KR20210092343A - 정조 줄기 세포의 집단을 증가시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
성체 조직의 유지는 국소 적소에서 줄기 세포 자가 재생에 의존한다. 정조 줄기 세포(SSC)는 정자형성 및 수정에 필요한 생식계 성체 줄기 세포이다. 본 발명은 장기간 배양에서 인간 및 포유동물 SSC를 지지하기 위한, 신경교 세포주-유래 신경친화성 인자(GDNF) 및 다른 인자를 생산하는 SSC 적소에서의 고환 내피 세포(TEC)의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피더 없는 배양물에서 인간 및 포유동물 SSC 콜로니의 장기간 유지에 충분한 5가지 인자를 이용하는 것에 관한 것이다. SSC가 세포독성 손상에 매우 민감하기 때문에 화학요법 후의 남성 암 생존자는 종종 불임이다. TEC 단독의 이식은 SSC의 화학요법-유도된 고갈 후에 마우스에서 정자형성을 회복하는 데 사용된다.
Description
성체 포유동물 조직은 그의 유지에 필요한 인자를 제공하는 특화된 기관 특이적 적소에서 자가 재생하는 줄기 세포 집단에 의해 유지된다. 그러나, 대부분의 기관에서, 줄기 세포 자가 재생에 필요한 적소 세포(niche cell)는 아직 확인되지 않았다. 정조 줄기 세포(spermatogonial stem cell; SSC)는 수정에 필요한 잘 특성화된 성체 줄기 세포이다. 그러나, SSC 적소 내의 세포 집단은 아직 기재되지 않았고, 다른 기관 내의 내피 세포(EC)가 줄기 세포 적소에 기여하지만, SSCH 적소에서의 TEC의 역할은 조사되지 않았다. 연구는 골수 EC가 골수에서 HSC 유지 및 자가 재생에 필요한, 줄기 세포 인자를 생성하는 조혈 줄기 세포(HSC) 혈관 적소(niche)에서 중요하다는 것을 보여주었다. 뇌 EC는 뇌 내피가 다른 인자 중에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 분비를 통해 신경 줄기 세포 유지에 기여하기 때문에 줄기 세포 적소에서의 EC의 또 다른 예이다. 내피는 조직 특이적 분비체의 생성을 통해 발달 과정을 조절하고 정상 기관 항상성을 유지하는 기관 특이적 방식으로 기능하다는 것이 점점 더 명백하다.
SSC는 성체 수컷에서 생산적 정자형성을 유지하면서 자가 재생시키는 고환 내의 성체 줄기 세포 집단이다. 이전의 연구는 GDNF의 형질전환 손실- 및 기능 획득 마우스 모델과 함께 SSC 자가 재생에 중요한 신경교-유래 신경친화성 인자(GDNF)를 확인하였고, 이는 SSC의 유지를 위한 이러한 인자의 필요성을 확인시켜준다. 정자형성을 위해 GDNF가 필요하였다는 관찰 후, 마우스 SSC에 대한 배양 조건은 수개월 동안 배아 섬유아세포 피더 세포 상에서 배양된 마우스의 SSC를 유지하기에 충분한 GDNF 및 다른 성장 인자를 첨가와 함께 빠르게 전개되었다. 마우스 및 다른 동물로부터 수거된 SSC는 현재 일상적으로 확장될 수 있고, 이전에 공개된 연구가 인간 고환 세포를 배양하기 위한 조건을 기재하였지만, 임상 용도를 위한 인간 SSC의 확장은 아직 재현가능하게 또는 일상적으로 수행될 수 없다. 이러한 장애물은 부분적으로 GDNF 및 다른 인자를 생산하는 중요한 SSC 적소 세포의 동일성에 관한 지식 부족에 기인한다. GDNF는 세르톨리 세포 및 정세관주위 근육모양 세포(PTM)에 의해 발현되지만, 이들 GDNF 생산 집단 중 어느 하나가 SSC의 장기간 유지 및 확장을 지지할 수 있음을 보여주는 명확한 연구는 없다. 이전의 연구는 GDNF가 고환에서 혈관 세포에 의해 발현될 수 있음을 시사하였다. GDNF 발현은 고환의 세동맥 및 동맥에서의 면역조직화학에 의해 검출되었고, 고환 내피의 전사 분석은 TEC가 GDNF의 공급원일 수 있음을 시사한다. 그러나, SSC 적소에서의 TEC의 역할은 아직 조사되지 않았다. 배양물에서 인간 SSC를 유지할 수 없는 것은 암으로 진단된 사춘기 전 소년에 대한 삶의 질에 해로운 결과를 갖는다. SSC는 세포독성 요법에 특히 민감하고, 이들 환자는 성숙한 정자를 수득하기 위한 옵션이 부족하고, 따라서 암 치료의 완료 후에 많은 것이 영구적으로 불임이 된다.
최근의 추정은 20세 내지 39세의 530명의 청소년 중 1명이 소아기 암의 생존자임을 시사한다. 암으로 진단된 사춘기 후 남성은 생식력 보존 옵션을 갖지만, 사춘기 소년에 대한 옵션은 존재하지 않는다. 1990년대에, 동질유전자 공여자로부터의 생식세포를 그들의 정세관 내로 주사함으로써 화학치료제 부설판으로 처리한 후 멸균된 마우스에서 정자형성이 회복될 수 있음이 입증되었다. 이들 결과는 SSC가 화학요법의 시작 전에 수거되고 치료 완료 시 고환 내로 재도입될 수 있음을 시사하였다. 그러나, 사춘기 전 소년으로부터의 고환 생검은 단지 약간의 수의 SSC를 함유하고, 따라서 후속 재주입 전에 시험관 내 확장을 필요로 한다.
본 명세서에서, 본 발명의 한 구현예는 배양물 중 인간 및 포유동물 SSC의 자가 재생 및 확장에 필요한 성장 인자를 제공하는 수컷 생식계 줄기 세포 적소에서 핵심 집단으로서 TEC를 사용한다. TEC는 SSC 및 TEC의 화학요법-유도된 고갈 후에 포유동물에서 정자형성을 회복하기 위해 이식되지만, 다른 기관 내피는 그렇지 않으며, 배양물에서 SSC의 유지에 충분한 성장 인자를 발현하며, GDNF, 섬유모세포 성장 인자-2(FGF2), 기질 세포-유래 인자-1(SDF1), 대식세포 염증성 단백질 2(MIP-2) 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2(IGFBP-2)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 배지에 이들 5가지 인자를 첨가함으로써 피더 없는 조건 하에 인간 및 포유동물 SSC 둘 다를 장기간 배양하는 것에 관한 것이다. 추가로, 또 다른 구현예는 GDNF 발현이 TEC에서 활성화된 T-세포의 칼시뉴린(CaN)- 핵 인자(NFAT) 경로를 활성화시키는 FGF 수용체 1(FGFR1)에 결합하는 FGF2에 의해 특이적으로 유도된다는 것을 입증한다. 또 다른 구현예는 정자형성 및 생식력을 제어하기 위한 EC에서의 CaN-NFAT 신호전달의 조절에 관한 것이다. EC 활성화는 CaN-NFAT 경로를 특이적으로 약화시키는 21번 염색체 인코딩된 유전자의 증가된 발현으로 인해 DS가 손상된다. DS 마우스 모델은 SSC 자가 재생 및/또는 유지에서의 결함을 나타내고, DS를 갖는 남성은 유의하게 감소된 정자 수를 갖고 불임이다. 종합하면, 한 구현예는 정자형성의 유지에 가장 중요한 인자인 GDNF의 발현을 조절하는 것으로서 TEC 또는 SSC 자가 재생 및 TEC에서 CaN-NFAT 경로에 필요한 인자를 제공함으로써 SSC 자가 재생을 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구현예는 고환 내피 세포(TEC)를 포유동물에게 이식함으로써 포유동물에서 정조 줄기 세포의 집단을 증가시키는 방법을 제공한다. 이식에 사용되는 TEC는 시험관 내에서 배양될 수 있거나, 이식 표적 포유동물로부터 수득되어 저장된 것일 수 있다. 상기 방법은 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포(SSC)의 이식의 추가 단계를 포함할 수 있다. 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포로서 고환 내피 세포를 사용하여 또는 피더 세포 없이 고환 상피 세포로부터 생성된 성장 인자만을 사용하여 배양될 수 있다. 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1 및 MIP-2로부터 선택된 3종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 성장 인자의 5가지 모두의 혼합물이 SSC를 배양하는데 제공된다. 이러한 구현예에서 포유동물은 바람직하게는 인간이다.
또 다른 구현예는 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포 또는 TEC의 이식에 의해 포유동물에서 정자형성을 회복하는 방법을 제공한다. 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포로서 고환 내피 세포를 사용하여 또는 피더 세포 없이 고환 상피 세포로부터 생성된 성장 인자만을 사용하여 배양될 수 있다. 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1 및 MIP-2로부터 선택된 3종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 성장 인자의 5가지 모두의 혼합물이 SSC를 배양하는데 제공된다. 이러한 구현예에서 포유동물은 바람직하게는 인간이다.
또 다른 구현예는 시험관 내에서 정조 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 피더 세포로서 고환 내피 세포(TEC) 또는 피더 세포 없이 고환 상피 세포의 성장 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 장기간이 60일 초과, 바람직하게는 90일, 더욱 더 바람직하게는 120일인 시험관 내 정조 줄기 세포의 장기간 유지를 허용한다. 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1 및 MIP-2로부터 선택된 3종 이상, 또는 바람직하게는 GDLF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1 및 MIP-2의 혼합물이다.
도 1. a. 3일 동안 FGF-2(20ngml-1) 처리 없이 또는 처리하면서 세르톨리 세포 또는 TEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 세르톨리 세포 및 TEC에서의 Gdnf mRNA, 및 GDNF 수준의 정량화. b. 뮤린 GFP+ Thy1.2 + SSC를 CD31+ TEC가 고갈되었지만 고환에서 모든 다른 세포 집단을 함유하는 TEC 또는 고환 세포와 함께 공동-배양하였다. 3주 후, SSC 콜로니는 세르톨리 및 PTM 세포가 존재하는 CD31-고갈된 고환 세포 공동-배양물에 부재한 반면, 유의미한 수의 GFP+ Thy1.2+ SSC 콜로니는 TEC 단독과 공동-배양물 중에 존재하였다. c. 비히클 또는 부설판 처리 5주 후에 야생형 마우스로부터의 고환 절편 상에서 CD31(EC 대신)에 대한 면역형광 염색. 미세혈관 밀도(MVD)는 우측에서 정량화되고, n = 3 내지 5이다. d. PBS 또는 부설판 처리 5주 후에 WT 마우스로부터 수거된 전체 고환 용해물에서의 GDNF 발현의 웨스턴 블랏 분석. 액틴을 로딩 대조군으로서 프로빙하고, 각각의 레인은 개별 고환이다. e. PBS, 부설판 또는 부설판 + 마우스 LuEC 또는 TEC의 이식 후 마우스로부터의 전체 고환. 명시야(brighteld) 이미지: 바 = 1cm. 형광 영상(막대 = 300 μm)은 이식된 GFP+ TEC의 존재 및 부재 하에 부설판으로 처리된 WT 마우스로부터의 고환을 나타낸다. f. GFP+ TEC 또는 GFP+ LuEC를 이식하거나 이식하지 않은 부설판 처리 후 WT 마우스로부터 수거된 고환 절편의 영상. 절편을 H&E로 염색하고, 줄기 세포 마커, PLZF(적색) 또는 DDX4(백색) 또는 GFP(녹색)에 대해 면역염색하여 이식된 EC를 검출하였다. 고출력장(high-powered field; HPF) 당 정자형성 및 HPF 당 PLZF+ 세포를 나타내는 정세관의 정량은 우측에 나타나 있고, n=3-4이다. 지시된 처리 후 WT 마우스로부터의 고환 절편의 면역형광 영상을 CD31(적색), GFP(녹색) 및 DAPI(청색)에 대해 면역염색하였다. MVD 및 용기 길이의 정량화가 우측에 나타나 있고, n = 3이다.
