KR101777160B1

KR101777160B1 - 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법

Info

Publication number: KR101777160B1
Application number: KR1020140037488A
Authority: KR
Inventors: 이승태; 윤정임; 박민희
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2017-09-11
Also published as: KR20150113493A

Abstract

포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리한 포유동물 유래의 정원줄기세포에 관한 것으로서, 정원줄기세포의 마커 개발과 생물학적 특성 및 활성도 연구 분야 뿐만 아니라, 형질전환 동물의 생산 등과 같은 적극적인 활용법으로 널리 응용될 수 있다.

Description

포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법{Method of isolating spermatogonial stem cells from mammals}

본 발명은 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리한 포유동물 유래의 정원줄기세포에 관한 것이다.

인간을 포함한 포유동물에 있어서, 정원줄기세포(spermatogonial stem cells; SSC)는 웅성(male)의 생애 전반에 걸쳐 정자세포(spermatozoa)를 생산하는 모든 과정인 정자형성과정(spermatogenesis)을 유지함에 있어서 기본이 되는 세포이다.

정원줄기세포는 상기 정자형성과정을 통하여 정자세포로 분화할 수 있는 미분화 웅성 생식세포로서, 여러 성체 줄기세포들이 지닌 특성과 같이 자가증식(self-renewal) 및 분화(differentiation) 능력을 지니고 있기 때문에, 유전 정보를 다음 세대에 전달함에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다.

단일 정원세포군(single spermatogonia)중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만, 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다.

따라서, 과거 여러 해 동안 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰을 통한 이론적인 지식에 의존하고 있었고, Brinster 등은 정원줄기세포의 이식 기법을 개발하여 정원줄기세포의 특성을 규명하는데 있어서 획기적인 전기를 마련하였다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, 22;91(24):11303-7).

정원줄기세포 이식 기법이 개발된 이후 정원줄기세포의 생물학적 연구분야에 있어서 많은 진전이 이루어지고 있는데, 전분화능 정원줄기세포를 이용한 형질전환 정자의 생산방법 (한국공개특허 제2011-130622호), 포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법 (한국등록특허 제1032335호), 렌티바이러스 벡터와 다가양이온를 이용한 생쥐 정원줄기세포의 유전자 도입 효율 증진 기법 (한국공개특허 제2012-0070996호), 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 정원줄기 세포의 동결보존 방법 (한국등록특허 제1230435호) 등이 알려져 있다.

그러나, 상기 종래기술들은 독성의 존재 및 정원분리세포 분리의 저효율성이라는 문제점을 지니고 있기 때문에, 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리하는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행한 결과, 특정 배지를 함유하는 페트리 디쉬 플레이팅법을 이용하여 포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리할 수 있는 방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 분리한 포유동물 유래의 정원줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 백막 및 부정소를 제거한 포유동물의 정소에 효소를 처리하여 정소세포를 분리하는 단계, (b) 상기 분리한 정소세포를 보충 성분이 부가된 DMEM 배지가 함유되고, 젤라틴이 피복된 페트리 디쉬에서 배양한 후, 부유 세포를 회수하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 회수한 부유 세포를 보충 성분이 부가된 DMEM 배지가 함유된 페트리 디쉬에 플레이팅하고, 배양한 후 부유 세포를 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리한 포유동물 유래 정원줄기세포를 제공한다.

본 발명의 분리방법에 의하면, 포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리할 수 있기 때문에, 정원줄기세포의 마커 개발과 생물학적 특성 및 활성도 연구 분야 뿐만 아니라, 형질전환 동물의 생산 등과 같은 적극적인 활용법으로 널리 응용될 수 있다.

