KR20180109798A - 향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법 - Google Patents

향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법을 제공한다. 상기 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법은 태반 조직으로부터 부착형 세포의 수득율 및 증식율을 증가시킬 수 있으며, 신경질환에 효과적인 단백질을 분비하고, 손상된 조직으로의 이동 능력이 향상된 부착형 세포를 제조할 수 있다.

Description

향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법{Enhanced postnatal adherent cells and method for producing the same}
향상된 산후 부착형 세포 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
세포치료제는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 세포를 체외에서 증식 또는 선별 등의 방법으로 세포의 특성을 변화시켜 특정 질환의 예방 또는 치료의 목적으로 사용되는 의약품으로 최근 난치성 질환 및 재생의학에 각광을 받고 있는 분야이다. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)는 자가 증식할 수 있고, 다양한 계통(lineages)으로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포로서, 중간엽전구세포(mesenchymal progenitor cells)로 칭해지기도 한다. 중간엽줄기세포는 조건에 따라 뼈, 지방, 연골, 신경, 근육, 및 골수 기질 세포 등으로 분화될 수 있어 다양한 치료학적 효능을 갖는다. 중간엽줄기세포는 성체 줄기세포의 일종으로, 주로 골수로부터 분리되는 조혈모줄기세포와 함께 분리할 수 있는데, 부유 상태로 배양되는 특징을 갖는 조혈모줄기세포와는 다르게 배양 접시 등에 부착되는 특징을 갖는다. 이러한 배양 조건에서 분리 및 배양되는 중간엽줄기세포는 다양한 실험 및/또는 임상에 사용되어 왔다. 그러나, 중간엽줄기세포는 주로 골수, 지방, 제대혈로부터 분리하여 연구되어 왔으며, 골수 유래 중간엽줄기세포의 채취 및 분리 과정 시 공여자에게 고통이 수반되며, 중간엽줄기세포의 분리 효율이 낮다는 단점이 있다.
한편, 태반은 출산 후 버려지는 조직으로서 채취가 수월하며 많은 종류의 부착형 세포가 존재하는 기관으로, 부위별로 중간엽 세포, 탈락막(decidua) 세포, 영양막(trophoblast), 양막(amnion), 상피 세포(endothelial cells) 등의 다양한 세포들이 존재한다. Zhang 등은 태반으로부터 중간엽 전구 세포의 분리방법 및 얻어진 중간엽 전구 세포의 특성을 개시한 바 있다(Experimental Hematology 32 (2004) 657-664). 상기 논문에 따르면, 태반으로부터 양막 강(amniotic sac) 및 탈락막을 제거한 후, 인산 완충액으로 세척한 후, 관류액 및 배양액을 동맥-정맥 순환(arterial-vein circuit)을 통해 흘려 조직의 잔류 혈액을 제거한 다음, 상기 배양액 중에 12 시간 내지 24 시간 동안 담그고, 퍼콜 밀도 구배에 의해 단핵구 세포를 얻은 후, 소 태아 혈청이 함유된 배지 중에 재현탁시켜 중간엽 전구 세포를 분리한다. 상기 방법은 복잡한 단계를 수행하여야 하고, 퍼콜 밀도 구배 등의 과정을 거쳐야 하므로 실험실적 적용은 가능할 수 있으나, 오랜 시간 태반 자체에서 중간엽 전구 세포를 배양하므로, 태반 내에 존재하는 단핵세포들의 혼재를 초래할 수 있을 뿐 아니라 건강한 균일한 세포를 안정적으로 대량의 분리/정제가 곤란하여 임상적으로 적용하기에는 많은 어려운 점이 있다. 또한, 상기 방법은 양막 강 및 탈락막이 제거된 태반을 그대로 사용함으로써, 얻어지는 세포가 태반 융모(placental villi) 전반에서 분리되게 되는 다른 세포들과의 혼합으로 순도가 낮아지는 문제가 있다. 치료제로 사용이 가능할 정도의 충분한 약효를 보일 수 있는 세포의 안정적 공급 및 충분한 세포수의 확보는 세포치료제 연구에서 선행되어야 하는 부분이다. 기존의 줄기세포 뿐만 아니라 치료 및 재생이 가능한 세포군의 제조방법에 대한 연구가 시급한 현황이다.