도 2. a. 표시된 농도의 FGF-2로 2일 동안 처리한 후 TEC, LuEC 및 LiEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF의 정량화, n=3. 막대 = 100 μm. 데이터는 평균±s.e.m로서 제시된다. b. 씨딩 후 1일째 및 8일째에 STO 세포 또는 TEC + 외인성 GDNF 및 FGF-2와 함께 공동-배양된 GFP+SSC의 2D 배양물의 대표적인 명시야(BF) 및 GFP 영상. STO 또는 TEC와의 공동-배양 8일 후 줄기 세포 수의 정량화 및 평균 콜로니 면적은 우측에 제시되고, n = 3이다. 데이터는 평균±s.e.m이다. 막대 = 100 μm. *P<0.05. c. GFP+ Thy1.2+ SSC와 TEC와의 2D 공동-배양물의 이미지 및 생식세포 마커 DDX4로 면역염색. 삽도: 막대 = 10 μm. d. GFP+ Thy-1.2+ SSC와 TEC 또는 LuEC와의 3D 구상체 공동-배양물을 매트리겔을 사용하여 생성시켰으나, 외인성 GDNF 또는 FGF-2를 사용하지 않았다. GFP+ 구상체 공동-배양물을 15일째에 DDX4(적색), Oct4(백색) 및 DAPI(청색)로 면역요법하였다. 콜로니의 평균 직경 및 총 수의 정량화가 우측에 도시된다; n = 3. 모든 데이터는 평균±s.e.m로서 제시된다. 막대 = 50 μm, *P<0.05. **P<0.01. e. 표시된 계대 수(1차, 2차, 3차 또는 4차) 또는 1일(D)에서 TEC와 공동 배양된 연속 계대된 GFP+ Thy-1.2+ SSC의 GFP 영상과 합쳐진 대표적인 BF 영상. 표시된 계대 수에서의 콜로니 수 및 평균 콜로니 직경의 정량화가 우측에 도시된다. 제시된 데이터는 6개의 독립적인 실험을 대표한다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 3. TEC와 함께 장기간 배양된 SSC는 마우스에서 정자형성 및 생식력을 회복시킨다. a. GFP+SSC와 이식 12주 후 부설판 처리된 마우스로부터의 고환의 영상은 TEC 또는 STO 피더 세포와 장기간 공동-배양되었다. GFP+SSC 콜로니의 정량화를 우측에 나타낸다. 제시된 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 벗어난 것이다. a': 막대 = 2mm, b': 막대 = 4mm, c':막대 = 200μm. *P<0.05. b. GFP+SSC를 이식한지 16주 후에 고환 및 GFP+ 새끼의 영상을 TEC와 함께 장기간에 걸쳐 불임 W/Wv 마우스 내로 공동-배양하였다. 막대 = 2mm. c. GFP+ 새끼(1, 4) 비-GFP+ 새끼(WT), 음성 대조군(N/C), 양성 대조군(GFP, GFP) 및 DNA 주형이 없는 대조군(NTC)에서의 gfp 발현의 PCR. d. 미분화된 정자세포 마커 PLZF 및 Cd49f 뿐만 아니라 정자세포 마커 PNA로 면역염색된 고환 절편의 영상. 고환은 TEC와의 장기간 공동-배양 후 GFP+SSC를 이식한 마우스로부터의 것이었다. 제시된 데이터는 6개의 독립적인 실험 중 하나이다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 4. a. Fgfr1+/+ 또는 Fgpr1-/- 마우스로부터 단리된 TEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 막대 = 1cm. b. PBS(Φ), Fgfr1+/+ TEC 또는 Fgpr1-/- TEC로 이식 12주 후에 부설판 처리된(45mgkg-1) WT 마우스로부터의 고환 영상. 고환 중량을 우측에 나타내었다(n=4). c. EC로부터 fgfr1 결실을 유도하기 위해 타목시펜 처리 후 12주에 대조군(Fgfr1+/+)으로부터의 고환 절편의 H&E 영상 또는 Fgfr1(Fgfr1iΔEC/iΔEC) 마우스의 내피특이적 결실. 적색 별은 빈 정세관을 나타낸다. 막대 = 100 μm. d. 4주 후 표시된 농도의 FGF ± GDNF의 첨가와 함께 TEC와 공동-배양된 GFP+SSC의 대표적인 명시야 및 GFP 영상. 시간에 따른 SSC 콜로니 수 및 크기는 우측에 제시된다. e. 표시된 농도에서 부설판 처리 5주 후에 Fgfr1+/+ 또는 Fgfr1iΔEC/iΔEC 마우스로부터의 고환 절편의 면역형광 영상. 절편을 우측에서 정량화된 상대 GDNF 강도(n = 3)로 GDNF에 대해 면역염색하였다. f. 부설판 처리 후 5주에 Fgfr1+/+(n=3) 또는 Fgfr1iΔEC/iΔEC(n=4) 마우스로부터의 SSC 마커 Lin28 및 Sall4에 대해 면역염색된 고환 절편의 대표적인 영상(10mgkg-1). Sall4+ 또는 Lin28+ 세포는 우측에서 정량화된다. g. 부설판으로 처리하고 PBS(Φ), Fgfr1-/- TEC 또는 Fgpr1+/+ TEC로 이식한 WT 마우스(n=3-4)로부터의 고환 절편의 대표적인 영상. 절편을 H&E로 염색하고, 렉틴-PNA, DDX4, CD49f 및 PLZF에 대해 면역염색하였다. 정자형성 정세관 및 PLZF+ 세포의 정량화가 우측에 있다. 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. 막대 = 50 μm. *P<0.05, ***P<0.001. 제시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 5. TEC에서의 GDNF 발현은 CaN-NFAT 신호전달에 의해 조절된다. a. 줄기 세포 마커 DDX4 및 Oct4 및 DAPI로 면역염색하여 DNA를 염색한 고환 절편의 면역형광 영상. 1주령 또는 4주령 정배수체 또는 Ts65Dn 마우스로부터 고환을 수거하였다. 고출력장(HPF) 당 DAPI에 대한 DDX4+ 및 Oct4+ 세포의 정량화가 우측에 제시된다, ***P<0.0001. 막대 = 50 μm. 2-웨이 ANOVA 시험. b. 사이클로스포린 A(CsA)의 존재 또는 부재 하에 2ngml-1 FGF-2 처리 후 대조군 iPS-유래 EC(C-iPS EC) 및 다운 증후군 iPS(Down syndrome iPS)-유도 EC(DS-IPS-EC)로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 값은 평균±s.e.m, n = 4이다. c. CsA의 존재 또는 부재 하에 2ngml-1 FGF-2 처리 후 뮤린 TEC, LuEC 및 LiEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 값은 평균±s.e.m.이고, n = 4이다. d. 동질유전자 야생형 마우스(Ts65Dn+GFP+ TEC)로부터 단리된 GFP+TEC를 이식한지 5주 후에 연령-매칭된 정배수체, Ts65Dn 또는 Ts65Dn 마우스의 고환으로부터 H&E-염색된 단면. 적색 점선은 정세관의 내강에서 성숙한 정자(황색 화살표)를 둘러싼다. Ts65Dn+GFP+TEC 마우스로부터 고환 절편의 DNA를 염색하기 위한 GFP 및 DAPI를 사용한 면역형광 영상. e. FGF-2 처리 후 또는 미처리 TEC 및 LuEC에서의 EGR-1 단백질 발현, 구성적으로 활성인 NFATc1(caNFATc1)의 발현 또는 빈 벡터 대조군의 웨스턴 블랏 분석. 액틴을 로딩 대조군으로서 프로빙하였다. f. 조건화 배지(CM), 2ng ml-1 FGF-2±CsA로의 처리 후 TEC에서의 EGR1 및 NFATc1의 핵 전좌의 정량화. 값은 평균±s.e.m이다. g. caNFATc1을 발현하는 TEC와 항-NFATC1 mAb의 염색질 면역침전(ChIP) 또는 TEC과 항-EGR-1 항체의 염색질의 면역침전. NFATc1 또는 EGR-1을 면역침전시키고, Egr1 프로모터 상의 NFATC1 공통 부위 또는 Gdnf 프로모터 상의 EGR1 공통 부위에 대해 PCR에 의해 DNA 프로빙하였다. IgG 풀다운을 대조군으로서 사용하였다. h. TEC 중 FGF-2-CaN-NFATc1-EGR-1을 통한 GDNF 조절의 개략도.
