 것으로 예상된 각 인플루엔자 단백질 (HA, NP, M1, M2, NA)을 X-179A가 X-181와 적어도 하나의 잔기가 다른 경우 서열을 확인하기 위해 균주에 걸쳐 비교하였다. HA에서 하나 및 NP에서 두 개로 세 개의 아미노산 차이를 발견하였다 (표 1):
Figure pct00012
차이 전에 및 후에 10의 잔기를 포함하는 부분 서열을 스미스-워터만 정렬을 사용하여 오렉신 관련 서열과 비교하였다. 4개의 정렬만이 0.4보다 낮은 e-값을 가졌다 (그 다음 최고 e-값은 > 0.4인데 10:1의 최고 e-값 정렬 대 그 다음 최고값의 비를 제공하며 이것은 다른 것들로부터 표시된 정렬의 양호한 분리이다). 정렬은 뉴클레오캡시드 단백질 단편 from X-179A 및 X-181의 뉴클레오캡시드 단백질 단편 (단일 잔기 차이 함유) 및 오렉신 수용체 1 및 2 사이에 있었다 (도 1). 뉴클레오캡시드 단편의 X-179A 버젼은 Immune Epitope Database (www.iedb.org)에서 보고된 많은 에피토프와 중첩되기 때문에, 이 오렉신 수용체 1 및 2와의 중첩 (이것은 기면증의 원인이 된다)은 의태에 대한 가능성을 제안하며 Pandemrix™ 백신의 투여 후 특정 유럽 국가에서 기면증의 관찰에 대한 가능한 설명이다. 흥미롭게, 뉴클레오캡시드 단편의 X-179A는 또한 H1N1 감염의 그것과 동일한 한편 (기면증과 감염의 보고된 연관성과 일치 [81]), 같은 뉴클레오캡시드 단편의 X-181 버젼 (Focetria™-결합됨)은 Focetria™과의 기면증 연관성의 결핍을 설명할 수 있는 단일 아미노산 치환을 함유한다.
Pandemrix™과 연관된 기면증에 걸린 환자는 오직 HLA DQB1*0602 뿐이다. 따라서 스웨덴에서 28건의 백신 접종 후 기면증 사례는 모두 HLA DQB1*0602였다. 핀란드에서, 2010에 Pandemrix™으로 백신 접종된 34명의 HLA 타입 기면증 환자는 HLA DQB1*0602였다. HLA DQB1*0602에 대한 결합 모티프는 공지되어 있다. HLA DQB1*0602에 대한 코어 결합 모티프는 위치 1, 3, 4, 6, 및 9에 있다. 이 모티프를 위치 1 및 3에서 지방족 아미노산, 및 위치 4에서 소수성 아미노산을 가진 펩타이드 L I LY DKEE I RRIWRQANNG (서열 번호: 10)에 잘 맞추는 오렉신 수용체 1 및 2 펩타이드에 대한 기록이 있다. 위치 6이 모티프에 맞지 않으면, 위치 9는 지방족이며 좋은 적합도(fit)를 제공한다 [82]. 기면증에서 가장 큰 부피의 P4 결합 포켓은 민감도에 중요하고, 0602에 대한 강한 바인더의 일부 공지된 실시예는 P4에서 티로신을 갖는다 [8].
Pandemrix™ 백신은 기면증으로 이어지는, 자가-항원의 분자적 모방체 (하이포크레틴 또는 그것의 수용체 중 하나)에 대한 면역 반응의 원인이 되는 H1N1 감염원의 특정 구성요소를 더 포함했을 수도 있다. 하지만, AS03-보조된 Pandemrix™ 백신 및 AS03-보조된 H1N1 유행성 백신 아레팬릭스(Arepanrix) (백신 접종과 연관된 증가된 기면증의 보고가 없는 캐나다에서 투여됨)와 연관된 기면증 신호의 불일치 때문에 최종 결론을 도출하기 전에 적절히 경계해야 한다. 이는 병원성 항원의 존재가 단독으로는 연관성을 설명하기에 충분하지 않을 수도 있거나, 또는 대안으로, 제조 장소 (Pandemrix™에 대하여 드레스덴(Dresden) 및 Canada에 대하여 퀘벡(Quebec))의 분할/정제 공정의 차이로 인해 AS03-보조된 백신에서 분할 백신 항원의 존재 또는 제공의 차이가 있을 수도 있고 제안할 수도 있다. 드레스덴에서 제조된 GSK AS03-보조된 H1N1 백신의 추정상 3080만 용량을 2009년 10월에 시작하여 47개 이상의 나라에서 사용하였으며, 핀란드, 스웨덴, 노르웨이, 및 아일랜드를 포함하는 일부 나라에서는 보급률이 높았다. 퀘벡에서 제조된 GSK AS03-보조된 H1N1 백신을 캐나다에서 높은 보급률로 사용하였으며 (아레팬릭스) 추정상 1200만 용량을 투여하였고 또한 여러 다른 나라에서 투여하였다. 캐나다에서 진행중인 역학 연구는 적절한 때에 기면증 및 AS03-보조된 H1N1 백신 (아레팬릭스) 사이의 어떤 연관성에 대하여 보고할 것이다.
