KR20080009101A - 현탁 조류 배아 유래 줄기세포주에서의 바이러스 백신제조방법 - Google Patents

현탁 조류 배아 유래 줄기세포주에서의 바이러스 백신제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 백신의 개발 및 제조에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 바이러스 벡터 및 백신의 산업적 생산 분야에 관한 것이며, 더 구체적으로는 바이러스 벡터 및 바이러스를 생산하기 위한 조류 배아 줄기세포, 바람직하게는 닭 배아 줄기세포로부터 유래된 EBx 세포주의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 및 동물의 바이러스 감염을 예방하기 위한 바이러스 백신의 산업적 생산에 유용하다.

Description

현탁 조류 배아 유래 줄기세포주에서의 바이러스 백신 제조방법{Process of Manufacturing Viral Vaccines in Suspension Avian Embryonic Derived Stem Cell Lines}
본 발명은 바이러스 백신의 개발 및 제조에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 바이러스 벡터 및 백신의 산업적 생산 분야에 관한 것이며, 더 구체적으로는 바이러스 벡터 및 바이러스를 생산하기 위한 조류 세포, 바람직하게는 조류 배아 유래 줄기세포주의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 및 동물의 바이러스 감염을 예방하기 위한 바이러스 백신의 산업적 생산에 유용하다.
집단 예방접종은 광역 유행성 독감 및 대유행기 사이의 독감 발생과 같은 바이러스성 독감을 컨트롤하기에 가장 간단하고 가장 효과적인 시도가 될 수 있으며, 미국에서의 탄저병과 같이 근래에 활동하는 테러리스트와 같은 바이오테러리스트의 활동을 예방할 수도 있다. 그러나, 인플루엔자 및 천연두 백신과 같은 많은 바이러스 백신은 최근에 달걀-기반 시스템에서 생산되었으며, 백신 제조자의 최근 생산 능력은 광역 유행성의 경우 또는 바이오테러리스트의 공격에 대한 요구를 만족시키 기에는 충분하지 않다.
예측불가능한 간격 그리고 계절성 경증상의 인플루엔자 유행은 항원 소폭 변이(antigenic drift) 또는 재집합, 존재하지 않는 인구 집단에 있는 면역과 대항하여 발생하는 완전히 새로운 인플루엔자 바이러스 서브타입과의 항원 변위에 의해 유발된다. 이것들은 전세계에 급속하게 전파되는 글로벌한 광역 유행성을 유발한다. 이들 광역 유행성 중의 3개는 마지막 세기(1918, 1957, 1968)에 일어났다. 가장 심각한 것이 1918년에 일어나, 세계 인구의 약 50%를 감염시켰으며, 이 중 약 25%는 심각한 질병을 앓았고; 총 사망율은 20-40 백만으로 추산되었으며, 특히 가장 혈기왕성한 사람들이었다. 이 광역 유행은 10세 이후의 인구 증가를 감소시켰다. 가장 높은 사망율과 광역 유행성을 마지막으로 나타낸 것은 1997년 이었으며, 이때 새로운 인플루엔자 바이러스(H5N1)가 홍콩에서 유발하여 감염된 환자의 1/3을 사망시켰고, 이는 주로 청소년이었다. 운좋게도, 이 바이러스는 사람으로부터 다른 사람으로 전파되지는 않았기 때문에 전파를 빠르게 중단시킬 수 있었다. 유사한 바이러스가 홍콩에서 2003년에 분리되었다. 미국에서, 후발 광역 유행성 충격이 18-42 백만의 환자에 감염되었고, 입원 314,000-734,000, 사망 89,000-207,000을 기록하여, 이 후발 광역 유행성이 1957년 또는 1968년의 광역 유행성과는 유사하지만 1918년의 광역 유행과는 그렇지 않은 것으로 추측되었다(Meltzer MI, Cox NH and Fukuda K. The economic impact of pandemic influenza in the United States: priorities for intervention. Emerging Infectious Diseases 1999; 5:659-671). 이 계획된 충격을 전세계 인구에 비율적으로 외삽하여 추정하면, 이 다음 광역 유행의 전세계적 충격이 1-2 천만 케이스의 독감, 5.3-12.3 백만 케이스의 심각한 질병 및 1.3-3.5 백만의 사망으로 추측할 수 있다.
잠재적 광역 유행과는 달리, 연간 인플루엔자 유행은 각 계절 마다 인구의 약 10-20%를 감염시키며, 발열성 병, 입원 및 사망을 유발하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 다양한 변이에 의해 유발된다. 간접적인 통계법이 인플루엔자의 총 부하를 예측하는데 사용되었으며; 이는 인플루엔자 유행 시기 동안 이환율과 사망율의 계절성 증가를 정량화하는 다양한 통계 모델을 포함한다 (Simonsen L., Clarke MJ, Williamson GD, Stroup DF, Arden NH, Schonber LB. The impact of influenza epidmics on mortality: introducing a severity index. Am J. Public Health 1997; 87:1944-1950). 이러한 방법을 이용했을때, 미국 내에서의 평균 인플루엔자 활동기가 25-50 백만 케이스의 독감, 150,000명 입원, 20,000-40,000명의 사망과 관련이 있었다. 인플루에자 이환율의 나이-특이적 위험율이 미국에서의 것과 유사하고, 광역 유행 내에서의 인플루엔자의 연간 평균 발생이 약 1천만 케이스의 독감, 약 3-5 백만 케이스의 심각한 질병 및 250,000-500,000명의 사망과 비슷한 것으로 추측된다(WHO 리포트 참조, Geneva, April 2003: State of the art of new vacines Research & Development - Initiative for Vaccine Research).
최근에 이용가능한 인플루엔자 백신은 광역 유행기 내에서의 인플루엔자-관련 질병을 예방하는데 효과적이며, 입원 및 사망을 예방하기 위해서 매우 효과적이다. 이러한 결과에도 불구하고, 선진국 및 개발도상국에서는 매년 재-접종이 필요함에도 불구하고 상대적으로 매우 비싼 백신의 가격으로 인해 "매우 높은 위험군에 속하는 집단"의 거의 대부분이 아직도 예방을 하지 못하고 있다. 그러나, 아주 최근에, 이 인플루엔자 백신의 사용이 전세계적으로 증가하기 시작하여 약 235 백만이 2003년에 사용하였으나, 최근의 백신 생산량은 광역 유행성 백신의 요구량과 여전히 큰 차이를 보이고 있다. 세계 보건 기구(WHO)에서는 약 1.2 백만 인구가 심각한 인플루엔자 발생에 대해 "매우 심각한" 그룹에 속하는 것으로 추측한다(65세 이상, 신생아, 청소년, 만성 건강의 문제를 가진 성인, 의료계 노동자, ...).
허가받은 인플루엔자 백신을 생산하기 위해 사용되는 최근의 달걀-기반 시스템은, 50년 이상 신뢰되어 오던 것임에도 불구하고 다음과 같은 한계를 나타낸다:
·정부조달을 필요로 하고, 각 개별적인 생산 작업을 위해 많은 양의 달걀을 질적으로 컨트롤하는 것을 필요로 하는, 시간이 많이 걸리고, 성가시며 자원-소비적인 제조 과정. 최근의 이 달걀-기반 생산 시스템은, 잠재적 이익의 차익금이 매우 적기 때문에 새로운 제약 회사들이 달걀-기반 독감 백신 사업으로 가도록 유도하지를 못하고 있다;
· 인플루엔자 시기보다 최소한 6개월을 앞서나가는 백신에 들어갈 바이러스 균주를 선택해야 하는 필요성. 어떤 균주가 인플루엔자 백신에 포함될지 빨리 선택하는 것이 항상 정확하지는 않을 것이며, 백신을 생산하기 위해 필요한 긴 시간은 중간단계에서의 수정 작업을 불가능하게 한다;
· 증가하는 요구를 계속적으로 만족시키기 위해 매년 충분한 인플루엔자 백신을 생산해야 하는 필요성(약 250 백만개가 2004년에 산업화 국가에서, 약 100 백만개가 오직 미국에서 사용). 2004-2005년 겨울 동안 미국 내에서 최근 인플루엔 자 백신의 부족분은 달걀-기반 독감 백신 제조업체 중 UK-계 공장에서의 오염에 의해 유발되어 큰 이슈가 되었다. 더불어, 인플루엔자 백신의 전세계적인 생산 능력은 전세계적인 "높은 위험" 인구의 일부를 커버하기에 충분하지 않다. 실제로, 전세계의 기반시설이 광역 유행성 인플루엔자 백신의 시간적 배분과 전달을 핸들링할 수 있는지도 의문이다;
· 백신을 생산하기 위해 필요한 수정된 달걀의 백만개 중의 백개가, 공여자 닭 무리에서의 유행성 감염의 경우 달걀을 공급하기에 충분하지 않은 위험성을 갖고 있는 것;
· 약독화된 인플루엔자 바이러스의 경우, 값비싼 특정 무병원체(SPF, specific pathogen free) 달걀을 사용해야 하는 필요성;
· BSE-면제국으로부터 생겨난 소 혈청의 사용과 관련된 인플레이션 비용;
· 일부 개인에서의 달걀-기반 성분의 알레르기 유발성;
· 닭에게 매우 전염성이 강하고 죽일 수 있는 바이러스를 전파시키기 위한 달걀 사용의 불가능.
더불어, 최근의 백신 기술은 광범위한 생산으로 백신을 생산하지만, 유감스럽게도 대부분은 신규한 인플루엔자 바이러스 광역유행 균주에 대해 완전히 대항할 수 있을 정도로 백신을 비축하고 있다.
기존과는 다르게, 바이오테러리스트의 위협은 탄저병과 연관되어 활동하는 최근의 테러리스트 처럼 지난 몇해 동안 수많은 서부 국가 정부에서 주요한 걱정거 리가 되었다. 미국 정부는 바이오테러리즘 준비 및 대응 법(Bioterrorism Preparedness and Response Act)을 2002년에 실행함으로써, 생물학적 공격에 대한 빠른 진단, 방어 및 대응을 하기 위해 적절한 방법을 갖고 있다. 생물학 무기는 대중 및 정부를 위협하고 굴복시키기 위한 저렴하고 효과적인 방법으로서, 바이오테러리스트 조직에게는 상대적으로 접근하기 쉽고 구성하기 쉬운 것으로 간주된다. 특히, 생물학 무기로서 천연두 바이러스의 사용이 최근 몇년동안 증가하였으며, 몇몇 국가에서는 이러한 위험을 처리하기 위해 우발상황 계획을 개발하였다.
천연두는 전염을 유발하는 경우, 뒤이어 흑사병, 탄저병 및 보툴리늄독소증을 유발하여 광범위한 피해를 유발시키는 매우 큰 잠재성을 가진 것으로 간주된다. 천연두는 1980년에 박멸된 것으로 선포되었으며, 전세계 모든 나라는 이때 이후로 그들의 백신화 프로그램을 중지시켰다. 이는 바이러스 감염에 대한 인류의 면역성이 점진적으로 감소되도록 유도함으로써, 바이오테러리스트가 발생할 경우 천연두 바이러스는 훨씬 더 위험한 제제로서 작용하게 하였다. 미국의 질병 통제 센터(CDC, Center for Disease Control)에서는 천연두를 클래스 A 바이오테러리스트 제제, 즉 쉽게 증식하고 높은 치사율을 가진 가장 위험한 미생물 중의 하나로 분류하였다.
다량의 빠른 백신 접종은 천연두의 발생을 조절하기 위한 이상적인 시도가 될 것이다. 미국 정부는 추가적으로 백신 저장량을 확보하고, 군대원 및 핵심 의료계 종사자를 백신 접종하며, 건강 상태에 대해 관심을 갖니 않는 모든 인류에게 제공할 수 있는 안전한 백신의 개발을 위한 프로그램을 확립하고 있다. 타국 정부 에서는 미국의 이러한 경과를 지켜보고 있을 뿐만 아니라 그들 자체의 비상사태 준비력을 평가하고 있다.
최근, 정부들은 그들만의 1세대 스탁(stocks)을 획득 또는 생산하거나, 통상적인 제안서를 발행하였다. 동물로부터 직접 회수된 1세대 백신은 효과적인 것으로 보였으나; 이들은 특히 면역약화된 개인에서 부작용과 합병증의 가능성을 매우 증가시키는 불순물과 박테리아를 종종 포함하고 있었다. 천연두의 박멸 때문에, 제한된 개수의 제약회사들은 재빠르게 천연두 백신에 뛰어들어 생산할 수 있었다. 이들 그룹 중 극히 일부는 우수 제조 표준 기술에 따라 적격의 세포 배양을 한 Dryvax
Figure 112007079830277-PCT00001
및 리스터-엘스트리(Lister-Elstree) 백시나 균주를 이용하는 2 세대 백신을 생산할 수 있다. 그러나, 1 세대와 같이, 이들 백신은 면역약화된 개인에 대해서는 접합하지 않다. 1 세대 및 2 세대 백신을 이용한 대량의 예방접종은 백만명 중 한명을 사망시키고, 10배 이상의 심각한 질병을 일으킬 수 있는 합병증을 유발할 수 있다. 결국, 안전한 3 세대 백신은 훨씬 더 극소수의 제약회사에 의해 개발되었다. 3 세대 백신은 1970년대 독일에서 천연두 박멸 기간 동안 사용된 변형된 백시나 안카라(MVA) 바이러스의 균주를 기반으로 한다. 임상 실험에서, MVA 투여는 약 150,000명에서 통상의 천연두 예방접종에서 간주되는 많은 위험을 포함한 심각한 부작용을 일으키지 않았다.
이러한 천연두 백신은 닭 배아로부터 분리된 1차 닭 배아 섬유아세포에서 생산되었다. 이러한 생산 시스템은 다음과 같은 몇가지 심각한 한계가 있다:
- 정부조달을 필요로 하고, 각 개별적인 생산 작업을 위해 많은 양의 달걀 또는 CEFs를 질적으로 컨트롤하는 것을 필요로 하는, 시간이 많이 걸리고, 성가시며 자원-소비적인 제조 과정;
- 많은 경우, 값비싼 특정 무병원체(SPF, specific pathogen free) 달걀을 사용해야 하는 필요성;
- 공여자 닭 무리에서의 유행성 감염의 경우 달걀을 공급하기에 충분하지 않은 위험성을 갖고 있는 것;
- BSE-면제국으로부터 생겨난 소 혈청의 사용과 관련된 인플레이션 비용;
- 일부 개인에서의 달걀의 알레르기 유발성;
- 닭에게 매우 전염성이 강하고 죽일 수 있는 바이러스를 전파시키기 위한 달걀 사용의 불가능.
달걀-기반 및 CEFs 생산 방법이 비교적 신뢰성이 있는 과정이지만, 효율적인 세포-기반 생산 시스템은 바이러스를 생산하기 위한 더 빠르고, 저렴하고 훨씬 더 성가시지 않은 방법을 제공하기 위한 유의적인 진보가 될 것이다. 더불어, 독감 광역 유행기의 경우, 세포 배양 기반의 제조 방법은 다음과 같은 추가적인 이점을 제공한다:
- 인플루엔자 백신의 생산은, 검증되고, 분리되며, 배포된 광역 유행기 이후에 신속하게 시작할 수 있다;
- 달걀에서 생산하는데 필요한 고성장 리소턴트(High Growth Reassortants, 발육란에서 높은 성장 수율을 나타내도록 개조된 바이러스)의 개발을 기다릴 필요 가 없다;
- 1차 백신 배치의 이용은, 달걀-기반 과정에서 6-9 개월이 소요되는데 반해, 균주로부터 얻은 뒤 약 9주면 가능하다;
- 세포-기반 방법은 달걀에서 적합하게 성장할 수 있는 균주의 생산을 가능하게 한다(예, 1997년의 조류 홍콩 독감);
- 광역 유행기 동안 달걀을 보관해야 하는 문제점이 없다.
더불어, 바이러스 백신을 제조하기 위해 달걀 또는 CEF 플랫폼 대신에, 세포주를 이용하는 것은 백신의 안전성과 관련된 다음과 같은 추가적인 이점을 가질 것이다: 독성 보존제(티오머살[thiomersal] 등)가 필요없음; 감소된 엔도톡신 레벨, 달걀 알러지 없음; 단백질 및 무혈청 배지에서의 성장(외래의 제제/BSE가 없음); 바이러스 백신 제조의 높은 순도.
