CN109486751B - 用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可以长期维持且无饲养细胞的未分化的精原干细胞的产生和培养。所得的无饲养细胞的群体可以用于许多方案中的任一种，包括子代公牛的产生。本发明包括成功富集牛精原干细胞所需的新方法、新细胞系和用于成功富集牛精原干细胞的其他组分，以及所得的干细胞组合物。

Description

用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法

本申请为申请日为2013年2月11日、申请号为201380009380.9、发明名称为“用于无饲养细胞培养牛和猪的精原干细胞的方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119要求2012年2月14日提交的临时申请序列号61/598,437的优先权，其整体援引加入本文。

资助信息

本发明用美国农业部授予的合同号117232-001的政府支助进行。政府具有本发明中的某些权利。

背景技术

干细胞是未分化的细胞，具有两个标志性特征：自我更新以及分化为一种或多种不同细胞谱系的能力。自我更新的过程包括干细胞的自我复制以允许增殖和扩增，其中所述干细胞保持未分化的状态。祖细胞也是具有分化为一种或多种细胞谱系的能力的未分化的细胞，但是具有有限的自我更新或不能自我更新。当在培养中维持时，未分化的细胞如干细胞或祖细胞可以进行自发分化，从而丧失期望的未分化的细胞表型。因此，需要最小化自发分化以保持未分化的干细胞或祖细胞状态的方法。

使未分化的细胞保持未分化的状态对于它们例如在工业和医药中的用途非常重要，因为这些细胞的主要科学和治疗实用性在于它们扩增为同质群体的能力，所述同质群体可以根据需要进一步增殖或分化为成熟细胞，例如用于科学研究或者修复患者的细胞或组织的损伤。一旦它们在细胞培养中已自发分化，细胞较少增殖，并且较不能够根据需要分化为不同类型的细胞。因此未分化的干细胞的同质培养是研究科学家和工业高度追求但未实现的目标。

目前培养未分化的细胞(例如，各种类型的干细胞)的方法试图通过每天或比每天更不频繁地将成纤维细胞生长因子2(FGF2)递送至细胞培养物来最小化这样的自发分化，这称作“饲养”。已显示FGF2通过抑制干细胞的分化来促进干细胞的自我更新；但是这种抑制是不完全的，并且干细胞培养物倾向于逐步分化，从而减少干细胞培养物的实用性。此外，干细胞如胚胎或精原干细胞通常需要在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上生长。这是个期望去除的繁琐步骤，并且导致污染了饲养细胞的细胞干细胞群体，其不可以用于各种受精方案和配子的产生。

在体外有条件地诱导干细胞系发育经过精子发生过程以产生配子的能力会为生物医学研究和动物育种(特别是如果可以对各种物种建立这类方案)提供长期追求的技术。到目前为止，仅在大鼠和小鼠中最为成功，而较大的哺乳动物如牛，则没有这样的进展。

位于解离的小鼠和大鼠睾丸细胞级分内的干细胞保持它们在受体小鼠的睾丸中再生精子发生的能力的发现对于建立这类培养系统非常重要。参见Brinster et al.，ProcNatlAcadSci USA 1994；91：11303-11307；Brinster et al.，ProcNatlAcadSci USA1994；91：11298-11302；Clothier et al.，Nature 1996；381：418-421；Kanatsu-Shinoharaet al.，Biol Reprod 2003；69：612-616；和Nagano et al.，Tissue Cell 1998；30：389-397。分离并实验操作这些干细胞的能力为精子发育、辅助生殖、细胞疗法和遗传学的研究打开了新的大门。参见Nagano et al.，BiolReprod 1999；60：1429-1436；Mahanoy et al.，Endocrinology 2000；141：1273-1276；Mahato et al.，Mol Cell Endocrinol 2001；178：57-63；Ogawa et al.，Nat Med 2000；6：29-34；Shinohara et al.，Proc Natl Acad SciUSA 2006；103：13624-13628；Zhang et al.，J Cell Physiol 2007；211：149-158；Kazukiet al.，Gene Ther 2008；15：617-624；Kanatsu-Shinohara et al.，Cell 2004；119：1001-1012；Kanatsu-Shinohara et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：8018-8023；和Nagano et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2001；98：13090-13095。鉴于这种潜能，已建立分离、增殖和遗传修饰培养中的全功能大鼠和小鼠精原干细胞的方案。参见Ryu et al.，Dev Biol 2004；274：158-170；Hamra et al.，Dev Biol 2004；269：393-410；Hamra etal.，Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：14931-14936；Hamra et al.，Methods Mol Biol2008；450：163-179；Hamra et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2005；102：17430-17435；Ryuet al.，Proc Natl Acad Sci USA 2005；102：14302-14307；Orwig et al.，Biol Reprod2002；67：874-879；和Kanatsu-Shinohara et al.，Biol Reprod 2008。选择小鼠和大鼠作为这些研究的物种，这是由于它们作为人健康和疾病研究的实验室动物模型的普及，并且由于缺少利用来自培养的克隆扩增的干细胞遗传修饰大鼠生殖系的方案。参见Hamra etal.，Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：14931-14936。考虑到实验室大鼠作为研究模型的许多潜在应用，在这个研究中寻求成本效益和易于制备的培养基用于体外原代大鼠精原干细胞的衍生和连续增殖。

尽管有这些进展，甚至在大鼠物种中，方法是复杂的且大部分不成功。例如，用于体外啮齿动物精原干细胞的长期增殖的培养基相对复杂、昂贵、制备费事，加上在与成纤维细胞的饲养层组合应用时最有效。

可以看到需要培养精原干细胞的方法，特别是较大的哺乳动物如牛。

发明内容

本发明包含用于培养精原干细胞的组合物和方法。根据本发明，申请人已开发一种无饲养细胞的培养系统，其允许培养的精原干细胞保持未分化的状态并在培养中长期保持存活。本发明的另一方面包括从睾丸组织分离未分化的精原细胞的方法，鉴定在体外支持未分化的精原细胞存活的特异性无血清的培养基，用于包被未分化的精原细胞粘附的塑料培养孔的基材，并且最终申请人已鉴定用于补充饲养细胞条件培养基的特异性生长因子，其促进牛未分化的精原细胞的维持和生长。虽然所述方法和实例公开了牛细胞，但是本发明并不限于此，其可应用于所有家畜物种，包括猪。

根据本发明，申请人已鉴定了具体的专有细胞系，包括牛胚胎成纤维细胞细胞系以及分离自牛睾丸的牛体细胞系。这些具体细胞系在培养任何SSC之前用作饲养支持细胞以处理培养基。预培养技术允许无饲养细胞的培养，使得能够产生推定的牛SSC的纯群体用于移植或其他用途。申请人的培养细胞没有其他饲养细胞系的污染和它们的有害作用，包括潜在的宿主免疫应答、有限的定殖能力以及随着时间最终分化。

