KR101131744B1 - 조류 골수세포를 이용한 생식세포를 제조하는 방법 및 그 골수세포를 이용한 형질전환 조류 생산 방법 및 조류 생식선 카이메라 - Google Patents
조류 골수세포를 이용한 생식세포를 제조하는 방법 및 그 골수세포를 이용한 형질전환 조류 생산 방법 및 조류 생식선 카이메라 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수컷 조류의 뼈로부터 골수세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 골수세포를 배지에서 배양하는 단계 및/또는 상기 배지에서 배양된 골수세포를 수용체 정소에 이식하는 단계를 포함하는 골수세포로부터 분화전환 (trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법 및 상기 제조된 웅성 생식세포를 이용한 형질전환된 조류의 생산방법에 관한 것이다 .
Description
본 발명은 수컷 조류의 뼈로부터 골수세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 골수세포를 배지에서 배양하는 단계 및/또는 상기 분리된 골수세포를 수용체 정소에 이식하는 단계를 포함하는 골수세포로부터 분화전환 (trans-differentiated)된 생식세포를 제조하는 방법 및 상기 분리된 생식세포를 이용한 형질전환된 조류의 생산방법에 관한 것이다 .
가금은 포유류에 비해 세대간격이 짧고, 번식능력이 높으며, 알을 낮기 때문에 형질전환 동물로서의 이상적인 장점을 갖고 있다. 한편 가금은 포유류에 비해 성성숙 기간과 세대간격이 짧으며 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는 장점을 가지고 있다(Ivarie, 2003, Trends Biotechnol., 21: 14-19).
그러나, 가금의 경우 포유류와는 달리 수정시 일어나는 일반적인 다정자침입(polyspermy) 현상(Perry, 1987, J. Anat.150: 99-109)이 일어나며, 수정 후부터 산란 직후까지의 배발생으로 인하여 배발달 X기(stage X, Eyal-Giladi et al., 1976, Dev. biol. 49: 321-337)의 배에는 배반엽에 약 60,000여 개의 분화전능(pluoripotent)한 세포들이 존재하여 포유류와는 상이한 초기배를 갖게 된다. (Petitte and Mozdziak, 2002, Production of Transgenic Poultry In Transgenic Animal Technology, chapter 11). 이러한 형태적, 발생적 특징으로 인해 가금에 있어 포유류의 경우와 동일한 방법으로 외래 유전자를 도입하는 것은 매우 어렵다. 또한 가금의 수란관에서 초기 수정란을 채취하기가 기술적으로 지극히 어려울 뿐만 아니라 산란된 난(卵)의 배반엽은 두꺼운 난각으로 둘러싸여 있기 때문에 포유류에 사용되고 있는 유전자 이식 기술의 적용이 불가능하다. 형질전환 가금의 생산에 있어서 외래유전자의 도입에 이용되는 표적 세포에는 난의 X기의 배반엽 세포(Rosenblum and Chen, 1995, Transgenic Res., 4:192-198), 원시생식세포(primordial germ cell) (Li et al., 1995, Transgenic Res., 4:26-29), 갓 수정된 난자(Sherman et al., 1998, Nat. Biotech., 16:1050-1053), 태아 줄기 세포(embryonic stem cell; Pain et al., 1999, Cells Tissues Organs, 165:212-219) 및 정자(Nakanishi and Iritani, 1993, Mol. Reprod . Dev., 36:258-261) 등이 있으며, 외래 유전자의 전이를 위해 DNA를 표적세포에 직접 형질감염(transfection)시키는 방법등이 있으나, 아직까지 정조 줄기세포를 제외한 다른 성체줄기세포를 이용하여 생식선 키메라를 생산한 예는 전무하다.
상기 기술적 이유로 인해 연구자들은 다양한 방법들을 고안하여 형질전환 가금 생산을 시도하였다. 그러나 어떤 방법들도 성공률은 1% 이상을 넘지 못하고 있는 실정이다. 따라서 형질전환 가금을 생산하기 위한 새로운 효과적인 세포의 필요성이 대두되고 있다.
이중 관심을 갖는 세포는 성체 줄기세포의 한 종류인 골수 세포이다. 골수세포는 중배엽 유래의 근육, 내배엽 유래의 폐와 간, 외배엽 유래의 색소 세포 및 자성 생식세포인 난자와 웅성 생식세포 전구 세포로의 분화가 이미 밝혀져 있음(Herzog et al., 2003; Grove et al., 2004; Heike and Nakahata, 2004; Nayernia et al., 2006).
또한 만능 성체 줄기 세포의 수용체로의 이식은 전달된 세포의 운명에 대한 이해 및 유전자 이식체의 생산에 대하여 포유류에서 널리 사용되고 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 체외에서 골수세포가 생식세포로 분화전환(trans-differentiated)하는 방법을 제공하는것이다.
