JP2010500015A - 胚幹細胞を用いたトランスジェニック鳥類の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、
−インスリン様増殖因子−1(IGF−1)および/または繊毛様神経栄養因子(CNTF);さらに
−所望により、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、白血病阻害因子(LIF)、インターロイキン11(Il−11)、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択された少なくとも1つの増殖因子;
ならびに
−動物血清;
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間、好ましくは、2〜20代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCF、FGF、Il−6、Il−6R、LIF、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびIl−11から選択された少なくとも1つの増殖因子を除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程;
を含んでなる方法を提供する。
a)好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)および繊維芽細胞増殖因子(FGF)ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間、好ましくは、2〜20代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCF、FGF、Il−6およびIl−6Rを含んでなる群から選択された少なくとも1つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、増殖因子SCF、FGF、IL−6およびIL−6Rを除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程;
を含んでなる。
a)好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCFおよびFGFを含んでなる群から選択された少なくとも1つの増殖因子を除去する、好ましくは、該培養培地から、両方の増殖因子 SCFおよびFGFを除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程;
を含む。
a)好ましくは未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、少なくともインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を工程a)の培地中でさらに培養する工程;
を含む。
a)鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板(blastoderm disk of fertilized un-incubated avain egg(s))由来のES細胞を少なくともインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を工程a)の培地中でさらに培養する工程;
を含む。
a)鳥類未孵卵受精卵胚盤葉板由来のES細胞を少なくともインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を工程a)の培地中でさらに培養する工程;
を含む。
−「ガンカモ目(Anseriformes)」(すなわちカモ、ガチョウ、ハクチョウおよび同類)。ガンカモ目というこの目には、3つの科に属する約150種の鳥が含まれる:サケビドリ科(Anhimidae)(サケビドリ類)、カササギガン科(Anseranatidae)(カササギガン)、およびガンカモ科(Anatidae)(140種を超えるミズドリ、中でもカモ、ガチョウ、およびハクチョウを含む)。前記目に属する総ての種は、水表面での水中生活に高度に適応している。総てには、効率的に遊泳するために足に水かきがある(一部は後に主として陸生となった)。この用語には、カモの様々な系統、例えばPekin duckおよびMuscovy duckが含まれる。
−Muscovy duck:ステージVII
−ホロホロチョウ:ステージVII〜VIII
−シチメンチョウ:ステージVII〜VIII
−Pekin duck:ステージVIII
−ニワトリ:ステージX
−ニホンウズラ:ステージXI
−ガチョウ:ステージXI。
a)上述の方法によって得られ、培養されたES細胞をベクターでトランスフェクトする工程;
b)トランスフェクトされたES細胞を、好ましくは、培地中に例えば抗生物質、アミノ酸、ホルモンなどの選抜薬剤を加えることによって、選抜する工程;
c)遺伝学的に改変された耐性ESクローンのスクリーニングおよび増幅する工程、
d)前述のとおりの培養培地中、フィーダー細胞層上で工程c)の該遺伝学的改変ES細胞を培養する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)本発明の方法によって得られ、培養された鳥類ES細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程;および