기존에 세포치료제로 활용할 수 있는 세포의 분리에 관한 연구 및 활용에 있어서의 제한적인 윤리적 문제, 분리할 수 있는 세포수의 제한, 그리고 제한된 단일 조직에서 분리할 수 있는 세포의 종류 등을 고려할 경우, 세포치료제로 사용될 수 있는 치료 효과가 뛰어난 세포의 분리방법을 확립하는 것은 매우 중요하다. 그러나, 상기한 바와 같이 기존의 태반-유래 세포의 분리방법은 분리 효율이 낮다는 단점이 있어, 이를 대체할 수 있는 태반 유래 세포의 증식능과 분화능을 동시에 만족시키면서 세포치료제로 사용이 가능한 새로운 부착형 세포의 분리 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 분리된 태반으로부터 태반 유래 조직을 얻는 단계; 상기 태반 유래 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계; 상기 수거된 세포 집단을 용기에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및 분리된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 산후 부착형 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 분리된 태반 유래 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계; 상기 수거된 세포 집단을 플라스크에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및 분리된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 산후 부착형 세포의 제조 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 분리된 태반의 태반 유래 조직으로부터 향상된 산후 부착형 세포(ePACs)를 분리하고 배양하는 향상된 산후 부착형 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 향상된 산후 부착형 세포를 제조하는 방법은, 분리된 태반으로부터 태반 유래 조직을 얻는 단계; 상기 태반 유래 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계; 상기 수거된 세포 집단을 용기에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 향상된 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및 분리된 향상된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "태반(placenta)"은 포유류의 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 기관으로, 일구체예에 있어서, 인간의 태반일 수 있다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하게 된다. 태반은 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있으며, 탯줄을 포함한다. 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막이다. 융모막은 태아나 양수를 둘러싸고 있는 양막과 탈락막 사이에 있는 막으로, 수정란에서 발생하여 난막의 일부를 구성한다. 탯줄은 태아와 태반을 연결하여 모체와 태아의 물질교환이 일어나는 기관으로 태아의 배꼽을 통해 심장으로 연결된다.
본 발명에서 용어 "향상된 산후 부착형 세포(enhanced Postnatal adherent cells: ePACs)"는 섬유모세포의 모양을 띄고 있으며 무한 증식이 가능하며, 지방, 골세포, 연골세포와 같은 세포계열로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미할 수 있다. 또한, 포배낭의 내부 세포 덩어리로부터 유도되지 않은 세포를 의미할 수도 있다. 체외로 분리된 인간의 태반으로부터 산후 부착형 세포는 예를 들면, (1) 양막 상피 세포, (2) 양막에서 유래한 부착형 세포, (3) 융모막 부착형 세포, (4) 융모 영양막 세포, 및 (5) 탯줄 세포를 포함한다.
상기 태반은 건강한 산모로부터 출산 후 분리되어 폐기되는 태반을 사용할 수 있다. 즉, 상기 "분리된 태반"이라 함은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 태반을 의미한다. 상기 분리된 태반은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. 상기 분리된 태반으로부터 태반 조직을 얻는 단계는 통상의 해부학적 방법 예를 들어, 태반 내에 존재하는 태반 조직들을 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 얻어진 태반 조직은 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등)이 포함된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2 회 이상 세척함으로써, 조직에 존재하는 혈액 등의 오염물질들을 제거할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 태반 조직은 양막, 융모막 또는 탈락막 조직일 수 있다. 상기 태반 조직이 양막인 경우, 분리된 태반으로부터 융모막판막을 잡아당겨 벗겨 낸 후, 분리된 융모막판막을 스크래핑하여 융모막을 제거함으로써 양막을 얻을 수 있다.
상기와 같이 수거된 태반 조직은 직접 효소 처리하거나, 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게 세절한 후 효소 처리할 수 있다. 예를 들면, 상기 태반 조직을 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게(예를 들어, 약 5 mm 이하) 세절한 후, 세절된 세포에 효소 처리할 수 있다.
상기 효소 혼합물 용액은 여러 가지의 효소를 혼합한 효소 혼합물, 또는 반응 효소액을 의미할 수 있고, 상기 태반 조직과 반응하는 효소 혼합물 용액은 조직을 용해시켜, 조직으로부터 부착형 세포를 분리할 수 있다. 상기 효소 혼합물 용액은 콜라게나아제(collagenase), 트립신(trypsin), 및 디스파아제(Dispase)를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 효소 혼합물 용액은 콜라게나아제(collagenase), 트립신(trypsin), 및 디스파아제(Dispase)를 포함하는 물, 염수(saline), 예를 들면, HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 포함할 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라겐의 펩티드 결합을 파괴하는 효소를 의미할 수 있으며, 콜라게나아제 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 효소 혼합물 용액은 DNA 가수분해 효소(deoxyribonuclease, DNase) I 또는 II를 더 포함할 수 있다. 상기 효소 혼합물 용액 중 콜라게나아제의 농도는 예를 들면, 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.5 mg/ml 내지 3 mg/ml, 0.8 mg/ml 내지 2 mg/ml, 또는 0.8 mg/ml 내지 1.5 mg/ml일 수 있으며, 일구체예에 있어서, 1.2 mg/ml 일 수 있다. 상기 효소 혼합물 용액 중 트립신의 농도는 예를 들면, 1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 1 mg/ml 내지 3 mg/ml, 1.5 mg/ml 내지 2.5 mg/ml, 또는 1.5 mg/ml 내지 2 mg/ml일 수 있으며, 일구체예에 있어서, 1.8 mg/ml일 수 있다. 상기 효소 혼합물 용액 중 디스파아제의 농도는 예를 들면, 0.1 U/ml 내지 5 U/ml, 0.1 U/ml 내지 3 U/ml, 0.5 U/ml 내지 2.5 U/ml, 또는 0.5 U/ml 내지 1.5 U/ml일 수 있으며, 일 구체예에 있어서, 1 U/ml일 수 있다. 상기 효소 혼합물 용액 중 DNA 가수분해 효소의 농도는 예를 들면, 0.001 mg/ml 내지 1mg /ml, 0.001 mg /ml 내지 0.5 mg /ml, 0.01 mg /ml 내지 0.25 mg /ml, 또는 0.01 mg /ml 내지 0.05 mg /ml일 수 있으며, 일 구체예에 있어서 0.025 mg /ml일 수 있다.