在一实施方案中，本发明介绍了一种从包含至少一个SSC的睾丸组织分离未分化的精原细胞(其中精原干细胞(SSC)为一组分)的方法。所述方法包括获得包括至少一个SSC的牛睾丸组织，使所述组织与胶原酶接触，从其他细胞类型分离生精小管，此后使所述生精小管与胰蛋白酶接触以获得富含精原细胞和支持细胞(Sertoli cell)的细胞悬浮液。所述方法还可以用于产生自诱导的多能干细胞的SSC或者甚至已操作为SSC的胚胎干细胞。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种富集和维持包含至少一个SSC的未分化的精原细胞的纯培养物的方法，其中所述方法包括提供特定的具有血清替代物的无血清培养基，进一步提供用Matrigel预包被的培养细胞孔，以及将特定生长因子GDNF、FGF2、SDF-1和CSF-1添加至预处理培养基，所有工作一起第一次提供精原细胞，优选牛精原细胞的无饲养细胞的培养。

在一实施方案中，本发明还介绍了保持未分化的、具有自我更新和分化能力的精原干细胞的推定群体在培养中存活，并且基本上是纯的，即无饲养细胞。

在另一实施方案中，本发明包括新的支持细胞系，其已开发且允许培养基的预处理以提供无饲养细胞的培养方法。所述细胞系包括源自35日龄雄性Holstein胎儿的细胞系牛胚胎成纤维细胞1(或BEF1，以前称为BEF)，以及源自分离自4月龄Holstein公牛睾丸的体细胞的第二细胞系牛体细胞1(或BSC1，以前称为BSC)。这些细胞系一起可以用来预孵育培养基，并且会提供SSC存活和增殖所必需的分泌的可溶性因子，一旦已引入SSC，不添加饲养细胞。根据本发明，将培养基首先用这些细胞预处理，并且足够时间之后，去除饲养预处理细胞，从而然后可以培养SSC细胞。

在本发明的一方面，所述SSC为牛SSC。在另一方面，SSC源自以下生物，选自小鼠、大鼠、猴、狒狒、人、猪和狗。

在本发明的另一方面，细胞源自精原干细胞的任何来源，包括选自野生型成年睾丸、小牛或小狗睾丸、新生儿睾丸以及隐睾成年睾丸的来源。

在本发明的另一方面，细胞源自成为精原干细胞的诱导的多能干细胞或胚胎干细胞，然后其可以成为根据本发明使用的细胞的来源。

在另一实施方案中，本发明介绍了支持SSC维持的无饲养细胞的培养系统，所述系统包含富集的SSC、无血清的确定培养基以及用饲养细胞预处理的培养基。在另一实施方案中，本发明介绍了支持SSC增殖的无饲养细胞的培养系统，其包含至少一个SSC、具有血清替代补充物(StemPro)的无血清的确定培养基，以及已用专有的成纤维细胞细胞系BEF1和专有的BSC1饲养细胞预处理的培养基。

在本发明的一方面，培养系统还包含生长因子GDNF、FGF2、SDF-1和CSF-1。在另一方面，培养基包含选自Dulbecco′s MEM：Ham′s营养混合物F-12(DMEM/F12)和StemPro血清替代补充物的至少一种培养基。

在本发明的另一方面，培养系统还包含用可商购的基质如Matrigel(生长因子减少的版本)预包被的生长塑料培养孔。没有这样的包被，细胞不粘附至塑料孔，并且不可以在培养中长期维持。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种包含纯的、富集的SSC群体的组合物，其中富集的SSC群体不含胚胎成纤维细胞或其他类型的饲养细胞。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种包含富集的SSC群体的组合物，所述富集的SSC群体表达未分化的精原细胞的特异性标记以及与培养的SSC细胞相似的形态学。在一方面，SSC群体对于SSC是基本上同质的。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种产生至少一个哺乳动物子代的方法，所述方法包括将不含饲养细胞的SSC群体给予雄性受体哺乳动物的睾丸，允许富集的SSC在受体哺乳动物中产生精子发生的集落，以及使受体哺乳动物和与受体哺乳动物相同物种的雌性哺乳动物交配。在一方面，将富集的SSC群体给予至受体哺乳动物的生精小管的腔。在另一方面，受体哺乳动物是不育的。

在本发明的一实施方案中，受体哺乳动物选自啮齿动物、灵长类、狗、牛、猪和人。在另一实施方案中，啮齿动物选自小鼠和大鼠。在另一方面，灵长类为狒狒。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种用于在无饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC的试剂盒。所述试剂盒包括培养系统(包含无血清的确定培养基)、用于预处理培养基的专有BSC1和BEF1细胞、(或者已用专有BSC1和BEF1细胞预处理的培养基)、施药器以及说明材料，其中所述说明材料包含使用所述试剂盒在无饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC的说明。

在一实施方案中，本发明介绍了根据本发明的方法产生的子代动物。在另一实施方案中，本发明介绍了根据本发明的方法制备的子代动物，其中富集的SSC用来制备包含至少一个遗传突变的子代动物。在一方面，遗传突变是利用重组技术产生的。

要求保护的本发明部分理解为利用某些天然存在或转基因产生(“遗传工程”)的雄性不育的牛作为供体精原干细胞的受体，动物与所述供体精原干细胞还是免疫相容的。因此，移植的精原干细胞自由发育为功能精子，并且在不存在来自受体雄性可育时也会产生的精子的竞争的情况下使雌性受精。以这种方式，可以从相对低数量的移植精子干细胞获得供体细胞单倍型的100％种系传递。

因此，根据本发明的一方面，提供一种方法用于进行供体单倍型的种系传递。本发明的方法包括以下步骤：(A)提供源自哺乳动物睾丸、诱导的多能干细胞或胚胎干细胞的精原干细胞系的细胞，所述细胞系包含预定的遗传背景，然后(B)将一个或多个细胞移植入雄性不育受体，从而移植的细胞发育为有受精能力的单倍体雄性配子。

根据本发明的另一方面，提供源自哺乳动物睾丸或诱导的多能干细胞或胚胎干细胞的精原干细胞系的细胞文库。本发明的文库包含许多基因敲除或“敲入”突变的干细胞。

附图说明

图1示出在无饲养细胞的培养中牛未分化的精原细胞的维持。左图代表在Matrigel包被的培养孔上用BEF1条件培养基进行无饲养细胞的培养期间形成的生殖细胞团。中图是用DAPI染色以标记单个细胞核的团。右图是未分化的精原细胞标记PLZF的免疫染色。

具体实施方式

除非另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。一般来说，本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交所用的命名以及它们的技术是本领域公知和常用的。除非另有说明，方法和技术一般根据本领域公知的常规方法并如本说明书中引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所述来进行。参见，例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to2002)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor and Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington EnzymeManual，Worthington BiochemicalCorp.，Freehold，N.J.；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol.I，CRCPress(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol.II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。