도 6. 인간 SSC는 인간 EC와 함께 시험관 내에서 유지되고 확장될 수 있다. a. 지정된 날에 Dil-Ac-LDL(적색) 흡수 후 인간 EC와 함께 또는 인간 EC 없이 배양된 신선하고 동결된 고환 조직으로부터의 인간 고환 세포의 대표적인 명시야 영상. 막대 = 100 μm. b. 인간 고환 세포 및 내피 세포 공동 배양물에서 생성된 SSC 콜로니의 특성화. 콜로니를 인간 SSC 마커, CD49f 및 SSEA4, 막대 = 50 μm로 면역염색하였다. c. EC와 공동-배양에서 증식된 PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)를 부설판 처리된 면역결핍 누드 마우스 내로 이식한 후 2일째(인셋) 및 40일째에 명시야 및 GFP 병합 영상. 적색 화살표는 정세관에서 PKH-표지된 SSC 콜로니를 나타낸다. 이식된 PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)는 미세주입 후 2일째에 정세관의 공동에서 볼 수 있었다. d. PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)로 이식 후 40일에 누드 마우스로부터의 정세관의 단면의 대표적인 면역형광 영상. 절편을 SSEA4(적색)로 면역염색하였다. 막대 = 50 μm. e. 매트리겔 모세관 형성 동안 구성적으로 활성 NFATc1(caNFATc1)을 발현하는 LuEC, LiEC, TEC 및 TEC에 의해 조건화 배지에서 항체 어레이에 의한 분비된 인자의 상대적 발현. f. 지정된 날에 SDF-1, MIP-2, IGFBP-2, GDNF 및 FGF-2를 함유하는 배지에서 피더 없는 배양물에서 SSC 콜로니를 보여주는 인간 고환 세포의 대표적인 명시야 영상, 막대 = 50 μm. g. 지시된 성장 인자를 갖는 피더 없는 배양물에서 시간에 따른 SSC 수의 정량화. h. 인간 TEC와의 공동-배양에서의 SSC 수의 정량화 및 FGF-2 단독 또는 FGF-2 및 GDNF의 지시된 계대에서의 첨가. 값은 평균±s.e.m, n = 3이다. 제시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2. a. 표시된 농도의 FGF-2로 2일 동안 처리한 후 TEC, LuEC 및 LiEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF의 정량화, n=3. 막대 = 100 μm. 데이터는 평균±s.e.m로서 제시된다. b. 씨딩 후 1일째 및 8일째에 STO 세포 또는 TEC + 외인성 GDNF 및 FGF-2와 함께 공동-배양된 GFP+SSC의 2D 배양물의 대표적인 명시야(BF) 및 GFP 영상. STO 또는 TEC와의 공동-배양 8일 후 줄기 세포 수의 정량화 및 평균 콜로니 면적은 우측에 제시되고, n = 3이다. 데이터는 평균±s.e.m이다. 막대 = 100 μm. *P<0.05. c. GFP+ Thy1.2+ SSC와 TEC와의 2D 공동-배양물의 이미지 및 생식세포 마커 DDX4로 면역염색. 삽도: 막대 = 10 μm. d. GFP+ Thy-1.2+ SSC와 TEC 또는 LuEC와의 3D 구상체 공동-배양물을 매트리겔을 사용하여 생성시켰으나, 외인성 GDNF 또는 FGF-2를 사용하지 않았다. GFP+ 구상체 공동-배양물을 15일째에 DDX4(적색), Oct4(백색) 및 DAPI(청색)로 면역요법하였다. 콜로니의 평균 직경 및 총 수의 정량화가 우측에 도시된다; n = 3. 모든 데이터는 평균±s.e.m로서 제시된다. 막대 = 50 μm, *P<0.05. **P<0.01. e. 표시된 계대 수(1차, 2차, 3차 또는 4차) 또는 1일(D)에서 TEC와 공동 배양된 연속 계대된 GFP+ Thy-1.2+ SSC의 GFP 영상과 합쳐진 대표적인 BF 영상. 표시된 계대 수에서의 콜로니 수 및 평균 콜로니 직경의 정량화가 우측에 도시된다. 제시된 데이터는 6개의 독립적인 실험을 대표한다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 3. TEC와 함께 장기간 배양된 SSC는 마우스에서 정자형성 및 생식력을 회복시킨다. a. GFP+SSC와 이식 12주 후 부설판 처리된 마우스로부터의 고환의 영상은 TEC 또는 STO 피더 세포와 장기간 공동-배양되었다. GFP+SSC 콜로니의 정량화를 우측에 나타낸다. 제시된 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 벗어난 것이다. a': 막대 = 2mm, b': 막대 = 4mm, c':막대 = 200μm. *P<0.05. b. GFP+SSC를 이식한지 16주 후에 고환 및 GFP+ 새끼의 영상을 TEC와 함께 장기간에 걸쳐 불임 W/Wv 마우스 내로 공동-배양하였다. 막대 = 2mm. c. GFP+ 새끼(1, 4) 비-GFP+ 새끼(WT), 음성 대조군(N/C), 양성 대조군(GFP, GFP) 및 DNA 주형이 없는 대조군(NTC)에서의 gfp 발현의 PCR. d. 미분화된 정자세포 마커 PLZF 및 Cd49f 뿐만 아니라 정자세포 마커 PNA로 면역염색된 고환 절편의 영상. 고환은 TEC와의 장기간 공동-배양 후 GFP+SSC를 이식한 마우스로부터의 것이었다. 제시된 데이터는 6개의 독립적인 실험 중 하나이다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 4. a. Fgfr1+/+ 또는 Fgpr1-/- 마우스로부터 단리된 TEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 막대 = 1cm. b. PBS(Φ), Fgfr1+/+ TEC 또는 Fgpr1-/- TEC로 이식 12주 후에 부설판 처리된(45mgkg-1) WT 마우스로부터의 고환 영상. 고환 중량을 우측에 나타내었다(n=4). c. EC로부터 fgfr1 결실을 유도하기 위해 타목시펜 처리 후 12주에 대조군(Fgfr1+/+)으로부터의 고환 절편의 H&E 영상 또는 Fgfr1(Fgfr1iΔEC/iΔEC) 마우스의 내피특이적 결실. 적색 별은 빈 정세관을 나타낸다. 막대 = 100 μm. d. 4주 후 표시된 농도의 FGF ± GDNF의 첨가와 함께 TEC와 공동-배양된 GFP+SSC의 대표적인 명시야 및 GFP 영상. 시간에 따른 SSC 콜로니 수 및 크기는 우측에 제시된다. e. 표시된 농도에서 부설판 처리 5주 후에 Fgfr1+/+ 또는 Fgfr1iΔEC/iΔEC 마우스로부터의 고환 절편의 면역형광 영상. 절편을 우측에서 정량화된 상대 GDNF 강도(n = 3)로 GDNF에 대해 면역염색하였다. f. 부설판 처리 후 5주에 Fgfr1+/+(n=3) 또는 Fgfr1iΔEC/iΔEC(n=4) 마우스로부터의 SSC 마커 Lin28 및 Sall4에 대해 면역염색된 고환 절편의 대표적인 영상(10mgkg-1). Sall4+ 또는 Lin28+ 세포는 우측에서 정량화된다. g. 부설판으로 처리하고 PBS(Φ), Fgfr1-/- TEC 또는 Fgpr1+/+ TEC로 이식한 WT 마우스(n=3-4)로부터의 고환 절편의 대표적인 영상. 절편을 H&E로 염색하고, 렉틴-PNA, DDX4, CD49f 및 PLZF에 대해 면역염색하였다. 정자형성 정세관 및 PLZF+ 세포의 정량화가 우측에 있다. 모든 데이터는 평균±s.e.m이다. 막대 = 50 μm. *P<0.05, ***P<0.001. 제시된 데이터는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 2-테일드 언페어드 T-시험
도 5. TEC에서의 GDNF 발현은 CaN-NFAT 신호전달에 의해 조절된다. a. 줄기 세포 마커 DDX4 및 Oct4 및 DAPI로 면역염색하여 DNA를 염색한 고환 절편의 면역형광 영상. 1주령 또는 4주령 정배수체 또는 Ts65Dn 마우스로부터 고환을 수거하였다. 고출력장(HPF) 당 DAPI에 대한 DDX4+ 및 Oct4+ 세포의 정량화가 우측에 제시된다, ***P<0.0001. 막대 = 50 μm. 2-웨이 ANOVA 시험. b. 사이클로스포린 A(CsA)의 존재 또는 부재 하에 2ngml-1 FGF-2 처리 후 대조군 iPS-유래 EC(C-iPS EC) 및 다운 증후군 iPS(Down syndrome iPS)-유도 EC(DS-IPS-EC)로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 값은 평균±s.e.m, n = 4이다. c. CsA의 존재 또는 부재 하에 2ngml-1 FGF-2 처리 후 뮤린 TEC, LuEC 및 LiEC로부터의 조건화 배지에서 ELISA에 의한 GDNF 수준의 정량화. 값은 평균±s.e.m.이고, n = 4이다. d. 동질유전자 야생형 마우스(Ts65Dn+GFP+ TEC)로부터 단리된 GFP+TEC를 이식한지 5주 후에 연령-매칭된 정배수체, Ts65Dn 또는 Ts65Dn 마우스의 고환으로부터 H&E-염색된 단면. 적색 점선은 정세관의 내강에서 성숙한 정자(황색 화살표)를 둘러싼다. Ts65Dn+GFP+TEC 마우스로부터 고환 절편의 DNA를 염색하기 위한 GFP 및 DAPI를 사용한 면역형광 영상. e. FGF-2 처리 후 또는 미처리 TEC 및 LuEC에서의 EGR-1 단백질 발현, 구성적으로 활성인 NFATc1(caNFATc1)의 발현 또는 빈 벡터 대조군의 웨스턴 블랏 분석. 액틴을 로딩 대조군으로서 프로빙하였다. f. 조건화 배지(CM), 2ng ml-1 FGF-2±CsA로의 처리 후 TEC에서의 EGR1 및 NFATc1의 핵 전좌의 정량화. 값은 평균±s.e.m이다. g. caNFATc1을 발현하는 TEC와 항-NFATC1 mAb의 염색질 면역침전(ChIP) 또는 TEC과 항-EGR-1 항체의 염색질의 면역침전. NFATc1 또는 EGR-1을 면역침전시키고, Egr1 프로모터 상의 NFATC1 공통 부위 또는 Gdnf 프로모터 상의 EGR1 공통 부위에 대해 PCR에 의해 DNA 프로빙하였다. IgG 풀다운을 대조군으로서 사용하였다. h. TEC 중 FGF-2-CaN-NFATc1-EGR-1을 통한 GDNF 조절의 개략도.
도 6. 인간 SSC는 인간 EC와 함께 시험관 내에서 유지되고 확장될 수 있다. a. 지정된 날에 Dil-Ac-LDL(적색) 흡수 후 인간 EC와 함께 또는 인간 EC 없이 배양된 신선하고 동결된 고환 조직으로부터의 인간 고환 세포의 대표적인 명시야 영상. 막대 = 100 μm. b. 인간 고환 세포 및 내피 세포 공동 배양물에서 생성된 SSC 콜로니의 특성화. 콜로니를 인간 SSC 마커, CD49f 및 SSEA4, 막대 = 50 μm로 면역염색하였다. c. EC와 공동-배양에서 증식된 PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)를 부설판 처리된 면역결핍 누드 마우스 내로 이식한 후 2일째(인셋) 및 40일째에 명시야 및 GFP 병합 영상. 적색 화살표는 정세관에서 PKH-표지된 SSC 콜로니를 나타낸다. 이식된 PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)는 미세주입 후 2일째에 정세관의 공동에서 볼 수 있었다. d. PKH-표지된 인간 SSC 콜로니(녹색)로 이식 후 40일에 누드 마우스로부터의 정세관의 단면의 대표적인 면역형광 영상. 절편을 SSEA4(적색)로 면역염색하였다. 막대 = 50 μm. e. 매트리겔 모세관 형성 동안 구성적으로 활성 NFATc1(caNFATc1)을 발현하는 LuEC, LiEC, TEC 및 TEC에 의해 조건화 배지에서 항체 어레이에 의한 분비된 인자의 상대적 발현. f. 지정된 날에 SDF-1, MIP-2, IGFBP-2, GDNF 및 FGF-2를 함유하는 배지에서 피더 없는 배양물에서 SSC 콜로니를 보여주는 인간 고환 세포의 대표적인 명시야 영상, 막대 = 50 μm. g. 지시된 성장 인자를 갖는 피더 없는 배양물에서 시간에 따른 SSC 수의 정량화. h. 인간 TEC와의 공동-배양에서의 SSC 수의 정량화 및 FGF-2 단독 또는 FGF-2 및 GDNF의 지시된 계대에서의 첨가. 값은 평균±s.e.m, n = 3이다. 제시된 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
골수 이식 전에 컨디셔닝 레지멘으로서 사용되는 화학치료제인 부설판은 무정자증 및 불임을 야기하는 것으로 알려져 있다. SSC 및 분화 정조세포 둘 다는 SSC 고갈 정도에 따라 불임의 지속기간으로 단일 용량의 부설판으로 처리된 마우스에서 사멸된다. 더 높은 부설판 용량에서, SSC는 분화하는 정조세포에 비해 우선적으로 제거되며, 정자형성이 회복될 때까지의 긴 지연은 거의 남아 있는 SSC의 자가 재생에 필요한 대부분의 SSC 적소 제한 인자의 파괴 때문일 것이다. 이전의 연구는 GDNF가 SSC 자가 재생에 중요한 것으로 확인하였고, 세르톨리 세포 및 PTM 세포가 고환에서 GDNF의 세포 공급원이고 SSC 적소를 포함할 수 있음을 입증하였다. 고환 절편에서, GDNF에 대한 면역염색은 TEC와 그리고 세르톨리 및 PTM 세포 주위의 정세관 전반에 걸쳐 공동-국재화를 나타낸다(보충 도 1a). 그러나, GDNF는 분비된 인자이기 때문에 그의 국재화는 그의 세포 공급원을 나타내지 않는다. 고환에서의 GDNF 조절은 이해되지 않지만, 그의 발현은 FGF-2에 부분적으로 의존한다. FGF-2는 세르톨리 세포에 의한 GDNF 생성을 유도함으로써 SSC 유지를 지지하는 것으로 제안되었다. 고환에서 GDNF 공급원을 확인하기 위해, 세르톨리 및 TEC 세포 중 Gdnf mRNA를 정량화하고, FGF-2 처리 전 및 후에 TEC 또는 세르톨리 세포에 의해 조건화 배지에서 GDRF 수준을 측정한다(도 1a). 고환에서 세르톨리 세포보다 유의하게 더 적은 TEC가 존재하기 때문에, 이들 데이터는, TEC가 세르톨리 세포에 비해 세포당 더 많은 GDNF를 발현한다는 것을 나타내며, 이는 TEC가 고환에서의 주요 GDRF-생성 집단이라는 개념과 일치한다. GDNF는 SSC 및 세르톨리의 장기간 배양에 필요하고 PTM 세포가 GDNF를 생산하므로, 세르톨리 세포 및 PTM이 배양에서 Thy1+SSC를 유지할 수 있는지 여부를 조사한다. 고환 세포(세르톨리 및 PTM 집단을 함유함)에 CD31+ TEC를 고갈시키고, GFP+Thy1.2+SSC와 공동-배양하였다. 동시에, GFP+Thy1+SSC를 또한 CD31+ TEC와 함께 공동-배양하였다. 3주 후, SSC 콜로니는 세르톨리 및 PTM 세포가 존재하는 고환 세포 공동 배양물로부터 부재하였다. 대조적으로, 다수의 GFP+ Thy1.2+ SSC 콜로니가 TEC 공동-배양에서 관찰되었다(도 1b).