일구체예에 있어서, 상기 조직과 효소 혼합물 용액의 반응은 진탕을 수행하여 반응이 이루어질 수 있으며, 상기 진탕은 약 20 내지 40 ℃, 약 30 내지 40 ℃, 또는 35 내지 40 ℃, 예를 들면, 37 ℃에서 수행할 수 있고, 약 5 내지 60 분간 또는 10 내지 30분간 수행할 수 있으며, 또한 예를 들면 10 내지 30분간 2번을 수행할 수 있다.
추가적으로, 상기 조직과 효소 혼합물 용액의 반응 후에, 반응 효소액을 불활성화 하긴 위한 과정을 추가로 수행할 수 있으며, 예를 들면, FBS를 첨가하여 상기 효소 반응을 정지시킬 수 있다. 또한, 효소 반응액으로부터 조직 세포, 예를 들면, 양막 세포(즉, 부착형 세포)를 분리하는 방법은 통상의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들면 원심분리 한 후, 세포체를 사용하여 세포를 분리할 수 있다.
본 발명에서 용어, "향상된 산후 부착형 세포(ePACs)의 분리"는 지방, 골세포, 연골세포와 같은 세포계열로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미하며, 상기 효소 혼합물 용액을 조직에 처리하여, 세포의 집단을 분리하는 것은 향상된 산후 부착형 세포를 분리하는 것과 호환적으로 사용되며, 즉, 예를 들면, 양막 세포의 분리는 양막 유래 부착형 세포의 분리와 호환적으로 사용되고, 상기 분리된 태반의 세포로부터 향상된 산후 부착형 세포를 효소를 사용하여 단일세포로 선별하는 것은 통상의 당업계에 잘 알려진 사항이다.
상기 분리된 세포 집단을 용기에서 부착 배양 한 후, 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리하여 부착형 세포의 분리 순도를 높일 수 있다. 상기 분리된 세포 집단을 용기(예를 들면, 플라스크)에서 부착 배양(예를 들면, P0)하는 단계는 세포 배양 배지, 예를 들어 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4) 및 헤파린이 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배지 중 FGF-4 는 약 10 ng/ml 내지 약 40 ng/ml, 또는 약 20 ng/ml 내지 약 30 mg/ml의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들면 25 ng/ml일 수 있다. 상기 배지 중 헤파린은 약 0.5 ㎍/ml 내지 2 ㎍/ml, 또는 0.5 ㎍/ml 내지 1.5 ㎍/ml의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들면 1 ㎍/ml일 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 소 태아 혈청, 및 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등)를 추가적으로 포함할 수 있다. 일구체예에 있어서, 10%의 소 태아 혈청, 50 ㎍/ml의 겐타마이신, 1 ㎍/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 FGF-4가 첨가된 PS-CM 배지가 사용될 수 있다. 상기 세포 집단의 배양은 저산소 조건하에서 수행할 수 있다. 용어 "저산소(hypoxia)"는 통상적인 정상산소 조건인 산소 분압 21%에 비해 낮은 산소 분압 상태를 의미할 수 있다. 상기 저산소 조건은 1 내지 15%, 1 내지 12%, 1 내지 10%, 또는 1 내지 5%의 산소 분압을 갖는 상태일 수 있으며, 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 9% 일 수 있다. 상기 배양은 예를 들면 2 내지 7일, 또는 3 내지 5일 동안 수행할 수 있으며, 배양 후 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리할 수 있다.
본 발명에서 용어 "동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) 효소"는 비동물 기원으로, 이는 효소가 동물 공급원으로부터 정제되지 않음을 의미할 수 있다. 상기 동물 유래 성분이 없는 효소는 재조합 기원일 수 있으며, 예를 들면 세균, 효모 또는 식물 기원일 수 있다. 재조합 기원의 효소는 그의 생산을 위해 미생물, 예컨대 세균, 바이러스, 효모, 식물 등의 사용을 포함하는 재조합 DNA 기술로 생산되는 임의의 효소를 의미할 수 있다. 상기 효소는 동물 유래 성분이 없는 재조합 트립신일 수 있으면, 예를 들면 옥수수 내에서 생산된 재조합 트립신일 수 있다. 상기 동물 유래 성분이 없는 재조합 트립신은 상업적으로 구매 가능하며, 예를 들면, TrypLETM Select(GIBCO Invitrogen), TrypLETM Express(GIBCO Invitrogen), TrypZeanTM(Sigma Aldrich) 또는 Recombinant Trypsin SolutionTM(Biological Industries)일 수 있다.