본 발명의 다른 목적은 성공적인 골수세포-매개된 형질전환 조류를 생산하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)수컷 조류의 뼈로부터 골수세포를 분리하는 단계; 및 b) 상기 분리된 골수세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 생식세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수컷 조류는 8주령 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본원에 사용된 용어 "조류"는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩,앵무새, 되새류, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조와 같은 "조류(avian)", 및 분류학적 기준의 모든 동물을 일컫는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조류 세포는 닭이다. 닭은 S86N, Valo, 화이트 레그혼, 브라운 레그혼,서섹스(Sussex), 뉴 햄스피어, 로드 아일런드, 오스트랄롭(Ausstralorp), 미노카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이, 이스트 랜싱(East Lansing), 이탈리안-파트리지-컬러(Italia-Partridge-colored), 마란스 (Marans), 베어드 락(Barred Rock), 코 뉴 루즈(Cou Nu Rouge, CNR), GF30, ISA를 포함하는 닭 종으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조류의 뼈는 대퇴골 또는 경골인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 중간 층 세포군을 얻는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양은 사이토카인 또는 성장인자가 공급되지 아니한 배지에서 배양 후에 비타민 A 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 '성장인자'란 PDGF, EGF, TGF-알파, FGF, NGF, 에리트로포이에틴(Erythropoietin), TGF-베타, IGF-I 및 IGF-를 포함하는 상당수 당업계의 공지된 성장인자를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 도살 이후 대퇴골과 경골을 분리하고, 분리된 뼈를 잘라내어 뼈 속의 골수를 회수하고, percoll density gradient 방법으로 중간층의 세포를 분리하고, 유지 배양 조건[DMEM/F12에 10% FBS, 0.5 mM 베타-mercaptoethanol, 20 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF; ESG1106 Chemicon), 1,000 unit/ml human leukemia inhibitory factor (LIF)]에서 배양하고, 분화를 위한 무작위 분화 배양 조건[DMEM/F12에 10% FBS, 0.5 mM 베타-mercaptoethanol]하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조류는 형광 유전자를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기의 방법은 상기 방법으로 분리된 골수세포를 수용체 정소에 이식하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 분리된 골수세포를 정소에 이식 받은 수탉의 정액을 암닭에 인공수정하여 형질전환 조류를 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 조류의 생산방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 세포 내로 형질전환 될 수 있고 숙주 세포 게놈과는 별개로 복제하거나 게놈 내에서 복제할 수 있는 천연 또는 합성의 단일가닥 또는 이중가닥 플라스미드 또는 바이러스 핵산 분자이다. 환형의 이중가닥 플라스미드는 플라스미드 벡터의 핵산 서열을 기본으로 하는 적당한 제한 효소로 처리함으로서 선형화될 수 있다. 핵산은 벡터를 제한 효소로 절단하고 조각을 함께 연결시킴으로써 벡터내로 삽입될 수 있다.
핵산 분자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드"는 박테리아 또는 효모 숙주 세포와 독립적으로 복제할 수 있는 작은, 환형의 DNA 벡터를 일컫는다. 핵산 벡터는 더불어 "관심 폴리펩타이드"를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 최소한 하나 포함한다. 조절 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 수행되는 실험 없이도 연결된 뉴클레오타이드 서열을 우수하게 발현할 수 있게 하기 위해 선별될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 발현을 조절할 수 있는 다른 인자를 포함한다. 삼부르크 등의 문헌(Sambrook et al. eds "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual"2nded. Cold Spring Harbor Press (1989)) 및 로디쉬 등의 문헌(Lodish et al. eds., "Molecular Cell Biology", Freeman (2000))과 같은 기초 분자생물학 서적은 적당한 발현 벡터, 프로모터 및 다른 발현 조절 인자를 디자인하기 위해 참고될 수 있다. 그러나, 적당한 발현 벡터의 선택은 형질전환되어야 하는 숙주세포의 선택 및/또는 발현되어야 하는 단백질의 타입을 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 또한, 다양하게 적용하기 위해 유용한 것은 조직-선별성(즉, 조직-특이성) 프로모터, 즉 하나 또는 그 이상의 조직 형태와 비교하여 특이한 종류의 조직 세포에서 바람직하게 발현하는 프로모터이다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 성계(adult chicken) 골수 세포를 분리 하는 방법, 분리된 골수 세포를 생식세포로 분화전환(trans-differentiated)시킬 수 있는 방법, 그리고 골수세포를 이식받은 수여체의 웅성 생식세포(sperm cells)를 사용한 닭의 제조에 관한 것이다. GFP (enhanced green fluorescent protein) 형질전환 닭의 대퇴골(femurs) 및 경골(tibias)로부터 수집된 골수 세포(Bone marrow cells;BMC)는 웅성 생식세포(male germ cells)로 인 비트로 분화전환이 유도됨을 RT-PCR 및 면역 염색방법으로 확인하였고, 골수세포중 다능성이 확인되어 분리되어진 세포들을 일반 닭 (수여체)의 정소로 주사되었다. BMC의 다능성(pluripotency)은 RT-PCR 및 면역조직화학 방법으로 컨펌하였다. 수용체 세정관(seminiferous tubules) 내에 주사된 세포의 위치화 및 인 비보 분화전환은 주사 후 80일간 GFP 발현을 관찰하고 면역조직화학 방법에 의해서 추적되었다. 정자 유전자 DNA에서 eGFP 및 neo 유전자의 삽입은 PCR 분석에 의하여 컨펌하였다. 비형질전환 암닭과 수용체 수닭의 차후 검정교잡(testcross)은 GFP 형질전환 자손 생산을 야기하였고, 이것은 정소 내의 생식 세포로 성체 골수 세포의 성공적인 분화전환을 증명하는 것이다. 본 발명자들은 형질전환 가금 생산에서 성체 골수 세포를 이용한 새로운 생식선 키메라 생산 방법을 제한하고 이것은 조류 발생 생물학 연구에도 큰 도움이 될 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용된 공여체 세포는 퍼콜 밀도 구배 방법을 사용하여 분리된 닭 골수세포(이하, 'chBMC'이라 함)이었다. 본 발명자들은 다능성(multipotency)을 가진 세포군을 대략적으로 분리한 후, SSEA-4와 포지티브하게 반응하는 세포를 분리하였다.
