KR101567095B1 - 배아 줄기 세포를 이용한 형질전환 조류의 제조 방법 - Google Patents
배아 줄기 세포를 이용한 형질전환 조류의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 a) 배양되지 않은 수정된 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF); 및 동물 혈청; 및 선택적으로, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨 11(IL-11), 온코스타틴 및 카디오트로핀이 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계; b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 2 내지 10 계대 동안 배양하는 단계; c) SCF, FGF, IL-6, IL6R, LIF, 온코스타틴 및 카디오트로핀 및 IL-11로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 상기 배양 배지로부터 선택적으로 제거하는 단계; d) 상기 단계 c)의 배지에 있는 ES 세포를 영양 세포층에서 추가로 배양하는 단계를 포함하는 조류 배아 줄기(ES) 세포 배양 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조류 생명공학에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 형질전환 조류의 제조 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 관심 재조합 단백질을 알에서 대량으로 발현하는 형질전환 조류를 제조하는데 유용하다.
임상 개발 분야에 있어서의 400개 이상의 생분자 및 300억 달러 이상의 시장에서 치료학적 분야는 최근 15년 동안 비약적인 성장을 하였다. 대부분의 재조합 단백질은 완전한 생물학적 활성을 나타내기 위해 특이한 후-전사적 변형을 필요로 하며, 큰 스케일의 생물반응기에서 포유동물 세포의 성장 동안 생산되어야 한다. 이러한 생산 시스템과 관련된 비용은 중요한 정량적 필요성과 함께 최종산물의 최종 생산 과정에서 지연을 증가시키는데 필요하다. 이 문맥에서 형질전환 동물은 경제적으로 흥미있는 대안을 나타내어야 하며, 특히 변형은 생식선을 통해 자손으로 전달되어야 한다.
토끼, 양 및 젖소는 많은 흥미요소를 이끌어내지만, 암탉은 달걀에서 재조합 치료 단백질을 빠르고 비용-효율적으로 생산하기 위한 가장 매력적인 생물학적 생산 시스템으로서 오랫동안 여겨졌다. 상업용 암탉이 일년에 약 250개의 알을 낳고 각 알은 약 4 그램의 달걀 흰자 단백질을 포함하고 있기 때문에 닭이 알을 낳는 능력은 매우 우수하다. 오직 100 mg의 재조합 단백질이 달걀에서 생산된다면, 1000 마리의 암탉의 작은 털은 일년에 25 kg의 재조합 단백질 재료 물질을 생산할 수 있을 것이다. 더불어, 상업용 달걀 산업은 이미 매우 자동화되었으며, 최근 10년 동안 많은 인간 백신이 달걀에서 생산되었기 때문에 취체기관(regulatory agency)은 알-유도된 제품을 손쉽게 이용할 수 있게 되었다.
마찬가지로, 가금류 산업은 상업적으로 중요한 유전적 특성을 좀더 빠르게 선별하기 위해 형질전환을 이용하는 것이 흥미로울 것이다(즉, "메타-클로닝 기술"). 이런 아이디어는 더 짧은 시간에 훌륭한 닭을 얻기 위해 고전적인 선별 과정[가계 -> GGP -> GP -> PS]을 통해야 한다. 가금류 산업에 있어서 형질전환 기술을 가장 잘 이용하는 것은 형질전환 식물에서 공통으로 실행하는 질병 내성을 전달하거나 음식물 소화를 향상시키는 것이다. 더불어, 형질전환 기술은 조류 유전 자원을 보존하기 위한 방법이 될 것이다. 오랫동안, 가금류 산업에서 가장 가치가 있는 동물 가계의 다른 부위로 분할하는 것은 번식 산업에 있어서 발생하는 문제(예, 바이러스 감염)에서 선별 프로그램에 소요되는 시간을 억제하기 위한 오직 한가지 방법이다. 이러한 시도는 비용이 비싸며, 2003년의 네덜란드의 경우와 같이, 바이러스 감염을 체크하기 위해 모든 지역의 가금류를 예방적으로 제거하기 위해 국가적으로 위생적 결정을 내리는 것에 대해 보증할 수 없다는 것이다.
변형된 동물을 제조하는 방법은 첫째로 외래 유전자를 동물의 게놈에 안정하게 도입하는 것이다. 25년 동안 개발된 DNA를 도입하는 기술은 다음과 같다 : (i) DNA 미세주입, (ii) 바이러스 형질도입, (iii) 정자-매개 유전자 전달, (iv) 핵 전달, (v) 원시 배아 세포를 이용한 세포 기원의 전달, 또는 (vi) 배아 줄기 세포를 이용한 세포 기원의 전달. 닭에서는, 오직 DNA 미세주입 시도(Love et al, 1994 Biotechnology 12 :60-63) 및 바이러스 형질도입(Bosselman et al, 1990 J. Reprod. Fertil. Suppl. 41 : 183-195)만이 외래 유전자를 생식계열로 전달하기 위해 증명된 것이었다. 그러나, 이 두가지 기술은 몇가지 제약 사항이 있다 ; 이들은 귀찮고 노동력이 많이 들며 효율이 낮으며, 외래 유전자가 삽입되지 않거나 무작위로 삽입되는 것. 바이러스 형질도입 기술은 바이러스 벡터로 삽입되는 외래 유전자의 크기에 있어서도 제약이 있다. 이런 두가지 기술은 오늘날 상업적으로 개발할 정도의 단백질 발현 레벨에 도달하는 것을 가능하지 않게 한다.
시험관 내에서 이미 유전적으로 재조합된 발생하는 닭 배아의 원시 배아 세포(PGC) 또는 배아 줄기(ES) 세포에 주입하는 것은, 조류 형질전환의 특히 유망한 기술 중의 하나인데, 그 이유는 이 기술이 표적으로 하는 외래 유전자를 게놈 내의 특정 위치로 삽입 가능하게 하여 외래 유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있게 하기 때문이다. 그러나, 형질전환 닭을 생산하기 위해 이러한 시도를 이용하기 위해, 중요한 필요조건이 만족되어야 한다 : 생식 계열을 군집화하기 위해 수여자 배아 내에 삽입되는 능력을 여전히 유지하면서 세포는 시험관내 조작을 하기 위해 생존해야 하며, 변형을 자손에게 전달해 주어야 한다.
과거에는 각 공정 단계에서의 여러가지 기술적 장애를 뛰어넘기 위해 많은 시도들이 행해졌으며, 오늘날은 배양되지 않은 배아로부터 분리한 새롭게 분리된 배아원기 세포를 갓 낳은 배아의 반-배아 강에 주입함으로써 체세포 및 생식 계열 키메라를 얻었다. 공여자 및 수여자 세포의 수여는 다음 것에 의해 측정되었다 (i) 검은색 및 흰색 색소의 검증을 통한 멜라닌 세포 개체수(베어드 락 또는 브라운 레그혼은 로커스 I에 열성 대립유전자를 갖지만 화이트 레그혼은 로커스 I에 우성 대립유전자를 갖는다) ; (ii) DNA 지문 분석을 통한 적혈구 개체수 ; (iii) 공여자-유도된 표현형을 가진 자손의 분석을 통한 생식샘(Petitte et al, 1990 Development 108 :85-189 ; Carsience et al, 1993 Development 117 :669-675 ; Thoraval et al, 1994 Poultry Science 73 :1897-1905 ; Pain et al, 1996 Development 122 :2339-2348). 체세포 조직 및 생식계열 모두에 기여하는 키메라는 배아원기 세포를 주입한 지 48시간 뒤(Etches et al 1996 Mol. Reprod. Dev. 45 :291-288)부터 배양 7일까지(Pain et al, 1996) 관찰하였다. 에치등의 문헌(Etches et al, 1996)에서는 주입된 세포를 생쥐 섬유아세포와 공동 배양하고 난 뒤에 훨씬 더 많은 체세포 키메라가 관찰됨을 보여주었다. 페인 등은(Pain et al, 1996) 조류 배아원기 세포를 STO 생쥐 섬유아세포주 상에 접종하였다. 배양 동안 유지되는 세포의 ES 상태는 ECMA-7 및 SSEA-1 에피토프의 발현 및 텔로머라아제 활성에 의존한다(Pain et al, 1996). 배아원기 세포의 분화가 없는 상태에서의 증식은 백혈병 저해 인자(LIF) 및 다른 인자인 IL-11, SCF, bFGF, IGF-1의 존재에 의해 촉진되며, 분화는 항-레티노익산 단일클론 항체에 노출됨으로서 억제된다(Pain et al, 1996). 공여자-유도된 세포에 의한 배아의 군집화는, 공여자 세포를 주입하기 전에 수여자 배아를 조사시킬 때 촉진되는 것으로 밝혀졌다(Carsience et al, 1993).
그러나, 배양동안 유지되는 배아원기 세포는, 갓 준비한 세포를 주입하고 난 뒤에 관찰되는 체세포 키메라 현상의 빈도 및 범위와 비교하여 체세포 조직에 대해 감소된 기여도를 나타내며 더 낮은 키메라를 생산한다. 그러나, 세포-기원의 조류 형질전환 방법의 일부분이 실현되지만 ; 어떤 형질전환 동물도 ES 세포 기술에 의해 얻어지지는 않는 것으로 증명되었다.
형질전환 닭을 생산하기 위한 효율적인 방법이 여전히 요구된다. 이것이 본 발명의 목적이다.
이 목적을 실현하고, 본원에 광범위하게 기술되는 본 발명의 목적에 부합하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 조류 배아 줄기(ES) 세포 배양 방법을 제공한다:
a) 수정되고, 바람직하게는 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를
- 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및/또는 섬모 신경영양 인자(CNTF); 및
- 선택적으로, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨 11(IL-11), 온코스타틴 및 카디오트로핀; 및
- 동물 혈청이 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 2 내지 10 계대 동안, 바람직하게는 2 내지 20 계대 동안 배양하는 단계;
c) 선택적으로 SCF, FGF, IL-6, IL6R, LIF, 온코스타틴, 카디오트로핀 및 IL-11로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 상기 배양 배지로부터 제거하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배지에 있는 ES 세포를 영양 세포층에서 추가로 배양하는 단계.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 배아 줄기(ES) 세포를 배양하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 수정되고, 바람직하게는 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 동물 혈청이 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 2 내지 10 계대 동안, 바람직하게는 2 내지 20 계대 동안 배양하는 단계;
c) 선택적으로 SCF, FGF, IL-6 및 IL6R를 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장인자, 바람직하게는 SCF, FGF, IL-6 및 IL-6R로부터 선택되는 성장인자를 상기 배양 배지로부터 제거하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배지에 있는 ES 세포를 영양 세포층에서 추가로 배양하는 단계.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 배아 줄기(ES) 세포의 배양 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 수정되고, 바람직하게는 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 동물 혈청이 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 2 내지 10 계대 동안 배양하는 단계;
c) 선택적으로, SCF 및 FGF를 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장인자, 바람직하게는 SCF 및 FGF 모두를 상기 배양 배지로부터 제거하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 배지에 있는 ES 세포를 영양 세포층에서 추가로 배양하는 단계.