본 발명의 일구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법에 있어서, 상기 계대배양의 계대수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 원하는 증식 세포의 수에 따라 적절히 계대수를 선택할 수 있다. 전형적으로는, 적어도 1 계대 이상, 10 계대 이상일 수 있으며, 예를 들면, 1 내지 20 계대, 1 내지 6 계대, 1 계대, 3 계대, 또는 6 계대 수행함으로써 임상적으로 필요한 수의 누적 증식세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포(ePACs)의 제조 방법에 있어서, 상기와 같이 얻어진 향상된 산후 부착형 세포를 세포 배양 배지, 예를 들어 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4) 및 헤파린이 첨가된 배지 중에서 계대 배양하는 단계를 포함한다. 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4) 및 헤파린이 첨가된 배지 및 배양 조건에 대해서는 상기한 바와 같다. 또한, 계대 배양시에도 상기한 바와 같이, 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리를 추가적으로 수행할 수 있다. 즉, 각각 계대 배양하는 단계마다 다음 단계로 세포를 계대하기 전 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리하여 세포를 수거함으로써 부착형 세포의 순도를 높일 수 있다. 예를 들면, P1에서 P2로 넘어가는 단계에서 P2를 위해 세포를 이식하기 전에 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 처리할 수 있다.
본 발명에서 제조한 향상된 산후 부착형 세포는 세포가 분화ㆍ증식되면서 세포 표면에 발현되는 부착형 세포 표지자에 대하여 CD44, CD73, CD90 및 CD105 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하고, 조혈세포 표지자인 CD45 음성 표면 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "양성"은 세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD105에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD105+"이다. 본 발명에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD45에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD45-"이다.
본 발명의 일구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포(ePACs)의 제조 방법에 있어서, 세포 집단 수거 단계는 효소 혼합물 용액을 사용하여, 그를 사용하지 않는 것에 비해 향상된 산후 부착형 세포의 수득율을 예를 들면, 50 배 이상 증가시킬 수 있다.
다른 구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법에 있어서, 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리는, 그를 처리하지 않는 것에 비해 촘촘한 덩어리 모양의 세포는 분리되지 않고, 계대 후 균질성의 세포만 남길 수 있다.
또 다른 구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법에 있어서, 향상된 산후 부착형 세포 배양 단계에서, 저산소 조건에서 배양함으로써, 세포의 배가 시간을 단축시켜, 세포의 증식율을, 예를 들면, 7 배 이상 증가시킬 수 있다.
또한, 일구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법에 의해 제조된향상된 산후 부착형 세포는 하기 표 3에 기재된 단백질을 분비할 수 있다. 특히, 상기 향상된 산후 부착형 세포는 신경질환에 특이적으로 효과적인 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor) (VEGF), 형질전환성장인자(transforming growth factor)(TGF)-β1, 간세포성장인자(Hepatocyte growth factor) (HGF), 인터루킨-6(interleukin, IL-6) 또는 프로그라눌린(progranulin)을 분비할 수 있다. 또한, 다른 구체예에 따르면, 상기 향상된 산후 부착형 세포는 손상된 조직으로의 이동 능력이 현저하다. 따라서, 상기 향상된 산후 부착형 세포는 세포치료제로서 신경 질환 및 그외 상기 분비 단백질이 유용하게 작용할 수 있는 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
다른 양상은 분리된 태반 유래 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계; 상기 수거된 세포 집단을 플라스크에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 향상된 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및 분리된 향상된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 향상된 산후 부착형 세포의 제조 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 발명에서 "향상된 산후 부착형 세포의 제조 효율 증가"는 상기 기재된 단계의 방법이 수행되는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 향상된 산후 부착형 세포를 제조하는 방법에 비해서 세포의 수득율이 증가하거나, 증식율이 증가하거나, 또는 세포의 순도가 증가하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 향상된 산후 부착형 세포의 제조 효율 증가는 상기 효소 혼합물 용액을 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 수득율을 증가시키는 것, 상기 정상산소 조건에 비하여 부착형 세포의 증식율을 증가시키는 것, 또는 상기 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 순도를 증가시키는 것일 수 있다.
또한 제조 효율 증가는 제조 방법 자체의 효율 증가뿐만 아니라, 제조된 부착형 세포의 유용한 특성이 증가되는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 일구체예에 따라 제조된 부착형 세포에서 상기한 바와 같은 질환 치료에 유용한 단백질의 생산이 증가되는 것 또는 손상된 조직으로의 이동 능력이 증가하는 것을 포함할 수 있다.
다른 양상은 분리된 태반으로부터 태반 유래 조직을 얻는 단계; 상기 태반 유래 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계; 상기 수거된 세포 집단을 용기에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 향상된 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및 분리된 향상된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계를 포함하는 향상된 산후 부착형 세포를 제조하는 방법에 의해 제조된 향상된 산후 부착형 세포를 제공한다.