본 발명자들은 공여체-유래 GFP-포지티브 세포가 세정관과 간질(interstitium)에서 존재하고 이것은 골수 유래 세포들이 이식 후 적어도 8개월 동안 수용체 정소에서 생존한다는 것을 나타낸다.
면역조직화학 분석에서, 본 발명자들은 포지티브 대조군으로 배반엽 세포(조류 배아 줄기 세포)를 사용하였다. 신선하고 40일 동안 배양된 BMCs 및 배반엽 세포는 닭과 작은 교차 활성을 가지는 Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, 및 SSEA-4와 같은 쥣과(murine) 면역 마커와 부분적으로 반응하였다. 이러한 이유로, BMC 및 생식세포를 포함하는 성계 줄기 세포를 특성화하기 위한 면역 마커들에 대한 더 개발이 필요하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 결과는 성계 줄기 세포를 가지는 이들 포유류 Abs의 성공적인 반응을 나타내었다. 즉 닭에 대한 항체는 포유류에 비해 다양하지 못하며, 이로 인한 적절한 실험재료의 부재가 닭에 있어서 실험적 증명을 어렵게 하였다. 본 발명에서는 면역교차 반응이 적은 포유류 항체로도 조류에 반응이 됨을 확인하여 조류에도 사용가능한 적절한 항체를 발견하였다.
7 수용체의 정소로 전달된 EGFP chBMCs는 공여체 세포로부터 유래한 2 eGFP 병아리의 생산을 야기하였다. 7마리 중에서 3 마리만이 eGFP 마커 유전자를 운반하는 정자를 생산하였고, 3 수용체 중 하나가 2 eGFP 병아리를 생산하였다.
따라서, 본 발명의 결과는 BMC가 생식계열 카이메라를 생산할 수 있는 수단일 수 있고 생식세포 발생의 이해의 소스일 수 있다는 것을 제안한다.
즉 닭 골수세포에 관한 분화연구결과는 전무하며 포유류, 조류를 통털어 골수세포를 이용한 실질적인 산자 생산은 본 발명이 처음이다.
수용체 정소로 eGFP chBMC의 전달 8개월 후, GFP 공여체 세포는 세정관에 존재하였고, 수용체의 일부 정자는 EGF 및 neo 마커 유전자를 운반하는 것이 증명되었다(도 6b). 이것은 전달된 BMC가 수용체 정소에서 장기간 생존하고 웅성 생식 세포로 분화한다는 것을 나타낸다. 정소은 공여체 줄기세포 이동, 증식, 분화 및 에팝토시스를 위한 독특한 미세환경을 생성한다. 그 정소은 거부없이 수용체를 숙주 공여체 세포로 가능하게 하는 혈액-정소 장벽에 의해서 면역 영향으로부터 보호되며, 분화 환경을 조성한다..
결론적으로 본 발명의 결과는 chBMC가 다능성(pluripotency)을 가지고 웅성 생식 세포로 분화될 수 있다는 것을 처음 밝혔다. 본 발명자들은 chBMC 유래 정모세포(spermatocytes)로부터 2 자손을 얻을 수 있었다.
본 발명은 조류 종에서 조류 성체 줄기세포의 이해에 대한 새로운 모델을 제공하는 첫 번째 성과이다. 골수 세포 이식의 성공은 유전자적으로 귀중한 개체의 번식 능력의 보존 및 유전자 조작에 의한 형질전환 정자의 생산과 같은 여러 응용분야에 사용될 수 있다.
도 1은 chBMC의 RT-PCR과 면역조직화학 분석을 나타내는 그림. 도 1a는 RNA를 퍼콜 밀도 구배 원심분리에 의해서 상층, 중간층, 및 하층 BMC 군으로 분리하였다. 상층 BMC는 대부분이 지방과 라이트 세포이었고 따라서 ALDBP (adipocyte lipid droplet binding protein) 유전자를 발현하였다. 중간층에서 BMC는 줄기 세포 특이적인 마커(Nanog, Sox2)를 발현하고 하층 BMC는 brachyury와 같은 중배엽 기원 마커를 나타내었다. 중층 BMC를 사이토카인 또는 성장인자 없이 5 계대동안 배양하면 Nanog 및 Sox2 유전자 발현을 상실하였고 3 생식 층 특이적인 마커 유전자(외배엽: PAX6, 중배엽: Brachyury, 내배엽: GATA4)을 얻었다. 도 1b는 분리된 chBMC를 LIF 및 bFGF 공급하면서 10일간 배양하고 연속적으로 LIF 및 bFGF없이 20일간 배양한 후 3 생식계열 특이적인 항체(외배엽: Tuj1, 중배엽: Brachury, 내배엽: 알파-fetoprotein)로 반응하였다.