따라서, 최근의 달걀 또는 닭-배아 섬유아세포 기반의 바이라스 백신 생산 기술에서 급속한 진보가 필요하다. 바이러스 백신을 제조하기 위한 닭 및 CEF 샌산 시스템에 대한 대안으로서 세포-배양 플랫폼의 개발은 최근의 백신 생산의 병목현상과 시간 압박을 해결하기 위한 가장 빠르고 약속가능한 해결책이다. 더불어, 세포-배양 생산 기술은 광역 유행기 또는 테러리스트의 공격에 대항하여 백신 생산 능력을 향상시킬 수 있는 가능성을 증가시킬 것이다.
이러한 구체적인 요구에 기초하여, 본 발명자들은 조류 생물학과 조류 배아 줄기(ES) 세포의 전문기술에서의 이점을 이용해, 인간 및 수의사 백신 및 백신 후 보자의 효율적인 복제를 가능하게 하고, 산업적, 통제적 및 의학적 설명을 만족시킬 수 있는 신규하고 안정한 조류 세포주를 개발하였다. 특허된 방법(참고 WO 03/076601 및 WO 05/007840)을 이용해, 본 발명자들은 특성이 규명되고 증명된 세포주(EBx
Figure 112007079830277-PCT00002
세포) 세트를 생산하였으며, 이는 유전적, 화학적 또는 바이러스 불멸화(immortalization)의 단계를 거치지 않은 닭 ES 세포로부터 유발된 것이다. EBx
Figure 112007079830277-PCT00003
세포는 완전하게 증명된 다음 2 단계의 과정을 이용하여 조절 요건을 고려하여 생산되었다:
단계 1: 닭 ES 세포의 분리, 시험관내 배양 및 증식
배아 줄기 세포는 유일하게 다음과 같은 특징을 갖는다: (i) 비분화된 세포 처럼 시험관내에서 자가-복제을 무제한 할 수 있다, (ii) 무제한적인 재생 능력을 가진다, (iii) 안정한 염색체 성분을 유지한다, (iv) 높은 레벨의 텔로머라제 및 특정 세포-표면 마커를 발현한다. 전세계적인 많은 노력에도 불구하고, ES 세포는 매우 제한된 수의 종(생쥐, 인간, 원숭이)으로부터만 성공적으로 분리되었다. 본 발명자들은 다양한 조류 종으로부터 ES 세포를 분리하고 확립하기 위해 수년동안 많은 노력을 기울였다. 이러한 연구 노력 결과, 닭 ES 세포를 성공적으로 분리 및 특성화하기에 이르렀다[Pain et al. 1999. Cell Tissue Organs 165: 212-219]. 그리고 난 뒤, 본 발명자들은 분화 유도 없이 닭 ES 세포를 효율적으로 시험관내 배양하고 대량으로 확장시킬 수 있게 하는 독점적인 방법을 개발하였다.
단계 2: EBx
Figure 112007079830277-PCT00004
세포의 유도(derivation):
본 발명자는 닭 ES 세포로부터 안정한 부착 세포주 및 현탁 세포주를 유도하는 독점적인 방법을 확립하였다. 이 방법은 세포 배양 배지로부터 혈청, 영양 세포층 및 성장 인자를 점진적으로 제거하고, 세포를 현탁 배양으로 적응시키는 단계를 포함한다. 이러한 배아 유도된 닭 세포주는 ES 세포의 대부분의 바람직한 특징(즉, 무제한적 증식, 텔로머라아제와 같은 ES 특이적 마커의 발현, 핵형의 안정성)을 유지하지만, 추가로 새로운 "산업-친화적(industrial-friendly)" 특징을 보여준다(무혈청 배지에서 현탁 상태로 성장하는 것).
이러한 매력적인 생물학적 특징에 기초하여, 본 발명자들은 추가적으로 개발하기 위해 현탁 세포주 EB14로부터 유도된 부착 세포주 EB45(WO 03/076601 및 WO 05/007840에서 S86N45라고도 불림)와 같은, 일부 닭 EBx
Figure 112007079830277-PCT00005
세포주를 선별하였다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 닭 EBx
Figure 112007079830277-PCT00006
세포는 EB45 및 EB14 세포주 중에서 선별하였다. 더욱 바람직한 실시예에서, 닭 EBx
Figure 112007079830277-PCT00007
세포주는 EB14 또는 이의 서브-클론 EB14-074이다. 간단하게 하기 위해, EB14 및 EB14-074는 이하 EB14라고 부르기로 한다. EB45 및 EB14 세포는 장기간의 배양(>150 계대) 동안 배아 줄기 세포 표현형(즉, 높은 핵-세포질 비율)을 나타낸다. EB45 및 EB14 세포는 큰 핵과 핵소체를 가진 작은 세포이며, 세포질 막으로부터 뻗어나가는 짧은 위족을 보인다(도 1). EB45 및 EB14 세포는 신진대사적으로 활동성이 높으며, 리보좀과 미토콘드리아가 많은 세포질을 갖고 있다. EB45 및 EB14 세포의 유전적 분석에서는 이들이 남성이 고, 두배수체이며 세대를 거쳐 유전적으로 안정함을 보여준다(도 2). EB45 및 EB14 세포는 알칼라인 포스파타아제, EMEA-1 및SSEA-1과 같은 줄기 세포-특이적 세포 표면 마커(도 5) 및 ES 세포-특이적 ENS1 유전자(도 4)를 발현한다. 특히 중요한 것은, EB45 및 EB14 세포가 세대를 통해 안정하게 유지되는 높은 수준의 텔로머라아제 효소 활성을 보인다(도 3). 텔로머라아제는 세포 성장 및 염색체 안정성을 계속적으로 촉진하는 중요한 효소이다. 면역-억제된 신생아 래트 모델에서 수행된 3주 및 2.5달의 발암성(tumorigenicity) 분석에서는 EB14 세포가 생체내에서 비-발암성임을 보여주었다. EB45 및 EB14 세포는 39℃(닭의 체온)에서 약 16시간, 37℃에서 약 20시간의 매우 짧은 세대(generation) 주기를 보여주였다. 따라서, 이러한 세포주는 인플루엔자 및 천연두 백신과 같은 바이러스 백신을 상업적으로 생산하기 위한 훨씬 효과적이고, 안전하며 비용-절감적인 세포 기질이라는 유일한 특징을 가진다.
EBx
Figure 112007079830277-PCT00008
세포, 보다 구체적으로는 본 발명의 EB14 세포는 인플루엔자와 천연두 백신 뿐만 아니라 다른 중요한 인간 및 동물 바이러스 백신(표 1)-홍역, 볼거리, 황열병 백신 또는 HIV 또는 암과 같은 감염성 질환에 대한 연구용 폭스바이러스와 같이 배아기 달걀 또는 닭 일차 섬유아세포에서 최근에 생산된-을 생산하는데 있어서 높은 가치가 있다. 최근의 데이터에서는 EBx
Figure 112007079830277-PCT00009
세포주의 능력, 보다 구체적으로는 수개의 재조합 및 야생형 바이러스를 복제하는 능력을 이미 검증하였다. 예를 들어, 예비 실험에서는 EBx
Figure 112007079830277-PCT00010
세포가 인플루엔자 바이러스(참고, 프랑스 우선권 특허 출원 FR 05 03583, 2005년 4월 11일 출원, 실시예 3, 30-41 페이지) 및 변형된 백시나 바이러스 안카라(MVA)(참고 WO 05/007840)의 복제를 도와주는 것을 확인하였다.
표 1
조류 돼지 말 인간 재조합
인플루엔자 바이러스 인플루엔자 바이러스 인플루엔자 바이러스 천연두 카나리아 폭스
레오마이러스 동부 말 뇌척수염 인플루엔자 바이러스 닭(fowl) 폭스
닭(fowl)폭스 바이러스 서부 말 뇌척수염 홍역 바이러스 변형된 백시나 바이러스 안카라(MVA)
카나리아폭스 바이러스 볼거리 바이러스 알파바이러스- 신비스(sinbis) 바이러스
닭(chicken) 폭스 바이러스 광견병 알파바이러스- 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스
사이타신(psittacine) 헤르페스 바이러스 황열병 바이러스 알파바이러스- 베네수엘라 EEV
뉴캐슬병 바이러스 진드기매개 뇌염 조류 아데노 바이러스-CELO
팔콘 헤르페스 바이러스
비둘기 헤르페스 바이러스
감염성 윤활낭(bursal)병 바이러스
감염성 기관지염 바이러스
마렉(Marek's)병 바이러스
칠면조 헤르페스 바이러스
닭 빈혈 바이러스
조류 뇌척수염 바이러스
폴리오나바이러스 타입 I&II
아데노바이러스 타입 I&II
상기에 나열된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00011
세포, 더 구체적으로는 EB14 세포의 독특한 특징은 EBx
Figure 112007079830277-PCT00012
세포에서 바이러스 백신을 제조하기 위한 구체적인 방법의 개발을 포함한다. 또한, 기존의 이론과는 달리, EBx
Figure 112007079830277-PCT00013
세포의 높은 대사 능력은 세포 성장 및 바이러 스 복제를 위해 세포에게 충분한 에너지를 제공하기 위한 세포 배양 배지를 요구한다. 본 발명의 목적은, 달걀 및 CEFs에서 최근에 생산되는 바이러스 백신의 상업적 생산을 위해, 조류 배아 유도된 줄기 세포 EBx
Figure 112007079830277-PCT00014
, 더 구체적으로는 EB14 세포를 기반으로 하는 혁신적이고 효율적인 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 조류 유도된 줄기 세포 EBx
Figure 112007079830277-PCT00015
, 바람직하게는 EB14 세포에서 바이러스를 복제시키는 방법을 제공하며, 다음과 같은 단계를 포함한다:
- EBx 세포 배양물을 대상 바이러스와 감염시키는 단계, 상기 EBx 세포는 동물 혈청이 존재하지 않는 배지에서 배양됨;
- 상기 바이러스를 복제하기 위해 감염된 EBx 세포를 배양하는 단계;
- 세포 배양 상등액 및/또는 상기 세포 내에서 바이러스를 수득하는 단계.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 상기 EBx 세포, 바람직하게는 EBx 세포를 무혈청 배지 No1이 들어있는 배양 용기에서, 현탁상태로 증식시키는 단계;
b) 세포 농도가 최소 1.5 백만 세포/㎖이 될때 상기 세포를 선별된 바이러스와 감염시키는 단계;
c) 감염 바로 직전, 감염시킴과 동시에, 또는 감염 직후에 상기 감염물을 세포 배양 무혈청 배지 No2에 첨가시키는 단계; 및
d) 바이러스를 증식시키기 위해 상기 감염된 세포를 추가로 배양하는 단계; 및
e) 선택적으로, 상기 바이러스를 회수하는 단계.
본원에 사용된 용어 "바이러스"는 자연적으로 발생하는 바이러스 뿐만 아니라 약독화된 바이러스, 재조합된(reassortant) 바이러스, 바이러스 균주, 재조합 바이러스 및 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 아데노바이러스, 헤파드나바이러스(hepadnaviruses), 헤르페스 바이러스, 오쏘믹소바이러스(orthomyxoviruses), 파포바바이러스(papovaviruses), 파라믹소바이러스, 피코나바이러스(picornaviruses), 폭스바이러스, 레오바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 바이러스, 연관된 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 바이러스 백신은 폭스바이러스 과(family), 보다 바람직하게는 코도폭스비리대(chordopoxviridae)에 속한다. 일 실시예에서, 바이러스 또는 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 바이러스 백신은 닭폭스 바이러스, 카나리아 폭스 바이러스(즉 ALVAC), 준코폭스 바이러스, 마이나폭스(mynahpox) 바이러스, 싸이타신폭스(psittacinepox) 바이러스, 메추리폭스바이러스, 참새폭스바이러스, 찌르레기폭스바이러스, 칠면조 폭스바이러스로부터 선택되는 조류폭스바이러스이다. 다른 바람직한 실시예에 따르면, 상기 바이러스는 Lister-Elstree 백시나 바이러스 균주, ATCC로부터 얻을 수 있는 변형된 백시나 바이러스 안카라(MVA, ATCC 넘버 VR-1508), NYVAC(Tartaglia et al., 1992 Virology 188: 217-232), LC16m8(Sugimoto et Yamanouchi 1994 Vaccine 12:675-681), CVI78(Kempe et al., 1968 Pediatrics 42:980-985) 및 다른 재조합 또는 비-재조합 백시나 바이러스와 같은 변형된 백시나 바이러스로부터 선택된 백시나 바이러스이다.
다른 바람직한 구현예에서, 바이러스, 연관된 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 오쏘믹소바이러스 과(family), 구체적으로는 인플루엔자 바이러스에 속한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 말 이플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 고양이 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다. 인플루엔자 바이러스는 균주(strain) A, B 및 C로부터 선택되는 것이 바람직하다. 균주 A 중에서는, H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 또는 H9N2에만 국한되는 것은 아니지만 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제(neuraminidase)의 다른 서브타입을 가진 바이러스를 열거할 수 있다. H1N1 균주 중에서는, A/Porto Rico8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91, A/Singapore를 열거할 수 있다. 균주 H3N2 중에서는, A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94를 열거할 수 있다. B 균주 중에서는, 이에 국한 되는 것은 아니지만 B/Porto Rico8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98를 열거할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 야생형 바이러스, 감염된 환자로부터 수득된 일차 바이러스 분리물, 재조합 바이러스, 약독화된 바이러스, 온도 민감성 바이러스, 저온 순화된 바이러스, 재편성된(reassortant) 바이러스, 역 유전자 변형된 바이러스로부터 선택된다.
본 발명의 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 경우, 본 발명의 방법은 바이러스 증식을 가능하게 하는 조건에서 배양 배지에 단백질분해 효소를 첨가하는 단계를 포함한다. 단백질 분해효소는 트립신, 키모트립신, 써모라이신(thermolysine), 펩신(pepsine), 판크레아틴, 파파인, 프로나아제(pronase), 서브틸리신 A, 엘라스타아제, 퓨린(furine) 및 카르복시펩티다아제로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 효소는 트립신이다. 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 약 0.5 내지 1 mg/㎖ 내지 25 mg/㎖이다. 더 바람직하게는, 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 0.01 내지 10 usp/㎖(usp: US pharmacopea unit)이고, 가장 바람직하게는 0.3 내지 1 usp/㎖이다. 바람직하게는, 단백질 분해 효소는 원핵생물 숙주에서 생산된 재조합 단백질이다.
다른 바람직한 구현예에서, 바이러스, 연관된 바이러스 백터, 바이러스 입자 및 백신은 파라믹소바이러스 과, 바람직하게는 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 볼거리 바이러스 및 풍진 바이러스에 속한다.
다른 바람직한 구현예에서, 바이러스, 연관된 바이러스 벡터, k이러스 입자 및 백신은 비마바이러스(bimavirus) 과, 바람직하게는 감염성 윤활낭 병 바이러스에 속한다.
재조합 바이러스는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 이형 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 바이러스의 복제를 위한 도움 작용은 숙주 세포 EBx
Figure 112007079830277-PCT00017
, 헬퍼(helper) 바이러스, 또는 헬퍼 플라스미드에 의해 제공된다. 대표적인 벡터는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 조류 또는 포유동물 세포를 감염시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 <<조류>>는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 닭, 칠면조, 오리, 기러기, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치(finches), 매, 까마귀, 타조, 에뮤(emu) 및 화식조(cassowary) 생물과 같이, 분류학적으로 <<ava>> 클래스의 모든 종(species), 아종(subspecies) 또는 속(race)으로 간주된다. 이 용어는 갈러스 갈러스(Gallus gallus)의 모든 균주, 또는 닭[예를 들어 화이트 레그혼, 브라운 레그혼, 베어드-록(Barred-Rock), 서섹스(Sussex), 뉴 햄스피어, 로드 섬, 오스트랄로프(Australorp), 미노카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이, 이탈리안 파티지-컬러(Partidge-colored)] 뿐만 아니라, 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 일상적으로 길러진 가금류의 균주를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 세포는 닭 세포이다.
본 발명의 배양 용기는, 바람직하게는 연속적으로 교반되는 탱크 생물반응기, WaveTM 생물반응기, BelloTM 생물반응기, 스피너 플라스크, 플라스크 및 세포 팩토리로부터 선택된다. 전형적으로, 세포는 다양한 크기의 T-플라스크 또는 롤러 병을 통해 마스터 또는 작동 세포 뱅크 바이알로부터 스케일이 증가되며, 바람직하게는 생물반응기에서 최종적으로 스케일 증가된다. 그리고 난 후, 제조된 세포 현탁물은 추가적인 배양을 위해 씨드(seed) 생산 생물반응기(일반적으로 20-30 L 부피)로 공급되며, 실시예에 따르면 대량 생산 생물반응기(일반적으로 150-180 L 부피)로 공급된다. 씨드 생물반응기에 대한 이차 (더큰) 생물반응기의 부피비는 일차 생물반응기에서 증식된 세포주의 정도에 의존하지만, 바람직하게는 3:1 내지 10:1, 즉 (6-8):1의 범위이다. 바람직한 구현예에 따르면, 배양 용기는 온도, 공기순환, pH 및 다른 조절 조건이 조절되는 연속 교반 탱크 생물반응기이며, 다음과 같은 장치가 장착되어 있다:
- 세포, 멸균 산소, 배양을 위한 다양한 배지 등을 주입하기 위한 적당한 입구(inlet);
- 세포 및 배지를 제거하기 위한 출구(outlet); 및
- 생물반응기에 있는 배양 배지를 혼합하기 위한 수단.