除非另有说明，以下术语应当理解为具有以下含义：

在本说明书中短语“精原干细胞”表示分离自睾丸、产生自诱导多能干细胞、来自胚胎干细胞或获得这类细胞的任何其他方法的干细胞。例如，产生自皮肤细胞的哺乳动物诱导多能干细胞已用来产生生殖细胞。参见，Easley CA 4^th et al，Cell Rep.2012 Sep27；2(3)：440-6，“Direct differentiation of human pluripotent stem cells intohaploid spermatogeniccells”。精原干细胞不能使卵细胞受精，但是可以产生发育为精子的细胞并这样产生能够存活的后代。可以将分离的精原干细胞培养延长的时间而不丧失它们的特性，并且可以有效地重新放入例如Oatley J.M.et al.，Methods Enzymol.419：259(2006)所述的合适的受体雄性动物的睾丸。

冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用来指一个或一个以上(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如，“一个元件”表示一个元件或一个以上元件。

如本文所用，术语“基因”和“重组基因”指包含编码多肽的开放阅读框的核酸分子。这类天然的等位变异通常可以导致给定基因的核苷酸序列中1-5％变异。通过将许多不同个体中所关注的基因测序可以鉴定可选等位基因。这可以通过利用杂交探针鉴定各种个体中的相同基因位点容易地进行。任何和所有这类核苷酸变异以及所得的氨基酸多态性或变异(其为天然等位变异的结果且不改变功能活性)意图在本发明的范围内。

此外，编码来自其他物种的蛋白(同系物)的核酸分子(其具有与本文所述蛋白的核苷酸序列不同的核苷酸序列)在本发明的范围内。对应于天然等位变体的核酸分子和本发明的cDNA的同系物可以基于它们与核酸分子的相同性，利用人cDNA或其部分作为杂交探针根据标准杂交技术在严格杂交条件下进行分离。

当术语在本文中使用时，生物学过程的“调节”指生物学过程的正常进程的改变。例如，精原干细胞活性的调节可以是所述细胞活性的增加。或者，精原干细胞活性的调节可以是所述细胞活性的减少。

当术语在本文中使用时，“富集”指某物的浓度、数量或活性由先前的状态增加的过程。例如，如果群体以前仅包含50个精原干细胞，则认为100个精原干细胞的群体“富集”了精原干细胞。相似地，如果群体以前仅包含99个精原干细胞，则也认为100个精原干细胞的群体“富集”了精原干细胞。同样地，即使群体以前仅包含0个精原干细胞，也认为100个精原干细胞的群体“富集”了精原干细胞。

当术语在本文中使用时，“群体”指两个或更多个细胞。

当术语在本文中使用时，“基本上与……分离”或“基本上分离”指从第二物质的群体邻近去除的第一物质的群体的特征，其中第一物质的群体不一定没有第二物质，并且第二物质的群体不一定没有第一物质。但是，“基本上与第二物质的群体分离”的第一物质的群体与未分离的第一和第二物质的混合物相比具有可测量的更低含量的第二物质。

在一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约1，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约2，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约5，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约10，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约50，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果第一物质的浓度比第二物质的浓度的比例大于约100，则第一物质基本上与第二物质分离。在另一方面，如果在包含第一物质的组合物中没有可检测水平的第二物质，则第一物质基本上与第二物质分离。

当术语在本文中使用时，“基本上同质”指物质的群体，其主要包含该物质，以及其中杂质已最小化的物质的群体。

细胞或细胞的群体的“维持”指其中培养物中活细胞或活细胞群体的细胞总数量不增加或减少的条件。或者，当术语在本文中使用时，细胞或细胞群体的“增殖”指其中相对于培养物中的原始细胞数量，活细胞的数量作为时间的函数增加的条件。

当术语在本文中使用时，“确定培养基”指具有已知组成的细胞培养基。

当术语在本文中使用时，术语“施药器”表示任何装置，包括但不限于皮下注射器、移液器、支气管镜、喷雾器等，用于将本发明的组合物给药至哺乳动物。

如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其他表达介质，其可以用来传达试剂盒中本发明的方法和/或组合物在维持、增殖或给药本文所述的任何组合物中的实用性。本发明的试剂盒的说明材料可以例如粘帖至包含本发明的组合物的容器，或者可以与包含组合物的容器一起运送。或者，说明材料可以与容器分开运送，目的是说明材料和化合物由接受者合作使用。

当术语在本文中使用时，当细胞不再发挥一种或多种对细胞群体或培养基的物理、生物学或化学影响时，认为细胞从细胞群体或培养基被“消除”。例如，可以利用FACS或利用细胞独特的细胞表面标记特异性的抗体物理去除细胞来从培养基消除细胞。还可以通过例如利用细胞特异性的中和抗体使细胞的生物学活性无活性来从培养基消除细胞。

当大多数但不是全部总数量的这类细胞不再发挥一种或多种对细胞群体或培养基的物理、生物学或化学影响时，细胞从细胞群体或培养基“基本上消除”。例如，如果利用细胞独特的细胞表面标记特异性的抗体从培养基去除至少75％该类型的细胞，则可以从培养基基本上消除特定类型的细胞。更优选地，从培养基消除至少80％的细胞，甚至更优选地，从培养基消除至少85％，更优选至少90％，并且甚至更优选至少95％的细胞。

当术语在本文中使用时，如果细胞源自睾丸，则细胞为“睾丸来源的”细胞。通过非限制性实例的方式，睾丸来源的细胞包括精原干细胞、体细胞和生殖细胞。

富集精原干细胞的方法

本发明介绍了一种富集精原干细胞(SSC)的方法。本文第一次显示SSC可以以无饲养细胞的方案培养，长期存活以富集细胞群体。在本发明的一实施方案中，SSC获得自牛。干细胞富集可用于医疗、诊断和研究领域中的各种目的，包括用于生物体中细胞重新增殖的基于干细胞的疗法，以及实验室研究以鉴定负责控制干细胞的维持和增殖以及人工授精的生长因子。

本发明包含用于培养精原干细胞的组合物和方法。根据本发明，申请人已开发一种无饲养物的培养系统，其允许分离(或获得)的牛精原干细胞保持未分化的状态并在培养中长期保持存活。还可以使用诱导的多能干细胞或胚胎干细胞。本发明的另一方面包括从牛睾丸组织分离未分化的精原细胞的方法，鉴定在体外支持牛未分化的精原细胞存活的特异性无血清的培养基，用于包被培养的牛未分化的精原细胞粘附的塑料培养孔的基质，并且最终申请人已鉴定用于补充饲养细胞条件培养基的特定生长因子，其促进牛未分化的精原细胞的维持和生长。