도 1의 결과는 다양한 세포들이 혼재해 있는 골수세포들중 다능성을 보유한 세포들을 대략적으로 분리할 수 있는 방법이며, 이 방법으로 분리한 다능성을 보유한 골수세포는 성장인자 및 싸이토카인이 첨가되지 않은 배지에서 무작위분화 유도시 3배엽 유래의 세포들로 분화한것을 면역 염색반응으로 확인하였다. 이는 조류의 골수 세포도 다능성을 가진 세포가 존재하며, 이 세포는 3배엽으로 분화가 가능한 세포로써 분화 목적 실험 및 세포 분화를 이용한 생물학적 생산의 재료로써 적합함을 증명한 것이다.
도 2는 닭 배반엽 및 골수 세포의 면역조직화학에 관련된 그림이다. 형광 이미지는 Oct4, SSEA-1, SSEA-3, 및 SSEA-4 포지티브 반응 세포에 대하여 줄기세포 특이적인 항체(red, antibodies), DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole) 염색 핵(blue, DAPI), 및 DAPI와 포지티브 항체 반응의 코-로칼라이제이션(purple, merged)을 나타낸다. 조류 배아 줄기세포에 해당하는 배반엽 세포들을 포지티브 대조군으로 사용하였다. 신선한 chBMC 및 30 일 배양한 chBMC들은 항체와 면역반응에 대하여 부분적으로 포지티브이었다.
도 3은 RA 처리 15일 후 chBMCs의 RT-PCR 분석 및 면역조직화학을 나타낸다. 도 3a는 공초점 이미지들은 Vasa, C-kit, Dazl 및 Heat shock protein 90 알파(Hsp90 알파 포지티브 반응 세포에 대한 생식 세포 특이적인 항체들(항체의 이름, green), 세포의 광학 이미지들(DIC) 및 광학 이미지와 포지티브 항체의 코-로컬라이제이션(merged)을 보인다. 3b는 성체 야생형 정소로부터 분리된 RNA, 신선한 BMC으로부터 분리된 RNA 및 생식 세포 분화로부터 분리된 RNA는 골수 세포 (GI-BMC)를 유도하였고 RT-PCR 분석에 대해 가공하였다. GAPDH를 대조군으로 사용하였다.
도 4는 수용체 세정관에서 chGFP BMC의 로칼라이제이션을 나타내는 도면이다. 공초점 이미지들은 eGFP BMC 주입 3 일후 수용체 세정관에 흩어져 있는 eGFP BMCs를 나타낸다. 주입 동안의 물리적인 압력으로 인하여, 많은 관들이 파열되었다(A). eGFP BMCs 주입 10, 20 및 40일 후, GFP 포지티브 세포들은 수용체의 세정관에 위치하고 5% 이하의 GFP BMC들이 간질(interstitium)에 위치하였다. 수용체의 정소로 이식된 형광 골수세포들은 시간에 따라 세정관에서 점유 면적을 나누고 넓혔다(GFP 포지티브 공여 세포 주입 후 10 일: B, 20 일: C, 40일: D ). 스케일 바: 50 ㎛ (A); 20 ㎛ (B, C, D).
도 5는 수용체 세정관에서 GFP 포지티브 BMC의 면역조직화학을 나타낸다. 동결 절편(cryostat) 방법에 의하여 수행된 공여 세포 주입 40일 후 수용체 정소의 횡단면을 보여준다.
도 6a는 본 연구에서 공여체로 이용된 eGFP Tg 닭을 생산하는데 사용된 레트로바이러스 벡터의 구조를 나타낸다. NeoR 및 eGFP 유전자 검출할 수 있는 특이적인 프라이머를 고안하였다. b는 증폭된 PCR 밴드를 나타낸다. L, 100 bp 분자 래더; S, 수용체의 정자 유전자 DNA; P, eGFP Tg 수닭으로부터의 정자 유전자. DNA을 가지는 포지티브 대조군; N, 노말 수닭으로부터 온 정자 유전자 DNA를 가지는 네가티브 대조군. NeoR 및 eGFP 유전자들은 수용체의 정자 DNA에서 검출되었다. (C)eGFP 병아리는 6 주령에 분화전환된 eGFP BMC로부터 생산되었다. chBMC는 30 주령 eGFP Tg 수닭으로부터 얻었고, eGFP 병아리는 노말 암닭에 인공 수정을 수행한 후에 부화하였다. 왼쪽에 첫번째 조류가 비형질전환된 대조군 병아리이다.
도 7은 노말 수용체의 정소로 GFP BMC의 전달을 통한 생식선 카이메라 생산을 보여주는 결과이다.