본 발명의 방법의 선택적 단계 c)는 ES 세포의 사망률 및/또는 분화의 징후가 배양에서 관찰될 때 수행된다. 예를 들어 분화의 징후는 세포의 형태가 특징적인 형태학적 형태, 예를 들면 상피세포 형태 또는 섬유아세포 형태로 변하는 것이다. 분화의 다른 예는 텔로머라아제, 알칼라인 포스파타아제, ES 세포의 마커인 SSEA-1 항원과 같은 ES 세포 마커의 발현의 감소 또는 부재가 될 수 있다.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 배아 줄기(ES) 세포의 배양 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 수정되고, 바람직하게는 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 동물 혈청이 최소한 한가지 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 단계 a)의 배지에서 ES 세포를 추가로 배양하는 단계.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 배아 줄기(ES) 세포의 배양 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 수정되고, 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R) 및 동물 혈청이 최소한 한가지 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 단계 a)의 배지에서 ES 세포를 추가로 배양하는 단계.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 배아 줄기(ES) 세포의 배양 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 수정되고, 배양되지 않은 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF) 및 동물 혈청이 최소한 한가지 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 단계 a)의 배지에서 ES 세포를 추가로 배양하는 단계.
본원에 사용된 용어 <<조류>>는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조와 같은 분류 집단 <<ava>>에 속하는 모든 종, 아종 또는 인종을 일컫는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 용어 "조류(avian)", "새(bird)", "aves" 또는 "ava"는 모두 같은 의미를 갖는 것으로 간주되며 구분되지 않고 사용될 것이다. 바람직한 구현예에서, "새"는 분류학적 기준의 모든 동물을 일컫는다:
- "안세리폼(Anseriformes)" (즉, 오리, 거위, 백조 및 동류). 안세리폼은 3개 과의 약 150 종의 새를 포함한다: 안히미대(Anhimidae, 명매기 일종), 안세라나티대(Anseranatidae, 까치-거위) 및 오리, 거위 및 백조 중에서 140 종 이상의 물새를 포함하는 아나티대(Anatidae). 이들 모든 종은 물 표면에서 수중 생활을 하기에 매우 적합하다. 모두는 수영을 할 수 있게 물갈퀴를 가진다(비록 일부는 불완전하여 주로 육상 생활을 한다). 이 단어는 예를 들어 페킨(Pekin) 오리 및 무스코비(Muscovy) 오리와 같은 다양한 종의 오리를 포함한다.
- "갈리폼(Galliformes)" (즉, 닭, 메추라기, 칠면조, 꿩 및 동류). 갈리폼은 닭, 칠면조, 메추라기 및 꿩을 포함하는 새이다. 약 256종이 전세계에서 발견되었다. 이 단어는 다양한 종의 갈러스 갈러스(Gallus gallus) 또는 예를 들어 S86N, Valo, 화이트 레그혼, 브라운 레그혼, 서섹스(Sussex), 뉴 햄스피어, 로드 아일런드, 오스트랄롭(Ausstralorp), 미노카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이, 이스트 랜싱(East Lansing), 이탈리안-파트리지-컬러(Italia-Partridge-colored), 마란스(Marans), 베어드 락(Barred Rock), 코 뉴 루즈(Cou Nu Rouge, CNR), GF30, ISA와 같은 닭 뿐만 아니라 칠면조, 꿩, 메추라기 및 다른 일반적으로 사육되는 가금류를 포함한다.
- "콜럼비폼 (Columbiformes)" 즉, 비둘기 및 동류). 이 새는 매우 널리 분포하는 비둘기(dove and pigeon)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 세포는 닭 세포이다. 닭은 S86N, Valo, 화이트 레그혼, 브라운 레그혼, 서섹스(Sussex), 뉴 햄스피어, 로드 아일런드, 오스트랄롭(Ausstralorp), 미노카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이, 이스트 랜싱(East Lansing), 이탈리안-파트리지-컬러(Italia-Partridge-colored), 마란스(Marans), 베어드 락(Barred Rock), 코 뉴 루즈(Cou Nu Rouge, CNR), GF30, ISA를 포함하는 닭 종으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 닭 ES 세포는 베어드-락 종이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 세포는 오리 세포이다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 오리 ES 세포는 페킨 또는 무스코비 종이다.
단계 a)의 세포는 조류 배아 줄기 세포이다. 배아 줄기 세포(ES 세포)는 아주 초기의 배아(예 배반포배 단계)의 일부분 또는 전체를 배양하여 얻어지는 특징을 갖는다. 이 ES 세포는 시험관 내에서는 줄기 세포의 모든 특성을 나타내며, 생체 내에서는 배아의 형태발생에 영향을 주는 유일한 특성 및 어떤 형태로든지 수여자 배아에 재이식될 때 생식계열 군집화를 이루는 특성을 나타낸다. 성적 성숙을 하고 난 뒤에 발생하는 정자 또는 난모세포의 기원인 원시 생식 세포(PGC)는 다능성 ES 세포이며 ES 세포의 아종을 구성한다. 바람직하게는, 본 발명의 조류 배아 줄기 세포는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 VI 내지 XII를 포함하는 발생 단계, 바람직하게는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 X 근처에서 수정된 조류 알(들)의 배아원기 디스크로부터 분리된다(참고, EYAL-GILADI의 분류: EYAL-GILADI 및 KOCHAV, 1976, <<From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick>> 및 "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337). 바람직한 구현예에서, 단계 a)의 세포는 갓 낳은 수정된 알로부터 분리되며, 즉 착란이라고 불리는 발생 단계에 분리된다. 셀리에르 등의 문헌(Sellier et al. 2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228)에 따르면, 착란은 Eyal-Giladi & Kochav의 분류에 따른 다음의 발생 단계에 대응된다:
- 무스코비 오리 : 단계 VII
- 기니 닭(Guinea fowl) : 단계 VII - VIII
- 칠면조 : 단계 VII - VIII
- 페킨 오리 : 단계 VIII
- 닭 : 단계 X
- 일본 칠면조 : 단계 XI
- 거위 : 단계 XI.
바람직하게는, 단계 a)의 페킨 오리 배아 줄기(ES) 세포는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류의 단계 VIII(착란)에 있는 배아(들)를 분해시킴으로써 얻어진다.
바람직하게는, 단계 a)의 무스코비 오리 배아 줄기(ES) 세포는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류의 단계 VII(착란)에 있는 배아(들)를 분해시킴으로써 얻어진다.
바람직하게는, 단계 a)의 닭 배아 줄기(ES) 세포는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류의 단계 X(착란)에 있는 배아(들)를 분해시킴으로써 얻어진다.
더욱 바람직하게는, 알들은 배양된 적이 없다(즉, "미-배양된"). 배아원기 디스크로부터 분리된 세포는 조류 배아 세포, 더욱 바람직하게는 조류 배아 줄기(ES) 세포를 포함하며; 이 배아 줄기 세포는 분화 전능성 또는 다능성 세포이다. 배아원기 세포는 타이트하게 연결된 콜로니로 성장하는 세포이며; 이는 큰 핵과 작은 세포질을 갖는 둥근 모양의 형태를 나타낸다(참고 도 2). 배아원기 세포의 형태는 배양하는 동안(본 발명의 방법의 도 2b 및 c의 단계) 타이트하게 연결된 세포에서 더 느슨하게 연결된 훨씬 분산된 세포로 진화한다. 단계 c)에서 얻어진 조류 ES 세포는 바람직하게는 느슨하게 연결된 형태를 보인다.
다른 구현예에 따르면, 단계 a)의 세포는 원시 생식 세포(PGC)에 많이 존재하는 배아 줄기 세포 집단이다. 보다 바람직하게는, 단계 a)의 ES 세포는 정제된 PGC이다. 조류 종에서, 원시 생식 세포는 배아원기의 중심 부위로부터 발생한다(Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 101(2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al, 1997 Poult Sci. 76(8):1084-92). 그리고 나서, 이들은 배아 능선에 도달하기 위해 배아 발생의 2.5 내지 5일 사이에 맥관계(vasculature)에 의해 수득될때까지 앞부분의 임시 배아 위치인 배아 능선으로 이동한다. 이들은 난모세포 또는 정모세포로 분화될 때 생식선 능선을 군집화한다(Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127). 공여자 조류 배아로부터 PGC를 분리하는 방법은 문헌에 보고되었으며 당업자에 의해 손쉽게 수행될 수 있다(참고예. 1993년 9월 7일에 공개된 공개번호 05-227947의 JP924997; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2):143-149; Naito et al. 1994 Mol. Reprod. Dev. 39:153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96:521-528; Chang et al. 1992 Cell Biol. Int.Reporter 16(9): 853-857). 일 구현예에 따르면, PGC는 Hamburger & Hamilton의 분류상 단계 2-14의 닭 배아의 등쪽 대동맥으로부터 수득한 배아 혈액으로부터 수득된다(Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88:49-92). 다른 바람직한 구현예에서, PGC는 닭 배아의 물리적 분해에 의해 생식 능선으로부터 또는 생식샘으로부터 수득된다. 그러나, 상기에 언급한 바와 같이, PGC를 분리하는 다른 방법도 공지되어 있으며 선택적으로 사용될 수 있다.
"완전 배양 배지"는 기본 배지를 의미하며, 바람직하게는 최소한 하나의 성장 인자 및 동물 혈청이 첨가된 기본 합성 배지를 의미한다. 완전 배양 배지의 예는 아래의 문헌에 개시되어 있다: WO03/076601, WO05/007840, EP787180, US6,114,168, US5,340,740, US6,656,479, US5,830,510 및 페인 등의 문헌(Pain et al, 1996, Development 122:2339-2348). 본 발명에 따르면, "기본 배지"는 그 자체로써 최소한 세포가 생존하고, 더 좋기로는 세포가 성장할 수 있게 하는 기본적인 배지 조성을 가진 배지를 의미한다. 기본 배지의 예로는 BME(basal Eagle Medium), MEM(minimum Eagle Medium), 배지 199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium), GMEM(Glasgow modified Eagle medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, Iscove's Modified Dulbecco's 배지, MacCoy's 5A 배지, RPMI 1640이다. 기본 배지는 무기염(예: CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4, ...), 아미노산, 비타민(티아민, 리보플라빈, 폴릭산, D-Ca 판토테네이트, ...) 및 글루코스, 베타-메캅토-에탄올, 소듐 피루베이트와 같은 다른 성분을 포함한다. 바람직하게 기본 배지는 합성 배지이다. 본 발명의 가장 바람직한 배지는 2mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 1% 비-필수 아미노산, 0.16 mM 베타-머캅토-에탄올이 첨가된 DMEM-HamF12 이다.
선택적으로, 완전배양 배지는 조건 배지이며, 바람직하게는 BRL 조건 배지이다. 예를 들어, BRL 조건 배지는 스미스와 후퍼의 문헌(Smith and Hooper, 1987, Dev. Biol. 121: 1-9)에 기재된 바와 같은 공지된 기술에 따라 제조된다. BRL 세포는 ATCC 참조 번호 CRL-1442로부터 이용할 수 있다. 조건 배지에는 아래에 기재된 외인성 성장 인자가 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성장 인자"는 배양하는 동안 조류 세포의 생존 및 성장에 필수적인 배양 배지에 첨가되는 외인성 성장 인자를 의미한다. 성장 인자를 두가지 종으로 개략적으로 구분하는 것이 가능하다: 사이토카인 및 영양 인자. 사이토카인은 gp130 단백질과 결합되어 있는 수용체를 통해 작용을 하는 사이토카인이다. 따라서, 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨 11, 인터루킨 6, 인터루킨 6 수용체, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 온코스타틴 및 카디오트로핀은 특정 사슬의 수용체 레벨에서 모이는 유사한 작용을 하며, 모노머 또는 헤테로-다이머 형태로 gp130 단백질과 함께 모인다. 영양 인자는 주로 줄기세포 인자(SCF), 인슐린 성장 인자 1(IGF-1) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)이며, 바람직하게는 염기성 FGF(bFGF) 또는 인간 FGF(hFGF)이다.