b)雛として孵化(hatch)させるために、工程a)において得られた胚をインキュベートする工程;
c)該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法も提供する。
a)本発明の方法によって得られ、培養された遺伝学的修飾ESをレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程;および
b)雛として孵化させるために、工程a)において得られた胚をインキュベートする工程;
c)該雛に定着した遺伝学的修飾異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる方法を提供することも本発明の目的である。
別の実施形態によれば、本発明のキメラ雛を得る方法は、ES細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定するさらなる工程を含んでよい。
−前記胚がニワトリであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージX前後の;
−前記胚がMuscovy duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージVII前後の;
−前記胚がPekin duckであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージVIII前後の;
−前記胚がニホンウズラまたはガチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージXI前後の;
−前記胚がホロホロチョウまたはシチメンチョウであるときにはEyal-Giladi & Kochav分類のステージVII〜VIII前後の;
段階にある。
a)前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程;
b)該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー5’−GGTGTAAATATCAAAATTATC−3’(配列番号1)およびリバースプライマー5’−CGGTTAAAATACGAATAGAGA−3’(配列番号2)のセットとフォワードプライマー5’−CTATGAGCAGTTACGAGGGTC−3’(配列番号3)およびリバースプライマー5’−CGGACCAACAGGCTAGTCTC−3’(配列番号4)のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む。好ましい実施形態によれば、前記ニワトリES細胞はbarred rock種に由来し、前記レシピエント胚はWhite Leghorn種のものである。前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写酵素PCRによって実施され、この際、前記解析は、PCR増幅DNAの制限酵素HincIIでの消化を含む。
a)HincII制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程;
b)該消化から得られた断片を分離する工程;
c)該断片によって生じた制限パターンを検出する工程;および
d)所望により、該パターンを、HincII制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも1つの制限パターンと比較する工程であって、工程c)およびd)において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む。
a)本発明の方法によって得られた前記選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程;
b)内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程;および
c)異種細胞を含んでなる該後代において該鳥を選抜する工程
を含む方法を含む。
a)該White Leghornニワトリ系統から遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統から遺伝物質のサンプルを得る工程;
b)該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー5’−GGTGTAAATATCAAAATTATC−3’(配列番号1)およびリバースプライマー5’−CGGTTAAAATACGAATAGAGA−3’(配列番号2)のセットとフォワードプライマー5’−CTATGAGCAGTTACGAGGGTC−3’(配列番号3)およびリバースプライマー5’−CGGACCAACAGGCTAGTCTC−3’(配列番号4)のセットからなる群において選択されたプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む方法も提供する。
a)HincII制限酵素でPCR増幅DNAを消化する工程;
b)該消化から得られた断片を分離する工程;
c)該断片によって生じた制限パターンを検出する工程;および
d)HincII制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、HincII制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、HincII制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む。