본 발명에 따르면, "무혈청 배지(serum-free medium)"(SFM)는 사용하기 위해 준비된 세포 배양 배지를 의미하며, 즉, 세포 생존과 세포 성장을 가능하게 하는 혈청의 첨가를 필요로 하지 않는다. 이 배지는 화학적으로 정제될 필요는 없으며, 다양한 기원, 이를테면 식물로부터의 가수분해물을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 SFM은 "비 동물 기원"으로 한정되며, 즉, 동물 또는 인간 기원의 성분을 포함하지 않는다(FAO status: "동물 기원이 없음"). SFM에는, 천연 혈청 단백질이 재조합 단백질로 대체된다. 대신, 본 발명에 따른 SFM 배지는 단백질(PF 배지: "무-단백질 배지") 및/또는 화학적 정제(CDM 배지: "화학적으로 정제된 배지")된 것를 포함하지 않는다. SFM 배지는 여러가지 이점이 있다: (i) 이중에 첫번째는 이러한 배지의 조절 순응도(regulatory compliance)(대신에 BSE, 바이러스와 같은 우발적 제제에 의한 오염의 위험이 없다); (ii) 정제 과정의 최적화; (iii) 훨씬더 정제된 배지로 인해 공정에서의 훨씬 더 높은 재생산율. 상업적으로 이용가능한 SFM 배지의 예는 다음과 같다: VP SFM(InVitrogen Ref 11681-020, 카탈로그 2003), Opti Pro(InVitrogen Ref 12309-019, 카탈로그 2003), Episerf(InVitrogen Ref 10732-022, 카탈로그 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, 카탈로그 2003), LC17(Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM(Cambrex ref 12-766Q, 카탈로그 2003), HyQ SFM4CHO(Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility(Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293(Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), Ex 세포 293 배지(JRH Biosciences ref 14570-1000M), Ex 세포 VPRO 배지(JRH Biosciences ref 14560-1000M), Ex 세포 302 무혈청 배지(JRH Biosciences ref 14312-1000M), Ex 세포 65319(JRH Biosciences), Ex 세포 65421(JRH Biosciences), Ex 세포 65625(JRH Bioscience), Ex 세포 65626(JRH Bioscience), Ex 세포 65627 (JRH Bioscience), Ex 세포 65628(JRH Bioscience), Ex 세포 65629(JRH Bioscience), 유전자 치료 배지 3(무-동물 성분)(SIGMA-Aldrich, ref G-9916)(이하 G9916 배지라 일컫음).
본 발명의 첫번째 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No1 및 무-혈청 배지 No2는 유사한 배지이다.
본 발명의 두번째 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No1 및 무-혈청 배지 No2는 다른 성분을 갖고 있다. 예를 들어, 무-혈청 배지 No1은 Excell 65319(SAFC Bioscience)이고, Opti Pro 배지(InVitrogen Ref 12309-019, 카탈로그 2003)는 무-혈청 배지 No2가 될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No1은 Ex cell 65319(JRH Bioscience)이다. 두번째 바람직한 구현에에 따르면, 무-혈청 배지 No1은 Ex cell 65421(JRH Bioscience)이다.
바람직한 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No2는 Ex cell 65319(JRH Bioscience)이다. 두번째 바람직한 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No2는 G9916(SIGMA-Aldrich)이다.
본 발명의 방법은 무-혈청 배지 1 전체 또는 일부를 제거한 뒤 무-혈청 No2로 대체하는 단계를 포함한다. 그러나, 무-혈청 배지 1의 실질적인 부분(즉, 약 50% 까지)을 제거한 뒤, 배지 1을 제거하는 동안 이를 스핀필터(spinfilter)를 통해 무-혈청 배지 No2로 대체하는 것이 훨씬 더 편리하다. 바람직한 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No1의 일부를 제거하지 않고 무-혈청 배지 No1에 직접 무-혈청 배지 No2가 첨가된다. 무-혈청 배지 No2의 0.25 내지 10 부피가 무-혈청 배지 No1 1 부피에 첨가된다. 바람직한 구현예에서는, 무-혈청 배지 No2의 0.5 내지 8 부피가 무-혈청 배지 No1 1 부피에 첨가된다. 더 바람직한 구현예에서는 무-혈청 배지 No2의 3 내지 6 부피가 무-혈청 배지 No1 1 부피에 첨가된다.
무-혈청 배지 No1 및/또는 무-혈청 배지 No2는 아미노산, 지질, 지방산, 콜레스테롤, 탄수화물, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분으로 조성된다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 아미노산, 지질, 지방산, 콜레스테롤, 탄수화물, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 세포에 공급하는 추가적인 단계를 포함하는 페드-배치(fed-batch) 방법이다. 첫번째 구현예에 따르면, 상기 공급 단계는 단계 a) 내지 d) 동안, 선택적으로는 오직 단계 b) 내지 d) 동안, 또는 오직 단계 d) 동안 발생한다. 상기 공급은 매일 마다 또는 계속적으로 발생할 수 있다. 상기 공급이 연속적이지 않을 때, 상기 공급은 하루당 1회, 하루당 1회 이상 또는 하루당 1회 미만 발생할 수 있다.
본 발명의 SFM 배지는 아미노산, 비타민, 유기염 및 무기염, 탄수화물의 근원, 시험관 내에서 세포 배양을 도와주는 양으로 존재하는 각 성분을 포함하는 다수의 성분을 포함한다. 그러나, 세포 성장 또는 바이러스 생산도를 향상시키기 위해, 추가 성분이 SFM 배지에 첨가된다.
세포 배양에 첨가되는 아미노산의 선택은 배양되고 있는 세포에 의한 아미노산 소비를 분석함으로서 결정될 수 있다. 바람직한 구현에에 따르면, 배지에 첨가되는 아미노산은 아스파라긴 및 글루타민 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서는, 글루타민이 첨가되며, 글루타민의 공급 단계는 배지 내의 글루타민 농도를 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 바람직하게는 약 1 mM 내지약 3 mM, 가장 바람직하게는 약 2 mM을 유지하기 위해 단계 a) 내지 d) 동안 수행된다. 바람직한 구현예에서, 글루타민의 공급은 기본적으로 연속적으로 이루어진다.
바람직한 구현예에 따르면, 배지에 첨가되는 탄수화물은 D-글루코스, D-수크로스 및 D-갈락토스 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에 따르면, 첨가되는 탄수화물은 D-글루코스이다. D-글루코스의 공급은 배지 내의 D-글루코스 농도를 약 0.5 g/ℓ 내지 25 g/ℓ, 바람직하게는 약 1 g/ℓ 내지 10 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 약 2 g/ℓ 내지 3 g/ℓ를 유지하도록, 단계 a) 내지 d) 동안, 더욱 바람직하게는 b) 내지 d) 동안 수행된다. 바람직한 구현예에서, D-글루코스의 공급은 기본적으로 연속적으로 이루어진다.
바람직한 구현예에 따르면, 지질은 콜레스테롤, 스테로이드 및 팔미틱산, 팔미토레익산, 스테아릭산, 올레익산, 리놀레익산, 리놀레닉산 및 이의 치환체와 같은 지방산 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 지방산은 SIGMA-ALDRICH(Ref. F7050)의 것이며, 약 0.35 ㎕/㎖의 지방산 용액이 q양배지에 첨가된다.
바람직한 구현예에 따르면, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물은 박테리아 트립톤, 효모 트립톤, 콩 가수분해물과 같은 식물 가수분해물, 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물은 효모 가수분해물이다.
용어 "가수분해물(hydrolysate)"은 콩 펩톤 또는 효모 추출물의 효소적 분해물을 포함한다. 가수분해물은 대다수의 콩 펩톤 또는 효모 추출 조제품으로부터 얻어지며, 이 각각은 추가적으로 효소적 분해되거나(예를 들어, 파파인에 의해), 및/또는 자가용해(autolysis), 열분해(thermolysis) 및/또는 원형질분해(plasmolysis)에 의해 형성된다. 또한, 가수분해물은 Yeastolate, Hy-Soy, Hy-Yeast 412 및 Hi-Yeast 44와 같은 것, 그리고 JRH BioSciences (Lenaxa, KA), Quest International (Norwich, N.Y), OrganoTechnie S.A(France) 또는 Deutsche Hefewerke GmbH(Germany)와 같은 수득처로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 또한, 효모 추출물의 수득처는 WO 98/15614에 기술되어 있다. 본 발명의 배지에 사용된 가수분해물은 조추출물 분획으로부터 얻는것이 바람직한데, 그 이유는 효율적인 배양을 방해할 수 있는 불순물이 이러한 정제 과정 동안 바람직하게 제거되고, 이로 인해 가수분해물의 농도를 향상시키기 때문이다. 정제는 한외여과 또는 세파덱스 크로마토그래피(예를 들어, 세파덱스 G25 또는 세파덱스 G10 또는 동등한 물질을 이용해), 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 또는 "역상(reversed-phase)" 크로마토그래피에 의해 수행된다. 바람직하게는, 정제는 10 kDa 컷-오프 필터를 이용한 한외여과에 의해 수행된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법을 사용하면, 정제는 정제된 콩 또는 효모 가수분해물을 분자량 단위로 선별할 수 있다. 바람직하게는, 콩 및 효모 가수분해물의 평균 분자량은 약 220 내지 375 달톤이다.
바람직하게는, 효모 가수분해물이 세포 배양 배지에 존재한다. JRH-BIOSCIENCES(Ref 58902)로부터 얻어진 효모 가수분해물 50X(약 200 g/ℓ)는 배양 배지에 약 0.1X 내지 2X, 바람직하게는 약 0.5X 내지 1X로 포함된다. 또한, 콩 가수분해물이 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. JRH-BIOSCIENCES(Ref 58903100M)로부터 얻어진 콩 가수분해물 50X는 배양 배지에 최종 농도 약 0.1X 내지 2X, 바람직하게는 약 1X로 첨가된다. 선택적으로, 콩 가수분해물 및 효모 가수분해물의 혼합물은 US2004/0077-86에 기술된 바와 같은 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다.
배지는 소듐 바이카보네이트와 같은 완충 물질, 산화 안정제, 물리적 스트레스를 중화하는 안정제, 또는 프로테아제 저해제와 같은 보조 성분을 포함할 수 있다. 요구된다면, 폴리프로필렌 글리콜(PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 또는 PLURONIC F-108)과 같은 비이온성 계면활성제가 거품형성억제제로서 배지에 첨가될 수 있다. 이들 제제는 계면활성제를 첨가하지 않고도, 공기 거품("sparging")의 표면에 존재하는 세포의 손상을 유도할 수 있는 공기 거품을 위로 상승시켜 터지게 함으로써, 공기순환의 부작용으로부터 세포를 보호하는데 일반적으로 사용된다. 비이온성 계면활성제의 양은 바람직하게는 약 0.05 내지 약 10 g/L, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 g/L이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 세포 배양 배지 내의 계면활성제의 농도는 세포 클럼프의 크기가 커지는 것을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 세포 배양에 무-혈청 배지 No2를 첨가하는 단계는 감염 단계 b) 이후에 수행되며, 바람직하게는 단계 b) 수행 약 0.5 내지 4시간 뒤에, 더욱 바람직하게는 단계 b) 수행하기 약 1시간 전에 수행한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 무-혈청 배지 No2의 첨가 단계는 감염 단계 b와 거의 동시에 수행된다.
바이러스 감염 단계 b)는 약 10 내지 10-6, 바람직하게는 약 10-2 내지 10-5, 더욱 바람직하게는 약 10-4 m.o.i(multiplicity of infection)로 수행된다. 당업자라면 바이러스 타입에 따른 적절한 m.o.i를 결정할 수 있을 것이다.
단계 c)에서, 감염된 세포는 최소 24시간, 최소 48시간, 최소 72시간, 최소 96시간, 최소 120시간, 최소 144시간 동안 배양되는 것이 바람직하다. 바이러스가 폭스바이러스일 때, 상기 감염된 세포는 최소 144시간 배양된다.
본 발명의 방법에서, 세포 배양 단계 a)는 배치(batch) 배양, 반복 배치 배양, 페드-배치(fed-batch) 배양 또는 관류(perfusion) 배양에 의해 수행된다. 더욱 바람직하게는, 세포 배양 단계 a)는 페드-배치 배양에 의해 수행된다. 단계 b)에서의 감염은 세포 농도가 최소 약 4백만, 바람직하게는 6백만 세포/㎖, 더욱 바람직하게는 8백만 세포/㎖일 때, 배치 또는 페드-배치 배양에서 수행된다. 관류 방법이 사용되는 경우, 단계 b)에서의 감염은 세포 농도가 최소 8백만 세포/㎖, 바람직하게는 약 9 내지 10 백만 세포/㎖, 또는 그 이상일때 수행된다.
단계 a), b), c) 및 d)에 있는 무혈청 배양 배지의 pH는 생물반응기에 의해 모니터되는게 바람직하다. 상기 pH는 6.5 내지 7.8, 바람직하게는 약 6.8 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 약 7.2의 범위이다.
본 발명의 방법에서, 단계 d)는 수득하기 전 2 내지 10일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에 따르면, 단계 d)는 수득하기 3 내지 7일 동안 유지된다.
세포 배양은 바이러스 타입에 따라 32℃ 내지 39℃의 온도에서 수행된다. 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해, 세포 배양 감염은 33℃에서 수행하는 것이 바람직하다.
EBx
Figure 112007079830277-PCT00018
세포는 소량의 세포, 100개 이상까지의 세포가 약하게 응집되어 있는 상태로 현탁 배양에서 자랄 수 있다. 기존의 이론과는 달리, 클럼프의 크기는 세포 배양 배지의 조성물에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜(PLURONIC F-61, FPURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 또는 PLURONIC F-108)과 같은 계면활성제의 존재 및 교반(stirring)은 클럼프 사이즈에 영향을 줄 것이다. 본 발명자는 최소한 본 발명의 방법의 단계 a) 동안 본 발명의 EBx
Figure 112007079830277-PCT00019
세포가 서로서로 응집되게 하여 클럼프를 형성함으로써 바이러스 수율이 증가할 수 있다는 발견하였다. 마스터 및 다양한 사이즈의 T-플라스크 또는 롤러-바틀을 통해, 마스터 및 작동 세포 뱅크 바이알로부터 생물반응기로 용량-증가시키는 동안, 현탁 세포는 새로운 배지로 희석시키거나 또는 원심분리후 세포 펠렛을 재-현탁시켜 새로운 배지로 희석시킴으로써, 일반적으로 더 큰 용기로 계대된다(passaged). 본 발명자는 세포 계대 동안, 배양에서 큰 세포 클럼프를 유지시키는 것이 요구됨을 발견하였다. 이를 위해, EBx
Figure 112007079830277-PCT00020
세포에서의 바이러스 복제를 향상시키기 위해 세포 클럼프를 파괴하지 않는 것이 더 낫다. 예를 들어, T-플라스크 또는 롤러-바틀에서의 배양 단계 a)의 최초 기(phase) 동안은, 세포를 계대시키기 위해 세포 배양을 더 큰 용기로 희석시킬 필요가 있으며, 원심분리하거나, 피펫팅 또는 교반에 의해 세포 클럼프를 파괴시키지 않을 필요가 있다. 그러나, 너무 많은 클럼프는 높은 바이러스 생산율을 위한 차선책이 될 수 있다. 결론적으로, 당업자라면 단계 a)의 최초 세포 계대 동안 피펫팅 또는 교반을 함으로써 클럼프의 일부를 파괴하는 것이 바이러스 수율을 향상시킬 수 있는지 여부를 정의내릴 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에 따르면, 폭스바이러스, 바람직하게는 MVA, ALVAC 및 Fowlpox 바이러스는 미약하게 응집되어 있는 소량의 세포에서 클럼프된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00021
세포를 증식시켜, 최소 100개의 세포, 최소 200개의 세포, 최소 500개의 세포, 최소 1000개의 세포로 세포수를 증가시키는 단계 a)를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 얻어진다.