본 발명의 방법의 단계 a)에 사용된 완전 배양 배지는 기본 배지를 포함하며, 바람직하게는 gp130 단백질과 결합하는 수용체를 통해 작용을 하는 최소한 하나의 사이토카인 및/또는 최소한 하나의 영양 인자를 포함하는 기본 합성 배지이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 완전 배양 배지는 기본 배지 및 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴, 카디오트로핀, 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인터루킨 11(IL-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 포함한다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구현예에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1과 CNTF 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다.
본 발명의 두번째 바람직한 구현예에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1, CNTF, IL-6 및 IL-6R 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다.
본 발명의 세번째 바람직한 구현예에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF 및 FGF 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다.
다른 구현예에 따르면, 완전 배양 배지는 성장 인자(즉 예를 들면 BRL 세포에 의해 발현되는 것) 및 선택적으로는 백혈병 억제 인자(LIF), 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인터루킨 11(IL-11)을 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 외인성 성장 인자가 첨가된 조건 배양 배지이다.
기본 배지 또는 조건 배양 배지에 들어 있는 성장 인자 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11의 농도는 약 0.01 내지 10 ng/ml, 바람직하게는 0.1 내지 5 ng/ml, 더욱 바람직하게는 약 1 ng/ml이다.
본 발명의 조류 배아 줄기 세포는 영양 세포층 상에서 배양된다. 영양 세포는 ES 세포를 얻기 위한 목적으로 배양되는 세포 또는 세포주가 될 수 있다. 선택적으로 영양 세포는 세포외 매트릭스와 결합한 성장 인자로 구성된다. 영양 매트릭스는 영양 세포 또는 세포외 매트릭스로도 불린다. 본원에 사용된 영양 매트릭스는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 영양 매트릭스는 바람직하게는 필수조건이다. 용어 "필수조건"은 영양 매트릭스와 접촉한 수정된 조류의 알의 배아원기 디스크로부터 유도된 세포를 저장하기 전 시간 동안 예를 들면, 영양 매트릭스에 의해 성장 인자 또는 다른 인자를 생산하기 시작하고 확립하기에 충분한 시간 동안 배지의 존재하에서 영양 매트릭스가 배양되는 것을 의미하며; 일반적으로 영양 매트릭스가 영양 매트릭스와 접촉한 수정된 조류알의 배아원기 디스크로부터 유도된 세포를 저장하기전 하루 또는 2일 동안 그 자체로도 영양 매트릭스를 배양할 수 있는 것이 필수조건이다. 영양세포는 바람직하게는 생쥐 섬유아세포를 포함한다. STO 섬유아세포가 바람직하지만 일차 섬유아세포도 적합하다. 또한, 본 발명이 생쥐 세포 영양 매트릭스의 이용에 대해 기술하였지만, 다른 생쥐 종(예, 쥐); 다른 포유동물 종(예; 유제동물, 소, 돼지 종); 또는 조류 종(예, 순계루 새, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩)의 세포를 포함하는 영양 매트릭스도 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 영양 세포는 STO 세포에 들어있는 조류 SCF와 같은 성장 인자의 지속적인 발현을 가능하게 하는 발현 벡터(들)에 의해 형질전환될 수 있다. 따라서, 이 "영양" 세포는 세포의 혈장 막에 부착 및/또는 용해된 형태의 인자를 생산한다. 따라서, 본 발명의 배양 방법은 선택적으로 단일층의 영양 세포층을 확립하는 단계를 포함할 수 있다. 영양 세포는 표준 기술을 이용하여 핵분열을 불활성화되게 할 수 있다. 예를 들어, 영양 세포는 X선 또는 감마선 조사(예, 4000 라드의 감마선 조사)에 노출되거나 마이토마이신 C(예, 2-3시간 동안 10 ㎍/ml)로 처리될 수 있다. 세포의 핵분열을 불활성화시키는 방법은 미국 유전자 은행(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209의 세포(예, STO 세포는 ATCC 참조번호 1503으로 이용가능하다)에 관한 일반적인 정보에 자세히 나와있다. 단일층은 선택적으로는 약 80%의 밀집도로 배양되며, 바람직하게는 약 90%의 밀집도로, 더욱 바람직하게는 약 100%의 밀집도로 배양될 수 있다. 단일층으로서 영양 세포의 형상은 배양을 하기에 바람직한 형상이지만, 모든 가능한 형상이 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 예를 들어, 층, 단일층, 클러스터, 응괴 또는 다른 응집체 또는 영양 세포의 그룹이 본 발명의 범위에 속하며, 특히 용어 "매트릭스"라는 의미에 속할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 동물 혈청이 포함된다. 사용되는 동물 혈청은 바람직하게는 동물 태아 혈청이다. 우태아 혈청이 바람직하다. 또한, 본 발명은 우태아 혈청을 사용하는 것으로 기재되어 있지만 다른 동물 종(예, 닭, 말, 돼지, 유제동물 등)으로부터의 혈청을 포함하는 동물 혈청도 사용될 수 있다. 배양 배지에 들어있는 동물 혈청의 최종 농도는 약 1 내지 25%, 바람직하게는 5% 내지 20%, 더욱 바람직하게는 8% 내지 12% 범위를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 배양 배지에 들어있는 동물 혈청의 최종 농도는 약 10%이다. 바람직한 구현예에 따르면, 배양 배지는 약 10%의 우태아 혈청을 포함한다. 본 발명의 배양 배지는 박테리아 오염을 막기 위해 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항체를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 조류 배아 줄기 세포를 유전적으로 변형시키는 방법을 제공한다:
a) 상기 방법에 따라 배양되고 수득한 ES 세포를 벡터로 형질전환시키는 단계;
b) 예를 들어 항체, 아미노산, 호르몬과 같은 선별제를 배양배지에 첨가함으로써 형질전환된 ES 세포를 선별하는 단계;
c) 유전적으로 변형된 내성을 띄는 ES 클론을 스크리닝하고 증폭하는 단계;
d) 상기에 기술한 바와 같은 배양 배지에서 영양 세포층 상에서 단계 c)의 유전적으로 변형된 ES 세포를 배양하는 단계.
첫번째 구현예에 따르면, 상기 단계 d)의 배양 배지는 동물 혈청 및 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, IL-11, LIF, FGF, SCF, 온코스타틴, 카디오트로핀을 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 d)의 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF1 및 CNTF를 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 d)의 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF1 및 CNTF를 포함하며, 선택적으로는 IL-6, IL-6R, IL-11, LIF, FGF, SCF, 온코스타틴, 카디오트로핀을 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 포함한다. 세번째 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 d)의 배양 배지는 동물 혈청 및 IGF1, CNTF, IL-6 및 IL-6R를 포함한다. 네번째 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 d)의 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF 및 FGF를 포함한다.
단계 c)의 ES 세포는 유전적으로 변형된다. 유전적 변형은 ES 세포 내에 벡터를 일시적 또는 안정적으로 형질전환시킴으로써 수행된다. 바람직한 구현예에 따르면, ES 세포는 당업계에 공지된 기술에 따라 벡터를 이용해 안정적으로 형질전환된다. 첫번째 구현예에 따르면, 벡터는 ES 세포의 게놈 내에 무작위로 삽입된다. 바람직한 구현예에 따르면, 벡터는 ES 세포의 게놈 내에 동형접합 재조합에 의해 삽입된다. WO03/043414에서는 동형접합 재조합에 의해 발현 벡터를 ES 세포에 유전적으로 재조합시키는 방법이 기술되어 있다.
단계 a)의 ES 세포는 시험관 내에서 수여자 배아로 도입되기 전에 장시간 동안 유지되고 배양될 수 있다. 이 장시간은 상기 세포를 유전적으로 변형가능하게 한다. 바람직한 구현예에 따르면, 세포는 시험관 내에서 최소한 5일, 최소한 10일, 최소한 14일, 최소한 25일, 최소한 50일, 최소한 75일, 최소한 100일 동안 배양된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 세포 내로 형질전환 될 수 있고 숙주 세포 게놈과는 별개로 복제하거나 게놈 내에서 복제할 수 있는 천연 또는 합성의 단일가닥 또는 이중가닥 플라스미드 또는 바이러스 핵산 분자이다. 환형의 이중가닥 플라스미드는 플라스미드 벡터의 핵산 서열을 기본으로 하는 적당한 제한 효소로 처리함으로서 선형화될 수 있다. 핵산은 벡터를 제한 효소로 절단하고 조각을 함께 연결시킴으로써 벡터내로 삽입될 수 있다. 핵산 분자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드"는 박테리아 또는 효모 숙주 세포와 독립적으로 복제할 수 있는 작은, 환형의 DNA 벡터를 일컫는다. 핵산 벡터는 더불어 "관심 폴리펩타이드"를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 최소한 하나 포함한다. 조절 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 수행되는 실험 없이도 연결된 뉴클레오타이드 서열을 우수하게 발현할 수 있게 하기 위해 선별될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 발현을 조절할 수 있는 다른 인자를 포함한다. 삼부르크 등의 문헌(Sambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989)) 및 로디쉬 등의 문헌(Lodish et al. eds., "Molecular Cell Biology", Freeman (2000))과 같은 기초 분자생물학 서적은 적당한 발현 벡터, 프로모터 및 다른 발현 조절 인자를 디자인하기 위해 참고될 수 있다. 그러나, 적당한 발현 벡터의 선택은 형질전환되어야 하는 숙주세포의 선택 및/또는 발현되어야 하는 단백질의 타입을 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 또한, 다양하게 적용하기 위해 유용한 것은 조직-선별성(즉, 조직-특이성) 프로모터, 즉 하나 또는 그 이상의 조직 형태와 비교하여 특이한 종류의 조직 세포에서 바람직하게 발현하는 프로모터이다. 예를 들어 조직-특이 프로모터는 오브알부민(ovalbumin), 라이소자임(lysozyme), 오보뮤코이드(ovomucoid), 콘알부민(conalbumin) 및 오보뮤신(ovomucin) 등을 포함하는 조류 알의 흰자 단백질과 자연적으로 관련이 있는 닭 난관(oviduct)-특이적 프로모터이다. 또한 유용한 프로모터는 외인성 유도성 프로모터를 포함한다. 이는 외래에서 공급된 제제 또는 자극물질-일반적으로 와인성 대사물질 또는 사이토카인은 아님-에 반응하여 " 작동" 할 수 있는 프로모터이다. 예를 들어, 테트라사이클린-유도성 프로모터와 같은 항생제-유도성 프로모터, 열-유도성 프로모터, 빛-유도성 프로모터, 또는 레이져 유도성 프로모터를 포함한다.(예., Halloran et al., 2000, Development 127(9): 1953-1960; Gemer et al., 2000, Int. J. Hyperthermia 16(2): 171-81; Rang and Will, 2000, Nucleic Acids Res. 28(5): 11205; Hagihara et al., 1999, Cell Transplant. 8(4): 4314; Huang et al., 1999, Mol. Med. 5(2): 129-37; Forster, et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27(2): 708-10; and Liu et al., 1998, Biotechniques 24(4): 624-8, 630-2 (1998)). 본원에 사용된 용어 "관심 폴리펩타이드" 또는 "관심 단백질" 은 펩타이드 결합을 통해 연결된 3개 또는 그 이상의 아미노산이 연속된 폴리머를 일컫는다. 용어 "폴리펩타이드" 는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩타이드, 펩타이드 등을 포함한다. 용어 "폴리펩타이드"는 적당한 기원으로부터 분리되거나 합성된, 재조합 기술에 의해 생산된, 핵산에 의해 인코딩되는 상기에 언급된 바와 같은 폴리펩타이드도 고려된다. 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는 성장 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터페론, 효소, 면역글로불린 또는 이의 단편이다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질전환된"은 핵산을 숙주세포(즉, 조류 ES)에 삽입하는 과정을 일컫는다. 핵산을 진핵생물 또는 원핵 생물에 형질전환하기 위한 많은 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 이 방법들은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 숙주 세포가 핵산 분자를 수득하게 하기 위해, 높은 농도의 염, 예를 들어 칼슘 또는 마그네슘 염으로 세포를 처리하는 방법, 전기장(즉, 전기충격), 계면활성제를 이용한 처리 또는 리포좀 매개 형질전환(즉, 리포펙션 등)을 포함한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 키메라 닭을 얻는 방법을 제공한다:
a) 본 발명의 방법에 의해 수득되고 배양된 조류 ES 세포를 수여자 조류 배아의 반-배아 강(subgerminal cavity)에 도입하는 단계; 및
b) 상기 단계 a)에서 얻은 배아를 배양하여 닭으로 부화시키는 단계;
c) 집락을 형성한 이형 세포를 갖는 닭을 포함하는 키메라 닭을 선별하는 단계.