드레스덴 항원은 폴리소르베이트 80 (Tween 80) 및 Triton X-100을 함유하는 한편, 퀘벡 항원은 이 부형제들을 함유하지 않는다. 이 세제가 기면증의 발병에 대한 효과를 가질 수도 있다고 추측되었다 (평가 보고서 참조 유행성 백신 EMA/687578/2012마다 면역학적 차이). 그러므로 드레스덴 항원에서와 같이 Tween 80 및/또는 Triton X-100을 함유하는 항원으로부터 생산된 백신에서 NP 단백질의 존재를 방지하는 것이 특히 중요할 수도 있다. 이것은 특히 MF59 또는 AS03과 같은 수중유 에멀젼으로 보조된 백신에 적용되는데, 기면증이 드레스덴 항원으로부터 유래된 보조되지 않은 계절성 백신에서는 나타나지 않았기 때문이다 (하기 참조).
하기 표 2는 드레스덴에서 제조된 2개의 다른 비활성화된 분할 비리온 H1N1 항원 구성요소의 조성물을 나타낸다 (WO2011/051235 p 41).
Figure pct00013
GSK 비- 보조된 H1N1 계절성 인플루엔자 백신에서 기면증 의 부재
GSK에 의해 제조된 유행성 및 계절성 인플루엔자 백신 둘 다는 같은 H1N1 항원을 함유하는 한편, 보조제에 의한 상기 과도한 면역자극이 기면증에 대하여 캐주얼하다고 추측하기 위한 것으로 즉시 이어질 수 있는 계절성 백신에서 비-보조된 H1N1 항원으로 보고된 기면증 신호가 없다. 하지만, 분할-바이러스 백신에서 나타나는 잠재 항원에 대한 상기 논의에 비추어, AS03 보조제에 의해 면역 시스템으로 바람직하게 또는 더 효율적으로 제공되는 병리학적 항원의 레저버(reservoir)와의 부조화 기면증 연관성을 또한 설명할 수 있다 - 개선된 항원 제공이 어떤 보조제로도 바람직하고 예상된 효과라는 생각을 명심해야 한다. 보조제는 다음을 포함하는 여러 방법으로 작용할 수도 있다: 1) 면역 시스템에 항원을 전달하는 단계, 2) 항원-제공 세포 (APC)에 의한 항원의 흡수 향상, 또는 3) 백신 내 항원의 구조적 형태를 변화시키며, 이로 인해 점진적 방출, 지연된 제거 및 면역 시스템에 더 나은 노출을 허용하는 단계. 수중유 에멀젼의 작용의 방식은 더 잘 이해되고 있으며 현재는 선천적 염증 반응의 조절, APC 모집 및 활성화, 주사 부위에서 항원 지속의 향상, 면역-컴피턴트(competent) 세포에 항원의 제공 조절, 및 다른 패턴의 시토킨의 유도를 수반하는 것으로 간주된다.
면역학적 설명
면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 자료 (Immune Epitope Database and Analysis Resources; IEDB)를 사용하여 인플루엔자 A 바이러스의 항체 및 T 세포 에피토프에 대하여 2007년 출판된 보존 분석으로부터 관련된 발견은 T-세포 에피토프 헤마들루티닌 단백질 및 핵단백질로부터 유래된 가장 많은 수의 T-세포 에피토프를 가진 T-세포 에피토프와 비교하여 항체 에피토프의 결핍이다 [83]. 게다가, T-세포 에피토프는 항체 에피토프보다 더 잘 보존되며 50%는 인간 H1N1 균주에서 80% 동일성 수준으로 보존되고 인플루엔자에서 T-세포 에피토프에 대하여 상당한 수준의 균주 간 교차 반응을 제안한다. 인플루엔자 A의 핵단백질은 등급 I 및 등급 II 주요 조직 적합성 복합체에 의해 효율적으로 제공되고 CD8+ 및 CD4+-특이적 효과기 T 림프구 분비 감마-인터페론 및 종양 괴사 인자를 확대시킬 수 있다 [84]. 그것은 교차-반응성 항-인플루엔자 A 세포독성 림프구 (CTL)에 대한 주요 표적 항원이고, PR8 핵단백질 유전자를 함유하는 재조합 우두 바이러스(vaccinia virus)는 둘 다 활발한 2차 교차-반응성 CTL 반응을 자극하고 이에 대하여 대비할 수 있다 [85]. 그것은 정확히 상당량의 비-표면 단백질을 함유하는 분할-비리온 인플루엔자 백신이 더 순수한 서브유닛 백신과 비교하여 세포-매개 면역 반응을 증가시킬 것으로 예상되는 이유이다. 하지만, 이것은 양날의 검인데 바이러스 (또는 백신-변형된) 핵단백질의 한정된 에피토프에 대하여 활발한 교차-반응성 CTL 반응을 일으키는 같은 면역학적 메커니즘은 그것이 유전적으로 민감한 숙주 (예를 들어, DBQ1 *0602)에서 자가면역 질환 (예를 들어, 기면증)으로 악화되는 T-세포-매개 자가면역력으로 이어지는 숙주 조직 (예를 들어, 오렉신 수용체)를 모방하면 문제가 될 수 있기 때문이다. 오렉신 수용체와 함께 Pandemrix™ 핵단백질 단편의 정렬은 매우 흥미로운데 뚜렷한 기면증 증후군이 또한 오렉신 2 수용체 넉아웃(knockout) 마우스 및 오렉신 넉아웃 마우스에서도 발생하였기 때문이다 (아마도 결함이 있는 오렉신을 통해 오렉신 1 수용체로 신호전달) [86].