또한, 질병이나 노화 등으로 정액 채취가 불가능한 우수 종모돈, 종모우 등의 정소로부터 생식선줄기세포인 정원줄기세포를 채취하고 젊은 수여자 정소에 이식하여 인공수정 등에 유용한 이식된 종모돈, 종모우 등의 정원줄기세포 유래 정자를 생산할 수 있으므로, 우수 종모돈, 종모우 등의 활용도를 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법의 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 정소세포의 알칼라인 포스파타제 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정소세포 중의 정원줄기세포 특이 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 정원줄기세포의 알칼라인 포스파타제 염색를 나타낸 것이다.
도 5는 정원줄기세포 특이 유전자의 발현 양상을 나탠 것이다.
도 6은 정원줄기세포 특이 단백질의 발현 양상을 나탠 것이다.
도 7은 정원줄기세포에 공존하는 라이디히 세포 및 세르톨리 세포의 발현율을 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 백막(tunica albuginea) 및 부정소(epididymis)를 제거한 포유동물의 정소에 효소를 처리하여 정소세포를 분리하는 단계, (b) 상기 분리한 정소세포를 보충 성분이 부가된 DMEM 배지가 함유되고, 젤라틴이 피복된 페트리 디쉬에서 배양한 후, 부유 세포를 회수하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 회수한 부유 세포를 보충 성분이 부가된 DMEM 배지가 함유된 페트리 디쉬에 플레이팅하고, 배양한 후 부유 세포를 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법을 제공한다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 효소는 콜라게나제(collagenase), 하이아루로니다제(hyaluronidase), 트립신(trypsin) 및 디엔에이 가수분해효소 I(DNase I)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 보충 성분은 열-불활성화된 소태아 혈청(fetal bovine serum)일 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 보충 성분은 상기 DMEM 배지 대비, 10%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청(fetal bovine serum)일 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양은 35℃~39℃, 바람직하게는 36℃~38℃, 보다 바람직하게는 37℃에서 12~20시간, 바람직하게는 14~18시간, 보다 바람직하게는 16시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 보충 성분은 열-불활성화된 소태아 혈청, 머캡토에탄올, 비필수 아미노산, 소디움 피루베이트, L-글루타민, 항생-항진균제 용액, 마우스 백혈구 저해 인자(mouse leukemia inhibitory factor) 및 글리아 세포 유래 신경영양 인자(glial cell-derived neurotrophic factor)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 보충 성분은 상기 DMEM 배지 대비, 15%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청, 0.1mM의 머캡토에탄올, 1%(v/v)의 비필수 아미노산, 1mM의 소디움 피루베이트, 2mM의 L-글루타민, 1%(v/v)의 항생-항진균제 용액, 1,000units/ml의 마우스 백혈구 저해 인자(mouse leukemia inhibitory factor) 및 10ng/ml의 글리아 세포 유래 신경영양 인자를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양은 35℃~39℃, 바람직하게는 36℃~38℃, 보다 바람직하게는 37℃에서12~18시간, 바람직하게는 14~16시간 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 상기 정원줄기세포의 분리방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 소, 양, 코끼리, 기린, 사자, 호랑이, 표범, 코뿔소, 하마, 고양이, 개, 돼지, 말, 마우스, 래빗(rabbit) 등 모든 포유동물을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 돼지, 보다 바람직하게는 생후 1 내지 60일령의 신생 돼지일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 분리한 포유동물 유래 정원줄기세포를 제공한다.

본 발명의 상기 정원줄기세포에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 원숭이 등의 영장류, 소, 양, 코끼리, 기린, 사자, 호랑이, 표범, 코뿔소, 하마, 고양이, 개, 돼지, 말, 마우스, 래빗(rabbit) 등 모든 포유동물을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 돼지, 보다 바람직하게는 생후 1 내지 60일령의 신생 돼지일 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 돼지 정소로부터 정원줄기세포의 분리

이하의 실시예에서는 금보(Gumbo Inc., Wonju, Korea)에서 기증받은 1-4일령의 신생 돼지(Landrace x Yorkshire)를 실험동물로 사용하였고, 모든 동물실험은 강원대학교의 동물실험 윤리위원회(IACUC)가 승인한 절차에 따라 수행하였다 (IACUC approval No. KW-131106-1).

<실시예 1> (돼지 전소의 복합 효소처리를 통한 정소세포의 분리)

상기의 실험동물인 신생 돼지로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출한 후, 정소의 백막 및 부정소를 제거한 다음, 정소 조직을 1%(w/v)의 항생제-항진균 용액(Welgene Inc., Daegu, Korea)을 함유하는 얼음 냉각 상태의 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS; Welgene Inc.)에 담아 1시간내에 실험실로 운반하였다.

운반된 정소 조직에 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Welgene Inc.)에 담겨 있는 0.1% (w/v)의 타입 IV 콜라게나제(Worthington Biochemical, Lake wood, CA, USA)를 처리하여 정세관(seminiferous tubules)을 소화시켰다.

이어서, 상기에서 조각난 정세관을 0.1% (w/v)의 하이아루로니다제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 트립신-EDTA(Welgen)이 보충된 DMEM(Welgene) 배지에 37℃에서 15분 동안 배양하였다.