본원에 사용된 용어 "닭"은 어린 새를 의미하며, 어린 닭을 포함한다. 용어 "반배아 강(subgerminal cavity)"은 배아원기 및 난황 사이의 공간을 의미한다. 이 공간은 배아원기 세포가 알부민으로부터 용액을 흡수하고 이를 이와 난황의 사이 공간에 배출할 때 생성된다.
또한, 본 발명의 목적은 다음의 단계를 포함하는 유전적으로 변형된 키메라 닭을 얻는 방법을 제공하는 것이다:
a) 본 발명의 방법에서 얻고 배양한 유전적으로 변형된 ES 세포를 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입하는 단계; 및
b) 상기 단계 a)에서 얻은 배아를 배양하여 닭으로 부화시키는 단계;
c) 집락을 형성한 유전적으로 변형된 이형 세포를 갖는 닭을 포함하는 키메라 닭을 선별하는 단계.
상기 키메라 닭의 선별은 표현형 또는 유전형 분석에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 키메라 닭은 깃털의 표현형 분석에 의해 선별된다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 닭을 얻는 방법은 ES 세포를 도입하기 전에 수여자 배아의 성별을 확인하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 갓 낳은 비-배양한 닭으로부터 유도된 수여자 배아는 약 5,000개 내지 약 70,000개의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 수여자 배아는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 VI 내지 XII를 포함하는 단계이며, 바람직하게는 다음과 같다:
- 배아가 닭일때는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 X;
- 배아가 무스코비 오리일 때에는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 VII;
- 배아가 페킨 오리일 때에는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 VIII;
- 배아가 일본 메추라기 또는 거위일 때에는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 XI;
- 배아가 기니아 가금류 또는 칠면조일 때에는 Eyal-Giladi & Kochav의 분류상 단계 VII-VIII.
바람직하게는, 최소한 1000개의 ES 세포, 최소한 10,000개의 ES 세포, 최소한 15,000개의 ES 세포, 최소한 30,000개의 ES 세포, 최소한 45,000개의 ES 세포, 최소한 65,000개의 ES 세포, 최소한 85,000개의 ES 세포 또는 최소한 100,000개의 ES 세포가 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입된다. 바람직한 구현예에 따르면, 최소한 30,000개의 ES 세포가 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입된다.
수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입된 ES 세포는 암컷 및 수컷 ES 세포의 혼합 집단일 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 수여자 배아 및 공여자 ES 세포는 도입하기 전에 이미 성이 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 암컷 ES 세포는 암컷 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입된다. 다른 바람직한 구현예에 따르면, 수컷 ES 세포는 수컷 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입된다.
본 발명의 키메라 닭을 얻는 방법은 상기 수여자 배아의 반-배아 강에 ES 세포를 도입하기 전에 수여자 배아를 X선 또는 감마선으로 조사하는 추가 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 수여자 닭 배아는 3 내지 6 그레이의 X선, 바람직하게는 약 4 그레이의 X-선으로 조사된다. 바람직한 구현예에 따르면, 약 15,000개의 닭 ES 세포가, 약 4 그레이의 X-선으로 미리 조사된 수여자 닭 배아의 반-배아 강에 도입된다. 다른 바람직한 구현예에 따르면, 최소한 30,000개의 닭 ES 세포가 비-조사된 수여자 닭 배아의 반-배아 강에 도입된다.
첫번째 구현예에 따르면, 수여자 닭 배아는 화이트 레그혼 종이고, 공여자 닭 ES 세포는 베어드 락(barred rock) 종, 마란스(Marans) 종, S86N 종을 포함하는 군으로부터 선택되는 종으로부터 유도된다. 두번째 구현예에 따르면, 수여자 닭 배아는 베어드 락 종, 마란스 종 및 S86N 종을 포함하는 군으로부터 선택되는 닭 종의 배아이고, 공여자 닭 ES 세포는 화이트 레그혼 종으로부터 유도된다.
이형 세포를 포함하는 본 발명의 키메라 닭을 선별하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 상기 키메라 닭으로부터 유전자 물질 샘플을 얻는 단계;
b) 조류 게놈에 삽입된 조류 류코시스 바이러스 서열에 있는 다형성(polymorphism)의 존재를 분석하는 단계, 여기서 다형성은 정방향 프라이머 5' -GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3'(서열번호 2)의 세트 및 정방향 프라이머 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(서열번호 4)의 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 세트로 증폭함으로써 확인가능함. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 닭 ES 세포는 베어드 락 종으로부터 유도되며, 상기 수여자 배아는 화이트 레그혼 종의 것이다. 상기 증식은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 역전사효소 PCR에 의해 수행되며, 상기 분석은 PCR 증폭된 DNA를 제한효소 HincII로 절단하는 단계를 포함한다.
다형성의 존재 또는 부재를 확인하는 방법은 제한 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 분석, 헤테로듀플렉스 분석, 단일 가닥 형태 다형성(single strand conformational polymorphism, SSCP), 변성 구배 젤 전기영동(denaturating gradient gel electrophoresis, DGGE), 온도 구배 젤 전기영동(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE), 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드(allele-specific oligonucleotide, ASO) 및 디데옥시-지문(dideoxy-fingerprinting, ddF)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
상기 다형성의 존재를 분석하는 단계는 다음의 단계를 포함한다:
a) 상기 유전 물질을 HincII 제한 효소로 절단하는 단계;
b) 상기 절단에서 얻은 단편을 분리하는 단계;
c) 상기 단편에 의해 형성되는 절단 패턴을 탐색하는 단계; 및
d) 선택적으로, HincII 절단 효소를 이용한 화이트 레그혼, 마란스, 베어드 락, S86N 유전 물질의 절단에 의해 얻어진 최소한 하나의 절단 패턴으로 상기 패턴을 비교하는 단계, 여기서 단계 c) 및 d)에서 탐색된 절단 패턴의 차이는 이형 세포를 포함하는 키메라 닭의 식별자가 됨.
또한 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 키메라 닭의 자손을 얻는 방법을 포함한다:
a) 본 발명의 방법에 의해 얻은 선별된 키메라 닭을 성인 닭으로 성숙하도록 놓아두는 단계;
b) 이형 세포를 포함하는 상기 성인 새를 교배시켜, 자손 새를 만드는 단계; 및
c) 이형 세포를 포함하는 자손 중에서 관심 새를 선별하는 단계. 상기 새의 선별은 깃털의 표현형 분석에 의해 수행되거나 새 개놈에 삽입된 조류 류코시스 바이러스의 서열에 있는 HincII 다형성의 존재를 분석하는 유전학적 분석에 의해서도 가능하다.
상기 방법은 유전적으로 변형된 이형 세포에 포함된 벡터에 의해 코딩되는 이형 폴리펩타이드를 발현하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 이형 폴리펩타이드는 혈액, 정액, 소변과 같은 새의 생체액으로 전달되거나, 유전적으로 변형된 새의 암컷에 의해 생산되는 발생하는 조류 알의 흰자위로 전달된다.
또한, 본 발명은 동물 혈청과 함께 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 인터루킨 11, 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴 및 카디오트로핀으로 구성되는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성분이 포함된 유전적 및 비-유전적으로 변형된 조류 배아 줄기(ES) 세포, 바람직하게는 닭 및 오리 ES 세포용 배양 배지에 관한 것이며, 상기 배지는 상기 조류 배아 줄기 세포가 최소한 10일, 최소한 30일, 바람직하게는 최소한 100일, 더욱 바람직하게는 무제한 동안 배양 동안 유지되기에 충분하다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 함께 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF)가 첨가된, 유전적 또는 비-유전적으로 변형된 조류 배아 줄기(ES)세포, 바람직하게는 닭 및 오리 ES 세포용 기본 배양 배지에 관한 것이다.
본 발명의 두번째 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 함께 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6) 및 인터루킨 6 수용체(IL-6R)가 첨가된, 유전적 또는 비-유전적으로 변형된 조류 배아 줄기(ES)세포, 바람직하게는 닭 및 오리 ES 세포용 기본 배양 배지에 관한 것이다.
본 발명의 세번째 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 함께 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장인자(FGF)가 첨가된, 유전적 또는 비-유전적으로 변형된 조류 배아 줄기(ES)세포, 바람직하게는 닭 및 오리 ES 세포용 기본 배양 배지에 관한 것이다.
상기 배지는 상기 배아 줄기(ES) 세포, 바람직하게는 닭 및 오리 ES 세포를 최소 7일, 최소 14일, 최소 30일, 최소 50일 및 바람직하게는 최소 100일 동안 배양하면서 유지시키기에 충분하다.
본 발명의 배양 배지는 인터루킨-11, 카디오트로핀, 온코스타틴 및/또는 LIF를 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 물질을 선택적으로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 영양 세포층을 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 다른 닭 종으로부터 화이트 레그혼 닭 종을 구분하는 유전학적 다형성 분석 방법을 제공한다:
a) 상기 화이트 레그혼 닭 종으로부터의 유전 물질 샘플 및 다른 닭 종으로부터의 유전 물질 샘플을 얻는 단계;
b) 닭 게놈에 삽입된 조류 류코시스 바이러스의 서열에 있는 다형성의 존재를 분석하는 단계, 상기 다형성은 정방향 프라이머 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA-3'(서열번호 2)의 세트 및 정방향 프라이머 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC-3'(서열번호 4)의 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 프라이머 세트로 증폭함으로써 확인가능함.
본 발명의 유전학적 다형성 분석 방법에 있어서, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 역전사효소 PCR에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
상기 다형성의 존재를 분석하는 단계는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) PCR 증폭된 DNA를 HincII 제한 효소로 절단하는 단계;
b) 상기 절단에서 얻은 단편을 분리하는 단계;
c) 상기 단편에 의해 형성되는 절단 패턴을 탐색하는 단계; 및
d) HincII 절단 효소를 이용한 화이트 레그혼 유전 물질의 절단에 의해 얻어진 절단 패턴을 다른 닭 종의 유전 물질 절단 배턴과 비교하는 단계, 여기서 HincII 절단 위치는 화이트 레그혼 종에는 비활성이고, HincII 절단 위치의 부재가 비활성이어서 화이트 레그혼 종에는 없다.