도 1의 결과는 다양한 세포들이 혼재해 있는 골수세포들중 다능성을 보유한 세포들을 대략적으로 분리할 수 있는 방법이며, 이 방법으로 분리한 다능성을 보유한 골수세포는 성장인자 및 싸이토카인이 첨가되지 않은 배지에서 무작위분화 유도시 3배엽 유래의 세포들로 분화한것을 면역 염색반응으로 확인하였다. 이는 조류의 골수 세포도 다능성을 가진 세포가 존재하며, 이 세포는 3배엽으로 분화가 가능한 세포로써 분화 목적 실험 및 세포 분화를 이용한 생물학적 생산의 재료로써 적합함을 증명한 것이다.
도 2는 닭 배반엽 및 골수 세포의 면역조직화학에 관련된 그림이다. 형광 이미지는 Oct4, SSEA-1, SSEA-3, 및 SSEA-4 포지티브 반응 세포에 대하여 줄기세포 특이적인 항체(red, antibodies), DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole) 염색 핵(blue, DAPI), 및 DAPI와 포지티브 항체 반응의 코-로칼라이제이션(purple, merged)을 나타낸다. 조류 배아 줄기세포에 해당하는 배반엽 세포들을 포지티브 대조군으로 사용하였다. 신선한 chBMC 및 30 일 배양한 chBMC들은 항체와 면역반응에 대하여 부분적으로 포지티브이었다.
도 3은 RA 처리 15일 후 chBMCs의 RT-PCR 분석 및 면역조직화학을 나타낸다. 도 3a는 공초점 이미지들은 Vasa, C-kit, Dazl 및 Heat shock protein 90 알파(Hsp90 알파 포지티브 반응 세포에 대한 생식 세포 특이적인 항체들(항체의 이름, green), 세포의 광학 이미지들(DIC) 및 광학 이미지와 포지티브 항체의 코-로컬라이제이션(merged)을 보인다. 3b는 성체 야생형 정소로부터 분리된 RNA, 신선한 BMC으로부터 분리된 RNA 및 생식 세포 분화로부터 분리된 RNA는 골수 세포 (GI-BMC)를 유도하였고 RT-PCR 분석에 대해 가공하였다. GAPDH를 대조군으로 사용하였다.
도 4는 수용체 세정관에서 chGFP BMC의 로칼라이제이션을 나타내는 도면이다. 공초점 이미지들은 eGFP BMC 주입 3 일후 수용체 세정관에 흩어져 있는 eGFP BMCs를 나타낸다. 주입 동안의 물리적인 압력으로 인하여, 많은 관들이 파열되었다(A). eGFP BMCs 주입 10, 20 및 40일 후, GFP 포지티브 세포들은 수용체의 세정관에 위치하고 5% 이하의 GFP BMC들이 간질(interstitium)에 위치하였다. 수용체의 정소로 이식된 형광 골수세포들은 시간에 따라 세정관에서 점유 면적을 나누고 넓혔다(GFP 포지티브 공여 세포 주입 후 10 일: B, 20 일: C, 40일: D ). 스케일 바: 50 ㎛ (A); 20 ㎛ (B, C, D).
도 5는 수용체 세정관에서 GFP 포지티브 BMC의 면역조직화학을 나타낸다. 동결 절편(cryostat) 방법에 의하여 수행된 공여 세포 주입 40일 후 수용체 정소의 횡단면을 보여준다.
도 6a는 본 연구에서 공여체로 이용된 eGFP Tg 닭을 생산하는데 사용된 레트로바이러스 벡터의 구조를 나타낸다. NeoR 및 eGFP 유전자 검출할 수 있는 특이적인 프라이머를 고안하였다. b는 증폭된 PCR 밴드를 나타낸다. L, 100 bp 분자 래더; S, 수용체의 정자 유전자 DNA; P, eGFP Tg 수닭으로부터의 정자 유전자. DNA을 가지는 포지티브 대조군; N, 노말 수닭으로부터 온 정자 유전자 DNA를 가지는 네가티브 대조군. NeoR 및 eGFP 유전자들은 수용체의 정자 DNA에서 검출되었다. (C)eGFP 병아리는 6 주령에 분화전환된 eGFP BMC로부터 생산되었다. chBMC는 30 주령 eGFP Tg 수닭으로부터 얻었고, eGFP 병아리는 노말 암닭에 인공 수정을 수행한 후에 부화하였다. 왼쪽에 첫번째 조류가 비형질전환된 대조군 병아리이다.
도 7은 노말 수용체의 정소로 GFP BMC의 전달을 통한 생식선 카이메라 생산을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1: 실험동물
실험동물은 다음과 같이 준비되고 수행되었다.
Barred Plymouth Rock (BPR)의 한 성체(35주령)을 BMC의 특성화를 위해 사용하였고, 성계(28 주령) 한 마리와 한 성성숙 이전 (16 주령) eGFP 형질전환(Tg) 수닭을 수용체 정소로 BMC의 전달을 위한 공여체로 사용하였다. 수용체 수닭은 성성숙 이전 및 성계 단계에 12 White Leghorn (WL)을 포함하였다. 12 수용체 중 4 마리를 수용체 세정관에서 GFP 골수 공여 세포의 추적을 위해서 연속적으로 희생하였고, 다른 것들은 검정교배를 위해 사용하였다. 동물 관리, 번식(reproduction), 및 수술 방법은 건국 대학교의 법적 요건에 따라서 수행하였다.