根据本发明，申请人已鉴定了特定的专有细胞系，包括成纤维细胞牛胚胎细胞系以及分离自牛睾丸或通过其他方式获得的牛体细胞系。这些特定细胞系在培养任何SSC之前用作条件培养基的饲养支持细胞。预培养技术允许无饲养细胞的培养，使得能够产生牛精原细胞SSC的纯群体用于移植或其他用途而没有其它饲养细胞系的污染和它们的有害作用，包括潜在的宿主免疫应答、限制SSC的定殖能力。

在一实施方案中，本发明介绍了一种从包含至少一个SSC的牛睾丸组织分离精原细胞(SSC)的方法。所述方法包括获得包括至少一个SSC的牛睾丸组织，使所述组织与胶原酶接触，从其他细胞类型分离生精小管，此后使所述生精小管与胰蛋白酶接触以获得富含精原细胞和支持细胞的细胞悬浮液。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种富集和维持包含至少一个SSC的来自睾丸衍生的群体的精原干细胞(SSC)、诱导的多能干细胞或胚胎干细胞的纯培养物的方法，其中所述方法包括提供具有血清替代物的特定的无血清培养基，进一步提供用Matrigel预包被的培养细胞孔，以及将特定生长因子GDNF、FGF2、SDF-1和CSF-1添加至预处理培养基，所有工作一起第一次提供精原细胞，优选牛精原细胞的无饲养细胞的培养。

在一实施方案中，本发明还介绍了保持未分化的、具有自我更新和分化能力的精原干细胞的群体在培养中存活，并且基本上是纯的，即无饲养细胞。

在另一实施方案中，本发明包括新的支持细胞系，其已开发且允许培养基的预处理以提供无饲养细胞的培养方法。所述细胞系包括源自35日龄雄性Holstein胎儿的细胞系BEF1，以及源自分离自4月龄Holstein公牛睾丸的体细胞的第二细胞系BSC1。这些细胞系一起可以用来预孵育培养基，并且会提供SSC存活和增殖所必需的分泌因子而不将饲养细胞添加至培养的SSC。

在本发明的一方面，SSC为牛SSC。在另一方面，SSC源自以下生物，选自小鼠、大鼠、猴、狒狒、人、猪和狗。

在本发明的另一方面，细胞源自选自以下的来源：野生型成年睾丸、幼年睾丸、新生儿睾丸、诱导的多能细胞、胚胎干细胞和/或隐睾成年睾丸。

在一实施方案中，本发明介绍了支持SSC维持的无血清的培养系统，所述系统包含富集的SSC、无血清的确定培养基以及用饲养细胞预处理的培养基。在另一实施方案中，本发明介绍了支持SSC增殖的无血清的培养系统，其包含至少一个SSC、具有血清替代补充物(StemPro)的无血清的确定培养基，以及已用专有的成纤维细胞细胞系BEF1和专有的BSC1饲养细胞预处理的培养基。

在本发明的一方面，培养系统还包含生长因子GDNF、FGF2、SDF-1和CSF-1。在另一方面，培养基包含选自Dulbecco′s MEM：Ham′s营养混合物F-12(DMEM/F12)和StemPro血清替代补充物的至少一种培养基。

在本发明的另一方面，培养系统还包含用可商购的基质如Matrigel(生长因子减少的版本)预包被的生长塑料培养孔。没有这样的包被，细胞不粘附至塑料孔，并且不可以在培养中长期维持。

在一实施方案中，本发明介绍了一种包含纯的、富集的SSC群体的组合物，其中富集的SSC群体不含胚胎成纤维细胞或其他类型的饲养细胞。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种包含富集的SSC群体的组合物，所述富集的SSC群体表达未分化的精原细胞的特异性标记以及与培养的SSC细胞相似的形态学。在一方面，SSC群体对于SSC是基本上同质的。

在一实施方案中，本发明介绍了一种产生至少一个哺乳动物子代的方法，所述方法包括将不含饲养细胞的SSC群体给予至雄性受体哺乳动物的睾丸，允许富集的SSC在受体哺乳动物中产生精子发生的集落，以及使受体哺乳动物和与受体哺乳动物相同物种的雌性哺乳动物交配。在一方面，将富集的SSC群体给予至受体哺乳动物的生精小管的腔。在另一方面，受体哺乳动物是不育的。

在本发明的一实施方案中，受体哺乳动物选自啮齿动物、灵长类、狗、牛、猪和人。在另一实施方案中，啮齿动物选自小鼠和大鼠。在另一方面，灵长类为狒狒。

在一实施方案中，本发明介绍了一种产生至少一个子代哺乳动物的方法，所述方法包括将不含饲养细胞的富集的SSC群体给予至雄性受体哺乳动物的睾丸，允许富集的SSC在受体哺乳动物中产生精子发生的集落，以及使受体哺乳动物和与受体哺乳动物相同物种的雌性哺乳动物交配。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种用于在不含饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC的试剂盒。所述试剂盒包括培养系统(包含无血清的确定培养基)、用于预处理培养基的专有BSC1和BEF1细胞、施药器以及说明材料，其中所述说明材料包含使用所述试剂盒在不含饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC的说明。

在一实施方案中，本发明介绍了根据本发明的方法产生的子代动物。在另一实施方案中，本发明介绍了根据本发明的方法制备的子代动物，其中富集的SSC用来制备包含至少一个遗传突变的子代动物。在一方面，遗传突变是利用重组技术产生的。

要求保护的本发明部分理解为利用某些天然存在或转基因产生(“遗传工程”)的雄性不育的牛作为供体精子干细胞的受体，动物与所述供体精子干细胞还是免疫相容的。在这些动物中精子发生受到严重破坏。因此，移植的精子干细胞自由发育为功能精子，并且在不存在来自受体雄性可育时也会产生的精子的竞争的情况下使雌性受精。以这种方式，可以从相对低数量的移植精子干细胞获得供体细胞单倍型的100％种系传递。

因此，根据本发明的一方面，提供一种方法用于进行供体单倍型的种系传递。本发明的方法包括以下步骤：(A)提供源自哺乳动物睾丸、来自诱导的多能干细胞或产生自胚胎干细胞的精原干细胞系的细胞，所述细胞系包含预定的遗传背景，然后(B)将一个或多个细胞移植入雄性不育受体，从而移植的细胞发育为有受精能力的单倍体雄性配子。