다형성의 존재 또는 부재를 확인하는 방법은 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 헤테로듀플렉스 분석, 단일 가닥 형태 다형성(SSCP), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE), 온도 구배 젤 전기영동(TGGE), 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 및 디데옥시-지문(ddF)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명해준다. 하기 실시예는 본발명을 훨씬 더 명확히 이해하고, 실시하기 위해 당업자에게 용이하도록 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 예시되는 구현예에 의해서 그 범위가 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 일 양태의 예로서 간주되고, 기능적으로 동등한 범위의 방법도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본원에 개시된 것에 추가로 본 발명을 다양하게 변형하는 것은 상기 상세한 설명 및 아래에 첨부되는 도면으로부터 당업자가 용이하게 수행할 수 있다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 상세한 설명의 나머지 부분에 대해 하기의 도면에 관한 설명이 첨부된다.
도 1: 조류 ES 세포의 세포 배양 속도
10% 우태아 혈청과 함께 IGF1, CNTF, IL6, IL6R, SCF, FGF가 첨가된 배양 배지에서 닭 ES 세포를 생쥐 영양 세포층 상에서 배양하였다.
세포수는 각 세포 분리 시점에 측정하였다. 각 분리 시점에 수득된 세포의 수는 누적 증식 계수를 결정하는데 사용하였다.
도 2: 닭 ES 세포의 형태학
배아원기 세포의 형태:
(A)BR22p2 및 (B) BR22p3 : 큰 핵과 작은 세포질을 가진 둥근 모양의 세포.
(C)BR29p12: 느슨하게 연결되어 분산된 배아원기 세포.
도 3: 세포-특이 마커 SSEA-1의 발현
ES 세포-특이 마커 SSEA-1의 발현은 시험관 내에서 다양한 배양시간 동안 유지되는 배아원기 세포에서 테스트하였다. 왼쪽 패널 A: 역상. 오른쪽 패널 B: 항체 염색.
도 4: ES 세포의 알칼라인 포스파타아제 활성
배아원기 세포의 내인성 알칼라인 포스파타아제 활성. 세포는 다양한 배양시간 동안 알칼라인 포스파타아제 활성에 대해 염색되었다.
도 5: 분화 마커인 VASA, THY1, BRACHYURY의 발현 발달, 세포는 배양 동안 유지됨.
마커 및 배양. 1: 골수; 2: 배아(머리); 3: 수컷 생식샘; 4: 배아(단계 X); 5: 영양세포(STO); 6: 영양세포(SN); 7: BR 4-5; 8: BR 4-6; 9: BR 5-2; 10: BR 8- 7; 11: BR 8-8; 12: BR 8-9; 13: BR 8-12; 14: V 9-19; 15: BR 15-0; 16: BR 15-1; 17: BR 15-2; 18: BR 15-3; 19: BR 15-5; 20: BR 15-6; 21: BR 15-6; 22: BR 15-8; 23: BR 15-8; 24: BR 15-9; 25: BR 15-10; 26: BR 15-11; 27: BR 18-2; 28: BR 18-3; 29: BR 18-4; 30: BR 18-5; 31: BR 19-1; 32: BR 19-2; 33: BR 19-3; 34: BR 19-4; 35: BR 20-2; 36: BR 20-3; 37: S1 p20; 38: gDNA 베어드 락; 39: 물; 40: 물. 여러가지 배양 시간 동안 Vasa, Thy-1 및 Brachuyry (T)의 발현. GAPDH 대조군 마커. 세포는 수주 동안 배양 유지되었다. 세포 펠렛은 각 분해시 동결시켰다. RNA 추출 및 RT-PCR은 각 세포 펠렛에 대해 동시에 수행하였다.
도 6: 수여자 및 공여자 닭 종 및 키메라의 PCR RFLP 프로파일 분석.
수여자 및 공여자 닭 종 및 키메라의 PCR RFLP 프로파일. 공여자 및 수여자 닭 종에서 갓 낳은 7개의 배형성된 알을 5일 동안 배양하였다. 전체 배아로부터 DNA를 추출하였다. 체세포 키메라: 공여자 세포가 주입된 배아를 18일 동안 배양하였다. 혈액, 심장, 간, 비장 및 생식샘으로부터 DNA를 추출하였다.
도 7: 키메라 새
공여자 닭 세포를 수여자 닭 배아로 주입하였다. 수여자 배아를 부화될때까지 배양하였다. 키메라 새는 성인이 될때까지 키웠다.
도 8: F1 및 F2 자손
공여자 닭 세포를 수여자 닭 배아에 주입하였다. 수여자 배아는 부화될 때까지 배양하였다. 키메라 새는 성인이 될때까지 키웠다.
도 9: 오리 ES 세포의 형태학
10% 우태아 혈청과 함께 IGF1, CNTF, IL6, IL6R, SCF, FGF가 첨가된 DMEM 배양 배지에서 오리 ES 세포를 생쥐 영양 세포층 상에서 배양하였다.
실시예 1: 실험 재료 및 방법
배아원기 세포
갓 낳은 배양되지 않은 알로부터 배아를 수득하였다. 멸균된 여과지 링을 배반을 가진 배아의 컷아웃(cutout) 부위 중심에 놓았다. 난황막은 디스크의 바깥쪽 주위를 잘랐다. 이 디스크를 뒤집어서 실온의 PBS 페트리 디쉬에 옮겨놓았다. 과량의 난황은 조심스럽게 세척했다. 전체 배아원기는 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 흡입하여 제거한 뒤 PBS에 옮겨놓았다. 평균 200개의 배아가 수집되었다. 이 세포들은 300g에서 2회 원심분리하였다. 세포 펠렛은 배양 배지에서 물리적으로 분해시켰다. 완전 배양 배지에 들어 있는 세포를 불활성화된 STO 영양층에 접종하였다. 배아원기 세포는 7.5% CO2에서 39℃로 유지시켰다. 이 세포들은 프로네이즈 용액(pronase, 5 내지 2% w/v)에서 39℃로 배양하여 분해시켰다. 분해된 세포를 완전 배지에 들어있는 새로운 영양 세포층에 접종하였다. 계대 3 내지 5의 세포들을 최소 배지에 들어있는 STO 영양 층 위에 접종하였다.
배양 배지
완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1(Tebu), 1ng/ml CNTF(Eurobio), 1ng/ml IL-6(Eurobio), 1ng/ml IL-6R(Tebu), 1ng/ml SCF(Tebu), 1ng/ml bFGF(Peprotech), 1% 페니스트렙토마이신(Biowhittaker)이 첨가된 DMEM-F12로 이루어져 있다.
선택적으로, 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1(Tebu), 1ng/ml CNTF(Eurobio), 1ng/ml IL-6(Eurobio), 1ng/ml IL-6R(Tebu), 1% 페니스트렙토마이신(Biowhittaker)이 첨가된 DMEM-F12로 이루어져 있다.
선택적으로, 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1(Tebu), 1ng/ml CNTF(Eurobio), 1% 페니스트렙토마이신(Biowhittaker)가 첨가된 DMEM-F12로 이루어 질 수 있다.
영양 세포의 준비
생쥐 섬유아세포 STO 세포주(ATCC)는 4% 우태아 혈청(JRH) 및 1% 글루타 민(Biowhittaker)이 첨가된 DMEM(Cambrex)에서 37.5℃로 7.5% CO2 조건으로 유지시켰다. 일부-빽빽하게 자란 STO 세포는 프로네이즈(Roche) 1X로 분해시키고, PBS로 세척하였으며 45그레이의 감마선을 조사하였다. 영양세포는 100-mm 디쉬의 새로운 배지에 1.5x106 내지 2x106 세포수로 접종하였다.
형질전환
STO 세포주 : pGPARα 및 pMEHCS는 버트랜드 페인 박사(Dr. Bertrand Pain)로부터 받았다. pCINeo는 프로메가사(Promega)에서 구입하였다. 플라스미드 DNA는 알칼라인 분해 및 PEG 정제를 이용해 준비하였다. 형질전환을 하기 위해, 세포는 매일 아침에 100-mm 디쉬당 0.5x106 세포수로 접종하였다. 이 세포들은 그날 저녁에 FuGENE 6(Roche) 리포펙턴트를 이용하여 3.0 ㎍의 환형 pCINeo, 15 ㎍의 pGPARα 또는 pMEHCS로 형질전환시켰다. 하루 뒤에, 세포들을 세척하고 배지를 바꿔주었다. 네오마이신을 이용한 선별은 첫째날에 0.3 mg/ml로 시작하여 8일 동안 적용하였다. 내성을 나타내는 세포를 증폭하여 액체 질소에 동결시켰다.
알칼라인 포스파타아제 반응:
세포를 PBS로 세척한 뒤 1.5% 포름알데히드, 0.5% 글루타알데히드, 0.1% Igepal로 4℃에서 10 내지 20분 동안 고정시켰다. 세포를 세척하고 난 뒤 100 mM NaCl, 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 1 mg/ml NBT, 0.1 mg/ml BCIP로 이루어진 알칼라인 포스파타아제 염색액으로 37℃에서 반응시켰다. 이 반응은 PBS 1x 또는 H2O를 첨가함으로써 중지시켰다.
면역형광 분석:
SSEA-1 항체는 아이오와 대학의 분화연구 하이브리도마 은행에서 구입하였다.
세포는 1.5% 포름알데히드, 0.5% 글루타알데히드 또는 0.2% 글루타알데히드, 0.01% IGEPAL로 4℃에서 20분 동안 고정시키거나, 4% 파라포름알데히드 또는 메탄올로 실온에서 10분 동안 고정시켰다.
세포는 0.1% PBS-BSA로 2시간 내지 4시간 동안 반응시켰다. 희석된 일차 항체를 첨가하여 밤새 두었다. 세척하고 난 뒤, FITC-표지된 이차 항-IgG 항체를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 두었다. 항체를 제거하고 PBS로 세포를 세척함으로써 반응을 중지시켰다. 세포는 형광 현미경으로 관찰하였다.
PCR RFLP:
18일 동안 배양된 배아 조직의 DNA는 QIAamp DNA 미니-키트의 방침에 따라 정제하였다. 게놈에 삽입되어 있는 조류 류코시스(leucosis) 바이러스 단편은 다음의 프라이머 쌍을 이용해 PCR로 증폭하였다.
올리고(157-158):
정방향 : 5'-GGTGTAAATATCAAAATTATC(서열번호 1)
역방향 : 5'-CGGTTAAAATACGAATAGAGA(서열번호 2)
올리고(78-81):
정방향 : 5'-CTATGAGCAGTTACGAGGGTC(서열번호 3)
역방향 : 5'-CGGACCAACAGGCTAGTCTC(서열번호 4)
앰플리콘(amplicon)은 거의 3106에서 1004 bp 사이이다. 프라이머 157은 화이트 레그혼의 DNA보다 베어드 락 닭의 DNA에 대해 더 높은 특이성을 갖는다. 완성된 앰플리콘은 HincII 효소로 절단하였다.
RT PCR 분석:
RNA는 프로메가사의 SV 전체 RNA 분리 키트의 지침에 따라 정제하였다. 머리 RNA는 배양 5일후의 배아로부터, 골수는 배양 15일째 배아의 대퇴골로부터, 고환은 성인 닭으로부터 추출하였다. BR15 세포의 RNAsms Qiagen RNeasy 키트의 지침에 따라 추출하였다. RNA는 프로메가 랜덤 프라이머 및 AMV 역전사효소 키트의 지침에 따라 역전사하였다. PCR 증폭은 다음의 프라이머를 이용하여 수행하였다.