実施例1:材料および方法
胚盤葉細胞
産まれたての未孵卵卵から胚を採取した。カットアウト領域中央の胚盤を有する胚の上に滅菌フィルターペーパーリングを置いた。そのディスク(disk)の外側周囲で卵黄膜を切断した。そのディスクをさっとひっくり返し、室温のPBSのペトリ皿に移した。過剰の卵黄を慎重に洗い流した。パスツールピペットで軽く吸引して胚盤葉全体を取り出し、PBS中に移した。平均200個の胚を一緒にプールした。それらの細胞を300gで2回遠心分離した。この細胞ペレットを培養培地中で機械的に解離した。完全培養培地中の細胞を不活性化STOフィーダー層上に播種した。胚盤葉細胞を7.5%CO2中39℃で維持した。これらの細胞を、プロナーゼ溶液(5〜2%w/v)中39℃でのインキュベーションにより解離した。解離細胞を、完全培地中、新たなフィーダー層細胞上に播種した。3〜5代継代間の細胞を最少培地中、STOフィーダー層上に播種した。
前記完全培養培地は、10%胎児子ウシ血清(JRH)、0.16mM β−メルカプトエタノール(SIGMA)、1%非必須アミノ酸(Biowhittaker)、1mMピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、2mM L−グルタミン(Biowhittaker)、1ng/ml IGF1(Tebu)、1ng/ml CNTF(Eurobio)、1ng/ml Il−6(Eurobio)、1ng/ml Il−6R(Tebu)、1ng/ml SCF(Tebu)、1ng/ml bFGF(Peprotech)、1%ペニストレプトマイシン(penistreptomycine) (Biowhittaker)を添加したDMEM−F12ベースで構成した。
前記マウス繊維芽細胞STO細胞系統(ATCC)を、4%胎児子ウシ血清(JRH)および1%グルタミン(Biowhittaker)を添加したDMEM(Cambrex)中37.5℃、7.5%CO2で維持した。STO細胞をサブコンフルエンスにおいてプロナーゼ(Roche)1Xで解離し、PBSで洗浄し、γ線源を用いて45グレイで照射した。フィーダー細胞を100mm皿内の新鮮培地に1.5x106〜2x106細胞で播種した。
STO細胞系統:pGPARαおよびpMEHCSは、Bertrand Pain医師によって提供された。PCINeoは、Promegaから購入した。プラスミドDNAは、アルカリ溶菌法およびPEG精製を用いて調製した。トランスフェクションでは、朝、細胞を100mm皿当たり0.5x106細胞で播種した。夕方、それらをFuGENE 6(Roche)リポフェクション試薬を用いて3.0μgの環状pCINeo、15μg pGPARαまたはpMEHCSでトランスフェクトした。翌日、細胞を洗浄し、その培地を交換した。ネオマイシン、0.3mg/mlでの選抜はD1に開始し、8日間適用した。耐性細胞を増幅し、液体窒素で冷凍した。
細胞をPBSで2回洗浄し、1.5%ホルムアルデヒド、0.5%グルタルアルデヒド、0.1%lgepalにより4℃で10〜20分間固定した。洗浄後、細胞を、100mM NaCl、100mM Tris pH9.5、50mM MgCl2、1mg/ml NBT、0.1mg/ml BCIPで構成されるアルカリ性ホスファターゼ染色溶液中で37℃でインキュベートした。PBS 1xまたはH2Oを加えることによってこの反応を停止させた。
SSEA−1抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of IOWAから購入した。
18日間インキュベートした胚組織由来のDNAを、QIAamp DNA mini-kitの使用説明書に従って精製した。前記ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの断片を、次のプライマー対を用いたPCRによって増幅した:
フォワード:5’−GGTGTAAATATCAAAATTATC(配列番号1)
リバース:5’−CGGTTAAAATACGAATAGAGA(配列番号2)
オリゴ(78−81):
フォワード:5’−CTATGAGCAGTTACGAGGGTC(配列番号3)
リバース:5’−CGGACCAACAGGCTAGTCTC(配列番号4)
RT PCR解析:
Vasaフォワード:TTTGGTACTAGATGAAGCAGACC(配列番号5)
Vasaリバース:GTTCCCTATCTCCATGAATGC(配列番号6)
オリゴBrachyury:
Brachyuryフォワード:CACAAAGACATGATGGAGGAAG(配列番号7)
フォワード2:TGAAGTCCTCTCCAAAACCATT(配列番号8)
Brachyuryリバース:CATAAGTTCGGGTACTGACTGG(配列番号9)
リバース2:CACAAAATCATTCTGCGGTAAA(配列番号10)
オリゴGAPDH:
GAPDHフォワード:AGGTGCTGAGTATGTTGTGGAGTC(配列番号11)
GAPDHリバース:AGAACTGAGCGGTGGTGAAGA(配列番号12)
オリゴThy−1:
フォワード:AGGACAACAGGAAGCACATCAT(配列番号13)
リバース:GTTCTGGATCAAGAGGCTGAAG(配列番号14)
照射する場合には、産まれたての未孵卵卵を、加速器源からの4グレイのX線照射に曝すことによってレシピエント胚を調製した。それらの胚にはその卵の長軸に切り込んだ窓から操作した。卵殻を粉砕により除去した。1滴のPBSを加えることによって卵殻膜を湿った状態に維持した。細胞注入直前にその卵殻膜を切断して胚を露出させた。培養培地中の細胞3μlをマイクロピペットを用いてレシピエント胚の胚下腔に注入した。