흥미롭게도, 미량의 면역원성 핵단백질이 Focetria™에 존재하면, Pandemrix™ 핵단백질 및 H1N1 감염의 것 (둘 다 이소류신을 가짐)으로부터 오렉신 수용체를 구별하는 오렉신 수용체와 함께 정렬하는 핵단백질 단편에서 하나의 아미노산 치환 (메티오닌)의 존재가 있다. Focetria™에서 함유된 핵단백질에서 이 아미노산 치환 (X-181 백신 균주로부터 물려받음)은 핵단백질에서 많은 아미노산 치환이 고도로 보존된 매트릭스 단백질과 대조적으로 CTL-매개 면역 감시로부터 벗어날 수 있는 인플루엔자 바이러스에 대한 것과 기능적으로 유사할 수도 있다 [87].
HLA 하플로타입 결합 검정
다양한 HLA-DRB1* 하플로타입으로 펩타이드의 결합을 무세포 REVEAL™ 등급 II 결합 기술을 사용하여 분석하였다 (참고문헌 88 참조). 이 기술은 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 합성 테스트 펩타이드의 능력을 측정한다. 검출은 MHC-펩타이드 복합체의 고유한 형태의 존재 또는 부재를 기반으로 하며, 이것은 특이적 단클론성 항체에 의해 검출된다. 각 펩타이드에 공지된 T-세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관한 점수를 제공한다. 점수는 양성 대조군 펩타이드와 비교하여 테스트 펩타이드에 의해 발생한 신호의 퍼센트로서 양적으로 보고된다. 점수를 0점에서 및 다시 24시간 후에 평가한다. 분석은 또한 테스트되는 MHC II 복합체와 각 펩타이드의 결합 안정성을 나타내는 안정 지수를 제공한다.
총 18개 펩타이드, 플러스 양성 대조군을 테스트하였다:
Figure pct00014
두 가지 하플로타입 DQA1*0102:DQB1*0602; 및 DQA1*0101:DQB1*0501을 테스트하였다. 상기 논의된 바와 같이, DQB1*0602 하플로타입은 기면증에 대한 공지된 결합을 갖지만, DQB1*0501 하플로타입은 환자의 HLA 타이핑(typing) 연구에 기초하여 기면증의 발병에 대하여 보호하는 것으로 보인다.
결합 결과는 다음과 같다:
Figure pct00015
DQB1*0602 HLA 하플로타입에 대한 네 개의 강력한 바인더, 즉 펩타이드 #1, #5, #9 및 #11이 있다 (양성 대조군 신호의 >15%). 0점에서 및 24시간 후에도 여전히 강력하게 결합된 X179-A 펩타이드 (#1)와 대조적으로, X181 (#2)의 해당 단편은 두 시점 모두에서 불량한 바인더였다.
일반적으로, DQB1*0501 하플로타입과 모든 펩타이드의 결합 안정성은 더 약하다. 펩타이드 #1은 여전히 잘 결합하지만 분명히 24시간 후 덜 안정하다. 펩타이드 #3 (펩타이드 #1의 더 짧은 버젼)은 DQB1*0602보다 이 하플로타입에 더 잘 결합하는 반면에, #4 (#2의 더 짧은 버젼)는 0501 하플로타입으로 불량한 바인더로 남아있다. 따라서, 기면증 환자와 분명히 연관된 DQB1*0602와 비교하여, NP 펩타이드는 기면증의 발병에 대하여 보호하는 것으로 보이는 하플로타입 (DQB1*0501)에 불량하게 결합하였다.
15-머 오렉신 단편 (#10)은 HLA 하플로타입에 결합하지 않았지만, Thr→Ile 돌연변이를 가진 이 펩타이드의 변형된 버젼 (#11)은 강력한 바인더였다. 펩타이드 #10에 대한 결과는 단편이 DQB1*06:02 HLA와 "복합체 형성을 용이하게 하기 위해" 15 aa 링커를 필요로 한다는 참고문헌 8의 보고서를 고려하면 놀라운 일이 아니다. 펩타이드를 더 강력한 바인더로 전환시키는 Thr→Ile 돌연변이의 능력은 DQB1*06:02 HLA 하플로타입에 대한 친화도를 부여하는데 있어서 균주 X179-A의 NP에서 이소류신의 중요성을 지지한다.