Vasa 올리고:
Vasa 정방향: TTTGGTACTAGATGAAGCAGACC(서열번호 5)
Vasa 역방향: GTTCCCTATCTCCATGAATGC(서열번호 6)
Brachyury 올리고:
Brachyury 정방향: CACAAAGACATGATGGAGGAAG(서열번호 7)
정방향 2: TGAAGTCCTCTCCAAAACCATT(서열번호 8)
Brachyury 역방향: CATAAGTTCGGGTACTGACTGG(서열번호 9)
역방향 2: CACAAAATCATTCTGCGGTAAA(서열번호 10)
GAPDH 올리고:
GAPDH 정방향: AGGTGCTGAGTATGTTGTGGAGTC(서열번호 11)
GAPDH 역방향: AGAACTGAGCGGTGGTGAAGA(서열번호 12)
Thy-1 올리고:
정방향: AGGACAACAGGAAGCACATCAT(서열번호 13)
역방향: GTTCTGGATCAAGAGGCTGAAG(서열번호 14)
수여자 배아로의 세포 주입:
수여자 배아는 배양되지 않은 알에 가속기원으로 4 Gray의 X선을 처음 조사하였다. 배아는 알의 긴 축에 창(window)을 잘라 접근하였다. 껍질은 연마하여 제거하였다. 껍질 막은 PBS를 방울로 떨어뜨림으로써 촉촉하게 유지시켰다. 껍질 막은 세포 주입하기 바로 전에 배아를 노출시키도록 잘랐다. 배양배지에 들어있는 3 ul의 세포를 마이크로피펫을 이용하여 수여자 배아의 반-배아 강(cavity)에 주입하였다.
두 조각의 껍질 막을 먼저 흰자위까지 담금으로써 창을 닫았다. 껍질 막이 건조될 때, 수술용 테이프로 창을 완전히 밀봉하였다. 이 알은 37.5℃, 50% 상대 습도로 유지되고, 18일 동안 매일 90o씩 회전하는 재래식 배양기에서 배양시켰다. 그리고 난 뒤, 이 알을 37℃, 85% 상대 습도로 유지되는 재래식 부화기에 옮겨 부화될 때까지 놓아 두었다. 표현형 및 체세포 키메라 현상은 배양 18일 후의 배아에서 측정하였다. 공여자 세포의 생식선 공여는 주입된 조류를 베어드 락(Barred Rock) 닭과 교배시킴으로써 확인하였다.
실시예 2. 닭 ES 세포의 분리 및 증폭
닭 배아 줄기세포는 갓 낳은 알로부터 분리하였다. 평균 200개의 배아를 모았으며 조사된 생쥐 섬유아세포의 영양 세포층에 접종하였다. 실제로, 에치 등(Etches et al., 1996, Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)은 생쥐 섬유아세포와 공동-배양한 닭 배아원기 세포를 주입하고 난 뒤에 유의적으로 더 많은 체세포 키메라가 발견됨을 증명하였다. 맨처음 접종한 후 계대배양 3 내지 5까지, 배아원기 세포는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1(Tebu), 1ng/ml CNTF(Eurobio), 1ng/ml IL- 6(Eurobio), 1ng/ml IL-6R(Tebu), 1ng/ml SCF(Tebu), 1ng/ml 소FGF(Peprotech), 1% 페니스트렙토마이신(Biowhittaker)이 첨가된 DMEM-F12로 이루어진 완전 배양 배지에서 배양하였다. 그리고, 몇번의 계대배양 후에, 분화되는 것을 막기 위해 성장인자 일부를 제거하고, 최소 배양 배지에서 세포를 배양하였다. 제거된 성장인자는 SCF와 FGF 이거나 SCF, FGF, IL-6, IL-6R이다.
분화되는 것을 막고 닭 ES 세포를 배양시키기 위한 배양 배지는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1, 1ng/ml CNTF, 1ng/ml IL-6, 1ng/ml IL-6R, 1% 페니스트렙토마이신이 첨가된 기본 배양 배지(즉, DMEM-F12)이다. 선택적으로, 분화를 막고 닭 ES 세포로 배양하기 위한 배양 배지는 10% 우태아 혈청(JRH), 0.16 mM 베타-머캅토에탄올(SIGMA), 1% 비필수 아미노산(Biowhittaker), 1mM 소듐 피루베이트(Biowhittaker), 2mM L-글루타민(Biowhittaker), 1ng/ml IGF1, 1ng/ml CNTF, 1% 페니스트렙토마이신(Biowhittaker)이 첨가된 기본 배지(즉, DMEM-F12)를 포함한다.
닭 ES 세포는 다른 종의 닭으로부터 분리 및 확장될 수 있다(표 1)
| 종 | 실험 개수 | 분리된 개수 | 성공률% |
| S86N | 127 | 33 | 26 |
| Valo | 17 | 5 | 29 |
| Brown Leghorn | 53 | 4 | 7 |
| GF30 | 20 | 4 | 20 |
| White Leghorn | 14 | 1 | 7 |
| Cou Nu Rouge | 11 | 4 | 36 |
| Marans | 29 | 16 | 55 |
| Barred Rock | 49 | 35 | 72 |
| ISA | 3 | 1 | 33 |
시험관 내 분리 및 증폭된 세포의 ES 상태의 특징은 생쥐 및 인간 ES 세포에 특이적인 것으로 증명된 다음의 몇가지 생물학적 기준에 의존한다: 자가-재생 능력, 세포 형태, 줄기세포 특이적 마커의 발현 및 세포의 분화 전능성, 즉 시험관 내에서의 다른 계통 및 생체 내에서의 배아 구성물로 분화하려는 능력. 대부분의 분리물의 성장 특성은 일년 이상 배양하는 동안 유지되는 닭 배아원기 세포에서 관찰되는 한가지와 동일하였으며(도 1), 이는 명확하지 않은 자가 재생의 잠재성을 보여준다. 배아원기 세포는 군락으로 성장한다. 이들은 둥근 모양의 세포이며 큰 핵과 작은 세포질로 이루어져 있다(도 2, BR22p2 & BR22p3). 흥미롭게도, 배양하는 동안 배아원기 세포의 형태는 빽빽하게 연결된 세포(도 2, BR22p2 & BR22p3)로부터 훨씬 느슨하게 연결된 분산된 세포(도 2, BR29p12)로 진화하였다. 느슨하게 연결된 세포는 최소 배지에서 장시간 동안 안정할 수 있다. 다른 형태를 갖는 세포는 줄기세포 특이적 마커의 발현 및 배아 구성물에 기여하는 능력에 대해 추가로 확인하였다.
ES 세포는 기본적으로 ECMA-7(Kemler et al. 1981 J. Embryol. Exp. Morphol. 64:45-60), SSEA-1(Solter and Knowles, 1978 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(11):5565-5569), EMA-1(Hahnel and Eddy, 1986 J. reprod. Immunol. 10(2)89-110)와 같은 다른 마커의 발현; 텔로머라아제 및 알칼라인 포스파타아제 활성과 같은 특이적 효소 활성의 존재 및 TROMA-1과 같은 분화된 세포 마커의 부재로 정의된다. EMA-1 및 SSEA-1 마커의 발현 및 알칼라인 포스파타아제 활성은 시험관내 증폭된 배아원기 세포에서 측정된다. 배양 기간 동안 배아원기 세포의 형태는 변화하며, 배(germ) 계통에 특이적 마커(Tsunekawa et al, 2000 Development 127:2741-2750), 중배엽 계통에 특이적 마커(Wilkinson et al, 1990, Nature 343:657-659) 및 조혈 계통에 특이적 마커(Uchida et al, 1994 Blood 83:3758-3779)는 분석을 완성하기 위해 첨가하였다. Brachyury, Thy-1 및 vasa에 대한 항체는 이용가능하지 않기 때문에, 상응하는 유전자의 전사체를 RT PCR로 분석하였다. 이 분석은 연장된 배양 기간 동안, 다른 형태에 대해 각각 수행하였다. SSEA-1 및 EMA-1은 장시간의 배양 동안 발현되었다(도 3). 또한, 알칼라인 포스파타아제 활성도 같은 배양 기간 동안 안정하였다(도 4).
도 5는 세포가 배양 유지되는 동안 분화 마커의 발현의 발달을 보여준다. Vasa mRNA는 예측한 대로 수컷 생식샘에서 강하게 발현하였다(도 5, 레인 3). 이는 X 단계의 배아에서는 검출되지 않았으나(레인 4), 생식 세포는 X 단계의 배아에서 발견되었다. Vasa 유전자는 약했으나 배양되는 동안 유지되는 세포에서 재현적으로 발현하였다(레인 18 내지 36). X 단계 배아에 있는 Vasa 전사체의 부재는 RT PCR의 낮은 민감성 때문인 것으로 설명된다. 시험관 내에서 증폭된 세포에서의 vasa 유전자의 발현은 이들 세포가 생식선 능력을 갖고 있거나, X 단계 배아에 존재하는 생식 세포가 시험관 내에서 증폭된 것을 의미한다. 중배엽 계통의 마커인 Brachyury mRNA는 이미 X 단계 배아(갓 낳은 알의 배아)에서 검출되었다(도 5, 레인 4). 세포가 배양 유지되는 동안 발현이 증가하였다(도 5, BR8 레인 12&13; BR15 레인 19 내지 26; BR18 레인 27 내지 30 및 BR19 레인 32 내지 34). 조혈 계통은 중배엽을 기원으로 한다. 조혈 계통의 마커인 Thy-1 mRNA도 배양 유지되는 세포에서 관찰되었다(레인 7,8; 11,12, 13; 16 내지 24; 27 내지 34). 닭의 신경능선 세포의 마커인 HNK1은 배아원기 세포에 의해 발현되었다. HNK1의 발현은 세포가 배양 유지되는 동안은 안정하게 유지되었다(결과 미제시). 미분화된 세포의 마커는 모든 배양 기간 동안 발현되었다(결과 미제시). 배양된 배아원기 세포는 미분화된 세포 마커 뿐만 아니라 신경능선 세포 및 중배엽 마커도 발현하였다. 놀랍게도, 생식세포 특이적인 것으로 생각되는 Vasa 유전자는 ES 세포에서 전사된다.
시험관 내에서 증폭된 닭 세포의 분화 전능성은 생체 내에서 배아 재조직에 기여하는 능력을 평가함으로써 체크하였다.
실험은 키메라 현상의 레벨에 미치는 영향을 확인하기 위해, 수여자 닭 배아로 주입하는 닭 ES 세포의 수를 다르게 하여 셋업하였다. 군집화 효율에 미치는 수요자 배아의 조사(irradiation) 강도도 연구되었다. 주입과 조사의 효과를 모니터하기 위해 4개의 파라미터가 선별되었다: (i) 배아의 생활력; (ii) 표현형 키메라 확률(색을 띄는 깃털을 가진 배아 확률); (iii) 표현형 키메라 현상의 확산(색깔을 띄는 깃털 확률); (iv) 체세포 키메라 현상 확률(깃털보다는 다른 조직에서의 키메라 현상).
300, 5,000, 15,000 또는 30,000개의 ES 공여자 세포를 감마선 조사를 하거나 하지 않은 갓 낳은 수여자 배아의 반-배아 강에 주입하였다. 주입된 알은 표준 조건에서 배양하였다. 배양된 배아원기 세포는 배양 14일 내지 43일 사이에 매주마다 주입하여 배양 시간에 따른 군집화의 잠재성의 변화를 확인하였다. 모든 배아들은 배양 18일째에 분석하였다.