ニワトリ胚幹細胞は産みたての卵から単離した。平均200胚をプールし、照射マウス繊維芽細胞のフィーダー層に播種した。実際に、Etches et al. (1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)は、マウス繊維芽細胞と同時培養したニワトリ胚盤葉細胞の注入後に有意に多い体細胞キメラが見られたことを示している。最初の播種から継代培養3〜5代まで、胚盤葉細胞を10%ウシ胎児血清(JRH)、0.16mM β−メルカプトエタノール(SIGMA)、1%非必須アミノ酸(Biowhittaker)、1mMピルビン酸ナトリウム(Biowhittaker)、2mM L−グルタミン(Biowhittaker)、1ng/ml IGF−1(TEBU)、1ng/ml CNTF(Eurobio)、1ng/ml IL−6(Eurobio)、1ng/ml IL−6R(TEBU)、1ng/ml SCF(TEBU)、1ng/mlウシFGF(Peprotech)、1%ペニストレプトマイシン(Biowhittaker)を添加したDMEM−F12塩基からなる完全培養培地で増殖させた。次に、数代後、数種の増殖因子を除去し、分化を避けるために最小培養培地で細胞を増殖させた。除去した増殖因子は(SCFとFGF)、または(SCF、FGF、IL−6、IL−6R)のいずれかであった。
最良の注射法を開発したところ、注入された鳥の9%の生殖腺がキメラであった(データは示されていない)。生殖細胞系列伝達の課題に取り組むため、生殖腺の最適な定着が可能であることが示されている最良の方法に従い、レシピエント胚に培養細胞を注入することによって584個体の一群の動物を作出した。これらの鳥の表現型キメラ現象は、孵化時の数枚の羽(これらは後に喪失)から成鳥では95%を超えるまで拡大した(図7および表2)。
4.1−原材料
カモ卵
Pekin系統GL30からのカモ卵をGRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbiere, Roussay France)から得た。親カモに大腸菌(Escherichia Coli)(自己ワクチンColi 01および02)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)(Landavax)、カモウイルス肝炎(Hepatovax)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)(Nemovac)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および腸炎菌(Enteridis)(自己ワクチン)、リエメレラ・アンチペスティファー(Riemerella antipestifer)(自己ワクチンRiemerella)、鳥類メタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)(Nobilis RTV不活性型)およびブタ丹毒菌(Ruvax)に対してワクチン接種されたものである。受け取った後、受精したPekin duck卵を次亜塩素酸塩(hypochloryde)浴中で殺菌を行った後、殻に付着した埃に関連した汚染のリスクを避けるためにFermacidal (Thermo)で除染した。
カモ幹細胞の多能性を維持するために、ネズミ起源の細胞(STO細胞)をフィーダー層として用いた。これらのフィーダー細胞をγ線照射(45〜55グレイ)により分裂不能とした後、プラスチック上に播種する。この照射量は、細胞周期の明らかな停止を誘発してなお、非分化細胞の細胞増殖の促進に必要な増殖因子および細胞外マトリックスの産生を可能とする、致死量以下の用量である。STO細胞系統は、SIM(Sandos Inbred Mice)マウス胚繊維芽細胞からA. Bernstein, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canadaが誘導し、American Type Culture Collection (ATCC) (STO製品番号: CRL-1503, バッチ番号1198713)が供給したものである。新鮮なフィーダー層を週2回調製した。指数関数的に細胞を分離し、計数した。活力のある培養物を維持するために細胞の一部を播種し、別の一部を照射した。照射に関しては、本発明者らは試験管中10×106細胞/mLの細胞懸濁液を作製した。細胞を45〜55グレイの線量に曝し、プラスチック上に播種した。播種後、不活性化したフィーダー細胞でコーティングしたディッシュまたはプレートを最大5日間用いた。
培地GTM−3(Sigma、カタログ番号G9916)
DMEM−HamF12(Cambrex、カタログ番号BE04−687)
添加物
グルタミン(Cambrex、カタログ番号BE17−605E)
抗生物質:ペニシリン/ストレプトマイシン(Cambrex、カタログ番号BE17−602E))
非必須アミノ酸(Cambrex、カタログ番号BE13−114E)
ピルビン酸ナトリウム(Cambrex、カタログ番号BE13−115)
ビタミン(Cambrex、カタログ番号13−607C)
βメルカプトエタノール(Sigma、カタログ番号M7522)
酵母自己融解物(SAFC、カタログ番号58902C)