연구는 세르톨리 및 라이디히(Leydig) 세포가 부설판에 의해 최소로 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 시험관 내 및 생체내 TEC에 대한 부설판 처리의 직접적인 영향을 조사하기 위해, 배양물 중의 TEC를 부설판으로 처리하였고, 감소된 증식 및 증가된 세포자멸사를 나타내는 반면, 부설판 처리된 마우스로부터의 고환 절편을 EC 마커 CD31로 면역염색하여 미세혈관 밀도의 유의한 감소를 나타내었다(도 1c). 부설판 처리 후 감소된 TEC 집단은 부설판의 노출 후 고환 GDNF 발현의 전반적인 감소와 일치한다(도 1d).
부설판 노출 후, 정자형성의 회복은 약 30-36주가 소요되며, 이는 잔류 SSC의 느린 증식 및 확장의 반영이다. 건강한 TEC의 도입이 부설판 후 SCC 재구성을 가속화할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 동질유전자 야생형 1차 GFP+ TEC를 부설판 투여 5주 후에 마우스의 고환 내로 이식하였다. 정자형성을 재구성하는데 있어서 TEC에 대한 특정 요건이 존재하는지 또는 임의의 기관 EC가 충분할지 여부를 확인하기 위해, TEC 또는 폐 내피 세포(LuEC)를 단리하고, 부설판 처리된 고환 내로 이식하였다. 이식된 GFP+ TEC 및 LuEC의 EC 동일성을 형태, EC 마커에 의한 면역염색 및 튜브 형성 검정에 의해 기능적으로 확인하였다. 이식 후 7주까지, TEC를 이식한 부설판 처리된 마우스로부터 수거된 고환은 모의 주사된 마우스와 크기가 유사하였다(도 1e). GFP+ 채널은 GFP+ TEC로 이식한 후 전체 고환에서 명백하였다(도 1e). 대조적으로, PBS로 주사되거나 LuEC로 재구성된 부설판 처리된 마우스에서의 고환은 상당히 더 작게 유지되었다(도 1e). 이식된 GFP+TEC와 함께 그리고 그것이 없는 부설판 처리된 마우스로부터의 고환 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, GFP 발현, 생식계 줄기 세포 마커(PLZF) 및 생식계 세포 마커(DDX4)에 대해 검사하였다(도 1f). PLZF+ 및 DDX4+ 세포의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 미처리 마우스에서의 것에 필적하는, TEC로 특이적으로 이식된 고환에서 정자형성의 유의한 회복이 관찰되었다(도 1f). 이는 또한 정세관에서 TEC 증식, 미세혈관 밀도 및 길이의 상당한 증가 및 생식세포의 증가된 증식을 발견하였다. 특히, GFP+ 세포는 CD31을 공동-발현하였고, 이는 이식된 세포의 EC 동일성을 확인하고, 이식된 TEC의 내인성 고환 혈관계 내로의 통합을 입증한다. 이식된 이식된 GFP+CD31+ TEC의 기능성은 이소렉틴 B4 흡수에 의해 확인되었다. 놀랍게도, LuEC가 이식된 부설판 처리된 마우스로부터의 고환은 정자형성의 명목상 회복을 나타내었다(도 1f).
본 발명의 한 구현예에 따른 데이터는 TEC가 부설판 처리 후 정자형성의 회복을 촉진한다는 것을 시사하기 때문에, 부설판 주사 후 3, 6 및 9일에 부설판 처리 직후 마우스의 고환 내로 동질유전자 야생형 TEC를 주사함으로써 TEC는 부설판-매개 세포 사멸로부터 SSC 및 정조세포를 보호할 수 있는지의 여부를 조사하면 부설판 처리 후 15주에 정자생성의 유의한 보호를 입증하였다. 비히클 주사된 마우스는 검출가능한 분화 정자를 갖지 않았고, 매우 적은 정세관을 갖는 반면, TEC 주사된 마우스는 아크로솜 특이적 마커인 렉틴-땅콩 응집소에 의해 검출된 바와 같이 정세관의 내강에서 분화 정자 및 성숙 정자를 모두 가졌다35(보충 도 5a, b).
LuEC는 부설판 처리된 마우스에서 정자형성을 회복시킬 수 없었기 때문에, GDNF 생산을 TEC, LUEC 및 간 EC(LiEC)에 의해 비교하였다. 흥미롭게도, FGF-2 처리는 LuEC 또는 LiEC가 아닌 TEC에서만 유의한 수준의 GDNF를 유도하였으며(도 2a), 이는 EC가 기관-특이적 유전자 발현 프로파일을 나타낸다는 것을 보여주는 연구와 일치한다. 현재, 단리된 SSC의 시험관 내 배양물은 피더 세포 + GDNF 및 여러 다른 성장 인자로서 STO 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포를 이용한다. 본 구현예에 따른 데이터는 고환 줄기 세포 적소 내의 EC가 SSC 증식을 촉진하는 데 필요한 인자인 GDNF를 생산할 수 있음을 시사한다. SSC 적소에서 TEC의 중요한 지지 역할을 확인하기 위해, 시험관 내 유지된 SSC 풍부 배양물의 효능을 STO 세포 또는 TEC와 비교한다. SSC 풍부 배양물을 TEC 또는 STO 세포로 분주하고 GDNF 및 FGF-2를 무혈청 배양 배지에 첨가한 후, SSC 콜로니 수 및 크기의 형성을 모니터링하였다. GFP+SSC 풍부 배양물과 TEC와의 공동 배양물은 STO 공동 배양물과 비교하여 콜로니의 수 및 크기 둘 다의 유의한 증가를 유도하였다(도 2b). 5일 후, 피더 세포의 부재 하에 SSC 풍부 배양물은 생존하지 않았다.
TEC가 추가의 GDNF의 부재 하에 SSC 자가 재생 및 유지를 지지할 수 있는지를 결정하기 위해, Thy-1.2+ SSC 풍부화 TEC 공동-배양물의 3D 콜로니 형성 능력을 검정하였는데, 이는 효율적인 3D 콜로니 형성이 줄기 세포의 특징이기 때문이다. GFP+Thy-1.2+ 세포를 외인성 GDNF의 부재 하에 매트리겔 단독으로 또는 1차 마우스 TEC와 함께 분주하였다. TEC 및 매트리겔과 공동-배양된 GFP+Thy-1.2+ 세포는 위상차 현미경검사에 의해 관찰된 바와 같이 2주 후에 전형적인 SSC 형태를 갖는 콜로니를 형성하였지만, TEC 또는 GDNF의 부재 하에 분주된 SSC 풍부 배양물은 7일 이내에 사망하였다(도). 이들 콜로니의 줄기 세포 동일성은 생식 줄기 세포 마커 DDX4의 발현에 의해 확인되었다(도 2c). TEC 및 매트리겔에 대한 과량의 GFP+Thy-1.2+ 세포를 이들 배양물과 함께 공동-배양하였으며, 이는 분주 후 2주만큼 빨리 상당한 수의 큰 구상체 콜로니를 입증하였다. 생식 줄기 세포 마커 DDX4 및 Oct4의 발현을 위해 콜로니를 면역염색하였다(도 2d). 특히, GFP+Thy-1.2+ SSC 풍부 세포와 LuEC와의 공동-배양에 의해 생성된 구상체 콜로니는 TEC로 형성된 콜로니보다 직경이 유의하게 더 작고 수가 더 적었다(도 2d). SSC 풍부 집단 및 TEC를 갖는 3D 콜로니를 외인성 GDNF의 부재 하에 배양물에서 3개월 초과 동안 유지하였으며, 이 시간에 걸쳐 콜로니가 계속 증식하였으며, 이는 TEC가 SSC를 시험관 내에서 유지하기에 충분할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이들 추정 GFP+SSC/TEC 콜로니를 해리시키고, 콜로니 형성 효율의 측정가능한 감소 없이 TEC의 존재 하에 여러 번 연속 계대하였다(도 2e).
뮤린 SSC가 STO 피더 세포 상에서 확장 및 자가 재생할 수 있기 때문에, 확장된 뮤린 SRC의 기능을 TEC 대 STO 세포에서 비교하였다. 먼저, 배양된 SSC에 의한 콜로니 형성을, TEC 또는 STO 피더 세포와 함께 공동-배양된 동일한 수의GFP+ SSC를 부설판 처리된 마우스의 고환 내로 이식함으로써 생체내 검사하였다. 이식 12주 후에, 수령체 마우스 고환을 TEC 또는 STO 세포와 함께 공동-배양된 GFP+ SSC의 콜로니 형성에 대해 분석하였다(도 3a). TEC와 함께 공동-배양된 SSC가 이식된 고환은 STO와 함께 동시-배양한 SSC를 이식한 고환보다 상당히 더 많은 콜로니를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 3a).
SSC 기능의 궁극적인 확인은 SSC 이식 후 새끼에게 출생을 주는 불임 마우스의 능력이다. 장기간 TEC와 공동-배양된 GFP+SSC를 생식세포가 결여되고 불임성인 W/Wv 마우스에 이식하였다. 이식 후 16주째에, 고환의 GFP+SSC 콜로니화 뿐만 아니라, PCR에 의해 확인된 새끼에서의 Gfp 발현을 갖는 GFP+ 새끼의 출생(도 3b)이 관찰되었다(도 3c). 장기간 배양 후 SSC가 이식된 마우스로부터의 고환 절편을 미분화 정조세포 마커 PLZF 및 CD49f 뿐만 아니라 정자세포 마커 PNA로 면역염색하였고, 이는 이식된 GFP+SSC의 기능적 정자형성을 추가로 입증하였다(도 3d).
고환에서의 GDNF 조절 메카니즘은 잘 이해되지 않지만, 그의 발현은 FGF-2에 적어도 부분적으로 의존하는 것으로 공지되어 있다31. FGF-2는 고환 내 세포에 의한 GDNF 생성을 유도함으로써 SSC 유지를 촉진하는 것으로 제안되었다. FGF-2 처리 후 1차 TEC에 의해 조건화 배지에서의 GDNF 수준의 정량화는 TEC가 GDNF를 생산한다는 것을 나타낸다. 한 구현예에 따른 데이터는, FGF-2 처리가 LuEC 또는 LiEC가 아닌 TEC에서만 유의한 수준의 GDNF를 유도하였음을 나타내며, 이는 EC가 기관-특이적 유전자 발현 프로파일을 나타내는 연구와 일치한다.