또한, 본 발명은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 닭 배아 섬유아세포(CEFs, chicken embryonic fibroblasts), VERO 세포, PerC6, MDCK와 같은 바이러스를 증식시키기 위해 사용되고, 세포 클럼프로서 현탁상태로 성장할 수 있는 다른 세포 타입에도 적합하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻을수 있는 바이러스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다. 바이러스 백신의 제조 방법은 본 발명에 따른 바이러스를 복제시키는 공정을 포함하며, 여기서 바이러스를 수득하는 단계 e)는 여과, 농축, 냉동 및 안정화제의 첨가에 의한 안정화 중에서 선택되는 최소한 한개를 포함한다. 바이러스 수득은 당업자에게 공지된 기술에 따라 수행된다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 바이러스를 수득하는 단계는, 세포 배양 농축물로부터 얻어지는 세포 배양 상등액을 수집한 뒤, 여과하고, 농축하고, 냉동하고, 안정화제를 첨가하여 바이러스 제조물을 안정화시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스에 대해서는 다음을 참고한다, Furminger, In Nicholson, Webster and Hay(Eds) Textbook of influenza, chapter 24 pp324-332.
또한, 본 발명에 따른 바이러스 백신 제조 방법은 수득된 바이러스를 불활성화시키는 추가 단계를 포함할 수 있다. 불활성화 단계는 포름알데하이드, 베타-프로피오락톤, 에테르, 에테르와 계면활성제(즉, Tween 80TM과 같은 것), 세틸-트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 및 트리톤 N102, 소듐 데옥시콜레이트 및 트리(N-부틸)포스페이트를 이용한 처리에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이러스로부터 바이러스 항원 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기의 추가적인 단계를 포함한다:
a) 선택적으로, 바이러스 전체를 포함하는 세포 배양 상등액을 데옥시리보뉴클레익산 제한효소, 바람직하게는 DNAses(참조, EC3.1.21 및 EC3.1.22 분류) 및 뉴클레아제(참조, EC3.1.30 및 EC3.1.31 분류)와 배양하는 단계;
b) 양이온성 계면활성제의 첨가 단계. 양이온성 계면활성제의 예는 다음과 같다; 이에 한정되지는 않음: CTAB와 같은 세틸-트리메틸 암모늄 염, 미리스틸-트리메틸 암모늄 염, 리포펙틴, DOTMA 및 TweenTM;
c) 항원 단백질의 분리 단계. 상기 이후 단계는 원심분리 또는 한외여과에 의해 달성된다.
백신에 있는 바이러스는 활성화 바이러스 입자, 또는 분해된 바이러스 입자로서 존재할 수 있다. 구현예에 따르면, 백신은 사멸 또는 불활성화된 백신이다. 다른 구현예에 따르면, 상기 백신은 생 약독화 백신이며, 상기 백신은 본 발명의 방법에 의해 수득가능하고, 바람직하게는 혈청이 없고, 선택적으로는 여과 및/또는 농축된 EBx 세포 배양 상등액을 주로 포함한다. 세번째 구현예에 따르면, 백신은 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스로부터 수득가능한 바이러스 항원 단백질을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 감염된 세포주 EBx
Figure 112007079830277-PCT00022
세포, 바람직하게는 EB14를 포함하는 백신을 제공하는 것에 관한 것이며, 여기서 감염된 세포주 EBx
Figure 112007079830277-PCT00023
, 바람직하게는 EB14는 단계 d)에서 수득된다.
본 발명의 백신은 면역 반응을 증가시키는 약제학적으로 허용가능한 성분을 본 발명의 백신에 혼합한 것을 포함할 수 있다. 면역 반응을 증가시키는 성분의 비제한적인 예로는, 프룬드(Freund) 애주번트(adjuvant), 사포닌, 알로미늄 하이드록사이드 염, 라이소레시틴, 플루토닉 폴리올, 폴리아나이온(polyanions), 펩타이드, BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파븀(corynebacterium parvum)을 포함한다. 합성 애주번트의 예는 QS-21이다. 추가로, 면역-촉진 단백질(인터루킨 IL1, IL2, IL3, IL4, IL12, IL13, 과립구 집락 자극인자, ...)이 백신 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 바람직하게는 액상의 제형, 동결 제제, 탈수 및 동결 제제이며, 선택적으로는 코-내 경로로 투여하도록 적용된다.
본 발명의 백신은 바람직하게는 천연두 및 인플루엔자, 홍역, 볼거리 및 루펠라 바이러스 중에서 선택되는 바이러스에 의해 감염된 인간의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위해 사용된다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스 백신은 암과 같은 만성 질환 또는 AIDS와 같은 감염성 질환의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 EBx
Figure 112007079830277-PCT00024
세포주는 재조합된(reassorted) 바이러스를 생성시키고 제조하는데 유용하다. 인플루엔자 바이러스와 같이 절단된 게놈을 갖는 바이러스가 재조합될 수 있다. 본 발명의 EBx
Figure 112007079830277-PCT00025
세포를 최소 2개의 다른 인플루엔자 바이러스 균주로 감염시킬 때, 두개의 다른 균주로부터의 절단된 게놈의 혼합이 유사한 숙주세포에 존재한다. 바이러스 조립 동안, 게놈 단편의 모든 조합이 이론적으로 생성될 수 있다. 따라서, 특정 재조합 바이러스는 항체, 예를 들어 요구되는 처치를 한 바이러스(참조, Kilnourne E.D in Poltkin SA and Mortimer E.A. Eds. Vaccines 1994)를 이용한 선별 또는 제거를 통해 분리될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 EBx
Figure 112007079830277-PCT00026
세포주는 역(reverse) 유전학(참조, Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805(1990); Enami et Palease, J. Virol. 65:2511-2513(1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113(1989))에 의해 인플루엔자 바이러스를 생성하고 생산하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바이러스 또는 이의 성분을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 제조예 및 실시예는 당업자 훨씬 더 명확하게 이해하고, 실시할 수 있도록 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 실시예의 범위에 의해 제한되지는 않으며, 단지 본 발명의 일부분을 예시할 뿐이며, 기능적으로 동일한 범위의 방법도 본 발명의 범위에 속한다. 하기에 기재된 것에 추가로 이후의 설명 및 이에 따르는 도면으로부터 본 발명을 다양하게 변형하는 것도 당업자에게는 용이하다. 이러한 변형은 첨부되는 청구항의 범위내의 것으로 간주된다. 명세서의 나머지를 설명하기 위해, 하기에 도면의 범례에 대한 설명이 첨부된다.
도 1: EB14 세포의 투과전자현미경 분석
EB14 세포는 생쥐 배아 줄기 세포(mES)의 표현형을 닮은 전형적인 배아 줄기 세포의 형태(즉, 높은 핵-세포질 비율)를 보인다. EB14 세포는 큰 핵과 핵형을 갖고, 세포질 막으로부터 뻗어나가는 짧은 위족을 갖는 작은 둥근 세포이다. 이들은 리보좀과 미토콘드리아가 풍부한 세포질을 가져서 대사 활성이 높다. EB14 세포의 세포 모양은 닭 배아 섬유아세포(CEF) 중의 하나와는 다르다.
도 2: 계대 105 및 118에서의 EB14 세포의 핵형분석
계대 105 및 118까지 무혈청 배지에서 배양한 EB14 세포의 분석에서는 18개의 마크로-염색체 및 30개의 마이크로-염색체가 존재하는, 이배체의 세포 특성을 가지는 것으로 확인된다(윗 패널). 이 결과는 닭 세포에 대해 예측된 염색체 수와 동일하다(아래 패널)
도 3: EB14 세포 내에서의 텔로머라제 발현
다른 계대에서의 무혈청 배지내에서 배양된 EB14 세포의 텔로머라제 발현은 로슈사의 텔로머라제 검출 킷트(Telomerase OCR ELISA)를 사용하여 확인하였다. 텔로머라아제는 EB14 세포에서 높게 발현되는 것으로 확인된다. 높은 레벨의 텔로머라제 발현은 계대 89, 계대 290(EB14 세포 마스터 세포 뱅크와 상응), 및 계대 179(계대 생산의 마지막과 상응)에서 보여지는 바와 같은 계대에서 유지된다. 송곳니 MDCK 세포주는 음성 대조군으로 사용되었으며, 텔로머라제를 발현하지 않는다. 유사한 흡광도의 텔로머라제 발현이 CEFs 세포에서 확인되었다(결과 미제시).
도 4: ENS1 유전자는 EB14 세포에서 발현된다.
ENS1 유전자는 닭 ES 세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 기술되어 있 다(Acloque & al., Mech Dev. 103, p79-91, 2001). EB14 세포에서의 이의 발현은 RT-PCR로 평가하였다. 조류 배아 줄기세포(ES 세포), 착란에서 수득된 조류 배아 세포 및 다양한 계대(P21, P159, P160)에서의 EB14 세포가 ENS1 유전자를 강하게 발현하는 반면, 조류 세포주 DF1(US 5,672,485) 및 닭 배아 섬유아세포(CEFs)는 이 유전자를 발현하지 않는 것으로 확인된다. 하우스키핑 GAPDH 유전자의 분석에서는 RNAs의 존재를 조절하기 위해 유사한 샘플 상에서 평행한 것으로 확인된다(아래 패널).
도 5: EB14 세포주(왼쪽 패널) 및 DF1 세포주(오른쪽 패널)에서의 ES 세포-특이 마커의 발현
EB14 세포는 EMEA1 및 SSEA1 유전자를 발현하는 반면, DF1 세포는 그렇지 않다. 팍실린(paxilline) 유전자는 대조군으로 사용된 보편적 유전자이다. EB14 세포는 세포 마커 TROMA-1, MelM, TRA-1-60 및 SSEA3를 발현하지 않는다.
도 6: EB14 및 MDCK 세포주에서의 수용체 SA 2-3 및 SAa2 -6의 세포 표면 발현
세포는 디그옥시게닌(digoxygenin) 표지된 렉틴과 배양된다: 삼부카 니그라(Sambuca nigra) 어글루티닌 렉틴은 Sia2-6Gal에 특이적으로 결합하지만, 마키아 아뮤렌시스(Maackia amurensis) 어글루티닌 렉틴은 Si2-3Gal에 특이적으로 결합한다. 세포에 결합한 렉틴은 당업자에게 널리 알려진 기술에 따라 항-디그옥시게닌 항체 FITC-표지에 의해 확인된다. FITC-표지된 세포는 형광표지세포분리기(FACS)를 이용해 갯수를 셀수 있다. SAα2-3 및 SAa2-6 분자는 조류 및 인간 인플루엔자 바이러스 각각에 대한 수용체로 기술되었다.
도 7A 및 7B: 3L- 페드배치 생물반응기에서의 EB14 세포의 성장 동역학
도 7A - EB14-유도된 바이오매스(biomass)는 0.5X 이스톨레이트(yeastolate)가 첨가된 세포 배양 배지에서 37℃로 세포 농도가 5-6.106 세포/㎖가 될때까지 유지시켰다. 그리고 난 후, 이 혼합물을 2.9배 희석시켰으며, 세포 성장 동역학을 10일 동안 지켜보았다. 13 백만 세포/㎖의 세포 농도는 5일째에 도달하였다.
도 7B - 3L 페드배치 생물반응기에 있는 EB-14 세포의 세포 성장 동역학에 대한 분리비(split ratio) 유연성: 분리비 1/10(0.4.106 세포/㎖ 농도의 0.23L를 최종 부피 2.1L에 넣음)으로 세포를 씨딩하고 난 뒤, EB14-유도된 바이오매스를 Excell 65319(SAFC) 성장 배지에서 37℃로 11일의 기간 동안 유지시켰다. L-글루타민(2 mM) 및 D-(+)-글루코스 (2g/L)의 농도는 페드-배치 공정에서 매일마다 적정시켰으며, 생물반응기 파라미터는 다음과 같이 고정시켰다: 회전 속도:80rpm, pO2:50%, pH:7.20.
도 8: 감염된 EB14 세포에서의 MVA - GFP 바이러스 증식에 대한 생산 배지 및 클럼프 사이즈의 영향: GFP 발현
EB14 세포는 세포 배양 SFM 배지(SAFC:Excell 65319)에서 세포를 증식시키는 동안 T175 교반 탱크 플라스크에서 작거나(왼쪽 패널) 큰(오른쪽 패널) 클럼프를 형성하도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 클 럼프를 감염시켰으며, 이 혼합물을 몇가지 생산 SFM 배지(Optipro, Excell 65319, Excell 65629)로 희석시켰다. 37℃에서 7일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, UV-노출 감염 세포 사진을 매일 찍었다. 대조군:optipro(INVITROGEN)는 세포 배양 및 생산 배지로서 사용되었다.
도 9: 감염된 EB14 세포에서의 MVA - GFP 바이러스 증식에 대한 생산 배지 및 클럼프 사이즈의 영향: 감염성 바이러스 역가 분석( titration )
EB14는 세포 배양 배지(SAFC Excell 65319)에서 세포 증식하는 동안 T175 교반 탱크 플라스크에서 작거나(왼쪽 패널) 큰(오른쪽 패널) 클럼프를 형성하도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 클럼프를 감염시켰으며, 이 혼합물을 몇가지 생산 SFM 배지(Optipro, Excell 65319, Excell 65421, Excell 65625, Excell 65627, Excell 65628, Excell 65629, G9916)로 희석시켰다. 37℃에서 7일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, TCID50 역가 분석은 매일 동역학 마지막에 수행하였다.
도 10: 감염된 EB14 세포에서의 MVA - GFP 바이러스 증식에 대한 생산 배지 및 첨가 성분의 영향
EB14는 세포 배양 배지(SAFC Excell 65319)에서 세포 증식하는 동안 T175 교반 탱크 플라스크에서 작은 클럼프를 형성하도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 몇가지 생산 배지(왼쪽부터 오른쪽 패널로: 배지 Excell 65319, Excell 65629 또는 G9916)로 희석시켰으며, 이 배지는 1X 이스톨레이트(성분 1) 및/또는 지방산(성분 2)를 포함하거나 포함하지 않는다. 37℃에서 7일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, TCID50 역가 분석은 동역학 마지막에 수행하였다.
도 11: 3L 페드 -배치 생물반응기에 있는 MVA - GFP 바이러스로 감염된 EB -14 세포에서의 GFP 발현
EB14-유도된 바이오매스는 Excell 65319 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 G9916 생산 배지로 희석시켰다. 37℃에서 UV-노출된 감염 세포의 사진(확대 X5 또는 X10)을 매일 찍었다(PI: 감염후).
도 12: 3L 페드 -배치 생물반응기에서 증식된 EB14 -유도된 MVA - GFP 인플루엔자 바이러스의 감염성 바이러스 역가 분석
EB14-유도된 바이오매스는 Excell 65319 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 1X 이스톨레이트가 첨가된 Excell 65319로 희석시켰다. 37℃에서 9일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, TCID50 역가 분석은 동역학 마지막에 수행하였고, CEF 세포에서 얻어진 역가와 비교하였다.
도 13: EB14 세포에서 생산된 MVA - GFP 바이러스의 전자 현미경 분석
EB14 세포를 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 감염시켰으며, 감염후 18시간, 48시간 및 72시간에 수득하였다. 고정 및 임베드된 샘플의 얇은 섹션을 전자 현미경으로 관찰하였다(Dr.D.Spehner, IGBMC, Strasbourg).
도 14: EB14 세포 상에서 생산된 복합 인간 인플루엔자 균주의 감염성 바이러스 역가 분석
EB14 세포를 T175 교반 탱크 플라스크에서 10-2 TCID50/세포의 다양한 A/H3N2, A/H1N1 및 B 인간 인플루엔자 균주-0.75 USP/㎖의 재조합 트립신의 존재하에서-로 감염시켰다. 샘플은 24시간 마다 수득하였으며, 소 혈청이 없는 상태에서 역동학의 마지막에 MDCK 세포의 역가 분석에 의해 TCID50 역가를 분석하였다. 일부 감염된 EB14 세포는 전자 현미경에서 동일하게 분석되었으며, 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하는 것으로 나타났다(오른쪽 패널; Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg).