상기 방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 의해 제조된 향상된 산후 부착형 세포는 세포 표면에 발현되는 부착형 세포 표지자에 대하여 CD44, CD73, CD90 및 CD105 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,98% 또는 약 99% 발현하고, 조혈세포 표지자인 CD45 음성 표면 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 향상된 산후 부착형 세포는 하기 표 3에 기재된 단백질을 분비하는 것일 수 있고, 손상된 조직으로의 이동 능력이 증가된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 향상된 산후 부착형 세포(ePACs)를 포함하는 세포 치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 따른 향상된 산후 부착형 세포(ePACs)는 상기한 바와 같이 질환 치료에 유리한 단백질을 분비하고, 손상된 조직으로의 이동 능력이 현저하므로, 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제 또는 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 질환의 예는 신경계 질환, 간질환 또는 대사성 질환을 포함할 수 있다. 상기 신경계 질환의 예는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 만성 또는 급성 뇌졸중(stroke), 뇌경색, 뇌종양, 뇌부종, 뇌허혈, 다발성 경화증, 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 또는 권투선수 치매 (Dementia pugilistica, DP)를 포함할 수 있다. 상기 대사성 질환의 예는 비만, 제1 형 또는 제2 형 당뇨병, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 또는 비알콜성 지방간(fatty liver)을 포함할 수 있다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 부착형 세포를 기준으로 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0 X 107 내지 1.0 X 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 부착형 세포와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약 학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
일 양상에 따른 향상된 산후 부착형 세포의 분리 및 배양방법에 의하면, 태반 조직으로부터 부착형 세포의 순도, 수득율 및 증식율을 증가시킬 수 있으며, 신경질환에 효과적인 단백질을 분비하고, 손상된 조직으로의 이동 능력이 향상된 부착형 세포를 제조할 수 있다. 특히, 본 발명의 부착형 세포는 높은 분화능과 증식능을 보유하고 있어 세포치료제로서 적합한 특성을 유지할 수 있다.
도 1은 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 균질성 및 표면 항원 특성을 나타낸 도면이다.
도 2는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 효소 반응액의 성분에 따른 세포수득율을 나타낸 도면이다.
도 3은 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 배양 조건(저산소 및 정상 산소 조건)에 따른 특성을 비교 분석한 도면이다.
도 4는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법에 의해 제조된 부착형 세포의 형태학적 특성과 유전적 안전성 여부를 나타낸 도면이다.
도 5는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법에 의해 제조된 부착형 세포의 분비 단백질을 계대 배양에 따라 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 향상된 산후 부착형 세포의 제조 방법
1. 태반의 양막 조직으로부터 부착형 세포의 분리 및 배양
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 융모막판막을 잡아당겨 벗겨내었다. 분리된 융모막판막을 겐타마이신이 함유된 Ca/Mg free DPBS로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거한 다음, 슬라이드글라스를 사용하여 융모막(chorionic plate)을 긁어내어 제거하였다(scraping). 남은 양막을 수술용 가위로 약 1 내지 5 mm가 되도록 최대한 세절하고 세절된 조직에 효소반응액 (Enzyme mixture) 20 ㎖을 투입하여 진탕 배양기(shaking incubator)에서 37℃에서 200 rpm으로 15분 반응시켰다. 반응 효소액을 불활성화하기 위하여 1:10의 비율로 2 ㎖ FBS를 첨가하였고, 반응액을 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 담았다. 상기 과정은 남은 조직에 대해 2회 반복되었다. 용해된 조직을 100 ㎛ 세포체(Cell strainer)를 사용하여 양막 세포를 분리하였다.
분리된 양막 세포를 원심분리 후 상층액을 제거하고 FGF4와 헤파린이 첨가된 배지(PS-CM 배지)로 세포침전물을 현탁하여 T-플라스크에 접종 후 37 ℃, 저산소 배양조건 (CO2 5%, O2 3%)에서 배양하였다. 세포가 군집을 형성하여 T-플라스크 바닥면적의 50 ~ 80% 를 차지할 때까지 배양하였다. 3 내지 4일마다 PS-CM배지(FGF, Heparin 및 FBS가 포함된 배양액)를 교체하여 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고 첫 계대에서 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소인 Invitrogen사의 TrypLE를 37 ℃인큐베이터에서 단기간 (3분) 처리하였을 때 분리된 세포만을 사용하여 양막 유래 부착형 세포의 순도를 높였다.
상기 사용된 효소 반응액(Enzmye mixture)의 성분 및 PS-CM 배지의 성분은 각각 하기 표 1 및 표 2로 나타내었다.
효소 반응액의 성분
구성성분 농도 입수처
HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) - Invitrogen
트립신(Trypsin) 1.8 ㎎/㎖ Sigma
디스파아제(Dispase) 1 U/㎖ Invitrogen
콜라게나아제(Collagenase) Ⅰ 1.2 ㎎/㎖ Invitrogen
DNA가수분해효소(DNase) Ⅰ 25 ㎍/㎖ Rhoche
PC-CM 배지의 성분
구성성분 농도 입수처
MEM alpha GlutaMAX Invitrogen
소태아혈청(FBS) 10 % Invitrogen
섬유아세포성장인자 4(FGF4) 25 ng/㎖ Peprotech
헤파린(Heparin) 1 ㎍/㎖ Sigma
겐타마이신(Gentamicin) 50 ug/ml Invitrogen
상기 양막 유래 부착형 세포의 제조 과정 중 분리된 세포 집단을 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는 효소 처리 후, 및 계대 후 세포를 도립현미경(Eclipse TS100 (Nikon))을 이용하여 100X 배율로 관찰하고, 그 결과를 도 1a로 나타내었다. 또한, 상기 제조한 양막 유래 부착형 세포의 특성을 분석하기 위하여, 1x106개의 세포를 1.5 ml 튜브에 모아서 각 항-CD44, 항-CD73, 항-CD90, 항-CD105, 및 항-CD45로 염색한 후 FACS caliber를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 1b로 나타내었다.