그 후, 분산된 세포를 10% (v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청(FBS; HyClone, Logan, UT, USA)이 보충된 DMEM 배지에 2회 세척한 다음, 70㎛ 나일론 메쉬(SPL, Pocheon, Korea)로 여과하여 근양 세포(myoid cell) 및 세르톨리 세포(Sertoli cell)를 제거한 후, 적혈구 세포분해 버퍼(Sigma-Aldrich)에서 상온으로 10~15 분 동안 배양하여 적혈구를 제거하여 신생 돼지 정소로부터 정소세포를 분리하였다.

그런 다음, 헤모싸이토미터(hemocytometer)를 이용하여 상기 분리된 정소세포의 세포수를 계수하였다.

<실시예 2> (정소세포로부터 정원줄기세포의 회수)

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 분리한 5 x 10⁶개의 정소세포를 10%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청이 보충된 DMEM 배지가 함유되고, 0.1% (w/v)젤라틴이 피복된 지름 100mm의 페트리 디쉬에 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 부유 세포를 회수하였다 (differential plating; DP).

상기 단계에서 회수한 1 x 10⁶개의 세포를 15%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청(Invitrogen, Calsbad, CA, USA) 0.1mM의 머캡토에탄올(Invitrogen), 1%(v/v)의 비필수 아미노산(Invitrogen), 1mM의 소디움 피루베이트(Invitrogen), 2mM의 L-글루타민(Invitrogen), 1%(v/v)의 항생-항진균제 용액(Welgene), 1,000units/ml의 마우스 백혈구 저해 인자(mouse leukemia inhibitory factor; Chemical International, Inc., Temecula, CA, USA) 및 10ng/ml의 글리아 세포 유래 신경영양 인자(glial cell-derived neurotrophic factor; R&D Systems, Inc., Miniapolis, MN, USA)가 보충된 DMEM 배지가 함유된 지름 35mm의 페트리 디쉬에 플레이팅하고, 37℃에서 15시간 동안 배양한 후 부유 세포를 회수하여 정원분리세포를 분리하였다 (petri dish plating post-DP).

<비교예 1>

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1에 의해 분리한 5 x 10⁶개의 정소세포를 10%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청이 보충된 DMEM 배지가 함유되고, 0.1% (w/v)젤라틴이 피복된 지름 100mm의 페트리 디쉬에 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 부유 세포를 회수하여 정원분리세포를 분리하였다(differential plating; DP).

<비교예 2>

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 비교예 1의 과정을 2회 반복하여 부유 세포를 회수하여 정원분리세포를 분리하였다(double differential plating; double DP).

<비교예 3>

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1에 의해 분리한 정소세포를 600 G에서 7분간 원심분리한 후, 앤티-마우스 CD90(anti-mouse CD90; EXBIO, Vestec, Czech Republic) 및 바이오틴-콘쥬게이티드 앤티-마우스 IgG1(biotin-conjugated anti-mouse IgG1; Abcam, Cambridge, UK) 항체를 사용하여 Invitrogen사의 MACS(magnetic activated cell storing) 시스템의 매뉴얼에 따라 정원줄기세포를 분리하였다(MACS).

<비교예 4>

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 비교예 1의 방법(DP)에 의해 분리한 부유 세포를 상기 비교예 3의 MACS 시스템과 같이 실시하여 정원줄기세포를 분리하였다(MACS post-DP).

<비교예 5>

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1에 의해 분리한 정소세포에서 세포를 직접 계수하여 정원분리세포를 분리하였다(direct).

<실험예 1> (정소세포의 알칼라인 포스파타제 염색)

정원줄기세포의 존재를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리한 정소세포를 알칼라인 포스파타제 염색(alkaline phosphatase staining)하고, DPBS로 2회 세척한 후, 헤모싸이토미터를 이용하여 양성 반응을 나타내는지를 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 알칼라인 포스파타제 염색은 세포를 4% (v/v/)의 파라포름알데하이드(Junsei Chemical Co., Ltd., Chuo-ku, Japan)로 고정하여 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS; Welgene Inc., Daegu, Korea)에 2회 린스한 후, 상기 고정된 세포를 0.2mg/ml의 나프톨 AS-MX 포스페이트(Sigma-Aldrich)가 보충된 0.1M의 트리스 버퍼(pH 8.2), 2%의 디메틸포름알데하이드 및 1mg/ml의 Fast Red TR salt(Sigma-Aldrich)로 이루어진 알칼라인 포스파타제 용액에 90분 동안 염색시켰다.