펩타이드 #12로의 결과는 펩타이드 #10에서 트레오닌을 메티오닌으로 변화시키는 것이 HLA DQB1*0602 (기면증과 연관된 대립유전자)로의 결합을 허용하지 않거나 개선하지 않는다는 것을 입증하며 따라서 DQB1*0602에 관하여 펩타이드 #1 및 #2와 일치하는 결과를 확인한다.
종합적으로, 이 결과는 펩타이드 #1 및 #2가 HLA-DQA1*01:02 DQB1*06:02로의 현저하게 다른 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. 펩타이드 #1은 이 대립유전자에 대한 양호한 결합을 나타내며, 그것의 높은 안정성 점수는 결합이 강력하다는 것을 제안한다. 그에 반해서, 펩타이드 #2는 낮은 초기 결합을 나타내지만, 매우 소량의 복합체만이 24시간 후에 남아있으며, 짧은 결합 반감기, 및 불안정한 복합체를 제안한다. 따라서 펩타이드 #1 (X-179A 핵단백질의 아미노산 106-126 및 아미노산 위치 116에서 이소류신 잔기를 함유)은 펩타이드 #2 (X-181 핵단백질의 아미노산 106-126 및 아미노산 위치 116에서 메티오닌 잔기 함유)보다 더 강력하게 및 더 나은 안정성으로 결합하였다. 따라서, 이 데이터는 X-181 핵단백질이 아니라, X-179A 핵단백질이 HLA-DQB1*06:02 하플로타입을 가진 개체에 특이적인 자가면역 반응에 수반될 수도 있다는 발명자들의 가설을 지지한다.
오렉신과의 펩타이드 상호작용의 모델링
오렉신 (하이포크레틴) 단편 1-13 (서열 번호: 16)은 HLA DQB1*0602와 강력하게 상호작용하는 것으로 공지되어 있다 [8]. 분석은 Leu-3, Thr-6 및 Val-8이 상호작용에 중요한 잔기라는 것을 나타낸다. 이 세 개의 잔기는 역방향의 인플루엔자 NP 펩타이드를 가진 X-179A 핵단백질 단편 (서열 번호: 17)의 12-머 단편과 함께 양호한 3D 구조적 정렬을 제공하며, Ile-6은 오렉신 Thr-6과 함께 정렬하고 Ile-9는 Leu-3과 함께 정렬한다. NP Ile-6은 서열 번호: 1 (X-179A) 및 3 (X-181)마다 다른 잔기이다. 컴퓨터 모델링은 DQ0602 결정 구조의 결합 그루브(groove)에서 매우 양호한 적합성을 나타낸다. X-179A에서 Ile-6 잔기는 오렉신의 Thr-6에 대한 HLA 단백질의 결합 공동에서 잘 맞지만, 서열 번호: 3의 해당 12-머 단편에서 X-181A 메티오닌 잔기는 HLA 단백질과의 극심한 공간 충돌을 제공한다.
이 모델링을 위해 PDB 파일 1uvq를 PyMol (Schrodinger Inc)과 함께 사용하였다. 하이포크레틴 펩타이드 (서열 번호: 16) 및 HLA 단백질 사이의 분자 내 상호작용의 분석을 시각적으로 및 SiteMap 소프트웨어 (Schrodinger Inc.)의 사용을 통해 더 상세히 수행하였다. 펩타이드의 X-선 구조의 3개의 잔기를 HLA 단백질로의 결합을 구동하는데 중요한 것으로 확인하였으며, 소수성 상호작용 (Leu-3, Thr-6 및 Val-8)을 통해서 일어날 가능성이 가장 높다.
핵단백질 (서열 번호: 17)의 단편의 정렬을 수행하였고 그것은 역방향으로 도킹될 때까지, 많은 충돌 및 가능성이 낮은 결합 포즈를 나타냈다. 극성 및 반 더 발스(van der Waals) 충돌에 관하여 HLA-DQB1*0602의 결합 부위로의 추정상 결합 방식을 평가하였고, Ile-6은 오렉신 Thr-6과 함께 정렬하고 NP Ile-9는 Leu-3과 함께 정렬할 때 양호한 매치를 볼 수 있다. 정렬 평가로의 잡음 또는 편견의 통합을 방지하기 위해서, 다음을 실행하였다: (i) 오렉신 펩타이드를 PyMol의 돌연변이 모듈(module)을 사용하여 NP 펩타이드로 한 잔기씩 돌연변이되게 하였다; (ii) 각 위치에서, NP 펩타이드의 각 잔기에 대한 최고의 이형태체를 HLA 단백질의 반 더 발스 표면에 그것의 근접에 의해 결합 포켓에 맞는지 또는 결합 포켓에 없는지 평가하였다. PyMol을 가진 표면을 초기 정상 외부 표면을 사용하여 발생시켰다; (iii) NP 펩타이드를 위해 생성된 모델은 오렉신 주형의 위치에 가능하면 가까이에 맞게 해야 한다. 만족스러운 모델을 이 방법으로 생성하였다. 정렬에서 기원하는 한 극성 미스매치(mismatch) (NP Glu-4 대 오렉신 Val-8)를 더 평가하였지만, Glu 잔기는 HLA 단백질의 결합 그루브에서 공간적으로 허용된다 (단백질의 표면과의 충돌이 관찰되지 않음).