도 1은 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 균질성 및 표면 항원 특성을 나타낸 도면이다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 단기간의 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리로 촘촘한 덩어리 모양의 세포는 분리되지 않고, 계대 후 균질성의 세포만 남는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 분리 직후 부착형 세포 마커들의 양성세포가 10% 미만으로 발현하지만 계대 후 부착형 세포 마커가 90%이상 발현하며 CD45는 1% 미만으로 발현함을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법을 사용하면, 향상된 산후 부착형 세포의 순도를 높일 수 있음을 확인할 수 있다.
2. 효소 반응액의 성분에 따른 양막 유래 부착형 세포 수득율 분석
상기 표 1의 효소 반응액과 같이, HBSS용액에 1.2 mg/㎖ 콜라게나아제, 1.8 mg/㎖ 트립신, 25 ug/㎖ DNase , 1 U/㎖ 디스파아제를 혼합한 효소 반응액을 사용한 양막 유래 부착형 세포 수득율을 분석하기 위해, 상기 효소 반응액에서 각각 1.2 mg/㎖ 콜라게나아제, 1.8 mg/㎖ 트립신, 1 U/㎖ 디스파아제가 제거된 3개의 효소 반응액(콜라게나아제 배제군, 디스파아제 배제군 및 트립신 배제군)을 비교 대조군으로 사용하였다.
구체적으로, 상기 표 1의 효소 반응액 및 비교 대조군 3개의 효소 반응액을 각각 사용하여 태반의 양막 조직으로부터 부착형 세포를 분리하였고, 그의 수득율을 비교하기 위해 각각의 효소 반응액으로부터 분리된 세포를 T-플라스크 접종 후 37 ℃, 저산소 배양조건 (CO2 5%, O2 3%)에서 배양하였다. 3 내지 4일마다 PS-CM배지를 교체하여 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하면서 상기 표 1의 효소반응액으로 분리한 세포군에서 세포가 군집을 이룰 때까지 배양한 다음 각각의 T-플라스크로부터 세포를 분리 후 계수된 세포 수를 조직 무게 (g)당 세포수로 환산하여 수득된 세포 수율을 확인하였다. 또한, 상기 효소 반응액으로 분리된 부착형 세포의 형태를 도립현미경(Eclipse TS100 (Nikon))40X 배율로 관찰하였고 그의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 효소 반응액의 성분에 따른 세포수득율을 나타낸 도면이다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 표 1에 따른 효소 반응액은 콜라게나아제 배제군, 트립신 배제군, 및 디스파아제 배제군에 비해 현저하게 양막 유래 부착형 세포의 수득율이 높았으며, 특히 콜라게나아제 배제군과는 약 50 배 이상, 트립신 배제군과는 약 5 내지 6배 이상 세포 수득 효율이 증가하였다.
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 표 1에 따른 효소 반응액을 사용하여 분리된 부착형 세포의 형태는, 콜라게나아제 배제군, 트립신 배제군, 및 디스파아제 배제군에 비해 불규칙적인 돌기를 갖은 섬유아세포 특이적인 형태를 보이는 세포로 구성된 것을 확인할 수 있다.
3. 배양 조건에 따른 부착형 세포의 비교 분석
배양 조건에 따른 부착형 세포의 특성을 분석하기 위해, 저산소 조건에서 배양된 부착형 세포를 정상 산소 조건에서 배양된 부착형 세포와 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1의 1의 저산소 조건을 정상 산소 조건으로 한 것만을 제외하고는 동일한 방법으로, 정상산소조건에서 부착형 세포를 분리하고 배양하였다. 상기 저산소 조건 및 정상 산소 조건에서 1 내지 19회 계대 배양(P1 내지 P19)된 부착형 세포의 총 세포 수 및 배가 시간을 비교하기 위해 각각 같은 수의 세포를 6 웰 플레이트에 접종하여 플레이트 바닥면적의 70 ~ 80% 차지할 때 세포를 수집하여 세포 수를 측정하였다. 측정은 총 3 반복 실시하였다. 총 세포 수는 세포현탁액의 10 ㎕와 트립판 블루 10 ㎕를 섞은 다음 그 중 10 ㎕를 혈구계산기(Hemocytometer)를 이용하여 계수하였다. 배가 시간은 세포 수가 2배에 이르는 시간으로 총 세포수와 이를 측정한 시간을 이용하여 계산하였다. 또한 세포의 손상된 조직으로의 이동능력을 분석하기 위하여 트랜스웰(transwell)을 사용하여 세포의 이동 능력을 확인하였다. 트랜스웰 위쪽에 각각의 세포를 같은 수로 접종한 후, 아래칸 배양액에 케모카인(chemokine)을 넣어 주었다. 수일 배양한 다음 트랜스웰을 통하여 이동한 세포 수를 계수하여 세포 이동을 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법의 배양 조건(저산소 및 정상 산소 조건)에 따른 특성을 비교 분석한 도면이다.
도 3a 및 b에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건에서 배양된 세포는 정상 산소 조건에서 배양된 세포와 비교하였을 때, 세포의 배가 시간이 20시간 내외로 단축되어 빠른 속도로 세포의 증식이 일어나며, 그 결과 같은 기간 내에 축적되는 세포 수가 7 배 이상 현저히 증가함을 확인할 수 있다.