EC의 FGF-2 활성화는 주로 FGFR1에 대한 결합을 통해 발생한다. GDNF 생산을 위한 TEC 상의 FGFR1 발현에 대한 요건을 결정하기 위해, TEC를 Fgfr1 iΔEC / iΔEC 마우스로 지칭되는, EC에서의 유도성 Fgf1 결실의 마우스 모델로부터 단리하였다. Fgfr1 iΔEC / iΔEC TEC를 FGF2로 처리한 후, 배지에서 GDNF 수준을 측정하였다. Fgfr1 -/- TEC는 Fgfr1 +/+ 야생형 TEC와 비교하여 FGF2 처리 후 GDNF 발현의 증가를 나타내지 않았다(도 4a). 생체내 정자형성에 대한 TEC에서의 Fgfr1 결실의 효과를 조사하기 위해, 야생형 수컷 마우스를 부설판으로 처리하고, 5주 후에 Fgfr1 -/- TECs, Fgfr1 +/+ TEC 또는 PBS 단독으로 이식하였다. Fgfr1 -/- TEC를 이식한지 12주 후에 마우스로부터 수거된 고환은 PBS만을 주사한 고환과 크기 및 체중이 유사하였고, Fgfr1 +/+ TEC가 이식된 고환보다 크기 및 중량이 유의하게 더 작았다(도 4b). 시험 절편을 H&E로 염색하고, 발달하는 정자가 결여된 상당수의 정세관을 입증하였다(도 4c). Fgfr1 iΔEC / iΔEC 마우스로부터의 고환에서 PLZF+ 세포 및 EC의 유의한 감소 뿐만 아니라 증식하는 생식세포의 감소가 관찰된다. FGF-2가 FGFR1에 결합하는 것을 암시하는 본 데이터는 TEC에서의 GDNF 발현의 주요 조절물질이므로, 본 발명자들은 Thy1.2+GFP+ 세포를 TEC와 공동-배양하고, FGF-2를 단독으로 또는 GDRF와 함께 첨가하였다(도 4d). FGF2 및 GDNF가 보충된 공동-배양물에서 콜로니의 수 및 크기 둘 다에 의해 정량화된 바와 같이 콜로니 형성이 강건한 반면, 성장 배지에 FGF2 단독의 첨가는 아마도 TEC-유래 GDNF의 존재로 인해 SSC 유지 및 확장에 충분하였다(도 4d).
한 구현예에 따른 종합 데이터는 부설판-매개 손상 후 SSC 자가 재생에 영향을 미치는 Fgfr1의 내피 특이적 결실을 갖는 마우스에서 GDNF 생산이 손상되어야 함을 시사한다. 야생형 및 Fgfr1 iΔEC / iΔEC 마우스를 부설판으로 처리하고, 4주 후 저용량 부설판 처리 후에도 Fgf1i Δ EC / iβEC 마우스의 고환에서 유의하게 감소된 발현을 나타내는 GDNF에 대해 고환 절편을 면역염색하였다(도 4e). 저-용량 부설판 처리 후 잔류 SSC의 확장은 GDNF를 필요로 하기 때문에, 부설판을 처리한지 4주 후에, 본 발명자들은 SSC 마커인 Lin28 및 Sall4에 대한 면역염색에 의해 Fgfr1 iΔEC/iΔEC 마우스로부터의 고환 절편에서 SSC의 존재를 조사하였다. 야생형 마우스와는 대조적으로, Fgfr1 iΔEC / iΔEC 마우스로부터의 고환 절편에서 Lin28+ 및 Sall4 + 세포 둘 다가 거의 완전히 부재하였다(도 4f). FGFR1 발현이 GDNF 생산에 필요한 경우, Fgfr1 -/- TEC 이식은 부설판 처리된 마우스에서 정자형성을 복원하지 않아야 한다. 실제로, Fgfr1 -널(null) TEC를 이식한 후 부설판 처리된 마우스로부터 수거된 고환의 H&E 절편은 Fgpr1 야생형 TEC가 이식된 마우스와 비교하여 최소의 정자형성 및 소수의 DDX4 또는 PLZF 양성 세포를 나타내었다(도 4g). 정자 PNA 및 CD49f를 분화시키는 마커에 의한 면역염색은 Fgfr1 -/- TEC가 부설판 처리된 마우스에서 강건한 정자형성을 재확립할 수 없음을 추가로 확인하였다(도 4g).
본 데이터는 TEC에 의한 GDNF 생산이 FGFR1에 대한 FGF2 결합에 의해 유도된다는 것을 나타낸다. FGF2 하류의 가장 흔한 신호전달 경로는 MAP 키나제 경로이지만, 다른 경로는 칼슘 활성화된 CaN-NFAT 축을 포함하는 FGF2-FGFR1 신호전달과 연관되어 있다. 내피 활성화는 부분적으로 CaN-NFAT 신호전달의 21번 염색체 인코딩된 억제제로 인해 다운 증후군(DS)에서 손상되는 것으로 이전에 밝혀졌다. 다른 연구는 DS를 갖는 남성이 유의하게 감소된 정자 수를 갖고, 아불임 또는 불임 중 하나라는 것을 보여준다. 분절 인간 삼염색체성을 갖는 Ts65Dn DS 마우스 모델은 남성 불임을 포함하는 DS의 많은 특징을 갖는다. 정세관 크기의 전반적인 감소와 함께 정세관 전체에 걸쳐 및 내강에서 정자가 발달하는 것의 거의 완전한 결여가 이들 마우스에서 8주까지 관찰된다(보충 도 8a). SSC 집단을 확인하기 위해, SSC를 표지하고 정자를 분화시키는 생식세포 마커 DDX4, 및 OCT4 및 PLZF, 원시배아세포 마커, 및 증식 마커 Ki67에 대해 고환 절편을 면역염색하였다. Ts65Dn 고환은 정배수체 한배새끼와 비교하여 시간이 지남에 따라 감소된 DDX4, PZLF 및 OCT4-양성 세포를 나타내었다(도 5a 및 보충 도 8b). 세르톨리 세포의 마커인 Sox9의 조사는 정배수체 대조군에 비해 Ts65Dn 고환에서 이 집단에서 중간 정도의 감소를 나타내었다.
TEC 및 DS와 보다 다루기 쉬운 시스템의 연관된 정자형성 결함의 역할을 추가로 조사하기 위해, 삼염색체성 21(DS)으로부터의 인간 유도된 다분화능 줄기 세포(iPS) 및 EC를 생성하기 위한 대조군 인간 대상체를 사용하였다. 삼염색체성 21은 핵형에 의해 확인되었고, EC 동일성은 VEGFR2, CD31, VE-카드헤린 및 폰 빌레브란트 인자의 EC 마커로의 면역염색에 의해 그리고 모세관 형성 및 아세틸화 LDL 흡수에 의해 기능적으로 검증되었다. DS-iPS EC로부터 유래된 EC는 매트리겔 상의 튜브-유사 구조로 조직화되지 않았고, VEGF에 반응하여 대조군(C) iPS-유래 EC와 비교하여 결함있는 증식 및 이동을 나타내었다(보충 도 9b 내지 d 및 보충 Movie a,b). C- 및 DS iPS-유래 EC의 분비체의 분석은 GDNF 발현의 급격한 감소를 확인하였다(보충 도 9e). 이전에, DS의 Ts65Dn 마우스 모델로부터 유래된 EC에서의 결함은 CaN-NFAT 신호전달의 약화 때문인 것으로 나타났다. C- 및 DS iPS-EC 둘 다에 의한 GDNF 생산에 대한 FGF2의 효과를 조사하기 위해, FGF2를 갖는 군 및 측정된 GDNF 생산을 갖는 군 둘 다를 조건화 배지에서 처리하였다. C-iPS EC에서, FGF2는 특이적 CaN 억제제 사이클로스포린 A(CsA)의 존재 하에 유의하게 폐지된 강건한 GDNF 생산을 자극하였다. 그러나, DS-iPS EC에서, FGF2에 의한 GDNF의 비교적 보통의 유도는 CsA에 의해 영향을 받지 않았다(도 5b). FGF2 처리는 또한 특히 마우스 TEC로부터의 1차 EC에서 CaN-의존성 방식으로 그리고 마우스 LuEC 및 LiEC에서 훨씬 더 적은 정도로 유의한 GDNF 생성을 자극하였다(도 5c). SSC 적소에서 TEC-유래 GDNF의 중요성을 추가로 입증하기 위해, 야생형 GFP+ TEC를 Ts65Dn DS 마우스의 고환 내로 이식하고 정자형성의 회복을 나타내었다(도 5d).
성상세포에서, FGF-2는 Gdnf 프로모터에 결합하는 전사 인자인 조기 성장 반응 단백질 1(EGR-1)의 발현을 유도함으로써 GDNF 생성을 조절한다. Egr -1 및 Nfat 패밀리 구성원은 상승작용하여 다수의 조직에서 유전자 발현을 활성화시킨다. FGFR1에 결합하는 FGF2는 CaN을 활성화시키고, 이어서 NFAT와 EGR-1 사이의 협동으로 TEC에 의한 GDNF 발현을 촉진할 수 있다. 웨스턴 블랏 분석은 FGF-2 처리 후 또는 TEC에 의한 GDNF 생성을 또한 증가시키는 구성적으로 활성인 핵 Nfatc1 구축물(caNfatC1)(도 5e)의 발현시 LuEC가 아닌 TEC에서 특이적으로 증가된 EGR-1 발현을 확인하였다. 유사하게, 약화된 칼시뉴린 신호전달을 갖는 DS-iPS EC에서, FGF 처리 후 EGR-1 발현은 최소화되었지만, caNFATc1 구축물의 발현은 EGR-1을 상향조절하였다. 이전의 연구는 Nfatc1이 CaN-의존성 방식으로 Egr -1을 유도하여 EGR-1 상향조절이 NFATc1 활성화에 의존적인지 여부를 결정하기 위해, CsA의 존재 및 부재 하에 FGF2 처리 후 TEC에서 NFATC1 및 EGR-1의 세포하 국재화를 평가하였다는 것을 보여주었다(도 5f). FGF2의 첨가 후 NFATc1 및 EGR1 둘 다의 핵 국재화가 증가한 반면, CsA는 FGF2-유도된 EGR-1 핵 국재를 억제하였으며, 이는 CaN-의존성을 나타낸다(도 5f). 추가로, NFATc1 ChIP는 caNfatc1이 TEC에서 Egr1 프로모터에 결합하지만 Gdnf 프로모터에는 결합하지 않는다는 것을 보여주는 반면, EGR-1 ChIP가 TEC에서의 GdNf 프로모터에 대한 직접적인 EGR-1 결합을 나타낸다(도 5g). 종합하면, 본 데이터는 TEC 상의 FGFR1에 결합하는 FGF-2가 TEC에 의한 GDNF 생성을 조절하는 CaN-NFAT-EGR1-GDNF 경로를 활성화시키는 모델을 지지한다(도 5h).