이 결합 가설을 더 분석하기 위해, Ile/Met 돌연변이 (서열 번호: 1 및 3)를 상기 설명된 같은 원칙에 따라 결합 포켓에서 평가하였다. Ile 잔기가 Met로 돌연변이될 때, HLA 단백질의 표면과 심하게 충돌하지 않의 Met의 이형태체가 발견될 수 없다. 이 분석으로부터, Met 돌연변이는 제안된 구조적 정렬 내 이 포켓에서 허용될 수 없다는 결론이 내려진다.
동시에, 두 서열 (즉, Ile 및 Met 변이체)을 DQB1*0302 (PDB 1jk8)에서 모델링하였고 이 잔기를 수용하는 (및 공개된 서열에서 인슐린의 Tyr 잔기에 맞는) 포켓은 플렉시블(flexsible)하고 그래서 Ile 및 Met를 구별하지 않아야 한다.
유사하게, NP 서열 및 오렉신 단편 둘 다를 HLA-DQ2 구조 (PDB 1s9v)에서 모델링하였다. 오렉신 펩타이드는 DQ2 그루브에 맞으며 핏이 느슨하고 심한 충돌이 없다. 이에 반해서, NP 펩타이드는 둘 다 DQ2 표면을 통해 돌출된 매우 심한 충돌을 갖고, 이 충돌은 어떤 로타머(rotamer)에서도 치유될 수 없다.
따라서, 이 모델링 연구는 MHC 펩타이드 결합 연구와 일치한다: 모델링된 세 개의 HLA 분자 중에서 단지 DQB1*0602가 Ile/Met 변화마다 다른 NP 펩타이드를 구별할 수 있다.
따라서, MHC 펩타이드 결합 연구 및 모델링 연구는 둘 다 다른 서브타입 HLA가 아닌 DQB1*0602로 특정 X-179A 대 X-181 핵단백질-유래된 펩타이드의 차등 결합을 가리킨다.
이에 더하여, 이런 종류의 인 실리코(in silico) 모델링은 DQB1*0602 하플로타입으로의 강력한 결합을 방지해야 하는 NP 내에서 아미노산 치환을 확인하는데 사용될 수 있다.
인플루엔자 백신의 질량 분석
질량 분석법을 사용하여 X- 179A 균주의 HA를 포함하는 다섯 개의 비활성화된 분할 인플루엔자 백신 내 NP를 확인하고 정량화하는데 사용하였다. 백신의 100 μl 샘플을 10μL 50% 포름산 물의 추가에 의해 산성화시켰다. 백신을 보텍싱하였고 (vortex) 10분 동안 초음파 처리 수조에서 초음파 처리하였다. 단백질 침전을 500μL -80℃ 아세톤의 추가로 수행하였고 2시간 동안 -80℃에서 저장하였다. 샘플을 15분 동안 4℃에서 10,000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 단백질 펠릿을 스피드 백(speed vac)에서 10분 동안 건조시켰다. 백신을 20μL 8M 유레아, 50mM 암모늄 바이카보네이트 및 20μL 0.5% 프로테아제, 50mM 암모늄 바이카보네이트에서 재구성하였다. 5mM의 최종 sdh도로 DTT를 사용하여 환원을 수행하였고, 55℃에서 30분 동안 환원시켰다. 샘플을 실온으로 올려놓았고 30분 동안 실온에서 10mM의 최종 농도로 프로피온아미드를 사용하여 알칼리화하였다. 50mM 암모늄 바이카보네이트 60μL를 각 샘플에 이어서 트립신/LysC 혼합물 300ng을 추가하였다. 샘플을 37℃에서 하룻밤 동안 분해시킨 후, 이어서 수중 10% 포름산 10μL의 추가에 의해 산성화하였다. 펩타이드를 C18 마이크로스핀(microspin) 컬럼에서 정제하였고 스피드 백에서 3μL 미만으로 건조시켰다.