또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 세포의 손상된 조직으로의 이동 능력을 분석한 결과, 저산소 조건에서 정상 산소 조건에 비해 약 2 배 이상 세포의 이동 능력이 좋아짐을 확인할 수 있다. 상기의 결과로 저산소 조건에서 배양된 부착형 세포는 손상된 조직으로의 유의적인 이동 능력을 가져, 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
4. 부착형 세포의 형태학적 특성과 유전적 안전성 분석
실시예 1의 1에서 제조한 부착형 세포의 유전적 이상 여부를 확인하기 위해, 형태학적 특성과 유전적 안전성을 분석하였다.
구체적으로, P7 및 P14에서 부착형 세포의 형태를 관찰하기 위해 도립현미경(Eclipse TS100 (Nikon))을 이용하여 40X 배율로 세포형태를 관찰하였다. 세포는 불규칙한 돌기를 가진 방추형의 섬유아세포의 특이적 형태를 보이는 것이 확인하었고, 핵형 분석을 G-밴딩(banding) 방법으로 분석하였다(Gosden JR (1994) Chromosome analysis protocols. In: Walker JM(ed.), Methods in Molecular Biology, vol. 29. Totawa: Humana Press., Sumner AT (1990) Chromosome Banding. London: Unwin Hyman).
또한, P1, P3, 및 P6에서 부착형 세포의 염색체 이상 여부를 SNPs(Single Nucleotide polymorphisms)방법을 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 각 계대의 세포로부터 프로메가 DNA 추출 키트(Promega DNA Extraction Kit)를 이용하여 DNA를 추출하여 시료로 사용하였다. 일루미나 휴먼옴니1-쿼드 칩(Illumina HumanOmni1-Quad Chip)을 이용하였으며 iSCAN® 스캐너를 사용하여 측정하였다. 먼저, 400 ng의 각 DNA 시료는 전체 게놈 증폭(whole genome amplification) 방법으로 증폭하여 화학적인 방법으로 무작위로 조각을 내어 2-프로판올 침전법으로 정제를 수행한 후, 칩은 DNA 시료를 넣기 전에 완충용액으로 전 처리된 칩에 DNA 시료를 가하였다. 그 다음 약 16 시간 동안 인큐베이션 시행 후, 염색, 대립 유전자 특이적 프라이머 확장(allele specific primer extension) (ASPE), 혼성화(hybridization), 표적 제거(target removal), 및 세척을 수행한 후, 일루미나아이스캔(IlluminaiScan)으로 스캐닝을 수행하여 게놈스튜디오 소프트웨어(GenomeStudio® software)를 사용하여 데이타를 분석하였다.
상기의 결과는 각각 도 4a 및 b로 나타내었다.
도 4는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법에 의해 제조된 부착형 세포의 형태학적 특성과 유전적 안전성 여부를 나타낸 도면이다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, P14까지 배양된 세포는 형태학적으로 잘 유지되고 있으며, 불규칙적인 돌기를 갖는 섬유아세포 특이적인 형태를 지니고 있음을 확인할 수 있고, 또한, 유전적 변이도 없음을 확인할 수 있다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, P1, P3, 및 P6까지 배양된 부착형 세포는 염색체에 이상이 없음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 향상된 산후 부착형 세포의 분비단백질 분석 프로파일링 및 정량적 분석
1. 분비 단백질 분석 프로파일링
실시예 1의 1에서 제조한 부착형 세포의 분비 단백질을 분석하기 위해 분비단백질 프로파일링을 수행하였다.
구체적으로, 상기 배양된 부착형 세포를 혈청이 없는 배지인 MEM 알파 글루타맥스(MEM alpha GlutaMAX) (Invitrogen)에서 분비단백질을 분비하도록 한 후 분비된 단백질을 농축하여 1 mg/㎖가 되도록 하였다. 상기 농축액을 사용하여 504가지 분비 단백질을 분석할 수 있는 인간 항체 어레이 (Raybio)를 통하여 부착형 세포에서 분비하는 단백질을 분석하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 총 48가지의 단백질을 분비함을 확인할 수 있었다.
순위 Cytokine 순위 Cytokine
1 Thrombospondin (TSP) 26 sFRP-1
2 EDA-A2 27 TGF-beta RI / ALK-5
3 IGFBP-rp1 / IGFBP-7 28 IL-15 R alpha
4 Thrombospondin-1 29 ENA-78
5 MMP-1　 30 IL-7
6 HGF　 31 SPARC　
7 IL-8 32 VEGF
8 sgp130 33 Inhibin B
9 WIF-1 34 IGFBP-3　
10 IL-6 35 Nidogen-1
11 TIMP-2　 36 EMAP-II
12 GRO 37 Progranulin
13 Latent TGF-beta bp1　 38 MIF　
14 GDF-15 39 IL-3
15 sFRP-4 40 IGFBP-6
16 IL-19 41 TIMP-1　
17 Kremen-2 42 IGF-II R
18 TGF-beta RIII 43 Activin C
19 M-CSF 44 Smad 4
20 MSP alpha Chain 45 Decorin
21 MIP 2 46 Dkk-1
22 TNF RI / TNFRSF1A 47 MIP-1a
23 MCP-3 48 FGF-7 / KGF
24 Galectin-3
25 MCP-1
2. 분비 단백질 정량적 분석
상기 분비 단백질 중 일부 특정 단백질들이 신경질환에 효과적인 단백질들이 존재하며, 손상된 조직을 재생하는데 유용한 단백질 VEGF, TGF-β1, 프로그라눌린(Progranulin), HGF 및 IL-6이 분비되는 것을 확인하였으며, 이들을 정량적으로 분석하였다.