根据本发明的另一方面，提供源自哺乳动物睾丸、诱导自多能干细胞或产生自胚胎干细胞的精原干细胞系的细胞文库。本发明的文库包含许多基因敲除或“敲入”突变的干细胞。

根据本发明的额外方面，除了培养精原干细胞的方法，提供用于精原干细胞生长的培养基。

不含饲养细胞的精原干细胞培养系统

本发明介绍了一种无饲养细胞的培养系统用于SSC的体外维持和增殖。这是因为本文已第一次显示牛未分化的精原细胞(SSC为其组分)可以在体外于已用饲养细胞预处理但不含饲养细胞的培养基中维持和增殖。通过本发明的方式，已建立具有最小的、确定条件的培养系统用于牛SSC的体外培养，所述系统提供以确定方式研究SSC生物学的能力，以及鉴定SSC的维持和扩增所需要的各个因子的能力。在一优选实施方案中，不含饲养细胞的培养方法允许产生不受饲养细胞污染的SSC细胞群体用于体外受精和商业牛生产的其他方面。

在本发明的一实施方案中，无饲养细胞的SSC培养系统包括预处理的饲养培养基。在本发明的一方面，预处理饲养细胞是申请人的专有细胞系，包括牛胚胎成纤维细胞系BEF1和牛体细胞系BSC1。在本发明的另一方面，预处理饲养细胞可以包括但不限于衍生自这些系的元件，包括细胞、其组分等。

申请人已鉴定了用于培养SSC的重要培养基。这是本发明的一方面，用于培养和预处理的培养基是无血清的确定培养基，包括基本必需培养基-α(MEMα)。在本发明的另一方面，无血清的确定培养基包括Ham′s F10培养基。在本发明的另一方面，无血清的培养基为Dulbecco′s MEM：Ham′s营养混合物F-12(DMEM/F12)。当掌握本公开时，技术人员会理解本发明的无血清的确定培养基还包括两种或更多种培养基的混合物，其中一种为DMEM/F12。

因此，本发明包括一种组合物，其包括已用一种或多种饲养细胞系预处理的确定培养基，用于SSC的维持或增殖。基于本文所示的公开会理解，本发明的培养系统可用于SSC的维持或扩增。在本发明的一方面，可用于所述培养系统的SSC是利用本发明的方法或组合物富集的SSC。在另一方面，可用于所述培养系统的SSC是根据本发明的方法或组合物以前尚未富集的SSC。

在本发明的一实施方案中，无饲养细胞的确定培养基还包括SSC。鉴于本公开，技术人员会理解可以利用本发明的无饲养细胞的培养系统维持或扩增来自任何来源的SSC。即，获得自睾丸来源的细胞群体的SSC可以获得自源自任何哺乳动物来源的睾丸细胞，包括但不限于人睾丸、大鼠睾丸、小鼠睾丸以及优选地，奶牛或牛睾丸。SSC的来源还包括野生型成年睾丸、诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、具有一个或多个基因突变的成年睾丸、幼年睾丸、新生儿睾丸和/或隐睾成年睾丸。将基因突变引入细胞如SSC中的DNA的方法是本领域公知的，并且在本文中不会进一步讨论。

基于本文所示的公开，还应当理解不与雄性可以是SSC的来源。因此，本发明的另一方面包括不育雄性作为本发明的SSC的来源。

如本文其他地方详细描述的，本发明的基础无饲养细胞的确定培养基还可以包括技术人员已知的可用于细胞培养的任何组分。在一实施方案中，无饲养细胞的确定培养基包括至少一种生长因子。可用于本发明的生长因子包括但不限于干细胞因子(包括小鼠SCF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、GDNF-家族受体(包括GFR.α.1)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(包括人bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、集落刺激因子(CSF)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(包括IGF-I)、血小板源性生长因子(PDGF)以及转化生长因子(包括TGF-βI至III，以及TGFβ.超家族BMP-1至12、GDF1至8、dpp、60A、BIP、OF)。在一优选实施方案中，生长因子包括GDNF、FGF2和CSF-1。

因此本发明还包括在无饲养细胞的确定培养基中维持或增殖SSC的方法。在一实施方案中，本发明介绍了一种在无饲养细胞的培养系统中维持SSC的方法。如本文其他地方详细解释的，所述方法包括在无饲养细胞的培养系统中提供至少一个SSC。

可以通过在培养基中于不同时间点评价SSC的活性并将该活性与培养期开始时SSC的活性进行比较来将SSC鉴定为在无饲养细胞的确定培养细胞中“维持”。技术人员会理解，很少或没有活性损失是SSC在培养中维持的指示。测量SSC的活性的方法在本文其他地方详细描述。

在另一实施方案中，本发明介绍了一种在无饲养细胞的培养系统中增殖SSC的方法。如本文其他地方详细解释的，所述方法包括在无饲养细胞的培养系统中提供至少一个SSC。可以通过在培养过程中于不同时间点评价SSC活性并将该活性与培养期开始时SSC的活性进行比较来将SSC鉴定为在无饲养细胞的确定培养细胞中“增殖”。培养期开始和任何较晚时间点之间活性的增加是SSC已增殖的指示。测量SSC的活性的方法在本文其他地方详细描述。可以根据本发明增殖的SSC包括但不限于牛SSC、人SSC、小鼠SSC和大鼠SSC。

此外，可以通过在SSC细胞培养期间的特定时间点计数存在的细胞数量并与培养期开始时存在的细胞数量值进行比较来评价本发明的无饲养细胞的培养系统中SSC的增殖程度。基于本文所示的公开，技术人员会理解可以使用这些和其他评价SSC维持和增殖的方法。这些方法包括但不限于FACS和MACS。

精原干细胞的移植

在本发明的一方面，可以将一个或多个SSC移植入受体睾丸。移植方法是本领域公知的，并且不会在本文中广泛详细讨论。对于涉及睾丸的一般细胞移植方法，参见Kanatsu-Shinohara et al.(PNAS，99：1383-1388(2002))，Brinster(I)(U.S.Pat.No.6,215,039)和Brinster(II)(U.S.Pat.No.5,858,354)，全部整体援引加入本文。Brinster(I)和(II)部分证实从供体移植至免疫耐受小鼠或其他相容受体的SSC会在受体中复制并维持。无饲养细胞的系统相对于传统饲养细胞系统是巨大进步，因为对于待移植的这些必须去除饲养细胞。申请人的无饲养细胞的培养物不需要这个费力和困难的步骤。

在本发明的一实施方案中，将一个或多个SSC引入睾丸的小管。例如，可以将受体雄性哺乳动物麻醉并将睾丸(或多个睾丸)手术暴露。在一实施方案中，利用显微操作方法，将薄玻璃针一个接一个引入暴露的小管，并且用包含用来定殖小管的原始细胞的溶液注射每个小管。在另一实施方案中，还可以通过将它们注射入小管系统的其他部分如睾丸网的腔来引入一个或多个SSC。技术人员会理解，最小化注射部位的数量并增加将SSC注射入受体雄性的效率的注射方法是可获得的。