각 샘플을 이어서 HPLC-MSMS를 위하여 15μL 0.2% 포름산, 2% 아세토니트릴, 97.8% 물에서 재구성하였고 자가-포장된 융합된 실리카 25cm C18 역상 컬럼으로 주사하였다. 유속은 90분 동안 8% 이동상 B에서 50% 이동상 B로의 선형 구배로 300nL/분이었다. 질량 분석기는 LTQ Orbitrap Velos였고, 단편 및 15개의 가장 강한 다중 하전된 전구체 이온에 대한 데이터 의존적 획득 (data dependent acquisition; DDA) 방식으로 설정되며, 이 이온들을 60초 동안 제외 목록에 배치하였다. 결과를 서열 데이터베이스에서 검색하였다. 전구체 이온에서 10ppm 및 단편 이온에서 0.25Da의 잔류 기준 설정으로 Byonic™을 사용하여 서열 데이터에서 검색하였다. 역 유인 데이터베이스 접근법을 이용하여 1% FDR을 이용하였다. 데이터베이스는 NCBI의 모든 백신 관련 단백질 서열 (310,490)을 함유하였다. 각 백신에 대하여 단백질을 스펙트럼 수에 의해 분류하였고 및/또는 상대적 존재율 계산을 각 백신에서 스펙트럼 수에 의해 확인된 상위 10개의 단백질의 강도를 요약함으로 이루었다. 상위 10개의 단백질의 보고된 강도을 이 10에 대하여 요약된 강도에 의해 나눴고, 100을 곱하여 퍼센트 상위 10개의 존재율으로서 제공하였다.
X-179 균주의 NP 및 HA에 대한 스펙트럼 수 및 퍼센트 존재율은 다음과 같다:
Figure pct00016
추가의 분석에서, MS로 확인된 펩타이드는, 상동성 대신에, 백신에 존재하는 것으로 공지된 균주와 서열이 정확하게 일치한다. 이 방법을 사용하여 결과는 다음과 같았다:
Figure pct00017
본 발명은 예의 방식으로만 설명되었으며 본 발명의 범위 및 사상 내에 남아있는 한 변형이 이루어질 수도 있다.
서열
서열 번호: 1 X-179A NP 단편 106-126)
RELILYDKEEIRRIWRQANNG
서열 번호: 2 (X-179A NP 전장; 498aa )
1 MASQGTKRSY EQMETDGERQ NATEIRASVG KMIGGIGRFY IQMCTELKLS DYEGRLIQNS
61 LTIERMVLSA FDERRNKYLE EHPSAGKDPK KTGGPIYRRV NGKWMRELIL YDKEEIRRIW
121 RQANNGDDAA AGLTHMMIWH SNLNDATYQR TRALVRTGMD PRMCSLMQGS TLPRRSGAAG
181 AAVKGVGTMV MELVRMIKRG INDRNFWRGE NGRKTRIAYE RMCNILKGKF QTAAQKAMMD
241 QVRESRNPGN AEFEDLTFLA RSALILRGSV AHKSCLPACV YGPAVASGYD FEREGYSLVG
301 IDPFRLLQNS QVYSLIRPNE NPAHKSQLVW MACHSAAFED LRVLSFIKGT KVLPRGKLST
361 RGVQIASNEN METMESSTLE LRSRYWAIRT RSGGNTNQQR ASAGQISIQP TFSVQRNLPF
421 DRTTIMAAFN GNTEGRTSDM RTEIIRMMES ARPEDVSFQG RGVFELSDEK AASPIVPSFD
481 MSNEGSYFFG DNAEEYDN
서열 번호: 3 (X-181 NP 단편 106-126)
RELILYDKEEMRRIWRQANNG
서열 번호: 4 (X-179A NP 단편 130-150)
WRQANNGDDAAAGLTHMMIWH
서열 번호: 5 (X-181 NP 단편 130-150)
WRQANNGDDATAGLTHMMIWH
서열 번호: 6 (X-179A HA 단편 136-157)
KTSSWPNHDSNKGVTAACPHA
서열 번호: 7 (X-181 HA 단편 136-158)
KTSSWPNHDSDKGVTAACPHA
서열 번호: 8 (X-179A NP 단편 108-116)
LILYDKEEI
서열 번호: 9
LXLYXXXIXXXXXX
서열 번호: 10 (X-179A NP 단편 108-126)
LILYDKEEIRRIWRQANNG
서열 번호: 11
LILYDKEEX
서열 번호: 12 (X-181 NP 전장; 498aa )
1 MASQGTKRSY EQMETDGERQ NATEIRASVG KMIGGIGRFY IQMCTELKLS DYEGRLIQNS
61 LTIERMVLSA FDERRNKYLE EHPSAGKDPK KTGGPIYRRV NGKWMRELIL YDKEEMRRIW
121 RQANNGDDAT AGLTHMMIWH SNLNDATYQR TRALVRTGMD PRMCSLMQGS TLPRRSGAAG
181 AAVKGVGTMV MELVRMIKRG INDRNFWRGE NGRKTRIAYE RMCNILKGKF QTAAQKAMMD
241 QVRESRNPGN AEFEDLTFLA RSALILRGSV AHKSCLPACV YGPAVASGYD FEREGYSLVG
301 IDPFRLLQNS QVYSLIRPNE NPAHKSQLVW MACHSAAFED LRVLSFIKGT KVLPRGKLST
361 RGVQIASNEN METMESSTLE LRSRYWAIRT RSGGNTNQQR ASAGQISIQP TFSVQRNLPF
421 DRTTIMAAFN GNTEGRTSDM RTEIIRMMES ARPEDVSFQG RGVFELSDEK AASPIVPSFD
481 MSNEGSYFFG DNAEEYDN
서열 번호: 13 (PR/8/34 NP 전장; 498aa )
1 MASQGTKRSY EQMETDGERQ NATEIRASVG KMIGGIGRFY IQMCTELKLS DYEGRLIQNS
61 LTIERMVLSA FDERRNKYLE EHPSAGKDPK KTGGPIYRRV NGKWMRELIL Y DKEE I RRIW
121 RQANNGDDA T AGLTHMMIWH SNLNDATYQR TRALVRTGMD PRMCSLMQGS TLPRRSGAAG
181 AAVKGVGTMV MELVRMIKRG INDRNFWRGE NGRKTRIAYE RMCNILKGKF QTAAQKAMMD
241 QVRESRNPGN AEFEDLTFLA RSALILRGSV AHKSCLPACV YGPAVASGYD FEREGYSLVG
301 IDPFRLLQNS QVYSLIRPNE NPAHKSQLVW MACHSAAFED LRVLSFIKGT KVLPRGKLST
361 RGVQIASNEN METMESSTLE LRSRYWAIRT RSGGNTNQQR ASAGQISIQP TFSVQRNLPF
421 DRTTIMAAFN GNTEGRTSDM RTEIIRMMES ARPEDVSFQG RGVFELSDEK AASPIVPSFD
481 MSNEGSYFFG DNAEEYDN
서열 번호: 14 ( Ox2R 단편)
1 TKLEDSPPCR NWSSASELNE TQEPFLNPTD YDDEEFLRYL WREYLHPKEY EWVLIAGYII
61 VFVVALIGNV LVCVAVWKNH HMRTVTNYFI VNLSLADVLV TITCLPATLV VDITETWFFG
서열 번호: 15 ( Ox1R 단편)
1 MEPSATPGAQ MGVPPGSREP SPVPPDYEDE FLRYLWRDYL YPKQYEWVLI AAYVAVFVVA
61 LVGNTLVCLA VWRNHHMRTV TNYFIVNLSL ADVLVTAICL PASLLVDITE SWLFGHALCK
서열 번호: 16 ( Orexin 단편)
MNLPSTKVSWAAV
서열 번호: 17 (서열 번호: 1의 단편)
YDKEEIRRIWRQ
서열 번호: 18 (X-179A NP 단편)
LILYDKEEIRRIWRQ
서열 번호: 19 (X-181 NP 단편)
LILYDKEEMRRIWRQ
서열 번호: 20 (X-179A NP 단편)
VGKMIGGIGRFYIQM
서열 번호: 21
SGAAGAAVKGVGTMV
서열 번호: 22
EKATNPIVPSFDMSN
서열 번호: 23
IDPFKLLQNSQVVSL