수많은 연구는 뮤린 SSC를 장기간 배양하고, 이들을 부설판 처리된 불임 수컷 마우스 내로 이식하였다. 그러나, 인간 SSC의 장기간 배양을 입증하는 연구는 제한되어 있고 용이하게 재현되지 않았다. EC에서 확장된 인간 SSC가 그의 줄기-유사 특성을 보유하는지 여부를 결정하기 위해, 고환 생검을 치료 개시 전에 암으로 진단된 사춘기 전 소년으로부터 수득하였다. 이들 생검의 매우 작은 샘플 크기로 인해, 고환 세포의 전체 샘플을 인간 EC의 단층 상에 분주하여 선택을 통한 SSC의 임의의 손실을 최소화하였다. 이들 미세 고환 생검으로부터 TEC를 단리하는 것이 어렵기 때문에, Dil-Ac-LDL 흡수에 의해 표지된 인간 iPS-유래 EC를 사용하였다. 신선하고 이전에 동결된 고환 생검 둘 다를 사용하여, iPS-EC(도 6a)와 함께 또는 EC 없이 배양된 시간에 따른 시험관 내 추정 SSC 콜로니 형성을 조사하였다. 30일까지, iPS-EC와 함께 공동 배양된 신선하고 동결된 고환 세포 둘 모두는 배양물 전체에 걸쳐 고전적인 SSC-유사 콜로니를 나타낸 반면, EC의 부재 하에 분주되었지만 GDNF 및 FGF2로 보충된 신선하게 단리된 고환 생검은 2주 후에 사망하였다. EC를 갖는 새로 단리된 및 이전에 동결된 SSC-유사 세포 둘 다는 150일째에 관찰된 배양물 전체에 걸쳐 수많은 SSC 유사 콜로니로 시간이 지남에 따라 계속 팽창하였다(도 6a). 본 발명자들의 고환 세포/EC 공동-배양으로부터의 콜로니에서의 SSC의 존재를 입증하기 위해, 인간 SSC 마커의 발현을 조사하였다. SSEA4 및 CD49f/ITGA6에 대해 절편을 면역염색하였고, 마커는 주로 SSC에서 발현되었다. 면역형광 분석은 인간 고환 세포/EC 공동-배양물로부터의 콜로니가 SSEA4 및 CD49f에 대해 양성임을 보여주며(도 6b), 이는 이들 콜로니 내의 SSC의 존재를 암시한다. 장기간 EC 공동-배양 동안 확장된 인간 SSC가 그의 줄기 세포 동일성을 보유하는 것을 보장하기 위해, SSC-유사 콜로니를 시험관 내 배양 150일 후에 해리시키고, 이를 형광 염료 PKH67로 표지하였다. PKH-표지된 추정 SSC를 부설판 처리된 누드 마우스에 이식하였다. 표지된 인간 SSC의 이식 후 고환을 검사하였다(도 6c). 이식 2일 후, PKH67+ 세포는 정세관에서 볼 수 있었다(도 6c). 이식 후 40일까지, 정세관에서 PKH67+ 콜로니의 형성이 명백하였다(도 6c). 고환은 SSEA4, SSC 마커에 대해 분리, 절편화 및 면역염색되었고, 이는 PKH67+ 콜로니 내의 SSC의 존재를 나타낸다(도 6d).
TEC는 SSC 자가 재생을 지지할 수 있지만, 다른 기관 내피는 그렇지 않다. 따라서, SSC 유지에 중요할 수 있는 TEC 활성화 동안 생성된 독특한 인자를 확인하기 위해 튜브 형성 검정 동안 TEC의 분비를 LuEC 및 LiEC의 분비와 비교하였다. GDNF 이외에, TEC에서 특이적으로 상향조절된 3종의 다른 인자가 확인되었고, 또한 CaN-의존성을 암시하는 caNFATc1을 발현하는 TEC에서도 상향조절되었다(도 6e). 이들 인자인 IGFBP-2, SDF-1 및 MIP-2는 줄기 세포 생물학에 연루되어 있어, 피더 세포의 부재 하에 시험관 내에서 GDNF 및 FGF2와 함께 인간 고환 세포 또는 마우스 고환 세포에 첨가하였다. 15일째까지, 전형적인 형태를 갖는 SSC 콜로니가 본 발명자들의 피더 없는 배양물에서 관찰되었다. 25일째까지, 배양 중 85일 후에도 유지된 강건한 SSC 콜로니 형성이 관찰되었다(도 6f). 피더 없는 배양물에서 SSC 수의 정량화는 GDNF, FGF2, IGFB2, SDF-1 및 MIP-2의 첨가가 GDNF 및 FGF2만을 갖는 배양물과 비교하여 9주에 걸쳐 SSC 수의 유의한 증가를 지지하였다는 것을 나타낸다(도 6g). 피더 없는 조건하에서 SSC를 배양하고 확장시키는 능력은 무암 진단 후 생식력을 회복시키기 위해 암 치료 전에 사춘기 전 소년으로부터 얻은 고환 생검으로부터의 SSC의 확장을 허용함으로써 중요한 임상적 의미를 갖는다. 인간 SSC가 인간 TEC 상에서 계속 성장한다는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 전체 고환 생검 샘플을 인간 TEc 상에 분주하고, 외인성 FGF2 단독 또는 FGF2와 GDNF의 첨가 사이에 성장 속도에 차이가 없는 다중 계대에 걸쳐 인간 TEC와 함께 배양된 SSC의 계속된 확장을 나타내었다(도 6h). 종합하면, 본 데이터는 인간 TEC가 시험관 내에서 인간 SSC의 자가 재생 및 확장을 지지하기에 필수적이고 충분한 GDNF 및 다른 인자의 중요한 공급원이라는 가설을 지지한다. 이는 정자형성 및 생식력을 회복시키기 위해 이후의 이식을 위해 사춘기 전 소년으로부터 수득된 고환 생검에 존재하는 매우 적은 수의 인간 SSC를 확장시키는 실현가능한 접근법을 제공한다.
대부분의 기관에서 세포의 자가 재생 집단인 줄기 세포는 그의 유지에 필요한 인자를 제공하기 위해 이종형 지지 세포를 필요로 하는 특수 조직 적소에서 유지된다는 것이 오랫동안 확립되어 왔다. 그러나, 고환을 비롯한 대부분의 기관에 대해, 줄기 세포 자가 재생에 필요한 보조 세포는 아직 결정적으로 확인되지 않았다. 종합하면, 데이터는 SSC 적소 생산 GDNF 및 SSC 자가 재생에 필요한 다른 인자에서 고환 내피를 주요 집단으로서 암시한다. 여기서, TEC는 장기간 배양에서 추정 SSC를 유지 및 확장시켜, 화학요법-유도된 불임 후 마우스에서 정자형성을 회복시킬 수 있다. TEC와 함께 장기간 배양된 SSC는 이식된 GFP+SSC 후 살아있는 새끼의 출생에 의해 입증된 바와 같이 기능적이었다. 추가로, TEC에 의해 특이적으로 생산되었지만 다른 기관 내피는 생산되지 않은 5개의 성장 인자는 피더 없는 배양물에서 SSC-유사 콜로니를 유지하기에 충분하였다. 이는 또한 주요 경로로서 FGFR1-CaN-NFAT 신호전달을 입증함으로써 TEC에서 GDNF 발현을 조절하는 메카니즘에 대한 통찰을 제공한다.
수년 동안, 신체 전체에 걸쳐 내피가 기능적으로 중복되는 것으로 추정되었다. 그러나, 보다 최근에 연구는 상이한 기관 환경에서의 EC가 독특한 분비체에 의해 부분적으로 조절되는 기관 특이적 기능과는 구별되는 특성 및 역할을 갖는다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 간 내피는 간세포 성장 인자의 생성에 의해 간 재생의 기저를 이루는 것으로 나타난 반면, 폐 내피는 MMP14의 발현으로 인해 손상 후 폐 재생에 필요하다8 , 9. 상이한 기관으로부터의 EC는 상호교환가능하지 않음이 점점 명백해지고 있다. 데이터는 다른 조직으로부터의 EC로 대체될 수 없는 생식세포 적소에서 TEC에 대한 특화된 역할을 명백하게 나타낸다. Ts65Dn DS 마우스의 고환 내로 야생형 TEC를 이식한 후 DS 마우스에서 관찰된 정자형성의 회복에 의해 SSC 적소에서 TEC의 유의성의 추가 확인을 관찰하였다. 본 데이터는 NFAT-의존성 표적, GDNF의 전사활성화를 방지하는 이 경로의 염색체 21 인코딩된 억제제에 의한 CaN-NFAT 경로의 약화로 인한 DS에서의 TEC 활성화에서의 결함을 나타낸다.
GDNF는 SSC 자가 재생에서 가장 중요한 단일 인자로서 확인되었는데, 그 이유는 그의 손실이 형질전환 마우스 모델에서 손상된 정자형성 및 그의 과다발현이 미분화된 정조세포의 확장을 초래하기 때문이다. 고환 내의 다른 세포, 예컨대 세르톨리 세포 및 PTM 세포는 또한 GDNF를 생산하는 것으로 생각된다. 그러나, 데이터는 부설판-유도된 SSC 손실 후 고환 내로 TEC의 이식이 주 내에 정자형성을 복구하는 동안 생존한 SSC의 느린 확장으로 인해 뮤린 정자생성의 복구가 부설판의 처리 후 6개월을 필요로 한다는 것을 보여준다. 또한, 부설판 처리 직후 마우스에 야생형 TEC를 주사하면 SSC 파괴를 보호하기에 충분하며, 이는 TEC에 대한 생존촉진 기능을 나타낸다. 세르톨리 및 PTM 세포로부터의 GDNF의 기여가 또한 SSC 유지에 필수적일 가능성이 있지만, 고환에서 이들 두 집단으로부터 생성된 GDRF의 수준은 충분하지 않을 수 있다. FGF2가 또한 SSC의 유지에 필요하기 때문에, FGF2는 TEC를 활성화시켜 GDNF 및 SSC 자가 재생 및/또는 유지를 위한 다른 인자를 생성할 수 있다. SSC 유지를 위해서는 GDNF의 임계 역치가 필요하지만, SSC 자가 재생에 충분한 GDRF를 생산하는데 필요한 TEC, 세르톨리 세포 및 PTM을 사용하는 경우 모두 덜 중요할 수 있다.
뮤린 SSC가 배양에서 확장될 수 있지만, 인간 SSC를 장기간 재현가능하게 배양하는 능력은 아직 달성되지 않았다. 암으로 진단된 사춘기 전 소년에 대한 생식력 보존 옵션의 결여는 암 치료의 개시 전에 이들 환자로부터 수득된 고환 생검에서 미세한 SSC 집단을 재현가능하게 확장시킬 수 없다는 것에 기인한다. 여기서 본 데이터는 인간 SSC가 인간 TEC와의 공동-배양에서 장기간 유지될 수 있음을 나타낸다. 장기간 배양된 인간 SSC의 기능적 확인은 이식 후 누드 마우스의 정세관의 기저막으로의 이동에 의해 관찰되었다. TEC는 SSC의 자가 재생 및 확장에 충분할 수 있지만, 줄기 세포의 임상적 적용은 종종 피더 세포에 대한 요건에 의해 방해된다. GDNF 단독의 보충은 STO 세포 상에서 배양될 때 SSC 생존에 충분하지 않기 때문에, 본 발명자들은 간 및 폐 EC와 비교하여 활성화된 TEC의 분비체를 스크리닝하였다. IGFBP-2, SDF-1 및 MIP-2는 TEC에 의해 특이적으로 생산되고, 이전에 줄기 세포 생물학에 연루되어 있다. 본 연구는 GDNF 및 FGF2와 함께 IGFBP-2, SDF-1 및 MIP-2의 첨가가 피더 세포의 부재 하에 뮤린 및 인간 SSC 둘 다의 확장 및 장기간 배양에 충분하다는 것을 보여준다.
종합하면, 데이터는 SSC의 유지를 위한 GDNF, IGFBP-2, SDF-1 및 MIP-2를 제공하는 생식세포 적소에서 핵심 집단으로서의 TEC에 대한 증거를 제공한다. TEC에서 GDNF 생성을 조절하는데 있어서 CaN-NFAT 경로의 기여를 추론하는 것은 남성 불임에 대한 치료 표적을 제시한다. 임상적으로 매우 중요한 것은, SSC에 피더 세포-유래 바이러스를 전달하는 위험을 시험관 내에서 제거하는 SSC의 피더 없는 확장을 허용하는 5개의 성장 인자의 확인이다. 이들 데이터는 암 치료의 개시 전에 암으로 진단된 사춘기 전 소년의 고환 생검으로부터 수득된 인간 SSC를 확장시킬 수 있게 하며, 결국 치료 완료 및 무암 진단시 SSC의 재도입에 의해 이 환자 집단에서 생식력을 보존할 가능성이 있다.