用于注射的一个或多个SSC的细胞悬浮液可以包含注射介质以及合适浓度的至少一个SSC。通过非限制性实例的方式，注射介质可以包含以下一种或多种：NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、EDTA、丙酮酸盐、乳酸盐、谷氨酰胺、葡萄糖、牛血清白蛋白和DNAse I。注射介质的pH适当地在7.0-7.7的范围中，但是如技术人员会理解的，可以根据介质组成、细胞类型和/或浓度以及受体注射部位的微环境将其调节至更碱性或更酸性。

在本发明的另一实施方案中，其他系统可以用于将一个或多个SSC引入受体雄性。这些包括注射入输精管和附睾或者在胎儿或幼年睾丸上操作，以最小创伤切开睾丸覆盖内的生精小管的技术，其允许注射的细胞进入小管的切端。或者可以使用仍进行发育的新生儿睾丸(或多个睾丸)。

如本文其他地方所示，进入睾丸小管的SSC一般受到小管内腔的免疫特许环境保护而不被破坏。从小管渗漏的细胞通常被宿主的免疫系统破坏，因为细胞对于动物是外源的。

在本发明的另一实施方案中，使用来自不同物种的动物品系以提供供体细胞(异种转移)。SSC的来源包括但不限于人，啮齿动物，包括大鼠和小鼠，灵长类，包括狒狒，奶牛和狗。

本发明可应用于动物的任何物种，包括人，其中雄性具有睾丸，包括但不限于非人转基因动物。本发明还不限于哺乳动物物种。其可以用来提供具有单一或许多新基因修饰或新特征的许多类型的动物或动物系。本发明可以应用的动物包括人、非人灵长类(例如猴、狒狒)、实验室动物如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)、陪伴动物(例如狗、猫)、鸟(例如鸡和火鸡)、野生动物(例如水牛、狼)、濒危动物(例如大象、豹)和动物园物种(例如老虎、斑马、狮子、熊猫、长颈鹿、北极熊、猴、海獭等)，可以将其修饰以允许它们用于细胞诊断或测定。本发明还可以有利地应用于农场动物，包括驯化的反刍动物和家禽(例如，牛、鸡、火鸡、马、猪等)，以便向这些动物灌输有利的基因修饰或特征。

在本发明的另一实施方案中，供体和受体哺乳动物可以是相同的哺乳动物。在一方面，包含SSC的细胞群体在破坏生殖细胞群体之前采集自哺乳动物，此后重新引入。这个实施方案在辐射疗法之后会保留哺乳动物的生殖能力，例如所述辐射疗法可能在癌症治疗期间是必需的。或者，精原干细胞可以收获自哺乳动物并保持培养或冷冻。在本发明的这个方面，当期望子代时，将干细胞移植至受体睾丸。然后供体哺乳动物卵子可以通过受体睾丸中发育的精子受精。这个方法没有时间限制，因为干细胞不断地进行自我更新。

卵子和子代受精的方法是本领域已知的，并且不会在本文中详细讨论。通过非限制性实例的方式，使卵子受精的方法包括但不限于胞浆内精子注射(ICSI)、圆形精子细胞注射(ROSI)等。此外，通过非限制性实例的方式，使子代受精的方法包括但不限于ICSI、ROSI等。

一旦初始受精事件实现且所得的后代可育，则建立了具有其新的基因修饰或特征的哺乳动物系，其中新的基因修饰或特征存在于雄性和雌性后代中。因此，根据本发明，通过重新放入其睾丸生精小管可以产生哺乳动物，仅在其睾丸中包含对于该哺乳动物不是天然的生物学功能生殖细胞。这个(亲代)哺乳动物可以产生子代。子代的每个细胞与亲代哺乳动物相比在遗传上不是天然的。

本发明提供的亲代哺乳动物及其子代均具有多个和不同用途，包括但不限于在农业和生物医药中的用途，包括人基因疗法。本发明的说明性农业用途涉及增加有价值的种畜动物的育种潜力。在本发明的另一方面，提供可用于生物医药或农业的嵌合动物。当掌握本申请时，技术人员会理解本发明为现有的转基因动物技术提供有利的补充。

本发明缓解了目前胚胎学转基因工作的困难和费用。在本发明的一实施方案中，可以将精原干细胞遗传修饰，然后转移至受体睾丸。所得的生殖细胞中存在的有价值的基因性状可以传递至受体种畜的(转基因)子代。本发明的这个具体应用对于大型农业动物的遗传工程很重要。

如本文所示，本发明还用于基因疗法，包括人基因疗法。通过非限制性实例的方式，具有有害遗传性状的患者可以进行睾丸活组织检查。可以将干细胞遗传修饰以修正有害性状。然后患者进行治疗以从他的睾丸去除剩余的生殖细胞，例如通过睾丸的特异性照射。然后可以将他的睾丸(现在没有生殖细胞)重新定殖他自己的遗传修正的干细胞。然后患者可以拥有后代而不担心他会将遗传疾病传递给他的后代。或者，可以将具有修正的基因的干细胞移植至小鼠，并且将所得的精子用于使卵子受精，从而前述需要将干细胞重新植入原来的人睾丸。

在另一实施方案中，本发明还用于建立、恢复或增强包括但不限于人的雄性哺乳动物的生育能力。通过非限制性实例的方式，患有可通过放射性同位素疗法、化疗或两者治疗的疾病或病症的患者是一个或多个SSC的供体。在患者已进行放射性同位素疗法、化疗或两者之后，患者可能没有SSC，或者可能不育。通过根据本发明使用、制备或移植一个或多个患者的SSC，可以建立、恢复或增强患者的生育能力。