도 2의 화살표에서 보는 바와 같이, 상기 알칼라인 포스파타제 염색에 양성 반응을 나타내는 정원줄기세포가 존재함을 알 수 있다 (화살표 참조).

<실험예2> (정소세포 중의 정원줄기세포 특이 유전자의 발현 양상)

상기 실시예 1에서 분리한 정소세포 중에 정원줄기세포가 존재하는지를 확인하기 위하여, 정원줄기세포 특이 유전자의 발현을 조사하였다.

분석 유전자로는 정원줄기세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 OCT4, NANOG, EPCAM, THY1 및 UCHL1 유전자를 대상으로 하였고, 대조군으로서 모든 종류의 세포에서 발현되는 GAPDH 유전자의 발현 양상을 조사한 결과를 도 3(스케일 바: 200㎛)에 나타내었다.

이때, 총 mRNA는 Dynabeads mRNA Direct^TM 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 상기 제조사의 매뉴얼에 따라 세포로부터 추출하였다.

다음으로, cDNA는 gDNA remover 키트를 구비한 ReverTra Ace 볘CR RT Master Mix(Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 상기에서 얻은 mRNA로부터 합성하였다.

또한, I-MAX^TM II DNA polymerase(iNtRON, Seongnam, Korea)가 하기 표 1 기재의 PCR 프라이머를 사용한 유전자 발현의 확인에 사용되었다.

PCR 증폭은 94℃에서 4분의 초기 변성, 94℃에서 30초, 각 프라이머의 적정 어닐링 온도에서 45초, 72℃에서 1분, 및 모든 유전자에 대하여 34회의 반응 횟수, 72℃에서 10분의 최종 신장 조건으로 수행하였다.

또한, PCR 산물은 1.5% (w/v)의 아가로스 겔(Promega, Madison, WI, USA) 상에서 전기영동을 통하여 분리하고, Redsafe^TM (iNtRON)으로 염색한 다음, Gel Doc^TM XR+ imaging system (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 가시화하였다.

PCR 프라이머 및 PCR 반응 조건

유전자	진뱅크 넘버	프라이머 염기서열		크기 (bp)	온도(℃)
유전자	진뱅크 넘버	센스(5‘→3’)	앤티센스(5‘→3’)	크기 (bp)	온도(℃)
GAPDH	NM_001206359.1	AGGGCTGCTTTTAACTCTGGCAA (서열번호 1)	GATGGTGATGGCCTTTCCATTG (서열번호 2)	180	60
OCT4	NM_001113060.1	CGCGAAGCTGGACAAGGAGA (서열번호 3)	CAAAGTGAGCCCCACATCGG (서열번호 4)	151	60
NANOG	NM_001129971.1	AACCAAACCTGGAACAGCCAGAC (서열번호 5)	GTTTCCAAGACGGCCTCCAAAT (서열번호 6)	158	60
EPCAM	NM_214419.1	CAATGCAGGGTCTACAGGCTGG (서열번호 7)	TGCATCTCGCCCATCTCCTTT (서열번호 8)	154	60
THY1	NM_001146129.1	GTGCTCTTGGGCACTGTGGG (서열번호 9)	TCTTGCTGGAGATGCTGGGC (서열번호 10)	178	60
UCHL1	NM_213763.2	TCCGGAAGACAGAGCAAAATGC (서열번호 11)	TCCGGAAGACAGAGCAAAATGC (서열번호 12)	150	60

도 3에서 보는 바와 같이, 정원줄기세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 OCT4(151bp), NANOG(158bp), EPCAM(154bp), THY1(178bp) 및 UCHL1(150bp) 유전자가 존재하고, 대조군으로 GAPDH 유전자(180bp)가 존재함을 알 수 있는 바, 상기 정소세포 중에는 정원줄기세포가 존재함을 확인할 수 있다.

<실험예 3> (정원줄기세포의 알칼라인 포스파타제 염색)

정원줄기세포의 존재를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2 및 비교예 1 내지 5에서 분리한 추정 정원줄기세포(putative SSCs)를 상기 실험예 1과 같은 방법으로 알칼라인 포스파타제 염색(alkaline phosphatase staining)하고, 헤모싸이토미터를 이용하여 양성 반응을 나타내는 세포를 계수한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 비교예 1의 DP에 의한 분리방법은 79.76±5.20%, 비교예 2의 double DP에 의한 분리방법은 68.87±2.71%, 비교예 3의 MACS방법에 의한 분리방법은 36.67±6.43%, 비교예 4의 MACS post-DP에 의한 분리방법은 43.45±14.01%이고, 비교예 5의 direct에 의한 분리방법은 58.86±7.51%이었다.