실시예
2: 골수 세포의 분리 및 배양
골수 세포(BMCs)는 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS; Gibco)로 GFP Tg 수닭의 잘라진 대퇴골 및 경골 내부를 관류하여 씻어내어서 수집하였다 그 후 세포들을 퍼콜 밀도 구배 원심분리 전에 70㎛ 나일론 메쉬 필터로 여과하였다. 세포들을 퍼콜의 세 층의 밀도 구배(0, 45, 90 %) 상에 로딩한 후 원심분리하였다. 선택된 세포군을 트립신-EDTA 처리로 떼어내고, 약 1 X 106 세포들을 10% FBS, 0.5mM 베타-mercaptoethanol, 20 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF; ESG1106 chemicon), 1,000 unit/ml human leukemia inhibitory factor (LIF; 13256 invitrogen)로 보충된 DMEM/F12를 가지는 60mm 디쉬에 놓았다. 면역염색을 위해서, 2 X 104 세포들을 60 mm 0.1% 젤라틴 코팅된 웰 플레이트 상에 배양하였다. 면역 염색 목적의 세포들은 36.5 ℃, 5% CO2, 60% 상대 습도 배양기에서 배양하였다. retinoic acid 처리를 위해서, 수집된 BMCs를 스피어 형성(sphere formation)을 유도하기 위해서 10% 넉아웃 혈청 보충물, 0.5mM 베타-mercaptoethanol, 20 ng/ml의 bFGF 및 1,000 unit/ml의 LIF가 보충된 DMEM/F12를 가지는 60mm 코팅되지 않은 디쉬에 하루 동안 위치한 후, 넉아웃 혈청을 FBS로 대체하였다. 배양은 상기 배지에서 추가로 2주 더 유지되었고, 그 후에 배지를 분화 시기를 위해서 10 -6M의 retinoic acid (RA) (Sigma)를 포함하는 상기 배지로 바꾸었다.
실시예
3:
BMC
의 이식과 검정교배 분석
본 발명자들은 정자형성(spermatogenesis)을 제거하여서 공여 골수 세포의 안착과 수용체의 세포와의 경쟁에 도움을 위해서 수용체 수닭에 증식세포를 파괴하는 화학요법제인 busulfan을 처리하였다(Lee, Y, M., Jung, J. G., Kim, J. N., Park, T. S., Kim, T. M., Shin, S. S., Kang, D. K., Lim, J. M., and Han, J. Y. (2006) A testis-mediated germline chimera production based on transfer of chicken testicular cells directly into heterologous testes. Biol . Reprod . 75, 380-386).
본 실험을 위해서, 16 및 40 주령의 수용체 노말 수닭을 2 주 간격으로 2번 busulfan (40 mg/kg 체중)을 투여하였다. 이식은 최종 busulfan 처리 2 주 후에 수행하였다. 분리되고 배양된 BMCs (3 x 108 in 1ml)를 0.1 ml/kg Zoletil 50 (Virbac laboratories, Carros, France)으로 마취한 후 수술에 의해서 각 수용체의 정소로 전달하였다. 요약하면, 마지막 늑골 바로 뒤 양편에서 약 2 cm정도 복강을 열어서 BMCs 서스팬젼을 인슐린 주사기(31 gauge, BD, Holdrege, USA)를 사용하여 정소로 직접 주사하였다. 정자형성이 완전하게 일어난 BMC 이식 십 주 후에 통상적인 복부 마사지 기술을 사용(Burrows, W. H., and Quinn, J. P. (1937) Collection of spermatozoa from domestic chicken and turkey. Poult . Sci . 16, 19-24)하여 4 수용체 수닭으로부터 사정된 정액 샘플을 일 주일에 두 번 모아서 노말 암닭에 인공수정을 위해서 사용하였다.
실시예
4: 면역염색
면역조직화학을 위해서, 배양된 세포 및 절편화된 정소 조직을 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS)의 4% paraformaldehyde로 고정화하고 10분간 0.2% Triton X-100로 침투시켰다. PBS로 세척 후, 그 세포들을 비특이적인 결합을 막기 위해서 1시간 동안 10% 노말 염소 혈청으로 배양하였다. 그 후 세포들을 4℃에서 1차 항체로 밤새 배양하였다. PBS로 세척 후, 그 다음 세포들을 2차 항체로 1시간 동안 배양하였다. 핵을 DAPI (1:2,000, Sigma)로 카운터염색하였다. 사용된 1차 항체는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4 (1:50; Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz, CA,) 및 Heat shock protein 90 알파(1:100; Abcam, Cambridge, UK)에 대한 단클론 항체 및 Oct-4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology), Vasa, C-kit 및 Dazl (1:100; Abcam, Cambridge, UK)에 대한 다클론항체이었다. 사용된 2차 항체는 염소 Anti-rabbit tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC; 1:200, Jackson Laboratories, West Grove, PA) 및 염소 안티-마우스 TRITC (1:200, Jackson Laboratories)이었다.