6つの異なる組換え因子を用いた。
組換えヒト毛様体神経栄養因子(CNTF)(Peprotech Inc、カタログ番号450−13)
組換えヒトインスリン様因子I(IGF1)(Peprotech Inc、カタログ番号100−11)
組換えヒトインターロイキン6(IL6)(Peprotech Inc、カタログ番号200−06)
組換えヒト可溶性インターロイキン6受容体(sIL6r)(Peprotech Inc、カタログ番号200−06R)
組換えヒト幹細胞因子(SCF)(Peprotech Inc、カタログ番号300−07)
組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(Peprotech Inc、カタログ番号100−18B)
非照射ウシ胎児血清(FBS)(JRH、カタログ番号12003)
本プログラムで用いた非照射血清はオーストラリアで採取および生産されたものである。採取に用いた動物はUSDAの視察を受け、屠殺者に許容されるものであった。これを鳥類幹細胞培養中、培地に加えた。このバッチは幹細胞の培養維持に不可欠であり得る重要なタンパク質または成分の破壊を避けるために照射を行わなかった。
このプログラムに用いた照射バッチは米国で採取した。この照射バッチは、STO細胞(フィーダー細胞)の培養に用いたDMEM培地中の添加物として加えた。これらの細胞は幹細胞のように、増殖および培養維持に特定の品質の血清を必要としない。培地中の高濃度の血清を最小限にするため、本発明者らはSTO細胞を4%のFBSの存在下でのみ増殖するようにした。
360前後の受精したカモ卵を割り、割っているときに卵白から卵黄を分離した。パンチを用いて予め孔の開いたリングの形に切り抜いた小さな吸収性の濾紙(Whatmann 3M paper)を用い、卵黄から胚を取り出した。切り抜きの直径は約5mmである。これらの小さなリングをオーブン内で約30分間、乾熱を用いて滅菌した。実際には、胚採取の段階で、小さな濾紙のリングを卵黄の表面にのせ、胚の中心に置き、従って胚は濾紙のリングに取り囲まれる。次に、これを小さなはさみで切り抜き、そのまま取り出してペトリ皿にのせ、PBSを満たす。このようにリングによって取り出された胚から培地中で余分な卵黄を除去し、このように余分な卵黄素を含まない胚子板をパスツールピペットで採取した。
カモES細胞は、分化させずに、この新たな培養培地で少なくとも14代さらに培養された。
Claims (39)
- 鳥類胚幹(ES)細胞を培養する方法であって、
a)未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、
−インスリン様増殖因子−1(IGF−1)および毛様体神経栄養因子(CNTF);さらに
−動物血清;ならびに
−所望により、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、白血病阻害因子(LIF)、インターロイキン11(Il−11)、オンコスタチンおよびカルジオトロフィンを含んでなる群において選択される少なくとも1つの増殖因子;
を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCF、FGF、Il−6、Il−6R、LIF、オンコスタチン、カルジオトロフィンおよびIl−11から選択された少なくとも1つの増殖因子を除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程
を含んでなる、方法。 - a)未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)および繊維芽細胞増殖因子(FGF)、ならびに動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCF、FGF、Il−6およびIl−6Rを含んでなる群から選択される少なくとも1つの増殖因子を除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程;
を含んでなる、請求項1に記載の鳥類胚幹(ES)細胞を培養する方法。 - a)未孵卵の、鳥類受精卵胚盤葉板由来のES細胞を、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)および動物血清を添加した基礎培養培地に懸濁する工程;
b)工程a)において得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、該ES細胞を少なくとも2〜10代継代の間さらに培養する工程;
c)所望により、該培養培地から、SCFおよびFGFを含んでなる群から選択される少なくとも1つの増殖因子を除去する工程;
d)工程c)の培地中、フィーダー細胞層上で該ES細胞をさらに培養する工程;
を含んでなる、請求項1に記載の鳥類胚幹(ES)細胞を培養する方法。 - 前記鳥類がニワトリである、請求項1に記載の方法。
- 前記鳥類がカモである、請求項1に記載の方法。
- 鳥類胚幹細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
a)請求項1〜5に記載の方法によって培養されたES細胞をベクターでトランスフェクトする工程;
b)トランスフェクトされたES細胞を選抜する工程;
c)遺伝学的に改変された選抜ESクローンをスクリーニングおよび増幅する工程、