不育睾丸互补

目前，在40-60％的病例中，男性不育的具体原因仍是个谜。参见Bhasin et al.，JClin Endocrinol Metab 79，1525-9(1994)；Sadeghi-Nejad et al.，Urol J 4，192-206(2007)；和Matzuk et al.，Nat Med 14，1197-213(2008)。总计＞5％的男性群体是不育的，并且所有男性中＞1％遭受称作无精子症的精子生成严重缺陷。参见Bhasin et al.，JClin Endocrinol Metab 79，1525-9(1994)；Sadeghi-Nejad et al.，Urol J 4，192-206(2007)；Barthold et al.J Urol 170，2396-401(2003)；和Bleyer，W.A.CA Cancer J Clin40，355-67(1990)。根本上，因为无精子症导致不能通过自然交配繁殖，为什么这种疾病在人群中这样流行看来很神秘。这样的流行趋势明确指向存在破坏精子生成(即精子发生)过程的有力环境因素或者大量在生命期间可以产生以使得人不育但其他方面健康的从头突变。参见Bhasin et al.，J Clin Endocrinol Metab 79，1525-9(1994)；Bleyer，W.A.，CACancer J Clin 40，355-67(1990)；Reijo，R.et al.Nat Genet.10，383-93(1995)；Oateset al.，Hum Reprod 17，2813-24(2002)。事实上，这在许多情况中是真实的，因为负责几种类型的男性因素不育的从头突变已在基因水平定义，并且越来越多的男性在他们的童年通过癌症化疗而不育。参见Sadeghi-Nejad，et al.，Urol J 4，192-206(2007)；Reijo etal.Nat Genet.10，383-93(1995)；Bleyer et al.，CA Cancer J Clin 40，355-67(1990)；Oates et al.，Hum Reprod 17，2813-24(2002)；Bhasin，S.，J Clin Endocrinol Metab92，1995-2004(2007)；和Geens，M.et al.，Hum Reprod Update 14，121-30(2008)。作为许多患有无精子症的不育男性的新希望，表明生殖生物学和遗传研究之间的强烈联系的干细胞生物学中的创新突破是发现小鼠睾丸包含在分离并移植入另一小鼠的睾丸之后能够产生完全功能的精子的精原干细胞。参见Brinster&Zimmermann，Proc Natl Acad Sci USA91，11298-302(1994)。相似的实验很快在大鼠中进行，并且随后显示分离的小鼠精原细胞在培养数月后保持它们的再生潜能。参见Clouthier et al.，Nature 381，418-21(1996)；Nagano et al.，Tissue Cell 30，389-97(1998)。此后已配制支持啮齿动物精原细胞系在体外长期增殖的新培养基，并且现在科学家即将建立培养来自睾丸活组织检查的人精原细胞系所需要的条件。参见Kanatsu-Shinohara et al.，Biol Reprod 69，612-6(2003)；Hamra，F.K.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 102，17430-5(2005)；Conrad，S.etal.Nature(2008)；和Kossack，N.et al.″Isolation and Characterization ofPluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells.″Stem Cells(2008)。表面上，在通过将精原细胞系移植回它们自己的供体的睾丸来利用它们产生功能精子之前，在培养中增殖精原细胞系的能力为治愈许多现有类型的男性不育提供了明确的策略。但是，很大程度上是由于生殖系干细胞的多能性质，在这些突破转化为实践之前，首先在更高等的医学相关性非人受体中评价这类细胞疗法的临床前细节是必要的。参见Geens，M.etal.，Hum Reprod Update 14，121-30(2008)；Conrad，S.et al.″Generation ofpluripotent stem cells from adult human testis.″Nature(2008)；Kossack，N.etal.″Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial StemCell-Derived Cells.″Stem Cells(2008)；Hermann，B.P.et al.Stem Cells 25，2330-8(2007)；和Zhang et al.，J Cell Physiol 211，149-58(2007)。

试剂盒

本发明包括各种试剂盒，其包含无饲养细胞的培养系统用于至少一个SSC的维持或增殖。虽然下文描述了示例性试剂盒，但是根据本公开，其他可用的试剂盒的内容物对于技术人员是显而易见的。这些试剂盒的每一种均包括的本发明内。

在一方面，本发明介绍了一种试剂盒用于在无饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC，所述试剂盒包含培养系统(包含无血清的确定培养基以及来自包括BEF1中的细胞和细胞系BSC1的一种或多种专有细胞系的预处理的饲养细胞)、施药器和说明材料，其中说明材料包含使用试剂盒在无饲养细胞的培养系统中维持至少一个SSC的说明。在另一方面，本发明介绍了一种试剂盒用于在无饲养细胞的培养系统中增殖至少一个SSC，所述试剂盒包含培养系统(包含无血清的确定培养基和预处理饲养细胞，或者已预处理的培养基)、施药器和说明材料，其中说明材料包含使用试剂盒在无饲养细胞的培养系统中增殖至少一个SSC的说明。

本发明还介绍了一种试剂盒，其用于向哺乳动物给予富集的SSC群体，所述试剂盒包含培养系统(包含用饲养细胞预处理的无饲养细胞的确定培养基)、施药器和说明材料，其中说明材料包括使用试剂盒在无饲养细胞的培养系统中增殖至少一个SSC以及基于施药器向哺乳动物给予富集的SSC的说明。

试剂盒中包括的具体施药器取决于例如用来将富集的SSC引入细胞的方法和/或组合物。这类施药器是本领域公知的，并且可以包括膜、植入物、注射器等。此外，试剂盒包括使用试剂盒的说明材料。这些说明简单地体现本文提供的公开。

试剂盒还包括药学可接受的载体。以如本文其他地方所示的适当量提供组合物。此外，给药途径包括但不限于与期望的给药部位直接接触以及与期望的给药部位相邻的细胞或组织接触。

如本发明的试剂盒涵盖的，用于SSC的分离、纯化、富集、增殖和维持的组合物和方法在本文其他地方详述。

参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，仅为了说明的目的提供这些实施例，而不是为了限制。因此，本发明不应当理解为限于以下实施例，而是应当理解为涵盖作为本文提供的教学的结果变得明显的任何和所有变异。

实施例

牛或猪未分化的精原细胞的分离和培养

1.制备胶原酶/DNase温育溶液(1-5mg/ml胶原酶，Worthington Biological和5-10mg/ml DNase，Sigma-Aldrich)。

2.利用显微外科手术镊手动分离100-200mg切开的牛或猪睾丸实质并置于胶原酶/DNase消化溶液中。

3.在37℃下温育，以周期性间隔温和旋转直至分离生精小管。

4.允许生精小管片段在冰上沉淀，去除上清并在可获得自Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA 92008 USA的Hanks平衡盐溶液(HBSS)或合适的生理缓冲液中洗涤。重复该过程直至上清相对澄清。

6.最后沉淀温育之后，去除上清并在胰蛋白酶/DNase消化缓冲液(Invitrogen)中重悬小管。

7.在37℃下温育，然后添加更多的DNase溶液，随后移液以制备由生殖细胞和支持细胞组成的单细胞悬浮液。

8.添加胎牛血清或其他合适的蛋白来源以终止胰蛋白酶消化，并且使细胞悬浮液通过合适的细胞滤器以去除组织片段，从而获得单细胞悬浮液。

9.在4℃下以600xg离心7min以沉淀细胞。

10.吸出上清，并且将细胞重悬于DPBS-S(具有1％FBS、10mM Hepes、1mM丙酮酸盐、1mg/ml葡萄糖、1x10⁴u/ml青霉素、1x10⁴μg/ml链霉素的磷酸缓冲盐水)或其他合适的生理缓冲液中。

11.将细胞悬浮液以2ml percoll溶液/5ml细胞悬浮液的密度覆盖在30％percoll溶液上。percoll和细胞悬浮液的其他体积和比例也可以是合适的。