서열 번호: 24
LILYDKEERRRRWRQ
서열 번호: 25
MNLPSTKVSWAAVTL
서열 번호: 26
MNLPSIKVSWAAVTL
서열 번호: 27
MNLPSMKVSWAAVTL
서열 번호: 28
LTVAAWSVKTSPLNM
서열 번호: 29
GAGNHAAGILTLGKR
서열 번호: 30
ASGNHAAGILTMGRR
서열 번호: 31
AMERNAGSGIIISDT
서열 번호: 32
ALNRGSGSGIITSDA
서열 번호: 33
ALSRGFGSGIITSNA
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any amino acid <400> 9 Leu Xaa Leu Tyr Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 10 Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala 1 5 10 15 Asn Asn Gly <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> 'Xaa' is any amino acid <400> 11 Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Xaa 1 5 <210> 12 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 12 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Met Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu 245 250 255 Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser 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Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu 245 250 255 Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val 340 345 350 Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Asn Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495 Asp Asn <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Thr Lys Leu Glu Asp Ser Pro Pro Cys Arg Asn Trp Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Glu Leu Asn Glu Thr Gln Glu Pro Phe Leu Asn Pro Thr Asp Tyr Asp 20 25 30 Asp Glu Glu Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Glu Tyr Leu His Pro Lys 35 40 45 Glu Tyr Glu Trp Val Leu Ile Ala Gly Tyr Ile Ile Val Phe Val Val 50 55 60 Ala Leu Ile Gly Asn Val Leu Val Cys Val Ala Val Trp Lys Asn His 65 70 75 80 His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Val Leu Val Thr Ile Thr Cys Leu Pro Ala Thr Leu Val Val Asp 100 105 110 Ile Thr Glu Thr Trp Phe Phe Gly 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ser Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu Phe Leu 20 25 30 Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr Glu Trp Val 35 40 45 Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala Leu Val Gly Asn 50 55 60 Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His His Met Arg Thr Val 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu Ala Asp Val Leu Val Thr 85 90 95 Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp 100 105 110 Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys 115 120 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Asn Leu Pro Ser Thr Lys Val Ser Trp Ala Ala Val 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 17 Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln 1 5 10 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 18 Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 19 Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Met Arg Arg Ile Trp Arg Gln 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 20 Val Gly Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 21 Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 22 Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 23 Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Val Ser Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 24 Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Arg Arg Arg Arg Trp Arg Gln 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Asn Leu Pro Ser Thr Lys Val Ser Trp Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Asn Leu Pro Ser Ile Lys Val Ser Trp Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Asn Leu Pro Ser Met Lys Val Ser Trp Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 28 Leu Thr Val Ala Ala Trp Ser Val Lys Thr Ser Pro Leu Asn Met 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gly Ala Gly Asn His Ala Ala Gly Ile Leu Thr Leu Gly Lys Arg 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ser Gly Asn His Ala Ala Gly Ile Leu Thr Met Gly Arg Arg 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 31 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 32 Ala Leu Asn Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asp Ala 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 33 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala 1 5 10 15