도 15A 및 15B: EB14 세포에서의 복합 인플루엔자 바이러스 균주의 생산적 복제
도 15A- 다양한 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 EB14 세포에서의 헤마글루티닌( HA ) 웨스턴 블랏 분석
EB14 세포를 T175 쉐이킹 플라스크에서 무혈청 배지로 배양하였으며, 0.75 USP/㎖의 트립신의 존재하에서, 복합 감염도 10-4로, 표시된 바이러스 균주로 감염시켰다. 4㎕의 세포 배양 상등액을 매일 수득하였으며 10% SDS-PAGE를 이용한 전기영동 및 웨스턴-블라팅으로 분석하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인에 전기전달(electroblot)시켰으며, 미절단 HA(HA0) 또는 후절단 서브유니트 HA(HA1 및 HA2)는 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청으로 반응시켜 검출하였다. 퍼옥시데이즈가 결합된 항-양-IgG 면역염색에 사용하였다. 각 바이러스 균주에 대해, 감염후 72시간부터 168시간까지의 HA 축적을 달걀-유도된 표준 HA 제제의 증가량과 비교하였다.
도 15B- 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 EB14 -유도된 HA 생산 레벨의 SRID 분석
EB14 세포를 T175 쉐이킹 플라스크에서 다양한 A/H3N2, A/H1N1 및 B 인간 인플루엔자 균주-0.75 USP/㎖ 트립신의 존재하에서-로 감염시켰다. 샘플을 매 24시간 마다 수득하였으며, 역동학이 마지막에 연속 방사선 면역확산(SRID, Serial Radial Immunodiffusion) 분석을 수행하였다. 각 바이러스 균주에 대해, HA 축적의 계산은 확실한 상응 표준 항원의 용량-반응 커브와 비교하였다.
도 16A 및 16B: 3L 생물반응기에서 EB14 세포에서의 A/ H3N2 인플루엔자 바이 러스 균주의 생산
도 16A- A/ H3N2 / NewYork /55/2005 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 EB14 세포의 성장 동역학
EB14 바이오매스는 세포 성장 배지에서 37℃로 세포증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 A/H3N2/New York/55/2005 인플루엔자 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 0.3 USP/㎖의 트립신이 첨가된 Excell 65629 생산 배지(배지 E)로 희석시켰으며, 온도를 33℃로 낮추었다. 10일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, -80℃에 보관하였다. 왼쪽 패널: 세포 농도(x106 세포/㎖), 오른쪽 패널: 총 세포수(노란색 마름모, x107 세포) 및 생존도(빨간색 원, %).
도 16B- 웨스턴 - 블랏 및 SRID 측정에 의한 HA 분석
3L 생물반응기로부터 감염후 7일 동안의 기간동안 수득한 샘플을 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청을 이용해 생산된 HA를 검출 및 정량화하기 위해 분석하였다. 왼쪽 패널: 4㎕의 바이러스 상등액의 웨스턴 블랏 분석은 항-HA 양 항체와 함께 퍼옥시다아제 결합된 항-양-IgG를 이용하여 면역염색시켰다. HA 축적은 달걀-유도된 표준 제제의 증가량으로 비교하였다. HA0: 미절단 HA 서브유니트, HA1&HA2: 절단 SA 서브유니트. 오른쪽 패널: 10㎕ 바이러스 상등액의 SRID 정량. HA 양의 계산은 동일 표준 제제의 용량-반응 커브와 비교하였다.
도 17A 및 17B: 3L 생물반응기에서 EB14 세포에서의 B 인플루엔자 바이러스 균주의 생산
도 17A- B/ Hohannesburg /5/99 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 EB14 세포 의 성장 동역학
EB14 세포는 37℃에서 세포 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-2 TCID50/세포의 B/Hohannesburg/5/99 인플루엔자 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 0.3 USP/㎖의 트립신이 첨가된 SAFC Excell 65629 생산 배지(배지 E)로 희석시켰으며, 온도를 33℃로 낮추었다. 10일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, -80℃에 보관하였다. 왼쪽 패널: 세포 농도(x106 세포/㎖), 오른쪽 패널: 총 세포수(노란색 마름모, x107 세포) 및 생존도(빨간색 원, %).
도 17B- EB14 -유도된 B/ Hohannesburg /5/99 인플루엔자 바이러스 HA 의 웨스턴 블랏 분석
감염후 7일 동안 샘플을 수득하였으며, 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청을 이용해 생산된 HA를 검출 분석하였다. 4㎕의 바이러스 상등액은 웨스턴 블랏 분석을 수행하기 위해 사용하였으며, 여기서 항원-캡쳐된 항체는 퍼옥시다아제 결합된 항-양-IgG로 면역염색하였다. HA 축적은 달걀-유도된 표준 항원의 증가량과 비교하였다. HA0: 미절단 HA 서브유니트, HA1&HA2: 절단 SA 서브유니트.
도 18A 및 18B: 30L 생물반응기에서 EB14 세포에서의 A/ H1N1 인플루엔자 바이러스 균주의 생산
도 18A- A/ H1N1 / NewCaledonia /20/99 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 EB14 세포의 성장 동역학
EB14 세포는 세포 성장 배지에서 37℃로 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-4 TCID50/세포의 A/H1N1/NewCaledonia/20/99 인플루엔자 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 0.3 USP/㎖의 트립신이 첨가된 SAFC Excell 65629 생산 배지(배지 E)로 희석시켰으며, 온도를 33℃로 낮추었다. 8일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, -80℃에 보관하였다. 왼쪽 패널: 세포 농도(x106 세포/㎖), 오른쪽 패널: 총 세포수(노란색 마름모, x107 세포) 및 생존도(빨간색 원, %).
도 18B- EB14 -유도된 A/ H1N1 / NewCaledonia /20/99 인플루엔자 바이러스의 헤 마글루티닌 분석
감염후 7일 동안 샘플을 수득하였으며, 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청을 이용해 생산된 HA를 검출 및 정량화 분석하였다. 왼쪽 패널: 4㎕의 바이러스 상등액의 웨스턴 블랏 분석, 여기서 항원-캡쳐된 항체는 항-HA 양 항체와 함께 퍼옥시다아제 결합된 항-양-IgG로 면역염색하였다. HA 축적은 달걀-유도된 표준 제제의 증가량과 비교하였다. HA0: 미절단 HA 서브유니트, HA1&HA2: 절단 SA 서브유니트. 오른쪽 패널: 10㎕ 바이러스 상등액의 SRID 정량분석. HA 양의 계산은 동일한 표준 제제의 용량-반응 커브와 비교하였다.
실시예 1 : EBx
Figure 112007079830277-PCT00027
세포주의 유도 방법
조류 배아 유래 줄기세포주 EBx
Figure 112007079830277-PCT00028
확립(establishment) 방법은 WO 03/076601 및 WO 05/007840에 이미 기술되어 있다. 상세하게는, EBx
Figure 112007079830277-PCT00029
세포주의 확립 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 조류 세포, 바람직하게는 조류 배아 줄기 세포를, 성장에 필요한 모든 인자를 포함하고, 생쥐 섬유아세포, 바람직하게는 불활성화된 상태의 섬유아세포의 영양 세포층이 존재하며, 그리고 동물 혈청이 공급되는 완전 배양 배지에서, 분리, 배양 및 증식시키는 단계;
b) 상기 인자, 상기 혈청 및 상기 영양 세포층을 단계적으로 얻거나 완전히 제거하기 위해 배양 배지를 변형시킴으로써 계대(passage)시키는 단계;
c) 외래 성장인자, 불활성화된 영양 세포층이 없고, 낮은 레벨의 혈청 또는 혈청이 없는 기본 배지에서 증식할 수 있는 부착성 또는 비-부착성 조류 세포주를 확립하는 단계.
여기서, 단계 c)의 기본 배지는 여전히 낮은 레벨의 혈청(즉, 약 2% 또는 그 미만)을 포함하며, 상기 방법은 더이상의 외래 성장인자, 더이상의 불활성화된 영양세포층을 포함하지 않으며, 낮은 레벨의 혈청 또는 혈청이 없는 기본 배지를 교환하는 추가 단계 d)를 선택적으로 포함할 수 있으며, 다음으로부터 선택된다:
- 혈청 (i)로 조성되고 무혈청 배지로 희석된 기본 배지. 여기서 기본 배지 (i)에서 상기 조류 세포를 성공적으로 계대시키는 동안 배양하며, 여기서 무혈청 배지의 비율은 외래 성장인자, 불활성화된 영양세포층 및 혈청을 포함하지 않는 상기 기본 배지를 완벽하게 제거할때 까지 점진적으로 증가함;
- 혈청 (ii)로 조성된 무혈청 배지. 여기서 배지 (ii)에서 상기 조류 세포를 성공적으로 계대시키는 동안 배양하며, 여기서 혈청의 비율은 무혈청 배지를 수득할 때까지 점진적으로 증가함;
- 무혈청 배지 (iii). 여기서 배지 (iii)에서 상기 조류 세포를 배양하고; 그리고 난 뒤 무혈청 배지에서 유지시켜, 상기 조류세포를 배지 변화에 적응시킴.
본원에 사용된 용어 "성장을 가능하게 하는 인자"는 배양하는 동안 조류세포를 생존하고 성장하는데 필요한 성장 인자를 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 성장 인자는 영양 인자 및 사이토카인을 포함한다. 영양인자는 주로 SCF, IGF-1 및 bFGF이다. 사이토카인은 주로 이의 작용이 LIF와 같은 gp130 단백질, 인터루킨 11, 인터루킨 6, 인터루킨 6 수용체, CNTF, 온코스타틴(oncostatin) 및 카디오트로핀(cardiotrophin)과 결합된 수용체를 통해 작용하는 사이토카인이다.
단계 a)의 조류 세포는 조류 배아 세포, 더욱 바람직하게는 조류 배아 줄기 세포 및 조류 일차 세포로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 조류 배아, 더욱 바람직하게는 닭 배아(참조 EYAL-GILADI의 분류: EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, <<From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick>>. "General Morphology" doubling time comprises between 48 to 72 hours in culture at 39℃)로부터 얻어진 분리 단계 X 배아원기 세포의 현탁물로부터 분리된 전능성 또는 다능성 조류 배아 줄기 세포이다. 이러한 조류 배아 줄기 세포는 39℃에서 배양되는 동안 48 내지 72시간의 느린 배가 시간(doubling time)을 갖는 특징이 있다.
성장 인자, 혈청 및/또는 영양 세포층을 점진적으로 또는 전체적으로 제거하기 위해, EBx
Figure 112007079830277-PCT00030
세포주를 확립하는 단계 b)의 배양 배지를 변형시키는 것은 동시에, 연속적으로 또는 독립적으로 이루어질 수 있다. 배양 배지를 버리는 순서는 다음으로부터 선택될 수 있다:
- 영양 세포층/혈청/성장인자;
- 영양 세포층/성장인자/혈청;
- 혈청/성장인자/영양 세포층;
- 혈청/영양 세포층/성장인자;
- 성장인자/혈청/영양 세포층;
- 성장인자/영양 세포층/혈청.
바람직한 구현예에서, 버리는 순서는 성장인자/영양 세포층/혈청이다.
이 방법은 혈청-제거 배지 또는 혈청이 완전히 없는 배지에서 성장 가능한 안정 세포주가 얻어질 때까지 새롭고, 과감하게 증가하는 배양 조건에 적응한 세포 클론을 선별 가능하게 한다. 확립된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00031
세포주는 외래 성장 인자가 없고 영양 세포층이 배제된 혈청이 없는 배지에 현탁되어 증식하는 비 부착성 줄기 세포인 것이 바람직하다.
"완전 배양 배지"는 성장 인자 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배지를 의미한다. 완전 배양 배지의 예는 다음에 기술되어 있다; Pain et al. (1996, Development 122:2339-2348), EP 787,180 및 US 6,114,168, US 5,340,740, US 6,656,479 및 US 5,830,510. 본 발명에 따르면, "기본 배지"는 단독으로, 최소한 세포를 생존하게 하고, 더 바람직하게는 세포 성장을 가능하게 하는 기본적인 배지 성분을 포함하는 배지를 의미한다. 기본 배지의 예로는 상기에 기술된 바와 같은 SFM 배지 또는 BME(basal Eagle Medium), MEM(minimum Eagle Medium), medium 199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium), GMEM(Galsgow modified Eagle Medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, Isocove's Modified Dulbecco's medium, MacCoy's 5A medium, RPMI 1640과 같은 배지이다. 기본 배지는 무기염(예: CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4, ...), 아미노산, 비타민(티아민, 리포플라빈, 폴릭산, D-Ca 판토테네이트, ...) 및 글루코스, 베타-머캅토에탄올, 소듐 피루베이트와 같은 다른 성분을 포함한다.
두 그룹의 성장인자는 개략적으로 구분 가능하다: 사이토카인 및 영양 인자. 사이토카인은 주로 gp130 단백질과 결합한 수용체를 통해 작용하는 사이토카인이다. 따라서, LIF, 인터루킨 11, 인터루킨 6, 인터루킨 6 수용체, CNTF, 온코스타틴 및 카디오트로핀은 특정 체인의 수용체 레벨로 보충하고, gp130 단백질과 상기 특정 체인 수용체가 결합하여 단량체 또는 때로는 이량체 형태로 보충하는 작용과 같은 유사한 작용을 한다. 영양 인자는 주로 SCF, IGF-1 및 bFGF이다. 더 바람직 하게는, 완전 배지는 기본 배지, 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), CNTF(Ciliary Neurotrophic factor), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 선택적으로 인터루킨 11(IL-11) 및 동물 혈청을 포함한다. 조류 세포, 바람직하게는 단계 a)의 조류 배아 세포는 완전 배지에서의 수회의 계대 동안 배양된다. 상기 배지는 다음 그룹으로부터 선택되는 최소 하나의 성장 인자로 조성된다:LIF, IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, IL-11, 온코스타틴, 카디오트로핀. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 완전 배양 배지는 IGF-1 및 CNTF로 조성된 기본 배지이다. 다른 구현예에 따르면, 완전 배양 배지는 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, 선택적으로 IL-11로 조성된 기본 배지이다. 상기 기본 배지 내의 성장 인자 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, 선택적으로 IL-11의 농도는 약 0.01 내지 10 ng/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 5 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 약 1 ng/㎖이다.
계대 3 내지 10 이후에, 완전 배지는 성장 인자가 고갈된다(단계 b). 바람직하게는, 각 성장 인자에 대해, 한 계대에서 다른 계대로 넘어가는 한 단계에서 고갈이 직접 일어난다. 선택적으로, 상기 성장 인자 고갈은 완전 배지에 있는 성장 인자 농도를 점진적으로 감소시킴으로써, 점진적으로 수행된다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 성장 인자 고갈은 최소 2개의 성장 인자에 대해 동시에 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 완전 배양 배지가 IGF-1 및 CNTF로 조성된 기본 배지일때, 성장 인자의 고갈은 1 라운드의 고갈에서 이루어진다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 완전 배양 배지가 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, 선택적 으로 IL-11로 조성된 기본 배지일때, 성장 인자의 고갈은 2 라운드의 고갈에서 이루어진다: 첫번째로, SCF, IL6, IL6R, bFGF, 선택적으로 IL11이 완전 배지로부터 완전히 제거; 그리고 난 뒤 상기 조류 세포는 IGF1 및 CNTF, 선택적으로 IL-11을 포함하며, 동물 혈청이 추가된 완전 배지에서 최소 1 계대 동안 배양에서 유지됨. 두번째로, IGF1 및 CNTF, 선택적으로 IL-11은 오직 혈청만으로 조성된 기본 배지를 궁극적으로 포함하는 배양 배지로부터 직접 제거된다. 일반적으로 배지는 약 20 내지 30 계대에서 성장 인자가 완전히 제거된다.
바람직한 구현예에서, 영양 세포의 고갈은 성장 인자의 고갈 이후에 수행된다. 영양 세포의 고갈은 점차적으로, 수회의 계대 동안 수행된다. 조류 세포는 단계 a) 보다 낮은 농도로, 약 4x104 세포/㎠ 내지 5x104 세포/㎠ 농도로 플라스크에 접종된다. 영양 세포는 약 4.2x104 세포/㎠로 플라스크에 접종된다. 점차적으로 플라스크 내의 영양 세포의 농도는 감소된다. 실제로, 동일 농도의 영양 세포는 2 내지 4 계대에서 사용되며, 그 이후 낮은 농도의 영양 세포가 추가적인 2 내지 4 계대에 사용된다. 그리고 난 후, 플라스크에는 약 4.2x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 2.2x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 1.8x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 1.4x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 1.1x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 0.9x104 영양세포/㎠, 그 다음에 약 0.5x104 영양세포/㎠가 접종된다. 그리고 난 뒤, 상기 플라스크 에는 영양 세포가 없이, 3.5x104 조류세포/㎠ 내지 약 7.5x104 조류세포/㎠로 접종된다. 가설에 따르면, 조류 세포를 배양하는 플라스크 내의 영양 세포 농도가 감소되고, 그 후 영양 세포 고갈을 수행하기 이전과 동일한 영양 세포 농도로 조류 세포를 추가적으로 계대 배양하고 난 뒤의 조류세포는 좋은 형태를 유지하지 못한다.