이에 반하여, 실시예 2의 petri dish plating post-DP에 의한 분리방법은 96.50±1.20%로서, 상기 다른 방법과 대비하여 정원분리세포의 분리 효율이 현저히 높음을 알 수 있다.

상기 수치값은 Statistical Analysis System(SAS) program을 이용하여 통계 분석하였고, 주요 효과의 유의성은 상기 SAS 패키지의 ANOVA 분석을 통하여 검증하였으며, 각 처리군은 최소 자승법(least square) 또는 DUNCAN법으로 비교하였고, 유의차는 p<0.05이었다.

<실험예 4> (정원줄기세포 특이 유전자의 발현 양상)

상기 실시예 2의 petri dish plating post-DP 방법에 의해 분리한 추정 정원줄기세포에 진정한 정원줄기세포가 존재하는지를 확인하기 위하여, 실험예 2와 같은 방법으로 정원줄기세포 특이 유전자의 발현을 조사하였다.

분석 유전자로는 정원줄기세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 OCT4, NANOG, EPCAM, THY1 및 UCHL1 유전자를 대상으로 하였고, 대조군으로서 모든 종류의 세포에서 발현되는 GAPDH 유전자의 발현 양상을 조사한 결과를 도 5(스케일 바: 200㎛)에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 정원줄기세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 OCT4(151bp), NANOG(158bp), EPCAM(154bp), THY1(178bp) 및 UCHL1(150bp) 유전자가 존재하고, 대조군으로 GAPDH 유전자(180bp)가 존재함을 알 수 있는 바, 상기 추정 정원줄기세포에 진정한 정원줄기세포가 존재함을 확인할 수 있다.

<실험예 5> (정원줄기세포 특이 단백질의 발현 양상)

상기 실시예 2의 petri dish plating post-DP 방법에 의해 분리한 추정 정원줄기세포에 진정한 정원줄기세포가 얼마나 존재하는지를 확인하기 위하여, 유동세포 계수법(fow cytometry)에 의해 정원줄기세포 특이 단백질의 발현율을 조사한 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 유동세포 계수법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

상기 실시예 2에서 분리한 정원줄기세포를 4% (v/v)의 파라포름알데하이드에 15분 동안 고정한 후, 얼음 냉각 상태의 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS; Welgene Inc.)에 세척하였다.

2% (v/v)의 열-불활성화된 FBS 및 0.01% (v/v)의 트리톤 X-100 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 DPBS에 고정된 세포를 항-래빗(anti-rabbit) OCT3/4 (SSC-특이 마커; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 항-래빗 NANOG (SSC-특이 마커; Santa Cruz Biotechnology), 항-래빗 SOX2 (SSC-특이 마커; Chemicon), 항-래빗 PLZF (SSC-특이 마커; Santa Cruz Biotechnology), 항-래빗 TRA-1-60 (SSC-특이 마커; Millipore, Billerica, MA, USA), 항-래빗 TRA-1-81 (SSC-특이 마커; Millipore), 항-염소(anti-goat) GATA4 (세르톨리 세포-특이 마커; Santa Cruz Biotechnology), 및 항-염소 황체형성 호르몬 수용체 (LHR; 라이디히 세포-특이 마커; Santa Cruz Biotechnology) 항체로 4℃에서 2시간 동안 착색하였다.

그런 다음, Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG 또는 Alexa Fluor 568 donkey anti-goat IgG (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 항체를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 프라이머리 항체를 검출하였다.

상기 착색된 세포를 DPBS로 2회 세척한 후, FACSCalibur (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분류한 다음, BD CellQuest Pro software (Becton, Dickinson and Co.)를 이용하여 분석하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, OCT4 (95.92±5.41%), NANOG (96.34±2.09%), SOX2 (99.12±0.86%), TRA-1-60 (86.05±2.26%), TRA-1-81 (87.35±5.26%) 및 PLZF (95.23±0.53%)의 양성 반응을 나타내는 바, 적어도 86%의 양성 반응을 보임을 알 수 있다.