ELISA(효소면역염색)방법으로 상기 5개 단백질의 분비량을 분석하였다. 각 계대의 세포를 같은 수로 6 웰 플레이트에 접종하여 1일 배양 후, 혈청이 없는 배지인 MEM 알파 글루타맥스(MEM alpha GlutaMAX )(Invitrogen)로 교체한 후 1일 배양한 후, 이 배양액을 시료로 사용하였다. 하기 표 4와 같이 각각의 ELISA 키트에 따라 진행하였으며, 그 중 TGF-β1은 시료의 전처리과정을 포함한다. 모두 450nm에서 마이크로플레이트리더 Epoch (BioTek Inc.)를 사용하여 측정하였으며 Gen5 (2.00) 소프트웨어를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 5로 나타내었다.
ELISA Kit 제품번호 입수처
인간 VEGF DVE00 R&D system
인간 TGF-β1 DB100B R&D system
인간 프로그라눌린(Progranulin) DPGRN0 R&D system
인간 HGF SEA047Hu Uscn life Science Inc.
인간 IL-6 D6050 R&D system
도 5는 일구체예에 따른 부착형 세포 제조 방법에 의해 제조된 부착형 세포의 분비 단백질을 계대 배양에 따라 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, VEGF 및 IL-6의 경우 계대가 진행됨에 따라 증가하는 양상을 나타내었고, TGF-β1 및 프로그라눌린의 경우 1,000 pg/㎖이상으로 분비되는 것을 확인하였다. 상기의 결과로, 일구체예에 따라 제조된 부착형 세포는 신경 질환에 특이적인 단백질으로 분비함으로써, 세포치료제에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. 분리된 태반으로부터 태반 유래 조직인 양막을 얻는 단계;
    상기 태반 유래 조직인 양막 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계;
    상기 수거된 세포 집단을 용기에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및
    분리된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계로서, 계대 배양 단계 마다, 계대 배양을 위한 세포 이식 전 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리를 더 포함하는 것인 단계를 포함하는 산후 부착형 세포를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 효소 혼합물 용액은 콜라게나아제(collagenase), 트립신(trypsin), 및 디스파아제(Dispase)를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소는 재조합 트립신 효소인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 태반 유래 조직으로부터 양막 조직을 얻는 방법은 태반의 융모막판막을 스크래핑(scraping)하여 융모막을 제거함으로써 양막 조직을 얻는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 효소 혼합물 용액은 DNA 가수분해효소(DNase)를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 효소 혼합물 용액 중 콜라게나아제는 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml, 트립신은 1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 또는 디스파아제는 0.1 U/ml 내지 5 U/ml의 농도로 포함되어 있는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 효소 반응은 30 내지 40 ℃에서 5 내지 60 분간 진탕을 수행하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 저산소 조건은 산소 분압이 1 내지 12%인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 계대 배양은 1 내지 20 계대까지 수행하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 집단을 수거하는 단계는 상기 효소 혼합물 용액을 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 수득율을 증가시키는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 정상산소 조건에 비하여 부착형 세포의 증식율을 증가시키는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 부착형 세포를 분리하는 단계는 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 순도를 증가시키는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 제조된 부착형 세포는 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor) (VEGF), 형질전환성장인자(transforming growth factor)(TGF)-β1, 간세포성장인자(Hepatocyte growth factor) (HGF), 인터루킨-6(interleukin, IL-6), 프로그라눌린(progranulin) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 분비하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 제조된 부착형 세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105 양성 표면 마커를 80%이상 발현하고 CD45 음성 표면 마커를 10%이하로 발현하는 것인 방법.
  15. 분리된 태반 유래 조직인 양막 조직에 효소 혼합물 용액을 첨가하여 세포 집단(cell population)을 수거하는 단계;
    상기 수거된 세포 집단을 플라스크에 부착 배양한 후, 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free) (ACF) 재조합 효소를 처리하여 산후 부착형 세포를 분리하는 단계; 및
    분리된 산후 부착형 세포를 정상산소 조건인 21%에 비해 낮은 저산소 조건에서 섬유아세포성장인자-4(FGF-4) 및 헤파린을 포함하는 배지에서 계대 배양하는 단계로서, 계대 배양 단계 마다, 계대 배양을 위한 세포 이식 전 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소의 처리를 더 포함하는 것인 단계를 포함하는 산후 부착형 세포의 제조 효율을 증가시키는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 부착형 세포의 제조 효율 증가는 상기 효소 혼합물 용액을 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 수득율을 증가시키는 것, 상기 정상산소 조건에 비하여 부착형 세포의 증식율을 증가시키는 것, 또는 상기 동물 유래 성분이 없는 재조합 효소를 사용하지 않는 것에 비하여 부착형 세포의 순도를 증가시키는 것인 방법.
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