다른 바람직한 구현예에서, 혈청 고갈은 성장 인자 및 영양 세포 고갈을 수행하고 난 뒤에 수행된다. 기본 배지는 다음으로부터 선택되는 배지로 바뀐다:
- 혈청이 보충되고 신규 무혈청 배지 (ii)로 희석된 기본 배지 (i). 여기서, 상기 조류 세포는 배지 (i)에서 연속적인 계대를 통해 배양되며, 여기서 무혈청 배지의 비율은 혈청이 보충된 조성된 기본 배지를 완전히 제거할 때까지(연속적인 희석), 계속적으로 증가된다.
- 혈청이 보충된 신규 무혈청 배지 (ii). 여기서, 상기 조류 세포는 배지 (ii)에서 연속적인 계대를 통해 배양되며, 여기서 혈청의 비율은 무혈청 배지를 얻을때까지(연속적 제거) 계속적으로 감소한다.
- 혈청이 보충되지 않은 신규 무혈청 배지 (ii). 여기서 상기 조류 세포는 무혈청 배지 (ii)에 직접 포함된다(직접 제거).
바람직한 구현예에서, 혈청 고갈은 점진적인 제거에 의해 수행된다.
영양 세포는, 바람직하게는 방사선 조사 또는 마이토마이신으로 화학 처리함으로써 불활성화된 동물 세포이다. 영양 세포는 SCF와 같은 성장 인자를 발현하도 록 유전적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 상기 영양 세포는 STO(American Type Culture Collection ATCC NoCRL-1503)와 같은 생쥐 섬유아세포 세포주이다.
본 발명의 방법은 상당한 시간 동안 시험관 내에서 배양하여 유지되는 EBx
Figure 112007079830277-PCT00032
로 불리는 조류 배아 유도된 세포주의 확립을 유도한다. 유리한 점은, 단계 c)에서 얻은 EBx
Figure 112007079830277-PCT00033
세포는 최소 50일, 100일, 150일, 300일 또는 바람직하게는 최소 600일 동안 증식이 가능하다. 상기 600일이라는 시간은 제한된 시간이 될 수 없는데, 그 이유는 얻어진 EBx
Figure 112007079830277-PCT00034
세포가 이 시간 보다 훨신 더 오래 생존하기 때문이다. 예를 들어, EB14 세포의 마스터 세포 뱅크는 계대 P160에서 생산되며, 생산 세포 뱅크의 마지막 EB14는 P184에서 생산되며, EB14 세포는 여전히 증식가능하다. 따라서, 이러한 세포주들은 외래 성장 인자, 혈청 및/또는 불활성화된 영양층이 없는 기본 배양 배지에서 무제한적으로 성장할 수 있는 것으로 간주된다. "세포주(line)"라는 표현은 동일한 형태적, 표현형적 특징을 더 많거나 더 낮은 수준으로 유지시키는 동안 배양에서 무제한적으로 증식가능한 모든 세포 군집을 의미하는 것으로 이해된다. 물론, 상기에 언급된 방법은 확립된 세포주로부터 얻은 세포로부터 유도된 세포 클론을 얻는 것을 가능하게 한다. 이러한 클론은 분열에 의해 유도된 세포와 유전적으로 동일한 세포들이다.
확립된 세포주 및 이로부터 유도된 세포(단계 c 또는 d)는 바람직하게는 배아 유도된 조류 줄기 세포주, 더욱 바람직하게는 다능성 조류 배아 유도된 줄기 세포이다. 본 발명의 방법에 얻을 수 있는 조류 배아 유도된 줄기 세포 EBx
Figure 112007079830277-PCT00035
은 작 고 둥근 모양이며, 약 24시간의 배가 시간을 가지며, 39℃ 이하에서 자라는 개별 세포이다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 세포는 최소 계대 P60, 최소 P70, 최소 P80, 최소 P90, 최소 P100, 최소 P120, 최소 P130, 최소 P150, 최소 P160, 최소 P170, 최소 P180 또는 그 이후의 것이다. 본 발명에 따른 조류 배아 유도된 줄기 세포는 다음의 특징 중 최소 한가지를 가진다:
- 높은 핵-세포질 농도,
- 내인성 알칼라인 포스파타아제 활성,
- 내인성 텔로머라아제 활성,
- SSEA-1(TEC01), SSEA-3, 및 EMA-1에 대한 특정 항체와의 반응성,
- ENS1 유전자 발현;
본 발명의 방법의 단계 a)에서의 조류 세포의 배가 시간(39에서 48 내지 72시간) 보다 짧은, 동일한 배양 조건에서 약 24시간 또는 그 미만의 배가 시간.
EBx
Figure 112007079830277-PCT00036
세포주는 기본 배지, 구체적으로는 당업자에게 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제가 보충된 SAFC Excell 배지, DMEM, GMEM, HamF12 또는 McCoy와 같은 배지에서 무제한적으로 증식 가능하다. 상기 첨가제 중에는, 비-필수 아미노산, 비타민 및 소듐 피루베이트, 지방산, 효모 및 콩 가수분해물이 언급될 수 있다. 그러나, 상기 세포는 글루타민이 없는 기본 배지에서 증식 가능하다. 이러한 세포주 및 이로부터 유도된 세포는 부착 세포 또는 현탁 세포로서 자라는 특징을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 EBx
Figure 112007079830277-PCT00037
세포, 바람직하게는 EB14 세포는 상기에 언 급된 특징을 가지며, 바이러스 백신 및 재조합 펩타이드 및 단백질(즉, 항체,...)과 같은 생물제제의 생산에 유용하다.
실시예 2: EB14 세포의 특성감별
2.1- EB14 세포 핵형분석
EB14 세포의 핵형분석은 Pr.Michel Franck 실험실(Unite de zootechnie, ethnologie et economie rurale, Ecole Nationale Veterinaire, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy l'Etoile, France)에서 수행하였다.
EB14 세포는 당업자에게 널리 알려진 표준 기술을 사용하여 두개의 다른 계대(계대 105 및 118)에서 핵형분석 하였다. 예측한 대로, EB14 세포는 계대 105 및 118에서 이배체 핵형을 보여주었다(도 2):
계대 105: 염색체의 모달(modal) 넘버 = 78 (평균: 78.41 - 표준 편차: 4.951 나누기(÷) 관찰된 중기 53)
계대 118: 염색체의 모달 넘버 = 79 (평균: 79.68 - 표준 편차: 3.733 나누기 관찰된 중기 50).
닭 게놈은 두가지 타입의 염색체 쌍을 포함한다: 마크로- 및 마이크로- 염색체. 계대 115 분석 결과에서는 모달 넘버가 18인 마크로-염색체는 평균값이 17.82이고 표준편차가 0.833이며, 모달 넘버가 60인 마크로-염색체는 평균값이 61.44이고 표준편차가 3.688이다. 상기 두가지 계대간의 염색체 분배에는 유의적인 차이가 없었다.
EB14 세포주는 계대 105 및 118에서 정상 남성(ZZ) 이배체 핵형을 나타내며, 이는 EB14 세포의 염색체 안정성을 보여준다.
2.2- 면역-억제된 신생아 쥐 모델에서의 EB14 세포의 발암성 분석
계대 127의 EB14 세포가 발암성을 나타내는지 여부를 알기 위해 신생아 쥐 모델(Sanofi-Aventis, France)(WHO technical report No878(1998))에서 측정하였다. Hela 세포가 양성 대조군으로 사용되었다. 10마리의 면역-억제된 신생아 쥐에 10 백만개의 EB14 세포를 피하에 주입하였으며, 추가로 10마리의 면역-억제된 신생아 쥐에 10 백만의 Hela 세포를 피하에 주입하였다. 모든 동물에게 0, +2, +7 및 +14일 째에 쥐 혈청 항-가슴샘세포(thymocyte) 0.1㎖을 주입하였다. 동물들을 3주마다 관찰하여 주입 부위의 결절을 검출하였다. 3주 뒤에, 동물들을 죽인 뒤 주입 부위 및 다른 기관에서의 세포 증식을 확인하였다. EB14 세포 주입 부위 또는 다른 기관에서 어떠한 결절 및 종양도 검출되지 않았다. EB14는 면역-억제된 신생아 쥐 모델에서 비-발암성이다.
2.3-조류 및 인간 인플루엔자 바이러스 수용체를 발현하는 EB14 세포
EB14 세포에서의 조류(Sia 2-3Gal) 및 인간 (Sia 2-6Gal) 인플루엔자 바이러스에 대한 수용체의 검출은 하기와 같은 디옥시게닌 표지된 렉틴(Boehringer)를 이용한 형광 세포 계수 분석으로 수행하였다:
▣ Sia 2-6Gal에 특이적으로 결합하는 삼부카 니그라(Sambuca nigra, SNA) 어글루티닌 렉틴;
▣ Sia 2-3Gal에 특이적으로 결합하는 막키아 아뮤렌시스(Maackia amurensis, MAA) 어글루티닌 렉틴.
EB14 세포 및 MDCK 세포주는 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.5로 세척한 뒤 최종 농도 5.106으로 동일한 버퍼에 현탁하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 반응시킨 뒤, SNA 또는 MAA의 존재하에서 추가로 15 내지 30분 동안 반응시켰다. 렉틴 처리된 세포를 FITC-표지된 항-디옥시게닌 항체로 15 내지 30분 동안 얼음에서 반응시키기 전에, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.5로 세척하였다. 그리고 난 뒤, 상기 세포를 NaCl 0.9% 로 세척하고 FACS 분석하였다.
EB14 세포는 Sia 2-6Gal 및 Siaα2-3Gal 잔기를 가진 올리고사카라이드를 포함하는 세포 표면 수용체를 발현한다(도 6).
실시예 3: EB14 세포에서의 MVA 생산
3.1- 재료 및 방법
녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 재조합 MVA 바이러스가 사용되었다. MVA-GFP 바이러스의 감염 역가분석은 DF-1 세포에서 수행하였다. 구체적으로, 5% 태아 송아지 혈청(FCS)(SAFC) 및 2 mM L-글루타민(Biowhittaker)이 보충된 DMEM 배지(Biowhittaker)에 세포를 15.103 세포/웰 농도로 96 편평-바닥 웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 뒤에, 상기 세포를 DMEM에 10배로 단계적으로 희석하여 감염시키고, 37℃, 5% CO2로 습도 조절되는 환경으로 1주일 동안 배양하였다. 광범위한 세포변병 효과(CPE) 및 UV-노출된 감염 세포를 현미경 관찰함으로써 바이러스 감염도를 측정하였다. 그리고 난 뒤, Reed and Muench 방법(1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97)에 따라 TCID50 역가를 계산하였다.
3.2-조직 배양 플라스크에서의 감염
3.2.1- 재료
o 용기 : F175 플라스크(Starstedt, Ref. 83 1812502)
o 궤도 혼합기 : IKA KS260 또는 등가물
o 소니케이터 : IKA U50(US50-3 프로브로 모니터)
o 배지 : 2.5 mM 글루타민(Cambrex Ref. BE17605E)이 첨가된 Excell 65319(SAFC-JRH);
3.2.2-방법
단계 1: EB14 세포 증식
세포는 감염 실험을 시작하기 2주 전에 준비하여야 한다.
0일 : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65319 배지 25㎖이 들어이는 T175 플라스크에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 EB14 세포를 접종한다(클럼프 파괴한 뒤 첫번째 접종). 상기 세포를 37℃, 7.5% CO2, 교반(60 rpm) 하에서 습도 유지된 조건하에서 배양하였다.
1일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 25㎖을 첨가한다.
2일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 50㎖을 첨가한다.
3일 : 세포를 계수한다. 분배된 EB14 세포를 새로운 F175 플라스크에 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65139 배지 25 ㎖에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종한다. 이는 희석 +1로 표시된다.
4일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 25㎖을 첨가한다.
5일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 50㎖을 첨가한다.
6일 : 세포를 계수한다. 분배된 EB14 세포를 새로운 F175 플라스크에 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65139 배지 25 ㎖에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종한다. 이는 희석 +2로 표시된다.
그리고 난뒤, 이러한 세포 증폭 단계를 계속 수행하여, 희석이 바람직하게는 +3 내지 +7, 더욱 바람직하게는 +3 내지 +5가 될때까지 수행한다. 그리고 난 뒤 이들 중 하나에는 세포 감염 2 단계를 수행한다.
크게 클럼프된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00038
세포를 포함하는 세포 배양을 얻기 위해서는(이하 다음과 같이 명명됨: "큰 클럼프" 조건), 세포를 더 큰 용기로 희석하여 계대시킬때에, 상기 EBx
Figure 112007079830277-PCT00039
세포를 원심분리하지 않으며, 피펫팅과 혼합에 의해 클럼프가 깨어지지 않는다. 반대로, 클럼프된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00040
세포의 실질적인 부분이 포함되지 않는 세포 배양을 얻기 위해서는, 세포를 계대시킬때 피펫팅 또는 혼합에 의해 클럼프가 파괴된다(이하 "클럼프 없는" 조건이라 명명).
단계 2 : MVA - GFP (녹색 형광 단백질)를 이용한 EB14 세포의 감염
1일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 JRH Excell 65319 배지 40㎖가 들어 있는 F175 플라스크에 EB14 세포를 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종하였다. 상기 세포를 37℃, 7.5% CO2, 교반(60 rpm) 하에서 습도 유지된 조건하에서 배양하였다.
2일 및 3일 : 세포를 계수하였다.
4일 : 세포를 계수하였다. 플라스크 내의 세포 농도가 약 4x106 세포/㎖이 되었을때, 플라스크 당 MOI 0.01의 TCID50/세포와 1 ㎖의 바이러스 감염 혼합액으로 상기 EB14 세포를 감염시켰다. 바이러스 감염 혼합액은 사용하기 바로 직전에 2.5 mM 글루타민을 포함하는 Excell 65319 배지에 바이러스를 희석하여 준비하였다. 각 접종물을 15 ㎖ FalconTM 튜브에서 얼음에서 30초 동안 소니케이션하였다(진폭 100%, 연속 사이클). 상기 접종물을 세포 배양액과 혼합하기 전에 실온으로 데웠다. 접종하고 난 뒤에, 상기 감염 배양 배지를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 2.5 mM 글루타민, 0.5x 이스톨레이트 및 0.35 ㎖/ℓ 지방산이 보충된 새로운 배지 Excell 65319 60 ㎖을 플라스크에 첨가하였다. 상기 감염된 세포 배양물을 37℃에서 최소 144시간 동안 추가 배양하였다(nb: 바이러스 생산 피크는 pi +72시간 및 pi +120시간이다).
세포 배양 샘플(1㎖)을 매 24시간 마다 수득하고 -80℃에 냉동보관하였다. 샘플 수득하기 전에, 세포 배양은 부드러운 피펫팅으로 섞어주었다. 각 수득된 샘플에서의 바이러스 역가분석은 TCID50/㎖ Reed and Muench의 방법(1938)을 이용해 각 실험의 마지막에 수행하였다.
3.3- 스피너에서의 감염
3.3.1- 재료
o 용기 : 50 ㎖ & 1 리터 스피너 바틀(Corning)
o 궤도 혼합기 : IKA KS260 또는 등가물
o 소니케이터 : IKA U50(US50-3 프로브로 모니터)
o 배지 : 2.5 mM 글루타민(Cambrex Ref. BE17605E)이 첨가된 Excell 65319(SAFC-JRH);
3.3.2-방법
단계 1: EB14 세포 준비
세포는 감염 실험을 시작하기 2주 전에 준비하여야 한다.
0일 : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65319 배지 25㎖이 들어있는 T175 플라스크에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 EB14 세포를 접종한다(클럼프 파괴한 뒤 첫번째 접종). 상기 세포를 37℃, 7.5% CO2, 교반(60 rpm) 하에서 습도 유지된 조건하에서 배양하였다.
1일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 25㎖을 첨가한다.
2일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 50㎖을 첨가한다.
3일 : 세포를 계수한다. 분배된 EB14 세포를 새로운 F175 플라스크에 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65139 배지 25 ㎖에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종한 다. 이는 희석 +1로 표시된다.
4일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 25㎖을 첨가한다.
5일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 Excell 65319 배지 50㎖을 첨가한다.
6일 : 세포를 계수한다. 분배된 EB14 세포를 새로운 F175 플라스크에 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65139 배지 25 ㎖에 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종한다. 이는 희석 +2로 표시된다.