반면에, TRA-1-60 및 TRA-1-81은 상기 다른 정원줄기세포 특이 단백질에 비하여, 현저히 낮은 발현율을 보임을 알 수 있고, 또한 도 7에서 보는 바와 같이, LHR(6.98±1.13%), 라이디히 세포-특이 마커(Lee et al . 2013) 또는 GATA4 (6.68 ± 1.77%), 세르톨리 세포-특이 마커(Lee et al. 2013)의 발현율을 나타냄을 알 수 있는 바, 추정 정원줄기세포와 음성 대조군인 염색되지 않은 추정 정원줄기세포(6.01±0.07%) 간의 유의차는 관찰되지 않았다.

이때, 통계 분석은 실험예 3과 같이 실시하였다.

이와 같은 결과로부터, 본원발명의 petri dish plating post-DP 기법에 의해 정소세포로부터 분리한 추정 정원줄기세포의 대부분은 라이디히 세포 또는 세르톨리 세포로 오염되지 아니하고, 정원줄기세포 만으로 이루어진다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본원발명의 방법에 의하면, 신생 돼지의 정소로부터 정원줄기세포를 고수율, 고순도로 분리할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 방법은 포유동물의 정소로부터 고효율, 고순도로 정원줄기세포를 분리할 수 있기 때문에, 정원줄기세포의 마커 개발과 생물학적 특성 및 활성도 연구 분야 뿐만 아니라, 형질전환 동물의 생산 등과 같은 적극적인 활용법으로 널리 응용될 수 있다.

또한, 질병이나 노화 등으로 정액 채취가 불가능한 우수 종모돈, 종모우 등의 정소로부터 생식선줄기세포인 정원줄기세포를 채취하고 젊은 수여자 정소에 이식하여 인공수정 등에 유용한 이식된 종모돈, 종모우 등의 정원줄기세포 유래 정자를 생산할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 활용될 수 있다.

<110> Kangwon University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method of isolating spermatogonial stem cells from mammals <130> 9539 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of GAPDH <400> 1 agggctgctt ttaactctgg caa 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of GAPDH <400> 2 gatggtgatg gcctttccat tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of OCT4 <400> 3 cgcgaagctg gacaaggaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of OCT4 <400> 4 caaagtgagc cccacatcgg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of NANOG <400> 5 aaccaaacct ggaacagcca gac 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of NANOG <400> 6 gtttccaaga cggcctccaa at 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of EPCAM <400> 7 caatgcaggg tctacaggct gg 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of EPCAM <400> 8 tgcatctcgc ccatctcctt t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of THY1 <400> 9 gtgctcttgg gcactgtggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of THY1 <400> 10 tcttgctgga gatgctgggc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of UCHL1 <400> 11 tccggaagac agagcaaaat gc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer of UCHL1 <400> 12 tccggaagac agagcaaaat gc 22

Claims

(a) 백막 및 부정소를 제거한 포유동물의 정소에 효소를 처리하여 정소세포를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리한 정소세포를, 열-불활성화된 소태아 혈청(fetal bovine serum)이 부가된 DMEM 배지가 함유되고, 젤라틴이 피복된 페트리 디쉬에서 배양한 후, 부유 세포를 회수하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 회수한 부유 세포를, 열-불활성화된 소태아 혈청, 머캡토에탄올, 비필수 아미노산, 소디움 피루베이트, L-글루타민, 항생-항진균제 용액, 마우스 백혈구 저해 인자(mouse leukemia inhibitory factor) 및 글리아 세포 유래 신경영양 인자(glial cell-derived neurotrophic factor)를 포함하는 보충 성분이 부가된 DMEM 배지가 함유된 페트리 디쉬에 플레이팅하고, 35℃~39℃에서 12~18시간 동안 배양한 후 부유 세포를 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 효소는 콜라게나제, 하이아루로니다제, 트립신 및 디엔에이 가수분해효소 I(DNase I)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 분리방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 열-불활성화된 소태아 혈청은 DMEM 배지 대비, 10%(v/v)가 부가되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양은 35℃~39℃에서 12~20시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 보충 성분은 DMEM 배지 대비, 15%(v/v)의 열-불활성화된 소태아 혈청, 0.1mM의 머캡토에탄올, 1%(v/v)의 비필수 아미노산, 1mM의 소디움 피루베이트, 2mM의 L-글루타민, 1%(v/v)의 항생-항진균제 용액, 1,000units/ml의 마우스 백혈구 저해 인자(mouse leukemia inhibitory factor) 및 10ng/ml의 글리아 세포 유래 신경영양 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 분리방법.
제9항에 있어서, 상기 돼지는 생후 1 내지 60일령의 신생 돼지인 것을 특징으로 하는 분리방법.
삭제