Claims (20)

  1. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 상기 핵단백질의 단편은 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드보다 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하며, 단 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  2. 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질 중 아무것도 서열 번호: 1에서 나타난 아미노산 서열을 가진 펩타이드와 같거나 더 높은 친화도로 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체에 결합하는 서열 번호: 2의 아미노산 106 내지 126과 동등한 단편을 포함하지 않으며, 단 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 서열을 포함하면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래된 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 조성물에서 모든 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 백신 조성물.
  4. 제3 항에 있어서, 조성물에서 모든 핵단백질이 서열 번호: 3에서 나타난 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 백신 조성물.
  5. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 아미노산 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 잔기를 갖지 않으며, 단 조성물에서 모든 인플루엔자 A 핵단백질이 서열 번호: 12에서 나타난 아미노산 서열을 포함하면, 그때 백신 조성물은 균주 A/California/7/2009 (H1N1)-유래 균주 NYMC X-181을 기반으로 하지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  6. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 아미노산 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신을 갖지 않으며, 단 모든 핵단백질이 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 아미노산 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 메티오닌을 포함하면 그때 상기 핵단백질은 서열 번호: 12로서 나타난 서열을 갖지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  7. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 2에서 나타난 핵단백질 아미노산 서열의 아미노산 116에 해당하는 위치에서 이소류신 또는 메티오닌 잔기를 갖지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  8. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 핵단백질은 서열 번호: 2, 서열 번호: 12, 또는 서열 번호: 13에서 나타난 아미노산 서열을 포함하지 않는 인플루엔자 백신 조성물.
  9. 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, 핵단백질은 변형되지 않은 핵단백질과 비교하여 HLA DQB1*0602를 포함하는 MHC 등급 II 수용체로 그것의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형된 인플루엔자 백신 조성물.
  10. 인플루엔자 바이러스 핵단백질을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물로서, (i) 조성물은 분할 비리온 백신이고 존재하는 핵단백질의 양은 헤마글루티닌 10μg 당 3μg 미만의 핵단백질이거나 또는 (ii) 조성물은 서브유닛 백신이고 존재하는 핵단백질의 양은 헤마글루티닌 10μg 당 0.5μg 미만인 핵단백질인 인플루엔자 백신 조성물.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제11 항에 있어서, 보조제는 수중유 에멀젼인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제12 항에 있어서, 보조제는 토코페롤을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, Triton 또는 Tween, 또는 이것들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유행성 인플루엔자 균주에 대한 백신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제11 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 분할 비리온 백신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  18. 백신은 적어도 4가지 다른 인플루엔자 바이러스의 항원 및 서열 번호: 2에서 나타난 아미노산 서열을 가진 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질을 포함하며, 보조제는 추가적인 면역자극제를 함유하지 않은 수중유 에멀젼 보조제이고, 조성물은 Triton을 함유하는 것을 특징으로 하는 보조된 분할 인플루엔자 백신.
  19. 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 소아 집단 (0-36개월) 및/또는 청소년 집단 (4-19살) 및/또는 독감 백신 접종에 관련된 자가면역 질환에 걸릴 유전적 성향을 가진 대상체에서 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 또는 백신 조성물.
  20. 백신 생산에 대한 적합성에 대하여 인플루엔자 A 바이러스를 테스트하는 방법으로서, 인플루엔자 바이러스의 핵단백질, 또는 이것의 단편은 H1N1 균주 X-179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있는지 결정하는 단계를 포함하며, 인플루엔자 바이러스는 그것의 핵단백질이 균주 X- 179A의 핵단백질과 비교하여 같은 조건 하에서 더 낮은 친화도로 HLA DQB1*0602에 결합할 수 있으면 백신 생산에 적합한, 방법.
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