실시예
5:
PCR
및
RT
-
PCR
분석
사정된 정자로부터 유래한 유전자 DNA는 Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 분리하였다. 각 층 세포군 및 배양된 세포로부터 유래한 전체 RNAs를 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 사용하여 분리하였다. 제조업자의 지시에 따라 Accupower RTpremix (Bioneer, CA, USA) 및 oligo dT-primers (Bioneer)로 0.5 ㎍의 총 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 그 PCR은 Accupower PCR premix (Bioneer, USA)를 사용하여 20 ㎕의 반응 부피에서 수행되었다. 그 반응은 30 사이클 수행되었다. PCR 및 RT-PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 표시하였다.
| Gene | Gene ID | Forward Reverse |
Sequences 5→3 | Product size |
| GAPDH | NM 204305 | Forward | CCT TCA TCG ATC TGA ACT ACA TGG(서열번호 1) | 265 |
| Reverse | GGA GCT GAG ATG ATA ACA CGC TTA(서열번호 2) | |||
| eGFP | EU530626 | Forward | GAC TTC AAG GAG GAC GGC AAC A(서열번호 3) | 256 |
| Reverse | TCT CGT TGG GGT CTT TGC TCA G(서열번호 4) | |||
| NeoR | EU530626 | Forward | ACG TTG TCA CTG AAG CGG GAA G(서열번호 5) | 442 |
| Reverse | GCA ATA TCA CGG GTA GCC AAC G(서열번호 6) | |||
| Nanog | NM001146142 | Forward | AGA GAG TCA GTG GGT GGA TAA AGG(서열번호 7) | 406 |
| Reverse | GGA GAG CTC GAG AAC TGT GTG ATA(서열번호 8) | |||
| SOX2 | AB092842 | Forward | GTG AAC CAG AGG ATG GAC AGT TAC(서열번호 9) | 399 |
| Reverse | TTC TGG TAC TTC AGC ACC TGG TAG(서열번호 10) | |||
| C-kit | D13225 | Forward | TCA GTG GGA GTT AAT GAT TCT GGA(서열번호 11) | 242 |
| Reverse | TGC TCT TCC TTT TCT GAA GTG ATG(서열번호 12) | |||
| DAZL | AY211387 | Forward | ATA CAA CTA TCA GGC TCC ACC ACA(서열번호 13) | 304 |
| Reverse | TGC TCT TCC TTT TCT GAA GTG ATG(서열번호 14) | |||
| STRA8 | XM416179 | Forward | TGA AAA ACA AAC AAT GGA AGA AGA(서열번호 15) | 441 |
| Reverse | CTA GAC AAT CCC TGA GTC TCG TTT(서열번호 16) | |||
| PAX6 | NM205066 | Forward | ACC AAC GAT AAC ATA CCC AGT GTG(서열번호 17) | 429 |
| Reverse | TCC TAT TTC TCT GCA GCT TCC TTT(서열번호 18) | |||
| GATA4 | NM204860 | Forward | GAT TAT TCA GAA GGG CGA GAA TGT(서열번호 19) | 394 |
| Reverse | TAA GAC TCT CAC TGC TGG ATG GAC(서열번호 20) | |||
| Brachyury | U67086 | Forward | ATC ACA AAG ACA TGA TGG AGG AAG(서열번호 21) | 423 |
| Reverse | GGA CCA TAA GTT CGG GTA CTG ACT(서열번호 22) | |||
| ALDBP | XM413860 | Forward | GAG GTC TAT GAG CAG GGA GTG AA(서열번호 23) | 410 |
| Reverse | TCC TCT TCT GGC AAC AGG TAC TC(서열번호 24) |
표 1은 chBMCs의 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
닭
BMC
의 특성화
퍼콜 밀도 구배 원심분리 후, 닭 골수 세포(chBMCs)를 3 맑은 층의 세포군으로 분리되었다. RT-PCR은 최상위 층 세포군이 adipocyte lipid droplet binding protein (ALDBP)를 발현하였고 형태학적으로 지방이라는 것을 나타내었다. 맨 하층은 중배엽 기원 마커(brachyury)를 발현하는 적혈구로 대부분 채워져 있었다. 대조적으로, Nanog 및 Sox2와 같은 줄기 세포 특이적인 마커들은 중간 층에 있는 세포로부터 발현되었다. 결론적으로, 퍼콜 밀도 구배 원심분리는 골수로부터 지방 및 적혈구 세포를 제거하고 차후 과정을 위한 다분화능 세포(multipotent cell)를 분리하는데 도움을 준다. 5 계대 동안에 사이토카인 또는 성장인자의 보충없이 DMEM/F12 배지에서 배양한 중간 층 세포들은 줄기 세포 특이적인 마커를 발현하지 못하고 모두 3 생식세포계열(germ line) 특이적인 유전자(도 1a)를 발현하였다. 신선한(갓 채집한 또는 수집한 후) chBMC를 LIF 및 bFGF 첨가 배지로 10일간 배양하고 연속적으로 LIF 및 bFGF 없이 20일간 배양한 경우에, chBMCs는 3 배엽 유래의 특이적인 항체(외배엽: Tuj1, 중배엽 Brachury, 내배엽: 알파-fetoprotein) (도 1b)와 반응하였다.