배양된 배아원기 세포(공여자 세포)는 우성의 흰색 로커스 I에 동종접합 열성 (ii)이 있는, 색을 띄는 베어드 락 또는 S86N 종으로부터 얻었다. 공여자 세포를 I 로커스에 동종접합 우성인 화이트 레그혼 종(수여자 종)의 수여자 배아에 주입하였다. 체세포 키메라는 부화때 검은색 솜털의 존재로 확인할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 공여자 세포 및 수여자 배아로부터의 유전적 지문을 구별하기 위해 PCR RFLP 분석법이 개발되었다(도 6). 수여자 종의 PCR RFLP 패턴은 각각 1 또는 2개의 밴드 프로파일이었다. 공여자 종의 PCR RFLP 패턴은 3개의 밴드 프로파일이다. 키메라 조직은 공여자의 전형적인 3개 밴드 프로파일로 확인하였다. 이는 주입된 세포가 깃털보다는 다른 조직을 집락화할 수 있는 능력을 가지는지 여부를 확인하는 것을 가능하게 한다. 특이 마커의 발현을 확인하기 위해, 장시간의 배양기간 동안 유지되는 세포에서 집락화 능력을 연구하였으며 세포의 형태학에도 따랐다.
몇가지 표현형(즉, 공여자 종의 세포에 의해 집락화된 깃털을 가진 동물) 및 체세포 닭 키메라(즉, 공여자 종의 세포에 의해 집락화된 깃털 보다 다른 조직을 갖는 동물)가 확인되었다. 공여자 세포는 생식샘을 포함하는 3개의 생식선에서 다양하게 존재하는 것으로 확인되었다. 이 결과는 본 발명의 방법에 따라 획득한 시험관 내에서 확장된 닭 ES 세포가 생식샘을 포함하는 수여자 배아의 다양한 조직을 접목하고 개조할 수 있음을 보여준다.
놀랍게도 본 발명자들은 종래 기술에서 재시되었던 양(즉 약 300 내지 500개의 조사된 세포)과 비교해 훨씬 더 많은 양의 세포를 주입하는 것이 배아의 활동력에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 더불어, 표현형 키메라 확률은 조사의 단계가 존재하거나 부재하는 것과는 상관없이 많은 양의 세포(15000개 이상을 말하거나 심지어는 약 30000개)가 주입될 때 유의적으로 증가한다. 주입된 30000개의 세포는 상한선은 아니며, 더 많은 세포를 주입하더라도, 수여된 이들 세포를 갖고 있으며 생존할 수 있는 정도의 수여자 배아가 제한선이 되는 것이다. 본 발명자들은 조사된 수여자 배아에 15000개의 세포를 주입하고, 비조사된 배아에 30000개의 세포를 주입하는 것이 가장 최상의 결과를 주며, 특히 생식샘에서의 배아 키메라 확률을 더 높여주는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 사용된 조사 범위가 닭 배아의 생존에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 더불어, 군집 가능성은 배아원기 닭 세포의 배양 시간에 의존하지 않았다(결과 미제시).
모든 데이터들은 시험관 내에서 분리되고 증폭된 ES 세포가 진정한 배아 줄기 세포라는 사실을 뒷받침해준다.
실시예 3. 닭 ES 세포에 의한 생식선 전달
가장 우수한 주입 방법이 개발됨에 따라, 주입된 닭의 9%는 생식샘이 키메라였다(결과 미제시). 생식선 전달의 이슈를 확인하기 위해, 생식샘의 최적의 군집화를 가능하게 보여준 최선의 방법에 따라, 584마리의 동물 무리에 배양된 세포를 수여자 배아에 주입하였다. 부화할 때의 몇가닥의 깃털로부터 확산되는 닭의 표현형 키메라는 그 후에 사라지며 성인기에는 95% 이상이 사라진다(도 7 및 표 2).
| 암탉번호 | 조사 | 배양 일수 | 키메라 표현형% | 주입된 PGC의 잠재 개수 |
| 2940 | X선 | 41 | 90 | 0.0025 |
| 1730 | X선 | 28 | 0 | 2.4 |
| 1692 | X선 | 21 | < 5 | 0.064 |
| 4164 | 없음 | 70 | < 5 | < 10-3 |
| 4316 | 없음 | 46 | 부화때만 | < 10-3 |
| 4542 | X선 | 59 | 0 | 2.7X10-8 |
베어드 락 세포로 주입한 암탉을 베어드 락 수탉과 교배시켜 공여자 계통이 생식선으로 기증되는지 확인하였다. 생식선 전달은 검정색 및 노란색 자손의 분포도를 확인함으로써 측정하였다. 221마리의 암탉 자손이 실험되었다. 16006마리의 F1 닭 중에서, 5마리의 닭이 흰색 깃털(한마리는 부화전 죽음)을 가지는 확률을 보였고, 한마리의 닭은 베어드 락의 전형적인 색깔을 띈 깃털을 보여주었다(도 8A).
베어드 락과 유사한 색깔의 깃털을 가진 암탉이 생산한 자손에 대한 서령과 주입 조건에 대한 설명이 표 3에 표시되어 있다. 배양 59일 후에도 불구하고, 세포들은 생식선이 군집을 이루는 것이 가능하게 유지되었다. 생식선 전달은 암탉의 표현형 키메라가 높은 빈도로 나타나는 것과는 관련이 없었다. 베어드 락과 유사한 닭의 어미는 흰색이었다. PGC 주입된 잠재적 개수는 단계 X 배아에 존재하는 50개의 PGC(Eyal-Giladi et al, 1976)로 추측되었다. PGC의 최종 개수는 세포의 연속적인 계대로부터 얻어지는 희석 인자 및 수여자 배아로 주입되는 세포 현탁액의 농도와 부피에 따라 계산하였다.
| 배양 일 | 표현형 키메라 % | 유전형 키메라 % |
| 14 | 2.3 | 0 |
| 22 | 6.4 | 0 |
| 29 | 11.1 | 0 |
| 37 | 11.6 | 0 |
| 43 | 6 | 1.3 (심장, 간, 비장, 생식샘) |
[표현형 키메라 % : 색깔을 띈 깃털을 가진 배아의 개수/18일째의 생존한 배아의 개수; 유전형 키메라 % : 깃털 보다 다른 조직에 키메라를 가진 배아의 개수/18일째의 생존한 배아의 개수]
F1 자손(16006마리 닭) 중 4 마리 내지 5마리는 성인이 될때까지 생존하였다. 이 4마리의 암탉은 베어드 락 수탉으로부터의 정액으로 인공수정되었다. 5664-5665 암탉의 자손은 베어드 락과 유사하였다(도 8B 및 표 4). 다른 3마리의 암탉의 자손은 베어드 락과 유사하고 화이트 레그혼과 유사한 닭이었다(표 4).
| 암탉 번호 | 자손 수 | 자손의 표현형 |
| 5664-5665(베어드 락) | 6 | 베어드 락 |
| 5660-5661 | 13 | 5마리 베어드 락 8마리 화이트 레그혼 |
| 5650-5651 | 8 | 3마리 베어드 락 5마리 화이트 레그혼 |
| 5662-5663 | 13 | 7마리 베어드 락 6마리 화이트 레그혼 |
베어드 락 닭과 주입된 키메라로 교배시켜 만든 암컷은 베어드 락 정자를 가지는 것을 추정되었다. 알들은 부화할때까지 배양하였다. 자손의 표현형을 기록하였다.
본 발명자들은 닭 ES 세포의 배양 방법을 제공한다. 배아원기 세포의 증폭은 화이트 레그혼 및 베어드 락 닭 종에 대해서만 기록되었다(Pain et al, 1996 Dev. 122(8) 2339-2348; Petitte et al, 1990 108(1):185-189; Zhu et al, 2005 Nat. Bioechnol. 23(9):1159-1169). 배양 방법은 본 연구에서 개발되었으며, 특히 특정 성장 인자의 조합 및 시간에 따른 이의 진화는 다른 종의 닭으로부터 재생적으로 분리하고 증폭할 수 있게 하였다. 증폭의 효율은 종 의존적이며, ES 세포주의 확립에 있어서 종의 다양성을 가지는 일관된 결과는 생쥐에 대해서 기술되었다(Kawase et al, 1994 Int.J.Dev.Biol. 38(2):385-390). 흥미롭게도 생쥐와는 달리, 장시간의 배양동안 유지되는 닭 ES 세포의 부화 전능성은 몇가지 성장 인자의 제거에 의해 뒷받침된다. 즉, 닭 ES 세포는 완전 배양 배지에서의 장시간의 배양 동안 분화 전능성을 유지하며, IL-6, IL-6R, SCF 및 FGF와 같은 성장 인자가 결핍된 완전 배양 배지에서도 그렇다. 유명하게도, 인간 ES 세포는 생쥐 ES 세포에 대해 확립된 배양 조건에서도 유지되지 않았다.
페인 등(Pain et al, 1996)은 닭 배아원기의 장기간의 배양의 경우(160일 이상), 작은 세포의 큰 군집이 생쥐 ES 세포와 유사한 전형적인 "ES-유사" 형태학적 특성을 가지면서 둥지 안에서 빽빽하게 패킹되어 있다고 기술하였다. 반대로 본 발명자가 장시간 동안 유지한 닭 배아원기 세포의 형태는 그렇게 안정한 형태를 유지하지 않았으며 빽빽하게 연결된 둥근 형태의 세포로부터 느슨하게 연결된 세포로 변화하였다. 이러한 형태학적 진화는 일관되었으며 닭의 종과는 관련이 없었다. 형태에 있어서의 이러한 변화는 특정 ES 세포의 자가-재생 능력에 영향을 주지 않았다. 다른 계통에 있어서의 세포의 잠재적인 특성은 다음에 의해 설명된다: (i) 면역형광분석 또는 RT-PCR 분석법에 의한 세포의 생화학적 특성; (ii) 배양된 세포의 생물학적 특성에 접근하기 위한 형질전환 방법. 세포들은 3개의 배엽층, 외배엽, 중배엽 및 내배엽에 특이적인 마커에 대해서 특징되었다. 매우 초기의 분화를 나타내는 마커가 선별되었다. 어떤 형태도 마커의 특이한 조합을 보이지 않았다. 미분화된 세포의 마커, 3개 배엽층 모두의 마커 뿐만 아니라 vasa와 같은 생식선 마커도 검출될 수 있다. 형태학의 변화에 특이적으로 발현하는 마커의 진화는 없었다. 대부분의 분화된 형태를 가지는 세포조차도 ES 세포 특이적인 마커를 발현하였으며 분화 마커를 발현하지 않았다.
시험관내에서 증폭된 세포 분산액을 수여자 배아에 주입하였다. 깃털의 색소화는 멜라닌 세포로부터 깃털 줄기로부터의 색소의 이동으로부터 유발된다. 멜라닌 세포는 배아 몸통의 신경 능선 세포로부터 유도된다. 신경 능선 세포의 분화는 배아 발달의 매우 초기에 일어난다. 검은색 종자 닭의 세포로 주입한 흰색 수여자 배아의 깃털은 주입된 세포의 분화 전능성을 반영하지는 않을 것이지만, 멜라닌 세포에 전달된 세포가 수여자의 멜라닌모세포 계통에 합류할 수 있음을 보여줄 수는 있을 것이다. 따라서 수여자 배아로 주입된 세포의 기여에 대한 연구는 깃털의 관찰에만 제한적이지 않을 것이며 3개 배엽층 모두의 조직 유도도 포함할 것이다. 표현형 및 체세포 키메라는 형태와는 상관없이 세포의 미분화 상태를 지지하는 배양물(cord, clumps 및 comets)에서 관찰되는 세포의 주요한 형태 각각에서 얻어졌다. 흥미롭게도 생식샘도 주입된 세포에 의해 군집화되었다.