그리고 난뒤, 이러한 세포 증폭 단계를 계속 수행하여, 희석이 바람직하게는 +3 내지 +7, 더욱 바람직하게는 +3 내지 +5가 될때까지 수행한다. 그리고 난 뒤 이들 중 하나에는 세포 감염 2 단계를 수행한다.
크게 클럼프된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00041
세포를 포함하는 세포 배양을 얻기 위해서는(이하 다음과 같이 명명됨: "큰 클럼프"), 세포를 더 큰 용기로 희석하여 계대시킬때에, 상기 EBx
Figure 112007079830277-PCT00042
세포를 원심분리하지 않으며, 피펫팅과 혼합에 의해 클럼프가 깨어지지 않는다. 반대로, 클럼프된 EBx
Figure 112007079830277-PCT00043
세포의 실질적인 부분이 포함되지 않는 세포 배양을 얻기 위해서는, 세포를 계대시킬때 피펫팅 또는 혼합에 의해 클럼프가 파괴된다(이하 "클럼프 없는"이라 명명).
단계 2 : MVA - GFP 를 이용한 EB14 세포의 감염
1일 : 2.5 mM 글루타민이 포함된 JRH Excell 65319 배지 150㎖(또는 300㎖)가 들어 있는 50 ㎖ (또는 1,000 ㎖) 스피너 바틀에 EB14 세포를 0.4x106 세포/㎖ 농도로 접종하였다. 상기 세포를 37℃, 7.5% CO2, 교반(100 rpm) 하에서 습도 유지된 조건하에서 배양하였다.
2일 및 3일 : 세포를 계수하였다.
4일 : 세포를 계수하였다. 스피너 내의 세포 농도가 약 4x106 세포/㎖이 되었을때, 스피너 바틀 당 MOI 0.01의 TCID50/세포와 1 ㎖의 바이러스 감염 혼합액으로 상기 EB14 세포를 감염시켰다. 바이러스 감염 혼합액은 사용하기 바로 직전에 2.5 mM 글루타민을 포함하는 Excell 65319 배지에 바이러스를 희석하여 준비하였다. 각 접종물을 15 ㎖ FalconTM 튜브에서 얼음에서 30초 동안 소니케이션하였다(진폭 100%, 연속 사이클). 상기 접종물을 세포 배양액과 혼합하기 전에 실온으로 데웠다. 접종하고 난 뒤에, 상기 감염 배양 배지를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 2.5 mM 글루타민, 0.5x 이스톨레이트 및 0.35 ㎖/ℓ 지방산이 보충된 새로운 배지 Excell 65319 60 ㎖을 500㎖ (또는 1,000㎖) 스피너 바틀에 첨가하였다. 상기 감염된 세포 배양물을 37℃에서 최소 144시간 동안 추가 배양하였다(nb: 바이러스 생산 피크는 pi +72시간 및 pi +120시간이다).
세포 배양 샘플(1㎖)을 매 24시간 마다 수득하고 -80℃에 냉동보관하였다. 샘플 수득하기 전에, 세포 배양은 부드러운 피펫팅으로 섞어주었다. 각 수득된 샘플에서의 바이러스 역가분석은 TCID50/㎖ Reed and Muench의 방법(1938)*을 이용해 각 실험의 마지막에 수행하였다. *Reed L & Muench H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
3.4 - 3L- 교반 탱크 생물반응기에서의 감염
3.4.1 - 방법
세포 해동
세포 냉동바이알은 -196℃에서 액체 질소에 저장되어 있으며; 각 냉동바이알은 20.106 세포를 포함하고 있다. 상기 냉동바이알을 37℃로 예열된 워터 배쓰에 재빨리 넣어 냉동된 바이알을 해동시킨다. 세포 현탁액을 30 ㎖ 예열된 배양 배지가 들어 있는 50 ㎖ PP 멸균 튜브에 피펫으로 넣는다. 상기 세포 현탁액을 실온에서, 300 ±20g로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고 펠렛을 새로운 배양 배지 15㎖에 재현탁하여 부드럽게 섞어준다. 상기 세포 현탁액을 T75 ㎠ 플라스크에 넣어 7.5% CO2 대기하에서 50 rpm으로 궤도 쉐이킹하는 조건하에서 배양한다. 배양 24시간 및 48시간 뒤에, 예열된 배양 배지 15 ㎖를 상기 세포 배양에 첨가한다. 배양 72시간 뒤에, 샘플을 수득하고(벌크하게 혼합한 뒤) 계수한다: ≥40.106 세포로 예측됨. 그리고 난 뒤 첫번째 증폭을 수행한다.
첫번째 세포 증폭: 원심분리, 분리(dissociation) 및 희석
상기 현탁 세포를 플라스크로부터 수득하여 50 ㎖ PP 멸균 튜브에 넣었다. 실온에서 300±20g로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 예열된 새로운 배양 배지 10㎖을 펠렛에 넣어준다. 10 ㎖ 피펫으로 상기 세포 클럼프를 부드럽게 분리시켜주고, 필요하다면 1개의 50㎖ PP 멸균 튜브에 세포 현탁액을 모은다. 필 요하다면 예열된 새로운 배양 배지 20㎖로 세포 배양 부피를 증가시킨다. 계수는 트라이판 블루를 사용하여 세포 농도 및 세포 생존도(세포 생존도는 일반적으로 약 80%)를 측정함으로써 수행된다. 1개의 T175㎠ 플라스크에, 0.4.106 세포.㎖-1을 40 ㎖의 예열된 배양 배지에 접종한다. 상기 세포 배양액을 7.5% CO2 대기하에서 50 rpm으로 궤도 쉐이킹하는 조건하에서, 37℃로 배양한다. 2일째에, 예열된 배양 배지 60 ㎖를 세포 배양에 첨가한다. 3일째에 세포 희석을 수행한다.
희석 +1 내지 +5 (원심분리, 분리 없음, 오직 희석만)
T175 플라스크로부터(부드럽게 혼합하고 난 뒤) 샘플을 수득하여 세포 농도를 측정하기 위해 트라이판 블루를 사용해 계수하였다. 1개의 T175㎠ 플라스크에, 총 부피 25㎖의 예열된 배양 배지에 0.4.106 세포.㎖-1을 접종하기 위해 T175 플라스크로부터(부드럽게 혼합하고 난 뒤) 샘플을 수득하였다. 이를 희석 +1로 표시한다.
1일째에, 예열된 배양 배지 50 ㎖를 세포 배양에 첨가한다. 2일째에, 희석 +1(상기 참조)과 동일한 방법을 사용해 희석 +2를 수행한다. 세포 증폭을 이 방법으로 수행하여, 희석 +3 내지 +5가 되게 하였다. 3L 생물반응기로의 접종물은 희석 +3에서부터 희석 +5가 될때까지의 것으로부터 준비될 수 있다. 두개의 T175 플라스크를 접종으로 사용하기 위해 준비한다.
3L 교반 -탱크 생물반응기에 세포 접종
접종 - 0일
접종물을 준비한다(320.106 세포가 3L-생물반응기에 접종하는데 필요하다). 2개의 T175 플라스크를 가득채운다. 부드럽게 혼합한 뒤(세포 클럼프가 파괴되면 안됨) 샘플을 얻어, 트라이판 블루를 사용해 계수하여 세포 농도를 측정하였다. 생물반응기 내의 최종 세포 부피 800㎖ 내에서의 세포 농도가 0.4.106 세포.㎖-1이 되도록 150 ㎖ 세포 혼합액을 준비하였다.
세포를 접종하기 전에, 용기 내의 pH를 7.2로 세팅하였다(왜냐하면 CO2 표면 주입에 의해 pH가 감소할 것이기 때문이다). pO2는 50% O2 포화로 세팅하였다(매쓰 플로우 조절기를 100%로 맞추며, 이는 최대 스파져(sparger) 플로우 속도가 50 ㎖.min-1인 것과 동일하다). 이 과정의 시작에, pH는 CO2 표면 주입에 의해 유지되며, 이후에는, 7.5% NaHCO3의 첨가에 의해 조절된다. 표면 통기(aeration)는 0.3 ㎖.min-1의 플로우 속도의 공기로 시작한다.
배양 후/공급 추가(1일, 2일)
세포 계수는 통상적인 방법으로 수행한다. 글루타메이트, 글루타민, 락테이트 및 글루코스와 같은 부산물은 BioPrifile Basic 소프트웨어를 사용하여 배양 중에 분석한다. 필요하다면 부산물의 농도를 맞춘다. 예를 들어, 글루타민 농도는 2 mM로 맞춘다.
MVA - GFP 를 이용한 감염(3일)
배양 3일 후에, 세포 농도는 3.106세포.㎖-1보다 높아야 한다. 목표 세포 농도에 도달하면(3 내지 5.106세포.㎖-1), 10-2 TCID50/cell의 MOI로 바이러스 감염을 수행한다. 바이러스 균주는 얼음에서 해동한다. 감염 혼합물은 10 ㎖의 생산 배지가 들어있는 50㎖ PP 멸균 튜브에서 준비한다. 상기 혼합물을 얼음에서 30초 동안(진폭 100%, 연속 사이클) 소니케이션한다. 상기 감염 혼합물을 생물반응기에 접종한다. 바이러스 흡착 1시간 뒤에, 최종 생산 배지를 상기 용기에 넣는다. 1.5 L에 들어 있는 1/5L Excell 65319 생산 배지는 이스톨레이트 및 지방산을 최종 농도가 각각 0.5X 및 0.35㎖/L(최종 부피 :2,3L)가 되도록 포함한다.
생산 후/공급 추가(4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일)
MVA 바이러스 생산 피크는 감염 후 72시간 내지 120시간에 도달하였다. 매일마다 약 15㎖의 샘플을 생물반응기로부터 수득하여 세포 계수, 세포 형태 분석 및 CPE 관찰을 수행하였다. 글루타메이트, 글루타민, 락테이트 및 글루코스와 같은 부산물은 BioPrifile Basic 소프트웨어를 사용하여 배양 중에 분석한다. 필요하다면 부산물의 농도를 맞춘다. 예를 들어, 필요하다면 글루타민 농도는 2 mM로 맞춘다. 필요하다면, 글루코스 농도는 2g/L-1로 맞춘다.
분석
바이러스 역가 분석은 모든 수득된 샘플을 사용하여 실험의 마지막에 수행한다.
3.5 - 결과
3.5.1 - 3L 페드배치 생물반응기의 EB14 세포의 세포 성장 역동학
EB14 세포는 교반-탱크 생물반응기에서 통상적인 방법으로 배양한다. EB14-유도된 바이오매스는 세포 농도가 5-6.106 세포/㎖에 도달할때까지 37℃로 세포 성장 배지에서 축적되게 한다. 그리고 난 뒤, 혼합물을 약 3배 희석하며, 10일 동안 세포 성장 역동학을 수행한다. 이러한 조건에서, 12 내지 16 백만 세포/㎖ 농도의 세포는 통상적으로 5 내지 8일째에 도달한다(도 7A). EB14 세포 분리비가 증가할 것이다. 도 7B는 10배로 희석된 EB14 세포의 성장 역동학을 보여준다.
3.5.2 - EB -14 세포 유연성: 부착 세포상에서의 MVA - GFP 의 플라크 정제
EB14 세포는 현탁 배양에서 자란다. 그러나, EB14 세포는 플라스크와 플레이트에 부착하여 자라는 능력도 있다. 이러한 특징은 본 발명자가 부착 EB14세포상에서 MVA-GFP의 플라크 정제를 수행하는 것을 가능하게 한다. 이를 위해, MVA-GFP 바이러스의 단계적 10배 희석액을, 7.104 세포/㎠ 농도가 되기 24시간 전에 6웰 플레이트에 접종된 부착 EB-14 세포에 접종하였다. 바이러스를 부착하고 난 뒤, 1.2% LMP 아가로즈/2.5% FCS DMEM 혼합액과 함께 상기 세포를 위 층에 깔고, 세포를 수일 동안 37℃에서 배양하였다. 웰은 최종적으로 중간 빨간색으로 염색된다. 그리고 난 뒤 플라크 형성 단위 역가는 분리된 플라크를 제공할 수 있는 희석에 의해 계산된다.
3.5.3 - 감염된 EB14 세포에서의 MVA - GFP 바이러스 증식에 대한 생산 배지 및 클럼프 사이즈의 영향
EB14 세포는 세포 배양 배지(Excell 65319)에서 세포 증식하는 동안 T175 교반 탱크 플라스크에서 작거나 큰 클럼프를 형성하게 놓아두었다. 그리고 난 뒤, 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 클럼프를 감염시키고, 이 혼합액을 몇가지 생산 배지(Optipro, Excell 319, Excell 421, Excell 625, Excell 627, Excell 628, Excell 629, G9916)로 희석하였다.
큰 클럼프의 EB14 세포의 존재는 바이러스 감염과 증식(도 8)을 향상시키고, 높은 MVA 바이러스 역가로 유도한다(도 9). 바이러스 생산 배지로의 이스톨레이트(부가물 1) 및 지방산(부가물 2)과 같은 부가물의 첨가는 MVA 바이러스 역가를 추가로 향상시킨다. 도 10에서 보는 바와 같이, 이스톨레이트 1X(부가물 1)이 단독으로 배지에 첨가될 때, MVA-GFP 바이러스 수율이 증가하며, 이스톨레이트(부가물 1) 및 지방산(부가물 2)가 세포 배양 배지에 첨가될때에는 상승적인 효과가 나타난다. 대신에, 지방산 1X 단독으로는 바이러스 역가를 증가시키지 못한다.
3.5.4 - 3L 생물반응기에서의 MVA 바이러스 생산
EB14-유도된 바이오매스는 Excell 65319 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 놓아두었다. 그리고 난 뒤 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 상기 세포를 감염시키고, 이 혼합액을 Excell 65319 생산 배지에 희석하였다. Excell 65319를 첨가하고 난 뒤, 세포 농도가 감소하였으며(3일), 5일째에는 감염된 세포 의 농도가 증가하여 세포 농도가 4 백만 세포/㎖이 되었다. 세포 증폭하는 동안 원심분리를 하지 않으면 감염후 2 내지 4일째 배양에서 큰 클럼프 사이즈를 얻을 수 있다(도 11). 이러한 조건에서, MVA-GFP 생산도는 높다. 감염 후 6일째에, MVA-GFP 역가는 약 108.32 TCID50/㎖(세포 농도 1.49x106 세포/㎖)이며, 이는 TCID50/세포=414(증폭 인자 41,000)과 맞먹는다(도 12). EB14 세포가 클럼프를 파괴하지 않으면서(예를 들어 희석에 의해) 증폭되면, 세포 배양에 있는 큰 클럼프가 없는 조건에서 얻어진 것(증폭 인자는 약 1900이고 TCID50/세포=19)에 비교하여 3L-생물반응기에서 높은 바이러스 역가가 얻어진다.
3.5.5 - MVA 감염된 EB14 세포의 정상 미세구조
MVA 바이러스로 감염된 EB14 세포를 전자 현미경으로 분석하였다(Drs. Daniele Spehner & Robert Drillien, IGBMC, Strasbourg France). EB14 세포에서 생산된 MVA 바이러스의 성숙도는 정상이며, 일차 닭 배아 섬유아세포에서 관찰되는 것과 유사하다.
실시예 4: EB14 세포에서의 인플루엔자 바이러스의 생산
4.1 - 재료 및 방법
4.1.1 - 인플루엔자 바이러스 감염도 분석( TCID50 )
감염성 인플루엔자 바이러스의 역가 분석은 MDCK 세포에서 수행하였다. 상세하게는, 2.5 mM L-글루타민이 보충된 UltraMDCK 배지에 세포를 3.103 세포/웰 농 도로 96웰 편평-바닥 플레이트에 접종하였다. 24시간 후에, 6 ㎍.㎖-1 트립신-EDTA를 포함하는 UltraMDCK에 10배로 연속 희석한 샘플로 상기 세포를 감염시켰으며, 33℃로 5% CO2 습도 유지 대기하에서 1주일 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 닭 적혈구를 이용하여 HA 분석으로 바이러스 복제를 테스트하고, Reed and Muench 방법(1938)*에 따라 TCID50 역가를 계산하였다.