d)動物血清ならびに少なくともインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)および所望により、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)を含んでなる群において選択される少なくとも1つの増殖因子を含んでなる培養培地中、フィーダー細胞層上で、工程c)の該遺伝学的改変ES細胞を培養する工程
を含んでなる、方法。 - キメラ雛を得る方法であって、
a)請求項1〜5に記載の方法によって培養されたES細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程;および
b)雛として孵化させるために、工程a)において得られた胚をインキュベートする工程;
c)該雛に定着した異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法 - 遺伝学的に改変されたキメラ雛を得る方法であって、
a)請求項6に記載の工程d)において得られた遺伝学的改変ES細胞をレシピエント鳥類胚の胚下腔に導入する工程;および
b)雛として孵化させるために、工程a)において得られた胚をインキュベートする工程;
c)該雛に定着した遺伝学的改変異種細胞を含んでなる該キメラ雛を選抜する工程
を含んでなる、方法 - 前記キメラ雛の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項7および請求項8に記載の方法。
- ES細胞の導入前にレシピエント胚の性別を決定する工程をさらに含んでなる、請求項7〜9に記載の方法。
- 工程a)の培養されたES細胞が、in vitroで少なくとも5日間培養されたものである、請求項7および請求項10に記載の方法。
- 前記レシピエント胚が、産まれたての未孵卵の卵に由来し、5,000個前後〜70,000個前後の細胞を含む、請求項7〜11に記載の方法。
- 前記レシピエント胚が、Eyal-Giladi & Kochav分類のステージVI〜XIIの間に含まれる段階、好ましくはEyal-Giladi & Kochav分類のステージX前後の段階にある、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1000個のES細胞、好ましくは少なくとも15,000個のES細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項7〜13に記載の方法。。
- 少なくとも30,000個のES細胞が、前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項7〜14に記載の方法。
- 前記レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入されるES細胞が、雌および雄ES細胞の混合集団である、請求項7〜15に記載の方法。
- 雌ES細胞が、雌レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項7〜15に記載の方法。
- 雄ES細胞が、雄レシピエント鳥類胚の胚下腔に導入される、請求項7〜15に記載の方法。
- ES細胞の前記レシピエント胚の胚下腔への導入前に、前記レシピエント胚にX線またはγ線照射を照射する工程をさらに含んでなる、請求項7〜18に記載の方法。
- ニワトリレシピエント胚が、3〜6グレイ間のX線、好ましくは4グレイ前後のX線で照射される、請求項19に記載の方法。
- 事前に4グレイ前後でX線照射された前記レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、15,000個前後のニワトリES細胞が導入される、請求項7〜20に記載の方法。
- 前記非照射レシピエントニワトリ胚の胚下腔に、少なくとも30,000個のニワトリES細胞が導入される、請求項7〜20に記載の方法。
- 前記レシピエントニワトリ胚が、White Leghorn系統のものであり、前記ニワトリES細胞が、barred rock系統、Marans系統、S86N系統からなる群において選択される系統に由来する、請求項7〜22に記載の方法。
- 前記レシピエントニワトリ胚が、barred rock系統、Marans系統およびS86N系統からなる群において選択されるニワトリ系統のものであり、前記ニワトリES細胞が、White Leghorn系統に由来する、請求項7〜22に記載の方法。
- 異種細胞を含んでなる前記キメラ雛の選抜が
a)前記キメラ雛から遺伝物質のサンプルを得る工程;
b)該鳥類ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー5’−GGTGTAAATATCAAAATTATC−3’(配列番号1)およびリバースプライマー5’−CGGTTAAAATACGAATAGAGA−3’(配列番号2)のセットとフォワードプライマー5’−CTATGAGCAGTTACGAGGGTC−3’(配列番号3)およびリバースプライマー5’−CGGACCAACAGGCTAGTCTC−3’(配列番号4)のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含んでなる、請求項23〜24に記載の方法。 - 多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型(RFLP)解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型(SSCP)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE) 温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)およびジデオキシ−フィンガープリント法(ddF)からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