세포의 ES 상태에 대한 최적의 증거는 생식선 전달이다. 1마리의 F0(주입된) 암탉(0.3%)은 생식선 전달을 지지한다. 이 암탉의 자손인 16마리 이상의 닭에서, 1마리의 F1 닭은 베어드 락과 유사하였다(6.25%). 베어드 락의 표현형을 나타내는 F1 암탉으로부터 얻은 F2 닭 모두는 공여자 성향의 습득이 몇세대 동안 안정함을 보여준다. 다양한 확률의 검은색 깃털을 가진 F1 암탉 자손의 절반은 베어드 락과 유사하였고, 화이트 레그혼 표현형을 가진 나머지 절반은 멘델의 유전 법칙에 따르는 것으로 추측되었다.
따라서, 본 발명자들은 닭 배아원기 세포의 생식선 경쟁을 설명하였다. 그러므로, 닭 배아원기 세포는 조류 형질전환을 개발하는데 유용하다.
실시예 4. 오리 ES 세포의 분리 및 증폭
4.1 - 실험 재료
오리 알
페킨(Pekin) 종 GL30의 오리알은 GRIMAUD FRERES SELECTION(La Corbiere, Roussay France)으로부터 얻었다. 부모 오리는 다음에 대해 예방접종하였다: 대장균(자가 백신 Coli 01&02), 파스츄렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)(Landavax), 오리 바이러스 헤파티티스(Hepatovax), 에리시페로트릭스 류시오패시애(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax), 조류 메타뉴모바이러스(Nemovac), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 과 엔테리디스(Enteridis)(자가 백신), 리메렐라 안티페스티퍼(Riemerella antipestifer)(자가 백신 Riemerella), 조류 메타뉴모바이러스(Nobilis RTV inactive) 및 에리시펠로트릭스 류시오패티에(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax). 수여받고 난 뒤, 수정된 페킨 오리알은 저염소 욕조에서 소독한 뒤 껍질에 묻은 먼지와 함께 오염의 모든 위험을 피하기 위해 퍼마시달(Fermacidal, Thermo)로 오염을 제거하였다.
영양 세포
오리 줄기 세포의 다능성을 유지하기 위해 생쥐 기원의 세포(STO 세포)를 영양 세포층으로 사용하였다. 이 영양 세포는 플라스틱에 접종하기 전에 감마선 조사(45 내지 55 Gray)하여 핵분열을 불활성화시켰다. 조사량은 세포 주기를 명확하게 정지시키도록 유도하지만 미분화된 세포의 세포 성장을 촉진하는데 필수적인 성장 인자 및 세포외 매트릭스의 생산은 여전히 허용하는 반-치사량이다. STO 세포주는 캐나다 토론토의 온타리오 암 연구소의 A. Bernstein이 갖고 있는 SIM(Sandos Inbred Mice) 생쥐 배아 섬유아세포의 계속주로부터 유도된 것이며, 이는 미국 세포주 은행(ATCC, STO 제품 번호: CRL-1503, 배치 번호 1198713)에서 공급받았다. 새로운 영양 세포층은 일주일에 2번 준비하였다. 대수증식 세포를 분리하고 계수항ㅆ다. 세포의 일부는 생존 세포를 유지하기 위해 접종하였고, 나머지 부분은 조사하였다. 조사하기 위해, 튜브 당 10x106 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 세포에는 45 내지 55 그레이 용량으로 노출시키고 플라스틱에 접종하였다. 접종하고 난 뒤, 디쉬 또는 플레이트는 최대 5일 동안 사용되는 비활성화된 영양 세포로 코팅하였다.
배지
GTM-3 배지(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
DMEM-HamF12 (Cambrex, 카탈로그 번호 BE04-687)
첨가제
글루타민 (Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-605E)
항체: 페니실린/스트렙토마이신 (Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-602E)
비필수 아미노산 (Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-114E)
소듐 피루베이트 (Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-115)
비타민 (Cambrex, 카탈로그 번호 13-607C)
베타 머캅토 에탄올 (Sigma, 카탈로그 번호 M7522)
이스톨레이트 (SAFC, 카탈로그 번호 58902C)
인자
6개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
□ 재조합 인간 인터루킨 6(IL 6)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-6)
□ 재조합 인간 수용성 인터루킨 6 수용체(sIL6r)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-06R)
□ 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 300-07)
□ 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-8B)
IL6r를 제외한 이들 인자 모두는 대장균 박테리아에서 생산되었다. 수용성 IL6r는 형질전환된 HEK293 세포에서 발현된다.
우태아 혈청
비조사된 우태아 혈청(FBS)(JRH, 카탈로그 번호 12003)
프로그램에 사용된 비 조사된 혈청은 오스트레일리아에서 수득하고 생산하였다. 수득에 사용한 동물은 USDA 검사하였으며 도살하기에 적합하다. 이 혈청은 조류 줄기 세포 배양 동안 배지에 첨가하였다. 이 배치는 배양동안 줄기 세포의 유지에 필수적일 수 있는 필수적인 단백질 또는 성분이 파괴되는 것을 막기 위해 조사를 하지 않았다.
조사된 혈청(JRH, 카탈로그 번호 12107)
이 프로그램에 사용한 조사된 배치는 미국에서 수득하였다. 이 조사된 배치는 STO 세포(영양 세포) 배양에 사용되는 DMEM 배지에 첨가물로서 첨가되었다. 이 세포들은 줄기 세포로서 배양 동안 성장과 유지를 하기 위한 특정양의 혈청을 필요로 하지 않는다. 배지에 있는 고농도의 혈청을 최소화하기 위해 STO 세포의 성장에는 오직 4%의 FBS 만을 사용하였다.
4.2 - 오리 ES 세포의 분리 및 배양 방법
약 360개의 수정된 오리 알을 열었고, 여는 동안 난황을 흰자위로부터 분리하였다. 작은 흡수 필터 페이퍼(Whatmann 3M paper)를 사용하여 난황으로부터 배아를 제거하였으며, 펀치를 사용하여 구멍난 링의 형태 안에 있는 앞을 잘랐다. 구멍의 직경은 약 5mm이다. 이 작은 링은 오븐에서 약 30분 동안 건조 가열하여 멸균시켰다. 실제로, 배아 수득 단계 동안, 작은 페이퍼 링은 난황의 표면 및 배아의 중앙에 위치하게 하여 페이퍼링에 의해 둘러싸이게 하였다. 그리고 난 뒤 작은 수술 가위의 도움으로 잘라나고 제거된 것을 PBS가 채워진 페트리 디쉬에 놓았다. 그리고 난뒤, 링에 의해 옮겨진 배아는 배지 내에서 과다한 난황을 세척하였고, 그로 인해 과량의 비텔린(vitellin)이 존재하지 않게 된 상태로 파스퇴르 피펫으로 수득되었다.
오리 배아는 1X PBS를 포함하는 50 ml 튜브에 놓아두었다. 오리 배아를 물리적으로 분해시키고, PBS로 세척하며, 완전 배양 배지에 들어 있는 비활성화된 STO 영양 세포 층에 접종하여 39℃, 7.5% CO2로 유지시켰다. 영양 세포는 6웰 플레이트 또는 약 2.7 X 104 세포/cm2의 디쉬에 접종하였다. 완전 배양 배지는 무혈청 배지 DMEM-Ham F12로 구성되어 있으며, 10% 우태아 혈청, IGF1, CNTF, 선택적으로는 최종 1 ng/ml 농도의 IL-6, IL-6R, SCF 및 소 FGF, 및 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/ml의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 1X 이스톨레이트가 첨가된다. 계대 4 단계에 즉시, 항체 혼합물은 더 이상 배지에 첨가되지 않는다.
오리 ES 세포는 계대 4단계까지 DMEM-Ham F12 완전 배양 배지에서 배양하였다. 계대 4단계 이후에, 기본 배지를 변형하였으며 DMEM-Ham F12 완전 배지는 아래 둘중의 하나로 교체되었다:
- 10% 우태아 혈청, 최종 농도 1ng/ml의 IGF1 및 CNTF, 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머탑토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 및 1X 이스톨레이트가 첨가된 GTM-3 배지; 또는
- 10% 우태아 혈청, 최종 농도 1ng/ml의 IGF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머탑토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 및 1X 이스톨레이트가 첨가된 GTM-3 배지.
오리 ES 세포는 분화시키지 않으면서 새로운 배양 배지에서 최소 14 계대 배양 동안 추가로 배양되었다.
<110> VIVALIS
<120> Method of production of transgenic avian using embryonic stem
cells
<130> D24698
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<170> KoPatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 1
ggtgtaaata tcaaaattat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 2
cggttaaaat acgaatagag a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 3
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 4
cggaccaaca ggctagtctc 20
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vasa forward primer
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tttggtacta gatgaagcag acc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vasa reverse primer
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Brachyury forward primer
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Thy-1 reverse primer
<400> 14
gttctggatc aagaggctga ag 22
Claims (39)
- 다음의 단계를 포함하는 조류 배아 줄기(ES) 세포 배양 방법:a) 배양되지 않은 수정된 조류 알의 배아원기 디스크를 기원으로 하는 ES 세포를- 유일한 외인성 성장인자들로서 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF); 및- 동물 혈청이 포함된 기본 배양 배지에 현탁하는 단계;b) 상기 단계 a)에서 얻은 ES 세포 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 2 내지 10 계대 동안 배양하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 성장 인자들 IGF-1 및 CNTFdml 농도는 1 ng/ml인, 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 배양 배지에 들어있는 동물 혈청의 최종 농도는 8% 내지 12% 인, 방법.
- 제 3 항에 있어서, 배양 배지에 들어있는 동물 혈청의 최종 농도는 10% 인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 영양세포는 생쥐 섬유아세포인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조류 배아 세포는 닭 세포인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조류 배아 세포는 오리 세포인, 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 조류 배아 줄기 세포를 유전적으로 변형시키는 방법:a1) 제 1 항의 방법에 따라 ES 세포를 배양하는 단계;a2) 제 1 항의 방법에 따라 배양된 ES 세포를 벡터로 형질전환시키는 단계;b) 형질전환된 ES 세포를 선별하는 단계;c) 유전적으로 변형된 선별된 ES 클론을 스크리닝하고 증폭하는 단계;d) 동물 혈청, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 포함하는 배양 배지에서 상기 단계 c)의 유전적으로 변형된 ES 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계.
- 제 8 항에 있어서,상기 단계 d)는 동물 혈청, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF); 및 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 단계 c)의 유전적으로 변형된 ES 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계인, 방법.
- 하기 단계를 포함하는 키메라 닭의 수득방법:a1) 제 1 항의 방법에 따라 ES 세포를 배양하는 단계;a2) 제 1 항의 방법에 따라 배양된 ES 세포를 수여자 조류 배아의 반-배아 강(subgerminal cavity)에 도입하는 단계; 및b) 상기 단계 a2)에서 얻은 배아를 배양하여 닭으로 부화시키는 단계;c) 집락을 형성한 이형 세포를 갖는 닭을 포함하는 키메라 닭을 선별하는 단계.
- 하기 단계를 포함하는 유전적으로 변형된 키메라 닭의 수득방법:a1) 제 8 항 또는 제 9 항의 방법에 따라 조류 배아줄기세포로부터 유전적으로 변형된 ES 세포를 얻는 단계;a2) 상기 단계 a1)에서 얻은 유전적으로 변형된 ES 세포를 수여자 조류 배아의 반-배아 강에 도입하는 단계;b) 상기 단계 a2)에서 얻은 배아를 배양하여 닭으로 부화시키는 단계; 및c) 집락을 형성한 유전적으로 변형된 이형 세포를 갖는 닭을 포함하는 키메라 닭을 선별하는 단계.
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