*Reed L & Muench H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
4.1.2 - 단일 방사선 면역확산 분석( SRID )
인플루엔자 바이러스 감염된 EB14 세포로부터 유도된 샘플에 있는 헤마글루티닌의 농도는 Wood and colleagues*의 방법으로 측정하였다. 자세하게는, 유리 플레이트를 항-인플루엔자 혈청(바람직한 농도는 NIBSC에 의해 제공됨)을 포함하는 아가로즈 젤로 코팅하였다. 젤을 세팅하고 난 뒤, 참고물질 희석액 10㎕과 샘플을 3 mm φ 펀치 웰에 로딩하였다. 습윤 챔버에서 실온으로 18-24시간 동안 반응시키고 난 뒤, 상기 플레이트를 0.9% NaCl에 담구고 증류수로 세척하였다. 그리고 난 뒤 젤을 압축 건조시켰다. 상기 플레이트를 코마시 블릴리언트 블루 용액으로 15분 동안 염색한 뒤 명확하게 염색된 부분이 보일때까지 메탄올과 아세트산 혼합액으로 2회 탈염색하였다. 플레이트를 건조시키고 난 뒤, 항원 웰을 둘러싸는 염색 부위의 직경을 오른쪽 각도로 2회 측정하였다. 표면에 대한 항원 희석의 용량-의존적 커브가 완성되었으며 그 결과를 표준 슬로프-비율 분석 방법에 따라 계산하였 다. * Wood JM. Et al. "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines". J Biol Stand. 1977;5(3):237-24.
4.1.3 - 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 웨스턴 블랏 분석
SDS-PAGE는 Laemmli UK(1970, Cleavge of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685)의 방법에 따라 10% 폴리아크릴아마이드 젤에서 수행하였다. 변성 단백질(1% SDS, 70 mM β-머캅토에탄올)을 반건조 블라팅 방법(Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocelluse)에 따라 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(hybond P, Amersham)으로 전달하였다. 1% FCS(SAFC) 첨가된 TBST에 5% 탈지 분유가 혼합된 혼합물에서 상기 블랏을 실온으로 1시간 동안 블라킹시켰다. 그리고 난 뒤, 상기 블랏을 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청이 첨가된(1:500 (NIBSC)) 블라킹 용액에서 밤새 반응시켰다. 상기 블랏을 TBST로 6회 세척하고 hrp-결합된 토끼 항-양 IgG 폴리클로날 항체가 들어있는 블라킹 용액(1:500 (Rockland))에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 6회 세척하고 난 뒤, 단백질-결합 컴플렉스를 케미루미네센스(ECL kit, Amersham) 및 필름(Hyperfilm, Amersham)을 사용해 최종적으로 확인하였다.
4.2 - 3L 생물 반응기에서의 EB14 세포의 인플루엔자 바이러스 감염
4.2.1 - 재료 및 장비
세포 해동 재료
o T75 ㎠ 플라스크(Sarstedt, Cat# 831813502)
o 배양 배지(무혈청 배지)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, Cat# BE17-605E)
o 궤도 혼합기 IKA KS260 (Fisher Bioblock, Cat# F35044)
세포 증폭 재료
o T75 ㎠ 플라스크(Sarstedt, Cat# 831813502)
o 배양 배지(무혈청 배지) : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65319(JRH, Cat# 65319-1000M1687)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, Cat# BE17-605E)
o 이스톨레이트 UF 용액 50X (JRH, Cat# 58902-100M)
o D (+) 글루코스 (45%) (Sigma, Cat# G8769)
생산 재료
o 생산 배지(무혈청배지) : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65629(JRH, Cat# 65629)
o 이스톨레이트 UF 용액 50X (JRH, Cat# 58902-100M)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, Cat# BE17-605E)
o D (+) 글루코스 (45%) (Sigma, Cat# G8769)
o 트립신 (Trypzean 1X, Sigma, Cat# 205-633-8)
o 인플루엔자 바이러스 균주(-80℃에 냉동)
4.2.2 - 방법
세포 해동
세포 냉동바이알은 -196℃에서 액체 질소에 저장되어 있으며; 각 냉동바이알은 20.106 세포를 포함하고 있다. 상기 냉동바이알을 37℃로 예열된 워터 배쓰에 재빨리 넣어 냉동된 바이알을 해동시킨다. 세포 현탁액을 30 ㎖ 예열된 배양 배지가 들어 있는 50 ㎖ PP 멸균 튜브에 넣는다. 원심분리후(실온에서, 300 ±20g로 5분 동안) 새로운 배양 배지 15㎖을 펠렛에 첨가하여 부드럽게 섞어준다. 상기 샘플은 트라이판 블루를 사용해 계수한다. 우수한 배양 조건을 만족하기 위해서는 계수 결과 ≥20.106 세포이고, 생존도도 >70%로 나타야 한다. 상기 세포 현탁액을 T75 ㎠ 플라스크에 넣어 7.5% CO2 대기하에서 50 rpm으로 궤도 쉐이킹하는 조건하에서 배양한다. 배양 24시간 및 48시간 뒤에, 예열된 배양 배지 15 ㎖를 상기 세포 배양에 첨가한다. 배양 72시간 뒤에, 샘플을 수득하고(벌크하게 혼합한 뒤) 계수한다: 20 내지 30.106 세포로 예측됨. 그리고 난 뒤 첫번째 증폭을 수행한다.
첫번째 세포 증폭: 원심분리, 분리(dissociation) 및 희석
상기 현탁 세포를 플라스크로부터 수득하여 50 ㎖ PP 멸균 튜브에 넣고, 실온에서 300±20g로 5분 동안 원심분리한다. 예열된 새로운 배양 배지 10㎖을 펠렛에 넣어준다. 상기 세포 클럼프를 부드럽게 분리시켜주고, 예열된 새로운 배양 배 지 40㎖로 세포 배양 부피를 증가시킨다. 1개의 T175㎠ 플라스크에, 0.25.106 세포.㎖-1을 40 ㎖의 예열된 배양 배지에 접종하여, 7.5% CO2 대기하에서 50 rpm으로 궤도 쉐이킹하는 조건하에서, 37℃로 배양한다. 2일째에, 예열된 배양 배지 60 ㎖를 세포 배양에 첨가한다. 3일째에, 두번째 세포 희석을 수행한다.
3L 교반 -탱크 생물반응기에 세포 접종
접종 - 0일
접종물을 준비한다(320.106 세포가 3L-생물반응기에 접종하는데 필요하다). 2개의 T175 플라스크를 가득채운다. 부드럽게 혼합한 뒤(세포 클럼프가 파괴되면 안됨) 샘플을 얻어, 트라이판 블루를 사용해 계수하여 세포 농도를 측정하였다. 생물반응기 내의 최종 세포 부피 800㎖ 내에서의 세포 농도가 0.4.106 세포.㎖-1이 되도록 150 ㎖ 세포 혼합액을 준비하였다.
세포를 접종하기 전에, 용기 내의 pH를 7.2로 세팅하였다(왜냐하면 CO2 표면 주입에 의해 pH가 감소할 것이기 때문이다). pO2는 50% O2 포화로 세팅하였다(매쓰 플로우 조절기를 100%로 맞추며, 이는 최대 스파져(sparger) 플로우 속도가 50 ㎖.min-1인 것과 동일하다). 이 과정의 시작에, pH는 CO2 표면 주입에 의해 유지되며, 이후에는, 7.5% NaHCO3의 첨가에 의해 조절된다. 표면 통기(aeration)는 0.3 ㎖.min-1의 플로우 속도의 공기로 시작한다.
배양 후/공급 추가(1일, 2일)
세포 계수는 통상적인 방법으로 수행한다. 글루타메이트, 글루타민, 락테이트 및 글루코스와 같은 부산물은 BioPrifile Basic 소프트웨어를 사용하여 배양 중에 분석한다. 필요하다면 부산물의 농도를 맞춘다. 예를 들어, 글루타민 농도는 2 mM로 맞춘다.
감염 - 3일
배양 3일 후에, 세포 농도는 4-5.106세포.㎖-1보다 높아야 한다. 목표 세포 농도에 도달하면, 10-4 MOI로 바이러스 감염을 수행한다. 용기 온도는 33℃로 맞춘다. 바이러스 균주는 얼음에서 해동한다. 감염 혼합물은 10 ㎖의 생산 배지에 준비한다. 상기 감염 혼합물을 생물반응기에 접종한 뒤, 바이러스 흡착을 1시간 동안 수행한다. 최종 생산 배지를 준비한다: 1.5L 생산 배지에는 트립신이 용기 내에서의 최종농도가 0.3 U.㎖-1가 되도록 포함되고, 0.5X 이스톨레이트가 포함한다. 그리고 난 뒤 예열된 최종 생산 배지가 첨가된다.
생산 후/공급 추가(4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일)
매일마다 약 15㎖의 샘플을 생물반응기로부터 수득하여 세포 계수, 세포 형태 분석 및 CPE 관찰을 수행하였다. 글루타메이트, 글루타민, 락테이트 및 글루코스와 같은 부산물은 BioPrifile Basic 소프트웨어를 사용하여 배양 중에 분석한다. 필요하다면 부산물의 농도를 맞춘다. 예를 들어, 필요하다면 글루타민 농도는 2 mM로 맞춘다. 필요하다면, 글루코스 농도는 2g/L-1로 맞춘다.
분석
바이러스 역가 분석, 헤마글루티닌 분석(HAU) 및 HA 항원 정량(웨스턴 블랏, SRID)은 모든 수득된 샘플을 사용하여 실험의 마지막에 수행한다.
4.3 - 결과
본 발명자들은 다양한 인플루엔자 바이러스 균주 A 및 B의 복제를 위해 EB14 세포가 가장 신뢰성이 높고 효과적인 세포임을 확인하였다. 인플루엔자 바이러스 생산은 플라스크 및 스피너(결과 미제시) 및 생물반응기와 같은 다양한 용기에서 수행할 수 있다. 3L 및 30L 교반 탱크 생물반응기에서의 인플루엔자 바이러스 생산의 재생산가능하고 효과적인 페드배치 공정은 본 발명자에 의해 획득되었다. 25 mg/ℓ 이상의 헤마글루티닌 생산도는 플라스크에서 얻어질 수 있으며, 35 mg/ℓ 이상의 헤마글루티닌 생산도는 인플루엔자 균주 A 및 B를 이용하여 플라스크에서 얻어질 수 있다.

Claims (42)

  1. 하기 단계를 포함하는, 아데노바이러스, 헤파드나바이러스(hepadnaviruses), 헤르페스 바이러스, 오쏘믹소바이러스(orthomyxoviruses), 파포바바이러스(papovaviruses), 파라믹소바이러스, 피코나바이러스(piconaviruses), 폭스바이러스(poxviruses), 레오바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스를 조류 배아 유래 줄기세포 °EBx
    Figure 112007079830277-PCT00044
    에서 복제하는 방법:
    a) 상기 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00045
    을 무혈청 배지 No.1이 들어있는 배양 용기에서 현탁상태로 증식시키는 단계;
    b) 상기 세포의 농도가 최소 1.5 백만 세포수/ml 일때, 상기 선별된 바이러스로 상기 세포를 감염시키는 단계;
    c) 감염시키기 바로 직전, 감염과 동시, 또는 감염 바로 직후에 세포 배양 무혈청 배지 No.2를 첨가하는 단계;
    d) 바이러스를 복제하기 위해 상기 감염된 세포를 추가로 배양시키는 단계; 및
    e) 선택적으로, 상기 바이러스를 수득하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배양 용기는 연속적으로 교반되는 탱크 생물반응기 인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 무혈청 배지 No.1 및 무혈청 배지 No.2는 유사한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 무혈청 배지 No.1 및 무혈청 배지 No.2는 다른 조성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 0.25 내지 10 부피의 무혈청 배지 No.2가 무혈청 배지 No.1에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 무혈청 배지 No.1 및/또는 무혈청 배지 No.2는 아미노산, 지질, 지방산, 콜레스테롤, 탄수화물, 비-동물 유래의 단백질 가 수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1가지의 성분이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 아미노산, 지방산, 탄수화물, 비-동물 유래의 단백질 가수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1개의 성분을 세포에 공급하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 공급 단계는 단계 a) 내지 d), 바람직하게는 단계 b) 내지 d) 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 공급 단계는 기본적으로 매일 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 공급 단계는 기본적으로 연속으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 공급 단계는 하루에 1회 이상 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 공급 단계는 하루에 1회 이하 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항에 있어서, 상기 아미노산은 아스파라긴 및 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되거나 이의 혼합인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 글루타민의 공급은 배지 내의 글루타민의 농도를 0.5 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 2 mM로 유지하기 위해 단계 a) 내지 d) 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 6 항 내지 제 12 항에 있어서, 탄수화물은 D-글루코스 및 D-갈락토스로 구성된 군으로부터 선택되거나 이의 혼합인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, D-글루코스의 공급은 배지내의 D-글루코스의 농도를 0.5 g/ℓ 내지 25 g/ℓ, 바람직하게는 2 g/ℓ로 유지하도록 단계 b) 내지 d) 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 6 항 내지 제 12 항에 있어서, 지방산은 팔미틱산, 팔미토레익산, 스테아릭산, 올레익산, 리놀레익산, 리놀레닉산 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 6 항 내지 제 12 항에 있어서, 비-동물 유래의 단백질 가수분해물은 박테리아 트립톤, 효모 트립톤, 식물 가수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항에 있어서, EBx
    Figure 112007079830277-PCT00046
    세포는 클럼프 상태의 세포로 현탁 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항에 있어서, 단계 a)에서의 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00047
    세포를 한 배양 용기에서 다른 용기로 옮겨 배양하는 최소 1 계대, 바람직하게는 모든 계대는 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00048
    세포 클럼프를 파괴하지 않는 희석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항에 있어서, 단계 a)에서의 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00049
    세포를 한 배양 용기에서 다른 용기로 옮겨 배양하는 최소 1 계대, 바람직하게는 모든 계대는 세포 클럼프를 파괴 및/또는 원심분리하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항에 있어서, 단계 c)는 감염 단계 b) 이후, 바람직하게는 단계 b) 수행 1시간 후에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항에 있어서, 감염 단계 b)는 약 10 내지 10-6, 바람직하게는 약 10-3 내지 10-5, 그리고 가장 바람직하게는 약 10-4 m.o.i(multiplicity of infection)로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항에 있어서, 상기 바이러스는 자연적으로 유발된 폭스 바이러스 또는 변형 백시나 안카라(MVA:Modified Vaccinia Ankara) 바이러스, 닭 폭스 바이러스, 카나리아 폭스 바이러스(즉, ALVAC), 준코폭스(juncopox) 바이러스, 미나(mynah) 폭스 바이러스, 비둘기폭스 바이러스, 사이타신(psittacine) 폭스 바이러스, 메추라기 폭스 바이러스, 참새 폭스 바이러스, 찌르레기 폭스 바이러스, 칠면조 폭스 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항에 있어서, 상기 바이러스는 자연적으로 유발된 바이러스, 또는 홍역(measles) 바이러스 및 볼거리(mumps) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 24 항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 고양이 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 인간 인플루엔자 바이러스는 균주 H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H7N7 및 H9N2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항에 있어서, 상기 배양 단계 a)는 배치(batch) 배양, 반복 배치 배양, 페드-배치(fed-batch) 배양 또는 관류(perfusion) 배양에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항에 있어서, 상기 감염 단계 b)는 배치 또는 페드-배치 배양 단계에서의 세포 농도가 최소 4백만 세포/㎖, 바람직하게는 6백만 세포/㎖ 일때 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항에 있어서, 상기 감염 단계 b)는 관류 배양 단계에서의 세포 농도가 최소 8백만 세포/㎖, 바람직하게는 9 내지 10백만 세포/㎖ 일때 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항에 있어서, 단계 a), b), c) 및 d)에서의 무혈청 배양 배지의 pH가 6.5 내지 7.8인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항에 있어서, 단계 d)는 수득하기 전에 2 내지 10일 동안 지속하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항에 있어서, 세포 배양은 30℃ 내지 39℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 바이러스.
  35. 제 34 항의 바이러스를 포함하며, 적절하게는 면역 반응을 증가시키는 물질과 조합된 백신.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 바이러스는 온전한 상태의 바이러스 입자로 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 바이러스는 파쇄된 바이러스 입자로 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
  38. 제 35 항에 있어서, 상기 바이러스는 약독화된 바이러스로 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
  39. 제 34 항의 바이러스의 성분을 포함하며, 적절하게는 면역 반응을 증가시키는 물질과 조합된 백신.
  40. 제 35 항에 있어서, 상기 백신은 바이러스로부터 분리된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  41. 제 1 항 내지 제 33 항의 방법에 의해 수득가능한 감염된 세포주 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00050
    를 포함하며, 상기 감염된 세포주 EBx
    Figure 112007079830277-PCT00051
    은 단계 d)에서 수득되는 것을 특징으로 하는 백신.
  42. 제 34 항의 바이러스 또는 이의 성분을 포함하는 진단용 조성물.
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