12.在4℃下以600xg离心8min。

13.去除上清以回收细胞沉淀并重悬于DPBS-S或其他合适的缓冲液中。

14.在4℃下以600xg离心7min。

15.去除上清并重悬于StemPro培养基(下文的配方)中。

16.再次离心并在StemPro中洗涤细胞以去除残余的胎牛血清。

17.在StemPro中重悬洗涤的细胞沉淀并添加生长因子混合物(GDNF 40ng/ml，FGF10ng/ml，CSF-1 10ng/ml，SDF-1 10ng/ml)。其他浓度的这些生长因子可以是合适的。

18.将细胞以2x10⁶个细胞/孔的密度添加至用0.1％明胶预包被的6-孔培养板并在37℃下温育过夜。其他培养板形式、明胶浓度和细胞密度可以是合适的。

19.第二天，将HBSS或其他合适的生理缓冲液添加至每个孔并在整个孔温和移液以去除非粘附细胞。

20.收集富含牛精原细胞的非粘附细胞的悬浮液。

21.将生殖细胞在4℃下以600xg离心7min，去除上清并重悬于BEF1或BSC1饲养细胞条件StemPro培养基中，添加生长因子混合物。

22.将细胞置于用Matrigel(BD Biosciences)预包被的24-孔板中。其他基质如层粘连蛋白和纤连蛋白也可以适合培养孔的包被，并且包括96-孔、48-孔和12-孔在内的其他培养板形式可以是合适的。

23.将细胞在37℃下于空气中5％CO₂的气氛中温育。每隔一天更换BEF1或BSC1预处理的培养基，并且以7-10天的间隔将细胞重新平板接种至新的基质包被的塑料板。

可以将细胞在这些条件下维持超过6个月并形成具有如图1所示的形态学的团块。此外，细胞保持表达未分化的精原细胞的分子标记，包括转录因子PLZF。

StemPro培养基的预处理

1.将BEF和BSC饲养细胞维持在可商购自Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA92008 USA的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)生长培养基中，并且在80％汇合时1∶2-1∶5亚培养。

2.StemPro的预处理在将培养基添加至培养的精原细胞之前24hr进行。

3.去除DMEM生长培养基，用HBSS或其他合适的生理缓冲液洗涤细胞并弃去。

4.将StemPro培养基添加至饲养细胞并在37℃下温育过夜。

5.收集预处理StemPro培养基并通过0.45μm注射器式滤器过滤，添加生长因子混合物(GDNF、FGF2、CSF-1和SDF-1)。

6.添加至维持在用Matrigel或其他合适的基质包被的塑料培养孔中的牛精原细胞。

牛胚胎成纤维细胞(BEF)饲养细胞的产生

1.将35日龄的牛胚胎采集至PBS中。

2.去除头和内脏器官，包括性腺。

3.用无菌刀片将胚胎切成小段。

4.通过在37℃下温育来在胰蛋白酶溶液中消化组织。

5.允许组织在冰上沉淀，然后剧烈吹打。

6.添加更多的胰蛋白酶溶液并在37℃下温育。

7.允许组织在并上沉淀，收集上清并以300xg离心5min。

8.将沉淀的细胞重悬于DMEM生长培养基中并置于培养板上。

9.使细胞在37℃下于空气中5％CO₂的气氛中生长。

10.通过用过量表达端粒酶的重组DNA构建体转染来使细胞永生化。

牛体细胞(BSC)饲养细胞的产生

1.将分离精原细胞的差异平板接种过程中粘附至明胶包被的培养孔的牛睾丸细胞在已去除精原细胞之后维持在DMEM生长培养基中。

2.这个细胞群体是来自牛睾丸的体细胞的混合物，包括支持细胞、Leydig细胞和成纤维细胞。

3.使细胞在37℃下于空气中5％CO₂气氛中生长，并且通过用过量表达端粒酶的重组DNA构建体转染来永生化。

保藏

从本申请的提交日期之前开始，细胞系BEF1和BSC1的保藏物由本发明的发明人维持。在本申请未决期间，该保藏物可由专利和商标专员以及在要求时授权的专员决定的人获得。在本申请中任何权利要求授权时，申请人会使美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，Virginia，20110每个系的保藏物可无限制地公开获得。ATCC保藏的细胞系采自发明人维持和上文描述的相同保藏物。此外，申请人会满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求，包括提供在制备保藏物时样品活力的指示。细胞系BEF1和BSC1的保藏物会在公共存放处ATCC存放处维持30年的时间，或者最近的请求之后5年，或者专利的有效时间，无论哪个较长，并且如果其在这个期间变得不可活，会将其更换。申请人不会对来自ATCC的保藏材料的可获得性强加限制；但是，申请人没有权利放弃法律对生物材料的转移或其商业运输的任何限制。

Claims (9)

1.一种预处理用于哺乳动物家畜精原干细胞的维持和富集的培养基的方法，包括

(a) 使培养基与选自来自家畜哺乳动物胚胎成纤维细胞和/或来自分离自哺乳动物家畜睾丸的哺乳动物家畜体细胞的细胞接触，

(b) 允许所述细胞在所述培养基上增殖，且此后

(c) 去除所述饲养细胞并收集所述培养基；

其中所述精原干细胞源自选自野生型成年睾丸、小牛或小狗睾丸、新生儿睾丸和隐睾成年睾丸的来源。

2.一种从包含至少一个精原干细胞的睾丸来源的细胞群体富集精原干细胞的方法，所述方法包括：

a) 根据权利要求1的方法预处理培养基以产生处理的培养基；

b) 使所述睾丸来源的细胞群体与所述预处理的培养基在适合精原干细胞维持和富集的条件下接触；

c) 回收通过和所述预处理的培养基接触而维持和富集的精原干细胞。

3.权利要求1的方法，其中所述培养基补充了血清替代补充物。

4.权利要求1的方法，其中所述精原干细胞维持在塑料培养孔中。

5.权利要求4的方法，其中用Matrigel包被所述塑料培养孔，从而精原干细胞会粘附并在长期培养中维持。

6.权利要求1的方法，其中所述培养基补充了生长因子，包括GDNF、FGF2、SDF-1和CSF-1。

7.通过权利要求2的方法获得的富集精原干细胞的群体在制备用于产生至少一个哺乳动物子代的方法中的试剂盒的用途，所述产生至少一个哺乳动物子代的方法包括：

a)将所述富集精原干细胞的群体给予雄性受体哺乳动物的睾丸，其中不必从所述群体去除饲养细胞；

b)允许所述富集的精原干细胞在所述受体哺乳动物中产生精子发生集落；以及

c)使所述受体哺乳动物和与所述受体哺乳动物相同物种的雌性哺乳动物交配；

其中所述精原干细胞源自选自野生型成年睾丸、小牛或小狗睾丸、新生儿睾丸和隐睾成年睾丸的来源。

8.权利要求7的用途，其中将所述富集精原干细胞的群体给予至所述受体哺乳动物的生精小管的腔。

9.权利要求7的用途，其中所述受体哺乳动物是不育的。

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