retinoic acid (RA)는 정소기능의 조절과 밀접하게 관련이 있다는 것은 이미 알려졌다. 비타민 A의 과잉 또는 결핍은 정자형성의 정자형성적 이상 또는 중지를 야기한다. 본 발명에서 본 발명자들은 면역조직화학 연구에서 배반엽(blastoderm) 세포, 신선한 chBMC 및 40 일 배양한 chBMC에서 Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, 및 SSEA-4와 같은 포유류 줄기 세포 특이적인 마커와 포지티브 반응을 나타내었다(도 3). 이들 결과는 chBMCs가 포유류 BMCs와 유사한 다기능성 및 분화능력을 가진다는 것을 나타낸다.
수용체
세정관에서
chGFP
BMC
의
위치화
및 수용체 정소로
BMC
주사에 의해서 생식선
카이메라의
생산
EGFP Tg 닭의 세포들은 녹색 형광 단백질을 발현하기 때문에 EGFP가 발현하는 세포는 분화, 발달 및 세포 안착을 추적하기에 편리하다. 본 발명자들은 퍼콜 밀도 원심분리를 사용하여 EGFP BMCs를 분리한 후 busulfan-처리된 수용체의 정소로 BMCs를 수술적으로 이식하였다. Busulfan 처리는 복강의 내부 깊숙하게 위치한 닭 정소에 화학적 피해를 유도하여 정자형성을 지연 및 방해한다. 공초점 현미경은 수용체 정소에 생식세포 특이적인 마커인 VASA, C-kit, Dazl 및 heat shock protein 90 알파와 BMCs 유래 eGFP 포지티브 공여체의 동시 발현을 나타내었다.
8주 후, 정자형성이 완전하게 회복된 후, 본 발명자들은 수용체 수닭으로부터 정액을 수집하였다. 수집된 정액의 부피(200㎕), 생존률(75%) 및 농도(3 X 108/ml)로써 정상 범위이었다. eGFP Tg 닭 생산에 사용된 레트로바이러스 벡터에 eGFP 및 neo R 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여(Kwon, M. S., Koo, B. C., Choi, B. R., Lee, H. T., Kim, Y. H., Ryu, W. S., Shim, H., Kim, J. H., Kim, N. H., and Kim, T. (2004) Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein. Biochem . Biophys . Res . Commun . 320, 442-448.), 본 발명자들은 공여체 eGFP BMC로부터 분화된 정자를 수용체 정액에서 검출하려 하였다. PCR 분석은 수용체 정자에 eGFP 및 neo R 유전자의 삽입을 보여 주었다(도 6a).
정소에서 공여체 세포의 위치화를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 하나의 수용체를 희생하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 이식된 공여체 eGFP BMCs는 세정관의 내부 공간에 존재하고 GFP를 발현하였다.
7마리의 수용체를 BMC 이식에 사용하였다. 웅성 생식 세포로 BMC의 분화전환(trans-differentiation)은 PCR 분석에 기반하여서 7마리 중 세마리에서 확인되었다(표 2). 그러나 단지 한 수용체만이 104 자손 중에서 2 eGFP 포지티브 병아리를 생산하였다(도 6c). 도 7에 요약한 바와 같이, 본 발명자들은 8 또는 30 주령의 eGFP 공여체로부터 골수세포를 제조하여, 30 일간 배양하고, 수용체(8, 16 및 40 주령)에 이식하였다. 너무 어린 시기(8주령 미만)에 BMC 이식을 겪은 수용체는 정액을 생성할 수 없었고, 수술 후 5개월에 정소의 퇴행이 관찰되었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- a)수컷 조류의 뼈로부터 골수세포를 분리하는 단계; 및
b) 상기 분리된 골수세포를 사이토카인 또는 성장인자가 공급되지 아니한 배지에서 배양 후에 비타민 A를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 조류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩,앵무새, 까마귀, 및 타조로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 조류의 뼈는 대퇴골 또는 경골인 것을 특징으로 하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 수컷 조류는 8 주령 이상된 것을 특징으로 하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 분리는 세 층의 퍼콜 밀도 구배(0, 45, 90%) 원심분리를 사용하여 세 층 중 중간 층 세포군을 얻는 것을 특징으로 하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기의 방법은 상기 배지에서 배양된 골수세포를 수용체 정소에 이식하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 골수세포로부터 분화전환(trans-differentiated)된 웅성 생식 세포를 제조하는 방법.
- 삭제
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| KR1020100017707A KR101131744B1 (ko) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | 조류 골수세포를 이용한 생식세포를 제조하는 방법 및 그 골수세포를 이용한 형질전환 조류 생산 방법 및 조류 생식선 카이메라 |
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| KR (1) | KR101131744B1 (ko) |
-
2010
- 2010-02-26 KR KR1020100017707A patent/KR101131744B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nakanishi and Iritani, 1993, Mol. Reprod. Dev., vol.36, pp.258-261 * |
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| Publication number | Publication date |
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