a)HincII制限酵素で前記遺伝物質を消化する工程;
b)該消化から得られた断片を分離する工程;
c)該断片によって生じた制限パターンを検出する工程;および
d)所望により、該パターンと、HincII制限酵素を用いてのWhite Leghorn、Marans、Barred Rock、S86N遺伝物質の消化によって得られる少なくとも1つの制限パターンとを比較する工程であって、工程c)およびd)において検出された制限パターンの違いが異種細胞を含んでなるキメラ雛の指標となる工程
を含む、請求項25および請求項26に記載の方法。 - 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写酵素PCRによって実施され、この際、前記解析が、PCR増幅DNAの制限酵素HincIIでの消化を含む、請求項25〜27に記載の方法。
- キメラ雛の後代を得る方法であって、次の工程:
a)請求項7または請求項8に記載の工程c)において得られた選抜キメラ雛を成鳥として成熟させる工程;
b)内部に異種細胞を有する該成鳥を繁殖させ、その結果、鳥後代を生み出す工程;および
c)該後代において対象となる鳥を選抜する工程
を含む、方法。 - 前記鳥の選抜が、羽毛の表現型解析によって実施される、請求項29に記載の方法。
- 前記鳥の選抜が、前記鳥ゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列におけるHincII多型の存在についてアッセイすることによる遺伝子型解析によって実施される、請求項29に記載の方法。
- 遺伝学的に改変された異種細胞中に含まれる前記ベクターによってコードされる異種ポリペプチドを発現させる工程をさらに含んでなる、請求項29〜31に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、前記遺伝学的改変鳥によって産み出された発生中の鳥類卵の卵白に送達される、請求項32に記載の方法。
- 鳥類胚幹細胞用の培養培地であって、少なくともインスリン様増殖因子−1(IGF−1)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、および所望により、インターロイキン6(Il−6)、インターロイキン6受容体(Il−6R)、幹細胞因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)を含んでなる群において選択される少なくとも1つの化合物を含んでなり、少なくとも7日間、好ましくは少なくとも100日間培養する該鳥類胚幹細胞の維持に十分である、培養培地。
- フィーダー細胞の層をさらに含んでなる、請求項34に記載の培養培地。
- White Leghornニワトリ系統と別のニワトリ系統とを区別するための遺伝子多型解析方法であって、
a)該White Leghornニワトリ系統からの遺伝物質のサンプル、および該他ニワトリ系統からの遺伝物質のサンプルを得る工程;
b)該ニワトリゲノムに組み込まれた鳥類白血病ウイルスの配列における多型の存在についてアッセイする工程であって、該多型が、フォワードプライマー5’−GGTGTAAATATCAAAATTATC−3’(配列番号1)およびリバースプライマー5’−CGGTTAAAATACGAATAGAGA−3’(配列番号2)のセットとフォワードプライマー5’−CTATGAGCAGTTACGAGGGTC−3’(配列番号3)およびリバースプライマー5’−CGGACCAACAGGCTAGTCTC−3’(配列番号4)のセットからなる群において選択されるプライマーセットによる増幅によって同定可能である工程
を含む、方法 - 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写酵素PCRによって実施される、請求項36に記載の方法。
- 前記多型の存在についてアッセイする前記工程が、
a)HincII制限酵素でPCR増幅DNAを消化する工程;
b)該消化から得られた断片を分離する工程;
c)該断片によって生じた制限パターンを検出する工程;および
d)HincII制限酵素を用いてWhite Leghorn遺伝物質の消化によって得られる該パターンと、前記他ニワトリ系統の遺伝物質の消化によって得られる該パターンとを比較する工程であって、HincII制限部位の存在がWhite Leghorn系統の指標となり、HincII制限部位の不在がWhite Leghorm系統でないことの指標となる工程
を含む、請求項37に記載の方法。 - 多型の有無を同定する前記方法が、制限断片長多型(RFLP)解析、ヘテロ二本鎖解析、一本鎖高次構造多型(SSCP)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE) 温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)およびジデオキシ−フィンガープリント法(ddF)からなる群から選択される、請求項36〜38に記載の方法。
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