세포 생존력 검정
1x103 개의 TEC 또는 세르톨리 세포(Lonza)를 96 웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 96 웰 플레이트 검정을 씨딩 전에 0.1% 젤라틴으로 코팅하였다. 부설판(Sigma)을 명시된 농도로 사용된 DMSO 중에 희석하고, 96시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 100 μl의 MTT 작업 용액(ScienCellTM)을 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. MTT 작업 용액을 제거하고, 50 μl의 DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 샘플을 550 nm 파장에서 판독하였다. 각각의 조건은 n=3 실험으로 삼중으로 수행하였다. 통계는 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)으로 분석하였다.
TEC 증식 및 세포자멸사 검정
웰당 5x103 개의 고환 EC를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 8-챔버 슬라이드(LabteK) 상에 분주하였다. 씨딩 24시간 후에 부설판(800μM) 또는 DMSO를 각 웰에 첨가하고, 72 또는 96시간 동안 배양하였다. 10 μM BrdU(BD PharmingenTM)를 부설판 처리 72시간 후에 배지에 첨가한 다음, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 항-BrdU(1:50; Invitrogen), 항-γ-H2AX(1:1400; Millipore) 및 항-절단된 카스파제 3(1:1400; Cell Signaling)으로 염색하였다. 10개의 랜덤 고출력장에서의 BrdU+ 세포를 계수하고, 그래프 패드 프리즘을 사용하여 통계를 분석하였다. 각 조건은 3회 수행하였다.
인간 고환 세포
환자가 또 다른 목적, 즉, 중앙선 배치, 골수 흡인/생검에 대해 전신 마취 하에 있는 절차 동안 요로학자에 의해 수행된 개방 고환 생검을 통해 사춘기 전 소년으로부터의 인간 고환 세포를 수득하였다. 이러한 절차는 임의의 암 요법이 개시되기 전에 발생한다. 고환의 우월 극에서 작은 절개를 수행하고, 압출된 정세관의 대략 대략 80 mm3 부분을 절제한다(약 2 mm x 4 mm x 10 mm). 크기는 환자의 크기에 따라 달라진다. 고환 생검을 수득하기 전에 동의를 얻었다. 이들 환자의 젊은 연령을 고려할 때, 그들의 부모는 동의서에 서명하였고, 12세 초과의 환자에 대해 환자로부터 무의서(assent)를 얻었다. 모든 절차는 Children's Hospital of Philadelphia 에서 IRB에 의해 승인되었다.
TEC의 단리
3 내지 4주령 마우스로부터의 고환을 수거하고 가능한 한 잘게 다졌다. 시험 조직을 10mg ml-1의 유형 콜라게나제(Worthington) 및 20ug ml-1의 DNase I(Sigma)이 보충된 HBSS에서 35분 동안 37℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 소화시켰다. 소화된 조직을 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 회전시켜 수집하고, 조직 펠릿을 7mg ml-1의 DNase I(Worthington)이 첨가된 0.25% 트립신에 재현탁시키고, 이어서 이를 37℃로 5분동안 인큐베이션하였다. 이어서, 분리된 세포를 100 μm 및 40 μm 스트레이너를 통해 순차적으로 변형시키고, 트립신 활성을 동일한 부피의 FBS로 켄칭하였다. 단리된 세포를 10 ml의 HBSS로 1회 세척하고, 10분 동안 4℃에서 1000rpm으로 스핀다운시켰다. 세포를 100-200ul의 MACS 완충액에 재현탁시키고, 10-20ul의 CD31-마이크로비드(Miltenyi Biotec: Cat:130-097-418) 및 10-20ul의 마우스 Fc 수용체 차단제와 혼합한 후, 이를 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 항체 결합 세포를 제조자의 지시에 따라 MACS 세포 분리에 의해 단리하였다. 정제된 세포를 CD31(1:50, BD; Cat:553370), VEGFR2(1:100; Cell signaling; Cat:55B11) 및 VE-cadherin(1:100, Santacuz; Cat SC-9989)을 사용한 면역염색에 의해 확인하였으며, 이는 EC 및 Dil-Ac-LDL 흡수 검정(Alfa Aescar) 상에서 특이적으로 발현되었다.
TEC 또는 TEC-음성 고환 세포를 이용한 SSC 배양
C57BL/6J 마우스는 Harlan Laboratories(Indianapolis, IN, USA)로부터 입수하였다. 모든 마우스를 2-3주령에 사용하였다. TEC 및 TEC-음성 고환 세포의 단리를 위해, 항-CD31 및 항-Thy-1 마이크로비드를 사용한 자기-활성화 세포 분류(MACS)를 수행하였다(Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA). 간략하게, 새로운 고환을 둘베코 포스페이트 완충 염수(DPBS; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에 넣고, 탈캡슐화하였다. 이어서, 정세관을 DPBS 중 콜라게나제 II형(Worthington) 10 mg ml-1 및 0.5 mg ml-1 DNAse I(Worthington)의 4:1 용액 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 다음, DPBS 중 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen) 및 7 mg ml-1 DNAse I(Roche, Basel, Switzerland)의 4:1 용액 중에서 37℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 효소 소화는 초기 반응 부피의 10%와 동등한 소 태아 혈청(FBS; Biotechnics research, INC. USA)의 첨가에 의해 불활성화되었다. 소화 후, 고환 세포 현탁액을 100 μm 및 40 μm 나일론 메쉬(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 통해 여과하고, 4℃에서 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. TEC를 항-CD31 항체 마이크로비드를 사용하여 MACS에 의해 단리하였다. 생식세포를 제외한 TEC-음성 집단을 분리하기 위해, CD31 - 세포를 항-Thy-1 마이크로비드와 함께 MACS에 사용하였고, T Thy-1- 고환 세포를 수집하여, CD31- Thy-1- 고환 세포를 생성하였다. 무혈청 배지에서 TEC 또는 TEC-음성 고환 세포를 함유하는 200 μl의 고체 매트리겔 혼합물의 상부에 3.0x105 개의 배양된 GFP+SSC를 분주함으로써 2D 공동-배양물을 생성하였다.
웨스턴 블랏 분석
비히클 또는 부설판 처리된-야생형 마우스로부터 수거된 고환체를 RIPA 완충제 중에서 균질화시키고, 단백질 농도를 BioRad DC 단백질 검정에 의해 정량화하였다. 샘플 당 25 ug의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 항-GDNF 토끼 다클론성 항체(1:500; Santa Cruz, Cat:13147) 또는 항-절단된 카스파제 3 토끼 다클론성 항체를 사용하여 프로빙하고, 화학발광(ECL, Amersham)에 의해 검출하였다. 블랏을 스트립핑하고, 로딩 대조군으로서 β-액틴으로 재-프로빙하였다. 비크로핑된(uncropped) 블랏에 대한 보충 물질을 참조한다.
면역조직화학
수컷 마우스로부터 고환을 절개하고, 20%(wt vol-1) 수크로스에서 밤새 동결보호한 다음, OCT(Tissue-Tek)에서 동결시켰다. 고환 절편(10 또는 30 μM)을 1시간 동안 차단하고(0.1% PBS-T 중 5% 정상 염소 혈청 및 0.1% 소 혈청 알부민), 0.1% PBS-T에서 세척하였다. 1차 항체: 항-CD31 랫트-pAb(1:50; BD science, Cat:550274), 항-PLZF 토끼-다클론성 Ab(1:150; Santa Cruz, CAT:22839), 항 -DDX4 토끼 pAb(1:200; Abcam, Cat:13840), 항 Sox9 토끼 pAb(1:1200; Millipore, Cat:ABE579) 및 항-GDNF 토끼 다클론성 Ab(1:50; Santa Cruz, Cat:SC328)를 차단 완충액에 희석시키고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온에서 30분 동안 항-마우스 Alexa 594(1:1000, Thermo Fischer, Cot:A110323) 또는 항-토끼 Alexa 488(1:1000, Thermo Fischer, Cat:A32723)과 함께 인큐베이션하였다. 절편을 1분 동안 염색하여 핵을 검출하였다. 고환 규칙적 절편의 면역형광 영상을 Zeiss Imager M2 현미경 상에 장착된 AxioVision 소프트웨어(ZeisS)로 포획하거나 또는 30 μM 두께 절편을 ZeISs LSM 710 공초점을 갖는 Z-스택으로 포획한 다음, 모든 Z-stack 영상을 Image J(National Institutes of Health)로 투사 영상으로서 재구성하였다. 디지탈 영상을 내피 세포 마커, 생식계 줄기 세포 마커 및 GDNF의 면적 및 밀도에 대해 고환 절편당 5개의 무작위 20x 필드를 계수함으로써 분석하였다.
부설판 처리 5 내지 6주 후에 마우스를 희생시키고, 조직을 파라포름알데히드 중에서 밤새 고정시킨 다음, 파라핀에 포매시켰다. 슬라이드를 5 μM 절편으로 절단하였다. 항원 회수를 위해, 절편을 60℃에서 60분 동안 베이킹하고, 99℃에서 20분 동안 DAKO 표적 항원 회수 용액(Dako, Carpinteria, CA)을 사용하여 항원 회수에 적용하였다. 절편을 정상 당나귀 혈청에서 차단한 다음, 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 적절한 종에 대한 2차 항체에 이어서 스트렙타비딘-HRP를 사용한 증폭을 사용하였다. 슬라이드를 AEC+ 기질로 염색하였다. 명시야 이미지를 AxioCam 디지털 카메라(Zeiss)로 Olympus BX51(Olympus)로 캡쳐하였다. 고환의 무작위 절편을 200X 하에 조사하였고, 필드를 명백한 고정 인공물의 증거 없이 단면에서 소년은 완전한 정세관을 탐색하였다. 모든 단면적을 계수한 후, 필드를 무작위로 이동시키고, 모든 단면 정세관을 그 필드에서 계수하였다. 이는 슬라이드당 10-20개의 정세관을 계수할 때까지 계속하였다.
GDNF ELISA 및 mRNA
고환, 폐 또는 간 EC를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 12 웰 접시 상에 분주하고(10,000 세포 ml-1), 24시간 동안 배양하였다. 조건화 배지를 FGF-2(2ng ml-1, 20ng ml-1 및 50ng ml-1) 처리 후 24 및 48시간에 수거하고, 제조자의 지시에 따라 GDNF(Promega GDNF Emax 면역검정 시스템, #G7621)에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)을 사용하여 통계를 분석하였다. Gdnf mRNA의 정량화를 위해, 전체 RNA를 Direct-zol RNA MiniPrep(Zymo Research)을 사용하여 세포로부터 단리하고, 제조자의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(Appliedbiosystems)를 사용하여 역전사시켰다. 모든 유전자 발현 수준을 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하였다.
고환 세포 증식
1x104 개의 총 고환 세포를 젤라틴-코팅된 8-웰 LabTek 챔버 슬라이드 상에 분주하고, 밤새 배양하였다. 배지 중 TEC-유래 GDNF를 4℃에서 밤새 2 ug ml-1의 GDNF 항체 또는 IgG1의 첨가에 의해 중화시킨 후, 4℃에서 단백질 G를 첨가하였다. GDNF 고갈을 GDNF ELISA에 의해 확인한 후, 조건화 배지를 고환 세포에 24시간 동안 첨가하였다. 고환 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, 5% 정상 염소 혈청에서 차단하고, 0.1% PBS-T 중 0.1% 소 혈청 알부민에서 투과화하였다. 항-Ki67 토끼 다클론성-FITC Ab(1:50; Abcam) 또는 이소형-매칭된 대조군 항체를 사용한 면역염색에 의해 증식을 검출하였다. 1차 항체를 1시간 동안 첨가하였다. 세포를 PBS-T로 세척한 후, 광으로부터 보호된 30분 동안 항-마우스-Alexa594(1:1000; 분자 프로브스)를 첨가하였다. 핵을 1% DAPI로 1분 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 마운팅하고, 상기 기재된 바와 같이 영상화하였다. Ki67+ 및 SSC+ 세포를 10개의 무작위 필드에서 계수하고, 퍼센트 양성 세포를 소프트웨어 프리즘(Graph Pad Prism)에 의해 분석하였다.
GFP
+
SSC의 이식
5 내지 6주령 수컷 C57Bl/6 마우스를 1회 용량의 부설판(45 mg kg-1, Sigma)으로 복강내 주사에 의해 처리하여 정조 줄기 세포를 고갈시켰다. 6주 후, 부설판 처리된 C57Bl/6 마우스를 수령체로서 사용하였다. 내인성 정자형성의 결여 때문에, W/Wv 마우스를 이식 실험을 위한 수령체로서 사용하여 자손을 생산하였다. 공여자-유래 정자를 정량하기 위해, 공여자 세포를 부설판 처리된 C57Bl/6 마우스에 이식하였다. 공여자 세포가 자손을 생산할 수 있는지를 결정하기 위해, 공여자 세포를 4- 내지 6-주령 W 돌연변이체 마우스 내로 이식하였다. 수령체를 75 mg kg-1 케타민 및 0.5 mg kg-1 메데토미딘로 i.p.로 마취하고, C57Bl/6 GFP-유비퀴틴 형질전환 마우스로부터 단리된 10 μl의 3D 매트리겔 배양된 GFP+Thy-1.2+ SSC 또는 GFP+ 고환 또는 폐 내피 세포(5x108 개의 세포/ml)를 수령체 마우스의 고환 내로 미세주입하였다. 대략 10 μl(2.5x106 개의 세포 mL- 1)의 공여자 세포를 부설판 처리된 C57Bl/6 내로 이식하여, 정세관의 약 80%를 채웠다. 자손 세대 이식을 수행하기 위해, 대략 2 μL(70x106 개의 세포 mL- 1)의 공여체 세포를 W 돌연변이체 마우스에 수출관을 통해 이식한 다음, 1.5 μL(50x106 개의 세포 mL- 1)의 TEC을 고환의 내부 공간에 직접 주사하였다. 이식 3개월 후, 수령체 고환을 형광 현미경 하에서 공여자-유래 정자에 대해 분석하였다. 모든 동물 절차는 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health(IACUC assurance no. 11-0038) 및 University of Pennsylvania(Philadelphia, PA) Institution Animal Care and Use Committee(IACUC protocol no. 804423)에 따라 수행하였다.
마우스
C57BL/6J 마우스는 Jackson Laboratories로부터 입수하였다. VE-카드헤린-Cre-ER 마우스는 Ralf Adams에 의해 제공되었다. FGFR1fl /fl 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다8. 모든 마우스를 5-6주령에 사용하였다. 모든 동물 실험을 University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 설정된 지침 하에 수행하였다. Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 입수한 WBB6F1-W/Wv 돌연변이체 마우스(W 돌연변이체 마우스)를 이식을 위한 수령체로서 사용하였다.
SSC 풍부 배양물
2.7x105 개의 배양된 GFP+ SSC를 STO 피더 세포28 상에 또는 외인성 GDNF 10ng ml-1(R&D system), GFRα1 75ng ml-1(R&D system) 및 FGF2 1ng ml-1(BD Biosciences)을 갖는 무혈청 배지28 중 TEC를 함유하는 고체 매트리겔 혼합물(BD bioscience) 200 μl의 상부에 분주함으로써 2D 공동-배양물을 생성하였다. 평균 GFP+SSC 콜로니 면적을 측정하고, 분주 8일 후에 GFP+ SSC 세포 수를 계수하였다. 각 조건은 3회 수행하였다.
6-8일령 마우스의 고환으로부터 Thy-1.2+ GSC의 단리에 의해 3D 구상체 콜로니를 생성하였다. 50,000개의 새로 단리된 Thy-1.2+ 생식 줄기 세포를 10% FBS, 2mmol/L L-글루타민, 100U L-1 펜-스트렙 및 1ml의 ITS 유니버셜(BD bioscience)를 함유하는 매트리겔 및 둘베코 변형 이글 배지/F12(DMEM/F2, Gibco)의 2:1 혼합물 중에서 25,000개의 TEC 또는 LuEC와 혼합하고, 8-웰 Lab-Tek 챔버 슬라이드(Thermo Scientific) 내로 분주하였다. 배양물을 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하여 고화시킨 후, 고체 매트리겔 혼합물의 상부에 생식 줄기 세포 배지를 첨가하였다. 배양된 Thy-1.2+ SSC 구상체 콜로니 수 및 콜로니의 평균 직경을 분주 후 지시된 날에 측정하였다.
Ts65Dn 마우스로의 TEC 이식
9주령 Ts65Dn 수컷 마우스를 수술 세포 이식을 위해 IP 주사에 의해 아베르틴(250 mg kg- 1)으로 마취시켰다. 이식 시에, C57BL/6 야생형 GFP-유비퀴틴 형질전환 마우스로부터의 10 μl(0.5 Х 108 세포/ml)의 TEC를 Ts65Dn 마우스의 고환 내로 미세주입하였다. 이식 후, 고환의 표면 정세관을 약 50% 충전하고, 트립판 블루를 사용하여 세포 사멸을 검사하였다.
iPSC 분화
iPSC 계통을 생성하기 위해, 인간 섬유모세포/기질 세포를 기재된 바와 같이 인간 OCT4, SOX2, KLF4, 또는 MYC를 갖는 pMXs-기반 레트로바이러스 상청액으로 형질도입하거나30, 또는 단핵 세포를 기재된 대로 pHage2-CMV-RTTA-W 및 파아지-Tet-hSTEMMCA-loxP 바이러스로 감염시켰다31. 모든 세포를 50ng ml-의 추가의 VEGF를 갖는 인간 내피 세포 배지(Lonza; EGM®-MV Bulletkit) 중에서 0.1% 젤라틴-코팅된 디쉬 상에서 배양하였다. 인간 iPSC로부터의 500,000개의 분해된 단일 배아체를 48시간 동안 배양하였다. 비-부착성 세포를 부드럽게 제거하고, 부착성 세포를 1-2 계대 동안 배양하였다. 80~90% 컨플루언스의 세포를 무효소 세포 해리 용액(Millipore)으로 30분 동안 해리시키고, 제조자의 지시에 따라 인간 CD34 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotec)로 단리하였다. 단리된 CD34+ 세포를 세포가 융합될 때까지 배양하였다. CD34+ 세포를 인간 CD31 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotec)로 선별하고, CD34+CD31+ 세포를 Ac-LDL 흡수, CD31, VEGFR2 및 VE-카드헤린을 사용한 면역염색, 및 매트리겔 튜브 형성 검정 ENREF 32에 의해 특징화하였다.
ChIP
EC를 caNFATc1로 형질감염시키고55, 내피 세포 성장 배지에서 배양시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 1% 포름알데히드 중에서 10분 동안 가교시키고, 0.125M 글리신으로 켄칭하고, PBS로 세척한 다음, 용해시키고(10mM Tris pH8.0, 10mM NaCl, 0.2% NP-40, 프로테아제 억제제, H2O), 세포질 내용물을 제거하였다. 이어서, 핵을 용해시키고(50 mM Tris pH8.0, 10mM EDTA, 1% SDS, 프로테아제 억제제, H2O), 초음파처리하였다. 샘플을 4℃에서 2시간 동안 단백질 G 및 50 ug의 마우스 IgG로 사전 소거하였다. 샘플을 원심분리하고, 펠릿을 폐기하고, 상청액을 항체 결합 비드(10 μg 항체 및 단백질 G 슬러리)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 사용된 항체는 항-NFATc1(Sc-7294; Santa Cruz) 및 마우스 IgG였다. 가교를 역전시키고, DNA를 용리시키고, qPCR을 프라이머 F:5'ACCTAGAACAATCAGGGTTCCGCA 및 R: 5' AGTGTCCCAAGAACCAGTAGCCAA를 사용하여 Egr1 프로모터 상의 -1000 내지 -830 사이의 영역에 대해 수행하였다. 음성 대조군 프라이머는 Egr -1 프로모터 상의 -548 내지 -420의 영역을 포함하고, 서열은 프라이머이다.
F:5' AGACCTTATTTGGGCAGCGCCTTA; R:5' GCCACTGCTGCTGTTCCAATACTA.
GFP
+
Thy-1.2
+
생식 계열 줄기 세포 및 TEC 이식
5 내지 6주령 수컷 C57Bl/6 마우스를 1회 용량의 부설판(45 mg kg-1, Sigma)으로 복강내 주사에 의해 처리하여 SSC를 고갈시켰다19. 부설판 처리된 마우스를 2-4% 이소플루란으로 마취시키고, C57Bl/6 GFP-유비퀴틴 형질전환 마우스로부터 단리된 10 μl의 3D 매트리겔 배양된 GFP+Thy-1.2+ SSC(5x106 개의 세포 mL-1) 또는 GFP+ 고환 또는 폐 내피 세포(5x108 개의 세포 ml- 1)를 수령체 마우스의 고환 내로 미세주입하였다. 모든 동물 절차는 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health(IACUC assurance no. 11-0038) 및 University of Pennsylvania(Philadelphia, PA) Institution Animal Care and Use Committee(IACUC protocol no. 804423)에 따라 수행하였다.
통계 분석
데이터의 그래프화 및 통계적 분석을 위해 Prism(GraphPad)을 사용하였다. 통계적 유의성은 2개의 그룹 사이의 T-시험(2 테일드 언페어드) 및 2-웨이 Anova 테스트에 의해 결정하였다.
Claims (20)
- 포유동물에서 정조 줄기 세포의 집단을 증가시키는 방법으로서, 고환 내피 세포를 포유동물에 이식하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고환 내피 세포는 시험관 내에서 배양되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포를 이식하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 고환 내피 세포를 피더 세포로서 사용하여 배양되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포 없이 고환 내피에 의해 생성된 하나 이상의 성장 인자와 함께 배양되는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1 및 MIP-2로부터 선택되는 3종 이상의 혼합물인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1, 및 MIP-2의 혼합물인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상이 포유동물은 인간인, 방법.
- 포유동물에서 정자형성을 회복하는 방법으로서, 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포를 포유동물에 이식하는 것을 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 고환 내피 세포를 피더 세포로서 사용하여 배양되는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포 없이 고환 내피 세포로부터 생성된 하나 이상의 성장 인자와 함께 배양되되, 상기 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1, 및 MIP-2로부터 선택된 하나 이상인, 방법.
- 시험관 내에서 정조 줄기 세포를 배양하는 방법으로서, 피더 세포로서 또는 피더 세포 없는 고환 내피 세포의 성장 인자로서 고환 상피 세포(TEC)를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 12에 있어서, 장기간이 60일 초과인 시험관 내에서 정조 줄기 세포를 장기간 유지할 수 있는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 장기간은 120일 초과인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1, 및 MIP-2의 혼합물인, 방법.
- 성선독성제로 처리한 후 인간에서 정조 줄기 세포의 집단을 보호하는 방법으로서, 고환 내피 세포를 인간에 이식하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 고환 내피 세포는 시험관 내에서 배양되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포를 이식하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포로서 고환 내피 세포를 사용하여 배양되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 시험관 내에서 배양된 정조 줄기 세포는 피더 세포 없이 그러나 고환 내피에 의해 생성된 하나 이상의 성장 인자와 함께 배양되되, 상기 성장 인자는 GDNF, FGF-2, IGFBP-2, SDF1, 및 MIP-2로부터 선택된 3종 이상의 혼합물인, 방법.
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|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |