EA034065B1 - Способ культивирования бычьих и свиных сперматогониальных стволовых клеток без использования клеток-фидеров - Google Patents

Способ культивирования бычьих и свиных сперматогониальных стволовых клеток без использования клеток-фидеров Download PDF

Info

Publication number
EA034065B1
EA034065B1 EA201491526A EA201491526A EA034065B1 EA 034065 B1 EA034065 B1 EA 034065B1 EA 201491526 A EA201491526 A EA 201491526A EA 201491526 A EA201491526 A EA 201491526A EA 034065 B1 EA034065 B1 EA 034065B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
ssc
bovine
stem cells
cell
Prior art date
Application number
EA201491526A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491526A8 (ru
EA201491526A1 (ru
Inventor
Джон Майкл Оатли
Мелисса Джоан Оатли
Original Assignee
Вашингтон Стейт Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вашингтон Стейт Юниверсити filed Critical Вашингтон Стейт Юниверсити
Publication of EA201491526A1 publication Critical patent/EA201491526A1/ru
Publication of EA201491526A8 publication Critical patent/EA201491526A8/ru
Publication of EA034065B1 publication Critical patent/EA034065B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/42—Gynaecological or obstetrical instruments or methods
    • A61B17/425—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/52—Sperm; Prostate; Seminal fluid; Leydig cells of testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/101—Bovine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/24—Genital tract cells, non-germinal cells from gonads
    • C12N2502/246—Cells of the male genital tract, non-germinal testis cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

Изобретение относится к производству и культивированию недифференцированных сперматогониальных стволовых клеток, которые можно поддерживать длительное время и которые являются лишенными фидера. Конечные свободные от фидера популяции можно применять в любом количестве протоколов, включая создание потомства быков. Настоящее изобретение включает новые способы, требуемые для успешного обогащения бычьих сперматогониальных стволовых клеток, новых линий клеток и других компонентов, применяемых для той же цели, так же как и конечные композиции стволовых клеток.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В данной заявке испрашивается приоритет по 35 U.S.C. § 119 предварительной заявке с серийным № 61/598437, поданной 14 февраля 2012, включенной в данную заявку во всей полноте посредством ссылки.
Предоставленная ссылка
Это изобретение создано при поддержке государства по контракту № 117232-001, выданному Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов. Государство имеет абсолютные права на изобретение.
Уровень техники, к которой относится изобретение
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, которые обладают двумя отличительными свойствами; самообновлением и способностью дифференцироваться в одну или более последовательностей клеточного поколения. Процесс самообновления включает саморепликацию стволовой клетки для обеспечения репродукции и распространения, где стволовая клетка остается в недифференцированном виде. Клетки-предшественники также являются недифференцированными клетками, которые обладают способностью к дифференцировке в одну или более последовательностей клеточных поколений, но имеют ограниченную способность или не имеют способности к самообновлению. При поддержании в культуре недифференцированные клетки, такие как стволовые или клеткипредшественники, могут подвергаться спонтанной дифференцировке, таким образом теряя желаемый недифференцированный клеточный фенотип. Таким образом, необходимы методы культивирования для минимизирования спонтанной дифференцировки с целью поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток или клеток-предшественников.
Поддержание недифференцированных клеток в недифференцированном состоянии является критическим для их применения, например, в индустрии и медицине, поскольку главная научная и терапевтическая польза этих клеток выражается в их способности разрастаться в гомогенные популяции, которые могут дополнительно пролиферировать или дифференцировать в зрелые клетки, как необходимо, например, в научных исследованиях или для восстановления повреждения клеток или тканей пациента. Как только они спонтанно дифференцируют в клеточной культуре, клетки становятся менее пролиферирующими и менее способными к дифференцировке в различные типы клеток, как необходимо. Гомогенную культуру недифференцированных стволовых клеток, таким образом, интенсивно ищут после нереализованной цели в исследованиях ученых и в производстве.
Текущие методы культивирования недифференцированных клеток (например, различных типов стволовых клеток) пытаются минимизировать такую спонтанную дифференцировку путем ежедневной доставки фактора роста фибробластов-2 (FGF2, ФРФ2) клеточным культурам или более редкой доставки, чем каждый день, что известно как кормление. Для ФРФ2 показано стимулирование самообновления стволовых клеток путем ингибирования дифференцировки стволовой клетки; тем не менее, это ингибирование является неполным, и культуры стволовых клеток имеют тенденцию к постепенной дифференцировке, таким образом, сводя на нет пользу культуры стволовых клеток. Более того, стволовые клетки, такие как эмбриональные или сперматогониальные стволовые клетки, которые обычно должны выращиваться на питающих клетках фибробласта эмбриона мыши (MEF). Это громоздкая стадия, которую желательно исключить, приводящая к популяции стволовых клеток, насыщенных клетками-фидерами, которые нельзя применять в различных протоколах оплодотворения и продукции гамет.
Способность условно индуцировать развитие линий стволовых клеток путем процесса сперматогенеза in vitro для продуцирования гамет предоставит долгожданную технологию для биомедицинского исследования и, в частности, для разведения животных, если такие протоколы утвердят для различных видов. Отмечается, что наибольший успех достигнут только на мышах и крысах, что оставляет более крупных животных, таких как быки, без таких преимуществ.
Открытие того, что стволовые клетки, содержащиеся в фракциях диссоциированных клетках яичек мышей и крыс, сохраняют свою способность восстанавливать сперматогенез в семенниках мышейреципиентов, является основным для обеспечения таких культур (см. Brinster с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11303-11307; Brinster с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:11298-11302; Clothier с соавт., Nature 1996; 381:418-421; Kanatsu-Shinohara с соавт., Biol Reprod 2003; 69:612-616 и Nagano с соавт., Tissue Cell 1998; 30:389-397. Способность выделять и экспериментально манипулировать этими стволовыми клетками открыла двери для исследования развития сперматозоида, вспомогательной репродукции, клеточной терапии и генетики (см. Nagano с соавт., Biol Reprod 1999; 60:1429-1436; Mahanoy с соавт., Endocrinology 2000; 141:1273-1276; Mahato с соавт., Mol Cell Endocrinol 2001; 178:57-63; Ogawa с соавт., Nat Med 2000; 6:29-34; Shinohara с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:13624-13628; Zhang с соавт., J Cell Physiol 2007; 211:149-158; Kazuki с соавт., Gene Ther 2008; 15:617-624; Kanatsu-Shinohara с соавт., Cell 2004; 119:1001-1012; Kanatsu-Shinohara с соавт., Proc Acad Sci USA 2006; 103:8018-8023 и Nagano с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:13090-13095. В свете этого потенциала установили протоколы выделения, репродуцирования и генетического модифицирования полностью функциональных сперматогониальных стволовых клеток крысы и мыши в культуре (см. Ryu с соавт., Dev Biol 2004; 274:158-170; Hamra с соавт., Dev Biol 2004; 269:393-410; Hamra с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931-14936;
- 1 034065
Hamra с соавт., Methods Mol Biol 2008; 450:163-179; Hamra с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 17430-17435; Ryu с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:14302-14307; Orwig с соавт. Biol Reprod 2002; 67:874-879 и Kanatsu-Shinohara с соавт., Biol Reprod 2008. Мышей и крыс выбирают в качестве видов для этих исследований, поскольку они являются популярными моделями лабораторных животных для исследования человеческого здоровья и заболеваний и из-за недостатка протоколов для генетического модифицирования зародышевой линии крыс при помощи клонально расширенных стволовых клеток из культуры (см. Hamra с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931-14936). Учитывая множество потенциальных применений лабораторной крысы в качестве исследовательской модели, в этом исследовании ищут эффективность и экономию, а также легкость приготовления культуральной среды для получения и продолжения пролиферации первичных линий стволовых клеток крыс in vitro.
Несмотря на эти преимущества, даже у крыс, процедура остается сложной и в большом количестве случаев не успешной. Например, среды для длительной пролиферации сперматогониальных стволовых клеток грызунов in vitro являются относительно сложными, дорогими, затратными по времени изготовления, плюс они являются наиболее эффективными при применении в комбинации с питающими слоями фибробластов.
Как видно, существует необходимость поиска методов культивирования сперматогониальных стволовых клеток, в частности, для более крупных млекопитающих, таких как быков.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает композиции и методы культивирования сперматогониальных стволовых клеток. В соответствии с изобретением заявители усовершенствовали культуральную систему, свободную от фидера, что позволяет культивируемым сперматогониальным стволовым клеткам оставаться в недифференцированном состоянии и оставаться жизнеспособными в культуре в течение длительных периодов времени. Дополнительные аспекты изобретения включают процедуры для выделения недифференцированных сперматогоний из ткани семенников, идентифицирования специфичной среды, свободной от сыворотки, что поддерживает выживаемость недифференцированных сперматогоний in vitro, субстраты для покрытия пластиковой лунки для культивирования, к которой адгезируются недифференцированные сперматогонии, и наконец заявители определили специфические факторы роста для поддержания кондиционированной среды питающей клетки, которая обеспечивает поддержание и рост бычьих недифференцированных сперматогоний. В то время как методы и примеры раскрывают бычьи клетки изобретение не является настолько ограничивающим и применяется ко всем видам домашнего скота, включая свиней.
В соответствии с изобретением заявители определили специфические собственные линии клеток, включая линии бычьих эмбриональных фибробластов и линии бычьих соматических клеток, полученных из бычьих семенников. Эти специфические линии клеток применяют в качестве клеток питательной поддержки для кондиционированной культуральной среды перед культивированием любых сперматогониальных стволовых клеток (SSC). Техника предварительного культивирования позволяет культивировать без фидера, обеспечивая поколение чистых популяций предполагаемых бычьих SSC для трансплантации и других применений. Культивируемые заявителями клетки свободны от примесей других линий питающих клеток и их вредных воздействий, включая иммунный ответ хозяина, ограниченную способность к колонизации и конечную дифференцировку в течение длительного времени.
В варианте осуществления настоящее изобретение характеризует метод выделения недифференцированных сперматогоний, в которых сперматогониальные стволовые клетки (SSC) являются компонентом из ткани семенника, содержащей по меньшей мере одну SSC. Метод включает получение бычьей ткани семенника, которая включает по меньшей мере одну SSC, содержащую указанную ткань с коллагеназой, разделяющей семенные канальцы с клетками других типов, и таким образом, контактирование указанных семенных канальцев с трипсином для получения суспензии клеток, обогащенной сперматогониями клетками Сертоли. Метод можно также применять к SSC, полученным из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или даже эмбриональных стволовых клеток, которыми манипулировали для их превращения в SSC.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует метод обогащения и сохранения чистой культуры недифференцированных сперматогониальных клеток, содержащих по меньшей мере одну SSC, где метод включает предоставление специфической свободной от сыворотки среды с замещением сыворотки, что дополнительно обеспечивает лунки для адгезии, предварительно покрытые Matrigel, а также добавление специфического нейротрофного фактора глиальных клеток (GDNF), фактора роста фибробластов-2 (FGF2), фактора стромы-1 (SDF-1) и колоний стимулирующего фактора-1 (CSF-1) в предварительно кондиционированную среду, что все вместе обеспечивает на первое время свободную от фидера культуру сперматогониальных клеток, предпочтительно бычьих сперматогониальных стволовых клеток.
В варианте осуществления изобретение также характеризует предполагаемую популяцию сперматогониальных стволовых клеток, которые остаются недифференцированными и сохраняют способность к самообновлению и дифференцировке, которая жизнеспособна в культуре и является фактически чистой, а именно свободной от фидера.
- 2 034065
В другом варианте осуществления изобретение включает новые поддерживающие линии клеток, которые усовершенствованы и позволяют предварительно кондиционировать среду для предоставления метода культивирования без фидера. Линии клеток включают линию клеток бычьих эмбриональных фибробластов 1 (или BEF1, ранее BEF), полученных из плода Holstein возраста 35 дней, и второе, линии клеток бычьих соматических клеток 1 (или BSC1, ранее BSC), полученных из соматических клеток, выделенных из семенника четырехмесячного быка Holstein. Вместе эти линии клеток можно применять для предварительного инкубирования культуральной среды, что предоставит необходимые секретируемые растворимые факторы для выживания и пролиферации SSC без добавления питающих клеток после введения SSC. В соответствии с изобретением среду сначала предварительно кондиционируют этими клетками и через достаточный период времени предварительно кондиционирующие клетки-фидеры удаляют, чтобы затем можно было культивировать SSC клетки.
В одном аспекте изобретения SSC представляют собой бычьи SSC. В другом аспекте SSC получают из организма, выбираемого из группы, состоящей из мыши, крысы, обезьяны, павиана, человека, свиньи и собаки.
В другом аспекте изобретения клетки получают из любого источника сперматогониальных стволовых клеток, включая источник, выбираемый из группы, состоящей из семенника взрослого дикого типа, семенника теленка или щенка, семенника новорожденного и семенника взрослого с крипторхизмом.
В другом аспекте изобретения клетки получают из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или эмбриональных стволовых клеток для их превращения в сперматогониальные стволовые клетки, которые затем могут стать таким же источником, применяемым в соответствии с изобретением.
В другом варианте осуществления изобретение относится к системе культивирования, свободной от фидера, для поддержки состояния SSC, системе, включающей обогащенные SSC, свободной от сыворотки среде определенного состава и среде, предварительно кондиционированной клетками-фидерами. В другом варианте осуществления изобретение относится к свободной от фидера системе культивирования для поддержки пролиферации SSC, включающей по меньшей мере одну SSC, свободной от сыворотки среде определенного состава с добавлением заместителя сыворотки (StemPro), которая была предварительно кондиционирована патентованной линией клеток фибробластов BEF1 и патентованными клетками-фидерами BSC1.
В одном аспекте изобретения система культивирования дополнительно включает факторы роста GDNF, FGF2, SDF-1 и CSF-1. В другом аспекте культуральная среда включает по меньшей мере одну среду, выбираемую из группы, состоящей из модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (MEM): питательной смеси Хэма F-12 (DMEM/F12) и добавленного заместителя сыворотки StemPro.
В другом аспекте изобретения система культивирования дополнительно включает пластиковые лунки для культивирования роста, которые предварительно покрывают имеющимся в продаже матриксом, таким как Matrigel (ослабленная версия фактора роста). Без этого покрытия клетки не прикрепляются к пластиковой лунке и не могут храниться в культуре длительное время.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует композицию, включающую популяцию чистых обогащенных SSC, где обогащенная популяция SSC свободна от эмбриональных фибробластов или других типов клеток-фидеров.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует композицию, включающую популяцию обогащенных SSC, которые экспрессируют специфический маркер недифференцированных сперматогоний и имеют морфологию, сходную с таковой у культивируемых SSC клеток. В одном аспекте популяция SSC является практически гомогенной по SSC.
В еще одном варианте осуществления изобретение характеризует метод создания по меньшей мере одного потомства млекопитающего, включающий введение популяции SSC без фидера в семенники млекопитающего-реципиента мужского пола, что позволяет обогащенным SSC создавать колонию сперматогенеза в млекопитающем-реципиенте, а также спаривание млекопитающего-реципиента с самкой млекопитающего того же вида, что и млекопитающее-реципиент. В одном аспекте популяцию обогащенных SSC вводят в просвет семенных канальцев млекопитающего-реципиента. В другом аспекте млекопитающее-реципиент является бесплодным.
В варианте осуществления изобретения млекопитающее-реципиент выбирают из группы, состоящей из грызуна, примата, собаки, быка, свиньи и человека. В другом варианте осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши и крысы. В еще одном аспекте приматом является павиан.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует набор для сохранения по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера. Набор включает систему культивирования, включающую свободную от сыворотки культуральную среду с определенным составом, собственные BSC1 и BEF1 клетки для предварительного кондиционирования культуральной среды (или среду, которая уже была предварительно кондиционирована таким же образом), аппликатор, учебный материал, где учебный материал включает инструкции для применения набора для сохранения по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера.
В варианте осуществления изобретение относится к потомству животных, произведенному в соответствии с методом изобретения. В другом варианте осуществления изобретение относится к потомству,
- 3 034065 произведенному в соответствии с методом изобретения, где обогащенные SSC, применяющиеся для создания потомства животных, содержат по меньшей мере одну генетическую мутацию. В одном аспекте генетическую мутацию создают при помощи рекомбинантной технологии.
Заявленное изобретение включает, помимо прочего, применение конкретных полученных естественным путем или генетически модифицированных (генетических) стерильных быков мужского пола в качестве реципиентов для донорских сперматогониальных стволовых клеток, с которыми животные также иммуносовместимы. Соответственно трансплантированные сперматогониальные стволовые клетки свободно развиваются в функционирующие сперматозоиды и оплодотворяют самок в отсутствии конкуренции со спермой, которая бы также вырабатывалась, если бы мужская особь была фертильной. Таким образом, 100%-ной передачи гаплотипа зародышевой линии донорской клетки можно достигнуть при относительно низком количестве трансплантируемых спермальных стволовых клеток.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения методология предоставлена для влияния на перенос зародышевой линии донорского гаплотипа. Изобретенный метод включает стадии (А) предоставления клеток сперматогониальной линии стволовых клеток, которые получены из семенников млекопитающих, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или эмбриональных стволовых клеток, чьи линии клеток воплощают предопределенный генетический фон, и далее (В) трансплантации одной или более клеток стерильному реципиенту мужского пола, так что трансплантированные клетки развиваются в компетентные для оплодотворения клетки, гаплоидные мужские гаметы.
В соответствии с другим аспектом изобретения библиотеку предоставляют клетки сперматогониальной линии клеток, которые получены из семенников млекопитающих, или из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или эмбриональных стволовых клеток. Библиотека изобретения содержит множество нокаутов гена или нокин мутантных стволовых клеток.
Описание чертежа
Чертеж показывает сохранение бычьих недифференцированных сперматогоний в культуре, свободной от фидера. Левое изображение представляет собой представительство группы зародышевых клеток, образующейся во время культивирования без фидера на покрытых Matrigel лунках для культивирования с BEF1 кондиционированной средой. Среднее изображение представляет собой группы, обработанные DAP1, для обозначения ядер отдельных клеток. Правое изображение представляет собой иммуноокрашивание для недифференцированного сперматогониального маркера PLZF.
Подробное описание изобретения
Если не определено иное, научные и технические термины, применяемые в связи с изобретением, будут иметь значения, под которыми их обычно понимают специалисты в области техники. Дополнительно, если другого не требует контекст, термины в единственном числе будут включать множественное число, а термины во множественном числе будут включать единственное число. В целом, номенклатура, используемая в связи с этим, и технологии биохимии, энзимологии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии, генетики и химии протеинов и аминокислот, а также гибридизации, описанные здесь, являются хорошо известными и применяемыми в области техники. Методы и технологии в целом осуществляют в соответствии с традиционными методами, хорошо известными в области техники, и как описано в различных и более специфических ссылках, которые включены и обсуждаются в настоящей инструкции, если не указано иное (см., например, Sambrook с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. (1989); Ausubel с соавт., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, и дополнения 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. (1990); Taylor и Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol.1, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol. II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1999)).
Следующие термины, если не указано иного, следует понимать в следующих значениях:
Фраза сперматогониальные стволовые клетки в этом описании подразумевает стволовые клетки, как выделенные из семенников, так и созданные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, из эмбриональных стволовых клеток или любым другим методом для получения этих клеток. Например, индуцированные плюрипотентные клетки млекопитающих, полученные из кожных клеток, применяют для создания зародышевых клеток (см. Easley CA 4th с соавт., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2 (3): 440-6, Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogonial cells). Сперматогониальные стволовые клетки обладают способностью к оплодотворению яйцеклетки, но могут дать толчок к развитию клеткам, которые развиваются в сперматозоиды, и, таким образом, производят жизнеспособное потомство. Полученные сперматогониальные стволовые клетки можно культивировать в течение длительного периода времени без потери их свойств, и описана возможность эффективного восстановления популяции в семенниках подходящего реципиента мужского пола, например, у Oatley ТМ. с соавт., Methods Enzymol. 419:259 (2006).
Слова, находящиеся здесь в единственном числе, применяют для названия одного или более одного (то есть по меньшей мере одного) грамматического объекта статьи. Например, элемент обозначает
- 4 034065 один элемент или более чем один элемент.
Как используют здесь, термин ген и рекомбинантный ген относится к молекулам аминокислоты, включающим открытую рамку считывания, кодирующую полипептид. Такие вариации натуральных аллелей могут обычно привести к 1-5% различий в нуклеотидной последовательности данного гена. Альтернативные аллели можно определить путем секвенирования интересующего гена у некоторых различных индивидов. Это можно без промедления провести при помощи гибридизационных проб для определения такого же локуса гена у множества индивидов. Любые такие вариации нуклеотидов, а также полиморфизм и вариации конечных аминокислот, которые являются результатом вариаций натуральных аллелей и которые не изменяют функциональную активность, должны находиться в объеме изобретения.
Более того, молекулы аминокислот, кодирующие протеины других видов (гомологи), которые имеют последовательность нуклеотидов, которая отличается от такой у протеинов, описанных здесь, находятся в объеме изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие вариантам натуральных аллелей и гомологам кДНК изобретения, можно получить на основании их идентичности молекулам нуклеиновых кислот при помощи человеческих кДНК или их части, в качестве гибридизационной пробы в соответствии со стандартными технологиями гибридизации под строгими гибридизационными условиями.
Как применяется здесь, этот термин модулирование биологического процесса относится к изменению нормального течения биологического процесса. Например, модулирование активности сперматогониальной стволовой клетки может быть повышением активности клетки. Альтернативно модулирование активности сперматогониальной стволовой клетки может быть снижением активности клетки.
Обогащение в качестве используемого здесь термина относится к процессу, при помощи которого увеличиваются концентрация, число или активность чего-либо по сравнению с изначальным состоянием. Например, популяция из 100 сперматогониальных стволовых клеток считается обогащенной сперматогониальными стволовыми клетками, если до того популяция содержала только 50 сперматогониальных стволовых клеток. Сходным образом, популяция из 100 сперматогониальных стволовых клеток также считается обогащенной сперматогониальными стволовыми клетками, если до того популяция содержала 99 сперматогониальных стволовых клеток. Также популяция из 100 сперматогониальных стволовых клеток считается обогащенной сперматогониальными стволовыми клетками, даже если популяция до того не содержала сперматогониальных стволовых клеток.
Применяемый здесь термин популяция относится к двум или более клеткам.
Применяемые здесь термины практически отделенный от или практически отделяемый относятся к характеристикам популяции первых веществ, которые удалили из-за близости ко вторым веществам, где популяция первых веществ не обязательно свободна от вторых веществ, и популяция вторых веществ не обязательно свободна от первых веществ. Тем не менее, популяция первых веществ, которая практически отделена от популяции вторых веществ, имеет значительно более низкое содержание вторых веществ по сравнению с неразделенной смесью первых и вторых веществ.
В одном аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает единицу. В другом аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает 2. В еще одном аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает приблизительно 5. В другом аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает приблизительно 10. В еще одном аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает приблизительно 50. В другом аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если соотношение концентрации первого вещества к концентрации второго вещества превышает приблизительно 100. В еще одном аспекте первое вещество практически отделено от второго вещества, если не определяется уровень второго вещества в композиции, содержащей первое вещество.
Практически гомогенный, как применяемый здесь термин, относится к популяции вещества, которое включено первично в вещество, примеси которого минимизированы.
Поддержание клетки или популяции клеток относится к состоянию, в котором живая клетка или популяция живых клеток не увеличивается и не снижается по общему числу клеток в культуре. Альтернативно пролиферация клетки или популяции клеток, как применяемый здесь термин, относится к состоянию, в котором число живых клеток увеличивается как функция времени по отношению к исходному числу клеток в культуре.
Культуральная среда с определенным составом, как применяемый здесь термин, относится к среде культуры клеток с известной композицией.
Термин аппликатор, как применяемый здесь, обозначает любой прибор, включающий, но не ограниченный подкожным шприцем, пипеткой, бронхоскопом, небулайзером и т.п., для введения композиции изобретения млекопитающему.
Как применяют здесь, термин учебный материал включает публикацию, запись, диаграмму или
- 5 034065 любое другое средство выражения, которое можно применять для передачи полезности метода и/или композиции изобретения в наборе для сохранения, пролиферирования или введения любой композиции, переписанной здесь. Учебный материал из набора изобретения может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит композицию изобретения или может быть доставлен вместе с контейнером, который содержит композицию. Альтернативно учебный материал можно доставить отдельно от контейнера с изобретением так, что учебный материал и вещество реципиент можно применять совместно.
Как применяется здесь, клетка считается устраненной из популяции клеток или из культуральной среды, когда клетка более не оказывает один или более эффектов - физический, биологический или химический - на популяцию клеток или культуральную среду. Например, клетка может быть устранена из культуральной среды путем физического удаления клетки при помощи FACS или при помощи использования антител, специфических к маркеру на поверхности клетки, уникальному для этой клетки. Клетку также можно устранить из культуральной среды путем изменения биологической активности клетки на инертную, так, например, как при применении нейтрализующего антитела, которое является специфичным для этой клетки.
Клетка является практически устраненной из популяции клеток или из культуральной среды, когда большая часть, но не все клетки от общего числа более не оказывают один или более эффектов - физический, биологический или химический - на популяцию клеток или культуральную среду. Например, конкретный тип клеток можно практически устранить из культуральной среды, если по меньшей мере 75% клеток этого типа удалены из культуральной среды при помощи применения антитела, специфического для маркера на клеточной поверхности, уникального для этой клетки. Более предпочтительно по меньшей мере 80% клеток устранены из культуральной среды, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95% клеток устранены из культуральной среды.
Клетка является полученной из семенника, как применяют здесь, если клетка получена из семенника. В виде неограниченного примера полученные из семенников клетки включают сперматогониальные стволовые клетки, соматические клетки и зародышевые клетки.
Методы обогащения сперматогониальных стволовых клеток.
Настоящее изобретение относится к методу обогащения сперматогониальных стволовых клеток (SSC). Здесь впервые показано, что SSC можно культивировать по свободному от фидера протоколу с длительной выживаемостью популяции клеток. В одном варианте осуществления изобретения SSC получены от быка. Обогащение стволовых клеток является полезным для различных целей в области медицинского лечения, диагностики и исследований, включая основанную на стволовых клетках терапию для восстановления популяции клеток в организме, а также для лабораторного исследования факторов роста, ответственных за контролирование поддержания пролиферации стволовых клеток, а также за искусственное оплодотворение.
Настоящее изобретение включает композиции и методы культивирования сперматогониальных стволовых клеток. В соответствии с изобретением заявители усовершенствовали культуральную систему, свободную от фидера, что позволяет выделенным (или полученным другим методом) бычьим сперматогониальным стволовым клеткам оставаться в недифференцированном состоянии и сохранять жизнеспособность в культуре в течение длительного периода времени. Можно применять также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или эмбриональные стволовые клетки. Дополнительные аспекты изобретения включают процедуры для выделения недифференцированных сперматогоний из ткани семенников быка, идентифицирования специфической свободной от сыворотки среды, которая поддерживает выживание бычьих недифференцированных сперматогоний in vitro, субстраты для покрытия пластиковых лунок для культивирования, к которым происходит адгезия недифференцированных бычьих сперматогоний, и наконец заявители определили специфические факторы роста для обогащения кондиционированной среды клеток-фидеров, что обеспечивает поддержание и рост бычьих недифференцированных сперматогоний.
В соответствии с изобретением заявители определили специфические собственные линии клеток, включая фибробласты быков эмбриональной линии клеток, и соматические линии клеток быков, выделенные из семенников или полученные другим методом. Эти специфические линии клеток применяют в качестве поддерживающих клеток-фидеров для кондиционирования культуральной среды до культивирования любых SSC. Техника предварительного культивирования позволяет культивированию без фидера обеспечить поколение чистых популяций бычьих сперматогониальных SSC для трансплантата или других применений без примешивания других линий клеток-фидеров и их вредного воздействия, включая потенциальный иммунный ответ хозяина, ограничение колонизационной способности SSC.
В варианте осуществления настоящее изобретение относится к методу выделения сперматогониальных стволовых клеток (SSC) из ткани семенников быка, содержащей по меньшей мере одну SSC. Метод включает получение бычьей ткани семенников, которая включает по меньшей мере одну SSC, контактирование указанной ткани с коллагеназой, разделение семенных канальцев от клеток других типов и, таким образом, контактирование указанных семенных канальцев с трипсином для получения клеточной суспензии, обогащенной сперматогониями и клетками Сертоли.
- 6 034065
В другом варианте осуществления изобретение относится к методу обогащения и поддержания чистой культуры сперматогониальных стволовых клеток (SSC) из популяции полученных из семенников, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или эмбриональных стволовых клеток, содержащих по меньшей мере одну SSC, где метод включает предоставление специфической свободной от сыворотки среды с замещением сыворотки, дополнительное предоставление лунок для культивирования клеток, которые предварительно покрыты Matrigel, а также добавление специфических факторов роста GDNF, FGF2, SDF-1 и CSF-1 в предварительно кондиционированную среду, что все вместе обеспечивает на первое время свободную от фидера культуру сперматогониальных клеток, предпочтительно бычьих сперматогониальных стволовых клеток.
В варианте осуществления изобретение также относится к популяции сперматогониальных стволовых клеток, которые остаются недифференцированными и сохраняют способность к самообновлению и дифференцировке, которая жизнеспособна в культуре и является фактически чистой, а именно свободной от фидера.
В другом варианте осуществления изобретение включает новые поддерживающие линии клеток, которые усовершенствованы и которые позволяют предварительно кондиционировать среду для обеспечения метода культивирования, свободного от фидера. Линии клеток включают линию клеток BEF1, полученные от плода Holstein 35 дней от роду, и вторые линии клеток BSC1, полученные от соматических клеток, выделенных из семенников 4-месячного быка Holstein. Вместе эти линии клеток можно применять для предварительного инкубирования культуральной среды, что предоставит необходимые факторы секреции для выживания и пролиферации SSC без добавления клеток фидеров к инкубируемым SSC.
В одном аспекте изобретения SSC представляет собой бычью SSC. В другом аспекте SSC получают из организма, выбираемого из группы, состоящей из мыши, крысы, обезьяны, павиана, человека, свиньи и собаки.
В другом аспекте изобретения клетки получают из источника, выбираемого из группы, состоящей из взрослого семенника дикого типа, семенника щенка, семенника новорожденного и/или семенника взрослого с крипторхизмом.
В варианте осуществления изобретение относится к свободной от сыворотки культуральной системе для поддержки сохранности SSC, системе, включающей обогащенные SSC, свободную от сыворотки культуральную среду определенного состава, и среду, предварительно кондиционированную клеткамифидерами. В другом варианте осуществления изобретение относится к свободной от сыворотки культуральной системе для поддержания пролиферации SSC, включающей по меньшей мере одну SSC, свободную от сыворотки культуральную среду с определенным составом с замещением сыворотки на обогатительную (StemPro), и которую предварительно кондиционируют собственной клеточной линией фибробластов BEF1 и собственными BSC1 клетками-фидерами.
В одном аспекте изобретения культуральная система дополнительно включает факторы роста GDNF, FGF2, SDF-1 и CSF-1. В другом аспекте культуральная среда включает по меньшей мере среду, выбираемую из группы, состоящей из модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (MEM): питательной смеси Хэма F-12 (DMEM/F12) и добавленного заместителя сыворотки StemPro.
В другом аспекте изобретения культуральная система дополнительно включает лунки для культивирования и роста, которые предварительно покрыты имеющимся в продаже матриксом, таким как Matrigel (ослабленная версия фактора роста). Без этого покрытия клетки не прикрепляются к пластиковой лунке и не могут храниться в культуре длительное время.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует композицию, включающую популяцию чистых обогащенных SSC, где обогащенная популяция SSC свободна от эмбриональных фибробластов или других типов клеток-фидеров.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует композицию, включающую популяцию обогащенных SSC, которые экспрессируют специфический маркер недифференцированных сперматогоний и имеют морфологию, сходную с таковой у культивируемых SSC клеток. В одном аспекте популяция SSC является практически гомогенной по SSC.
В еще одном варианте осуществления изобретение характеризует метод создания по меньшей мере одного потомства млекопитающего, включающий введение популяции SSC без фидера в семенники млекопитающего-реципиента мужского пола, что позволяет обогащенным SSC создавать колонию сперматогенеза в млекопитающем-реципиенте, а также спаривание млекопитающего-реципиента с самкой млекопитающего того же вида, что и млекопитающее-реципиент. В одном аспекте популяцию обогащенных SSC вводят в просвет семенных канальцев млекопитающего-реципиента. В другом аспекте млекопитающее-реципиент является бесплодным.
В варианте осуществления изобретения млекопитающее-реципиент выбирают из группы, состоящей из грызуна, примата, собаки, быка, свиньи и человека. В другом варианте осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши и крысы. В еще одном аспекте приматом является павиан.
В еще одном варианте осуществления изобретение характеризует метод создания по меньшей мере одного потомства млекопитающего, включающий введение популяции SSC без фидера в семенники млекопитающего-реципиента мужского пола, что позволяет обогащенным SSC создавать колонию сперма- 7 034065 тогенеза в млекопитающем-реципиенте, а также спаривание млекопитающего-реципиента с самкой млекопитающего того же вида, что и млекопитающее-реципиент.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует набор для сохранения по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера. Набор включает систему культивирования, включающую свободную от сыворотки культуральную среду с определенным составом, собственные BSC1 и BEF1 клетки для предварительного кондиционирования культуральной среды, аппликатор, учебный материал, где учебный материал включает инструкции для применения набора для сохранения по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера.
В варианте осуществления изобретение характеризует потомство животных, произведенное в соответствии с методом изобретения. В другом варианте осуществления изобретение характеризует потомство, произведенное в соответствии с методом изобретения, где обогащенные SSC, применяющиеся для создания потомства животных, содержат по меньшей мере одну генетическую мутацию. В одном аспекте генетическую мутацию создают при помощи рекомбинантной технологии.
Заявленное изобретение включает, помимо прочего, применение конкретных полученных естественным путем или генетически модифицированных (генетических) стерильных быков мужского пола в качестве реципиентов для донорских сперматогониальных стволовых клеток, с которыми животные также иммуносовместимы. Сперматогенез у таких животных тяжело нарушен. Соответственно трансплантированные сперматогониальные стволовые клетки свободно развиваются в функционирующие сперматозоиды и оплодотворяют самок в отсутствии конкуренции со спермой, которая бы также вырабатывалась, если бы мужская особь была фертильной. Таким образом, 100% передачи гаплотипа зародышевой линии донорской клетки можно достигнуть при относительно низком количестве трансплантируемых спермальных стволовых клеток.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения методология предоставлена для влияния на перенос зародышевой линии донорского гаплотипа. Изобретенный метод включает стадии (А) предоставления клеток сперматогониальной линии стволовых клеток, которые получены из семенников млекопитающих, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или эмбриональных стволовых клеток, чьи линии клеток воплощают предопределенный генетический фон, и далее (В) трансплантации одной или более клеток стерильному реципиенту мужского пола, так что трансплантированные клетки развиваются в компетентные для оплодотворения клетки, гаплоидные мужские гаметы.
В соответствии с другим аспектом изобретения библиотеку предоставляют клетки сперматогониальной линии клеток, которые получены из семенников млекопитающих, или из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или эмбриональных стволовых клеток. Библиотека изобретения содержит множество нокаутов гена или нокин мутантных стволовых клеток.
В соответствии с добавочным аспектом изобретения предоставляют среду для выращивания сперматогониальных стволовых клеток в дополнение к методам культивирования сперматогониальных стволовых клеток.
Свободная от фидера культуральная система сперматогониальных стволовых клеток.
Настоящее изобретение относится к свободной от фидера культуральной среде для in vitro поддержания и пролиферации SSC. Это происходит, поскольку, как показано здесь на первый раз, что бычьи недифференцированные сперматогонии, в которых SSC являются компонентами, могут поддерживаться и пролиферировать в среде, которая была предварительно кондиционирована фидерами, но которая не содержит клеток-фидеров in vitro. При помощи настоящего изобретения утверждают культуральную систему, имеющую минимальные определенные условия, для in vitro культивирования бычьих SSC, чья система предоставляет возможность исследовать биологию SSC в определенном виде, а также и способность определять индивидуальные факторы, необходимые для поддержания и разрастания SSC. В предпочтительном варианте осуществления свободный от фидера метод культивирования позволяет создавать популяцию SSC клеток, которые свободны от включения клеток-фидеров, для применения в оплодотворении in vitro и в других аспектах промышленного бычьего производства.
В одном варианте осуществления изобретения свободная от фидера культуральная система включает предварительно кондиционированную питающую среду. В одном аспекте изобретения предварительно кондиционирующие клетки-фидеры представляют собственные линии клеток заявителей, включающие бычьи эмбриональные линии BEF1 и линию бычьих соматических клеток BSC1. В другом аспекте изобретения клетки-фидеры для предварительного кондиционирования могут включать, но не ограничиваются элементами, полученными из этих линий, включая клетки, их компоненты и т.п.
Заявители определяют критическую среду для культивирования SSC. Это в одном аспекте изобретения представляет собой среду для культивирования и предварительного кондиционирования, которая является свободной от сыворотки средой с определенным составом, включающей минимальную поддерживающую среду-α (МЕМ). В другом аспекте изобретения свободная от сыворотки среда с определенным составом включает культуральную среду Ham F10. В еще одном варианте осуществления свободная от сыворотки среда с определенным составом представляет собой модифицированную по методу Дульбекко среду Игла (MEM): питательную смесь Хэма F-12 (DMEM/F12). Как понимают специалисты в данной области техники, вооруженные настоящим раскрытием, свободная от сыворотки среда с опреде- 8 034065 ленным составом настоящего изобретения также включает смесь из двух или более сред, где одной из которых является DMEM/F12.
Таким образом, настоящее изобретение включает композицию, включающую определенную среду, которая предварительно кондиционирована одной или более линиями клеток-фидеров для поддержания или пролиферации SSC. Как следует понимать на основании раскрытия, излагаемого в данном документе, культуральная система изобретения является полезной для поддержания или разрастания SSC. В одном аспекте изобретения SSC, полезные в культуральной среде, представляют собой SSC, обогащенные при помощи методов или композиций настоящего изобретения. В другом аспекте SSC, полезные в культуральной среде, представляют собой SSC, которые не были предварительно обогащены в соответствии с методами или композициями настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления свободная от фидера среда с определенным составом дополнительно включает SSC. Специалист в данной области поймет в свете настоящего раскрытия, что SSC из любого источника можно поддержать или разрастить при помощи свободной от фидера культуральной системы изобретения. Так SSC, полученные из популяции клеток, полученных из семенников, можно получить их клеток семенников любого млекопитающего, включая, но не ограничиваясь человеческими семенниками, семенниками крыс, семенниками мышей и предпочтительно семенниками коровы и быка. Источники SSC дополнительно включают взрослые семенники дикого типа, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, взрослые семенники с одной или более генетическими мутациями, ювенильные семенники, семенники новорожденного и/или семенники взрослого с крипторхизмом. Методы внесения генетических мутаций в ДНК клетки, такие как SSC, хорошо известны в области техники и не обсуждаются здесь дополнительно.
Также следует понимать на основании раскрытия, излагаемого в данном документе, что стерильный самец также может быть источником SSC. Таким образом, другой аспект изобретения включает стерильного самца в качестве источника SSC настоящего изобретения.
Как подробно описано здесь, базовая свободная от фидера среда с определенным составом настоящего изобретения может дополнительно включать любые компоненты, известные специалистам в области техники, для пользы в применении в культивировании клеток. В одном варианте осуществления свободная от фидера среда с определенным составом включает по меньшей мере один фактор роста. Факторы роста, полезные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются фактором стволовых клеток (включая мышиный SCF), нейротрофным фактором глиальных клеток (GDNF), рецептором семейства GDNF (включая GFR.alpha.1), фактором, ингибирующим лейкоз (LIF), основным фактором роста фибробластов (включая человеческий bFGF), кислотным фактором роста фибробластов (aFGF), колонийстимулирующим фактором (CSF), фактором стромы 1 (SDF-1), эпидермальным фактором роста (EGF), инсулиноподобным фактором роста (включая IGF-1), фактором роста тромбоцитов (PDGF) и трансформирующим фактором роста (включая TGF-β I-III, а также TGF β, суперсемейство ВМР-1-12, GDF 1-8, dpp 60A, BIP, OF). В предпочтительном варианте осуществления факторы роста включают GDNF, FGF2 и CSF-1.
Настоящее изобретение, таким образом, также включает методы поддержания или пролиферации SSC в культуральной среде с определенным составом, свободной от фидера. В одном варианте осуществления изобретение относится к методу поддержания SSC в культуральной системе, свободной от фидера. Метод включает предоставление по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера, как определено в деталях здесь.
SSC можно идентифицировать как поддерживаемые в культуральной системе с определенным составом, свободной от фидера, путем оценивания активности SSC в различные отрезки времени в культуральной среде, а также путем сравнения активности с активностью SSC в начале периода культивирования. Как понимают специалисты в данной области техники, небольшая активность или отсутствие ее изменения являются показателем, что SSC поддерживаются в культуре. Методы измерения активности SSC описаны в деталях здесь.
В другом варианте осуществления изобретение характеризует метод пролиферирования SSC в культуральной среде, свободной от фидера. Метод включает предоставление по меньшей мере одной SSC в культуральной системе, свободной от фидера, как определено в деталях здесь. SSC можно идентифицировать как пролиферирующие в культуральной среде, свободной от фидера, путем оценивания активности SSC в различные отрезки времени в процессе культивирования и сравнения активности с активностью SSC в начале периода культивирования. Повышение активности между началом периода культивирования и любой более поздней временной точкой является показателем того, что SCC пролиферируют. Методы измерения активности SSC описаны в деталях здесь. SSC, которые могут пролиферировать в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются бычьими SSC, человеческими SSC, мышиными SSC и крысиными SSC.
В дополнение степень пролиферации SSC в культуральной среде, свободной от фидера, настоящего изобретения можно оценивать путем подсчета числа клеток, присутствующих в конкретный момент времени во время культивирования SSC клеток и путем сравнивания значения с числом клеток, присутствующих в начале периода культивирования. На основании раскрытия, описанного здесь, специалисты в
- 9 034065 данной области техники понимают, что также можно применять другие методы оценки поддержания и пролиферации SSC. Эти методы включают, но не ограничиваются, FACS и MACS.
Трансплантация сперматогониальных стволовых клеток.
В одном аспекте настоящего изобретения одну или более SCC можно трансплантировать в семенник реципиента. Методы трансплантации в целом известны специалистам в данной области техники и не будут обсуждаться здесь в дальнейших деталях. Для изучения общих методов трансплантации клеток, вовлекающих семенники, см. Kanatsu-Shinohara с соавт. (PNAS, 99:1383-1388 (2002), Brinster (I) (патент US 6215039) и Brinster (II) (патент US 5858354), обе из которых включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Brinster (I) и (II) демонстрируют, в частности, что трансплантированные SSC от донора к иммунологически толерантной мыши или другому совместимому реципиенту реплицируются и поддерживаются у реципиента. Система, свободная от фидера, имеет огромное преимущество по сравнению с традиционными системами с фидером, которое заключается в том, что для трансплантации следует удалить клетки-фидеры. Культура заявителя, будучи свободной от фидера, не требует этой напряженной и трудной стадии.
В варианте осуществления изобретения одну или более SSC вводят в канальцы семенника. Например, после анестезии млекопитающего-реципиента мужского пола осуществляют хирургический доступ к семеннику (или семенникам). В одном варианте осуществления при применении микроманипуляционных методов тонкую стеклянную иглу вводят в выделенные канальцы один за другим, и в каждый каналец вводят раствор, содержащий эмбриональные клетки, применяемые для колонизации в канальце. В другом варианте осуществления одну или более SSC также можно вводить путем введения их в другие части канальцевой системы, например в просвет и сеть семенников. Как понимают специалисты в данной области техники, доступны методы введения, которые минимизируют число инъекций и повышают эффективность введения SSC реципиенту мужского пола.
Суспензия клеток из одной или более SSC для инъекции может включать инъекционную среду и по меньшей мере одну SSC в подходящей концентрации. В виде не ограничивающего примера инъекционная среда может включать один или более из веществ NaCl, Na2HPO4, KCl, KH2PO4, ЭДТК, пируват, лактат, глутамин, глюкозу, бычий сывороточный альбумин и ДНКазу I. рН инъекционной среды подходящим образом находится в диапазоне 7,0-7,7, но как понимают специалисты в данной области техники, ее можно адаптировать в сторону более основной или более кислотной в зависимости от среды композиции, типа клеток и/или концентрации, а также микросреды в области инъекции реципиента.
В другом варианте осуществления изобретения другие системы можно применять для введения одной или более SSC реципиенту мужского пола. Они включают введение в семявыносящий проток и придаток яичка или манипуляции с семенниками плода или ювенальными семенниками, технологии для выделения семенных канальцев в покрове семенника с минимальной травмой, что позволяет вводимым клеткам проникать через концы канальцев. Альтернативно можно применять семенник (или семенники) новорожденных, которые все еще претерпевают изменения.
Как указано здесь, SSC, попадающие в семенной каналец, обычно защищены от разрушения иммунологически привилегированной средой внутреннего просвета канальца. Клетки, которые выпадают из просвета, обычно уничтожаются иммунной системой хозяина, поскольку клетки являются чужеродными для животного.
В другом варианте осуществления применяют линии животных от различных видом для обеспечения донорскими клетками (ксеногенный перенос). Источники SSC включают, но не ограничиваются человеком, грызунами, включая крыс и мышей, приматами, включая павиана, коровами и собаками.
Настоящее изобретение применимо к любым видам животных, включая людей, у которых представители мужского пола имеют семенники, включая, но не ограничиваясь нечеловекоподобными трансгенными животными. Изобретение также не является ограниченным по видам млекопитающих. Его можно применять для обеспечения животных и линий животных различных типов единичными или множественными новыми генетическими модификациями или новыми свойствами. Животные, для которых можно применять изобретение, включают людей, не человекообразных приматов (например, мартышек, бабуинов), лабораторных животных, таких как грызуны (например, мышей, крыс и т.п.), домашних животных (например, собак, кошек), птиц (таких как куриц и индеек), диких животных (например, быков, волков), животных под угрозой исчезновения (например, слонов, леопардов) и видов из зоопарка (таких как тигров, зебр, львов, панд, жирафов, белых медведей, обезьян, морских выдр и т.д.), которые можно модифицировать для разрешения их применения в клеточной диагностике или оценке. Настоящее изобретение также можно с пользой применять к сельскохозяйственным животным, включая одомашненных жвачных животных и домашних птиц (например, скот, кур, индеек, лошадей, свиней и т.д.) для наделения этих животных преимущественной(ыми) генетической(ими) модификацией(ями) или свойством(ами).
В другом варианте осуществления изобретения донор и реципиент млекопитающих может быть одним и тем же млекопитающим. В одном аспекте популяция клеток, включающих SSC, собирают у млекопитающего до разрушения популяции зародышевых клеток и далее вводят повторно. Этот вариант осуществления сохранит способность млекопитающих к репродуцированию после лучевой терапии, на- 10 034065 пример, что может быть необходимо во время лечения рака. Альтернативно сперматогониальные стволовые клетки можно собирать у млекопитающего и хранить в культуре или замороженными. В этом аспекте изобретения, когда требуется потомство, стволовые клетки трансплантируют в семенники реципиента. Донорскую яйцеклетку млекопитающих можно далее оплодотворить при помощи развившихся сперматозоидов в семенниках реципиента. Для данной процедуры не существует временных ограничений, поскольку стволовые клетки длительно подвергаются самообновлению.
Методы оплодотворения яйцеклеток и потомства известны в области техники и не будут обсуждаться здесь в деталях. В виде неограничивающего примера методы оплодотворения яйцеклеток включают, но не ограничиваются введением сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ/ICSI), кругового введения сперматида (ROSI) и т.п. В дополнение в виде неограничивающего примера методы оплодотворения поколения включают, но не ограничиваются ИКСИ, ROSI и т.п.
После достижения оплодотворения и фертильности конечного потомства линию млекопитающих с ее новой генетической модификацией или свойством утверждают там, где новая генетическая модификация или свойство присутствуют как у потомства женского, так и мужского рода. Так в соответствии с изобретением млекопитающее можно воспроизвести путем удерживания только в его семенниках биологически функциональной эмбриональной клетки, которая не является родной этому млекопитающему, путем повторного восстановления популяции его семенных канальцев. Это (родительское) млекопитающее может производить потомство. Каждая клетка в потомстве является генетически не родной по сравнению с млекопитающим-родителем.
Млекопитающее-родитель и его потомство, предоставленные настоящим изобретением, имеют множество различных применений, включая, но не ограничиваясь применением в сельском хозяйстве и биомедицине, включая человеческую генную терапию.
Демонстрационное сельскохозяйственное применение настоящего изобретение относится к повышению потенциала разведения ценных заводских животных. В другом аспекте настоящего изобретения предоставляются гибридные животные, полезные как в биомедицине, так и в сельском хозяйстве. Как понимают специалисты в данной области техники, при наличии настоящей заявки настоящее изобретение предоставляет преимущественную комплементацию к существующим трансгенным животным технологиям.
Настоящее изобретение облегчает имеющуюся дороговизну эмбриональной трансгенной работы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения сперматогониальные стволовые клетки можно генетически модифицировать и далее перенести в семенники реципиента. Ценные генетические признаки в конечных зародышевых клетках можно передать (трансгенному) поколению заводских животныхреципиентов. Это конкретное применение настоящего изобретения является важным для генной инженерии крупных сельскохозяйственных животных.
Как указано здесь, настоящее изобретение также имеет применения в генной терапии, включая человеческую генную терапию. В виде неограничивающего примера пациенту с вредным генетическим признаком может проводиться биопсия семенников. Стволовые клетки можно генетически модифицировать для коррекции вредного признака. Далее пациенту проводится лечения для удаления оставшихся зародышевых клеток из его семенников, например, при помощи специфического облучения семенников. Его семенники (теперь уже свободные от зародышевых клеток) можно далее повторно заселять его собственными генетически скорректированными стволовыми клетками. Пациент далее может стать отцом поколения без боязни передать генетическое заболевание своему поколению. Альтернативно стволовые клетки со скорректированным геном можно трансплантировать мыши, и получившуюся сперму применять для оплодотворения яйцеклеток при помощи вышеупомянутой необходимости реимплантации стволовых клеток в исходный человеческий семенник.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также может применяться в утверждении и восстановлении или, другими словами, усилении фертильности в млекопитающих мужского пола, включая, но не ограничиваясь людьми. В виде неограничивающего примера пациент, имеющий заболевание или расстройство, излечиваемое при помощи радиоизотопной терапии, химиотерапии или обоих методов, является донором одной или более SSC. После прохождения пациентом лечения при помощи радиоизотопной терапии, химиотерапии или обоих методов пациент может быть приведен к состоянию, свободному от SSC, или, другими словами, может считаться бесплодным. Путем применения, изготовления или трансплантации одного или более SSC пациента в соответствии с настоящим изобретениям фертильность пациента может быть утверждена, восстановлена или, другими словами, усилена.
Комплементация стерильных семенников.
В последнее время конкретные причины бесплодия у мужчин остаются невыясненными в 40-60% случаев (см. Bhasin с соавт., J Clin Endocrinol Metab 79, 1525-9 (1994); Sadeghi-Nejad c соавт., Urol J 4, 192-206 (2007) и Matzuk с соавт., Nat Med 14, 1197-213 (2008)). Всего >5% мужской популяции являются бесплодными, и >1% всех мужчин имеют тяжелое нарушение выработки спермы, которое называется азооспермией (см. Chasin с соавт., J Clin Endocrinol Metab 79, 1525-9 (1994); Sadeighi-Nejad с соавт., Urol J 4, 192-206 (2007); Barthold с соавт. J Urol 170, 2396-401 (2003) и Bleyer, W.A. CA Cancer J Clin 40, 35567 (1990). В основном поскольку азооспермия приводит к неспособности к репродукции естественным
- 11 034065 путем, кажется загадочным, почему это заболевание остается таким распространенным в человеческой популяции. Такая эпидемиологическая тенденция четко указывает на существование сильных факторов среды, которые нарушают процесс выработки спермы (то есть сперматогенез), или на значительное число мутаций de novo, которые могут появляться во время жизни для оставления особи стерильной, но в остальном здоровой (см. Bhasin с соавт., J Clin Endocrinol Metab 79, 1525-9 (1994); Bleyer, W.A., CA Cancer О Clin 40, 335-67 (1990); Reijo, R. с соавт., Nat Genet. 10, 383-93 (1995); Oates с соавт., Hum Reprod 17, 2813-24 (2002)). На самом деле это правда в некоторых случаях, поскольку такие мутации de novo характерны для нескольких типов бесплодия по мужскому типу, которые определены на генетическом уровне, а растущее число мужчин остаются бесплодными в детстве из-за химиотерапии рака (см. Sadeghi-Nejad с соавт., Urol J 4, 192-206 (2007); Reijo с соавт. Nat Genet. 10, 383-93 (1995); Bleyer с соавт., СА Cancer J Clin 40, 355-67 (1990); Oates с соавт., Hum Reprod 17, 2813-24 (2002); Bhasin, S., J Clin Endocrinol Metab 92, 1995-2004 (2007) и Geens, M. c соавт., Hum Reprod Update 14, 121-30 (2008)). Как новая надежда для многих бесплодных мужчин с азооспермией, передовой прорыв в биологии стволовых клеток, который установил сильные связи между репродуктивной биологией и генетическим исследованием, представляет собой открытие, что семенники мышей содержат сперматогониальные стволовые клетки, способные вырабатывать полностью функциональную сперму после выделения и трансплантации в семенники другой мыши (см. Brinster & Zimmermann, Proc Natl Acad Sci USA 91, 11298-302 (1994)). Похожие эксперименты вскоре последовали с крысами, и выделенные у мышей сперматогонии, как оказалось, сохраняют свой потенциал к регенерации через месяцы в культуре (см. Clouthier с соавт., Nature 381, 418-21 (1996); Nagano с соавт., Tissue Cell 30, 389-97 (1998)). Составлена новая культуральная среда, поддерживающая длительную пролиферацию сперматогониальных линий у крыс in vitro, и ученые сейчас находятся на пороге утверждения условий, требуемых для культивирования человеческих сперматогониальных линий из биоптатов семенников (см. Kanatsu-Shinohara с соавт., Biol Reprod 69, 612-6 (2003); Hamra, F.K. с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 102, 17430-5 (2005); Conrad, S. с соавт. Nature (2008) и Kossack, N. с соавт. Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells. Stem Cells (2008)). По-видимому, способность к репродукции сперматогониальных линий в культуре до применения их для продуцирования функциональных сперматозоидов путем трансплантации их обратно в семенники донора представляет ясную стратегию для лечения многих существующих типов мужского бесплодия. Из-за во многом мультипотентной природы зародышевых стволовых клеток, тем не менее, до того, как эти прорывы будут переведены на практику, обязательно сначала строго оценивать доклинические детали таких клеточных терапий в более запущенных нечеловеческих реципиентах по медицинской значимости (см. Geens, M. с соавт., Hum Reprod Update 14, 121-30 (2008); Conrad S. с соавт. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature (2008); Kossack, N. с соавт. Isolation and Characterization of Pluripotent Human Spermatogonial Stem Cell-Derived Cells. Stem Cells (2008); Hermann, B.P. c соавт., Stem Cells 25, 2330-8 (2007) и Zhang с соавт., J Cell Physiol 211, 149-58 (2007)).
Наборы.
Изобретение включает различные наборы, которые включают культуральную систему, свободную от фидера, для поддержания или пролиферации по меньшей мере одной SSC. Хотя типичные наборы описаны ниже, содержимое других полезных наборов будет очевидно специалисту в области техники в свете настоящего раскрытия. Каждый из этих наборов включен в изобретение.
В одном аспекте изобретение относится к набору для поддержания по меньшей мере одной SSC в культуральной системе, свободной от фидера, включающей культуральную систему, включающую культуральную среду определенного состава, свободную от сыворотки, а также предварительно кондиционированные клетки-фидеры из одной или более собственных клеточных линий, включая клетку в BEF1 и линию клеток BSC1, аппликатор, учебный материал, где учебный материал включает инструкции для применения набора для поддержания по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера. В другом аспекте изобретение относится к набору для пролиферирования по меньшей мере одной SSC в культуральной системе, свободной от фидера, включающей культуральную систему, включающую культуральную среду определенного состава, свободную от сыворотки, а также предварительно кондиционированные клетки-фидеры, или среду, которая уже предварительно кондиционирована, аппликатор, учебный материал, где учебный материал включает инструкции для применения набора для пролиферирования по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера.
Изобретение также относится к набору для введения популяции обогащенный SSC млекопитающему, включающему культуральную систему, включающую культуральную среду с определенным составом, свободную от фидера, предварительно кондиционированную клетками-фидерами, аппликатор, учебный материал, где учебный материал включает инструкции для применения набора для поддержания по меньшей мере одной SSC в культуральной среде, свободной от фидера, а также для введении при помощи аппликаторы обогащенных SSC млекопитающему.
Конкретный аппликатор включен в набор в зависимости от, например, метода и/или композиции, применяемых для введения популяции обогащенных SSC в клетку. Такие аппликаторы хорошо известны в области техники и могут включать, среди других, мембрану, имплант, шприц и т.п. Более того, набор включает учебный материал для применения набора. Эти инструкции просто излагают предоставленное
- 12 034065 здесь раскрытие.
Набор также может включать фармакологически приемлемый носитель. Композиция предоставлена в подходящем количестве, как указано здесь. Дополнительно путь введения включает, но не ограничивается, прямым контактом с желаемой областью введения, а также контактом с клеткой и тканью, прилежащими к желаемой областью введения.
Композиции и методы выделения, очищения, обогащения, пролиферации и поддержания SSC, охваченные наборами изобретения, описаны здесь в деталях.
Изобретение дополнительно описано в деталях посредством ссылки на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры предоставлены только с демонстрационной целью и не имеют тенденции к ограничению, если не указано иного. Таким образом, изобретение ни в коей мере не должно считаться ограниченным следующими примерами, но, более того, его следует интерпретировать как охватывающее любые и все варианты, которые очевидны в качестве результатов предоставленного здесь обучения.
Примеры
Выделение и культивирование бычьих или свиных недифференцированных сперматогоний.
1. Приготовить инкубационный раствор с коллагеназой/ДНКазой (1-5 мг/мл коллагеназы, Worthington Biological и 5-10 мг/мл ДНКазы, Sigma-Aldrich).
2. Вручную разделить 100-200 мг разделенной паренхимы бычьих или свиных семенников при помощи микропинцета и поместить в дигестивный раствор коллагеназы/ДНКазы.
3. Инкубировать при 37°С, аккуратно и периодически перемешивая до разделения семенных канальцев.
4. Дать фрагментам семенных канальцев осесть на лед, удалите надосадочную жидкость и промыть в сбалансированном солевом растворе Хенкса, имеющемся у Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA 92008 США (HBSS), или в подходящем физиологическом буфере. Повторить процедуру до того, как надосадочная жидкость станет относительно чистой.
6. После последней инкубации осадка удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать канальцы в дигестивном буфере трипсина/ДНКазы (Invitrogen).
7. Инкубировать при 37°С и далее добавить больше раствора ДНКазы, отмеряя пипеткой, чтобы создать суспензию клеток, состоящую из зародышевых клеток и клеток Сертоли.
8. Добавить фетальную бычью сыворотку или другой подходящий источник протеина для остановки переваривания трипсина и прохождения суспензии клеток через подходящий клеточный фильтр для удаления фрагментов тканей с оставлением, таким образом, только клеточной суспензии.
9. Центрифугировать при 600xg в течение 7 мин при 4°С для осаждения клеток.
10. Аспирировать надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в DPBS-S (фосфатносолевом буфере с 1% FBS, 10 ммоль Hepes, 1 ммоль пирувата, 1 мг/мл глюкозы, 1х 104 ед/мл пенициллина, 1х 104 мкг/мл стрептомицина) или другой подходящий физиологический буфер.
11. Переложить клеточную суспензию в 30%-ный раствор перколла при плотности 2 мл раствора перколла на 5 мл клеточной суспензии. Другие объемы и соотношения перколла и клеточной суспензии также могут быть подходящими.
12. Центрифугировать при 600xg в течение 8 мин при 4°С.
13. Удалить надосадочную жидкость для восстановления осаждения клеток и повторно суспендировать в DPBS-S или другой подходящий буфер.
14. Центрифугировать при 600xg в течение 7 мин при 4°C.
15. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать в культуральную среду StemPro (рецепт ниже).
16. Центрифугировать снова и вымыть клетки в StemPro для удаления остаточной фетальной бычьей сыворотки.
17. Повторно суспендировать вымытый осадок клеток в StemPro и добавить смесь из факторов роста (GDNF 40 нг/мл, FGF 10 нг/мл, CSF-1 10 нг/мл, SDF-1 10 нг/мл). Другие концентрации этих факторов роста также могут быть подходящими.
18. Добавить клетки в емкость с 6 лунками для культивирования, предварительно покрытую 0,1% желатином при плотности 2х106 клеток на лунку, и инкубировать при 37°C. Другие форматы лунок для культивирования, концентрации желатина и плотности клеток также могут быть подходящими.
19. На следующий день добавить HBSS или другой подходящий физиологический буфер к каждой лунке и аккуратно пропустить при помощи пипетки через лунку для удаления неприлипших клеток.
20. Собрать суспензию неприлипших клеток, которые обогащены бычьими сперматогониями.
21. Центрифугировать зародышевые клетки при 600xg в течение 7 мин при 4°C, удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать в BEF1 или BSC1 кондиционированной клеткамифидерами среде StemPro и добавить смесь факторов роста.
22. Поместить клетки в емкость с 24 лунками, предварительно покрытыми Matrigel (BD Biosciences). Другие субстраты, такие как ламинин и фибронектин также могут быть подходящими для
- 13 034065 покрытия пластиковых лунок для культивирования, а также могут быть подходящими емкостями для культивирования на 96, 48 и 12 лунок.
23. Инкубировать клетки при 37°C в атмосфере 5% СО2 на воздухе. BEF1 или BSC1 предварительно кондиционированную среду меняют через день, и клетки повторно помещают на новый матрикс покрытых пластиковых лунок для культивирования с периодичностью в 7-10 дней.
Клетки могут поддерживаться в этих условиях в течение более чем 6 месяцев с формированием глыбок с морфологией, показанной на чертеже. В дополнение клетки сохраняют экспрессирование молекулярных маркеров недифференцированных сперматогоний, включая фактор транскрипции PLZF.
Предварительное кондиционирование среды StemPro.
1. Поддержать BEF и BSC фидеров в модифицированной по методу Дульбекко среды Игла (DMEM), питательной среды, имеющейся в продаже от Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA 92008 США, и субкультуры 1:2-1:5 при 80% совпадении.
2. Предварительное кондиционирование StemPro происходит за 24 ч до добавления среды к культивируемым сперматогониям.
3. Удалить DMEM питательную среду и вымыть клетки при помощи HBSS или другого подходящего физиологического буфера и отложить.
4. Добавить среду StemPro к фидерам и инкубировать при 37°C в течение ночи.
5. Собрать предварительно кондиционированную среду StemPro и пропустить через 0,45 мкм фильтр шприца, добавить смесь факторов роста (GDNF, FGF2, CSF-1 и SDF-1).
6. Добавить рысьи сперматогонии, поддерживаемые в пластиковых лунках для культивирования, покрытых Matrigel или другим подходящим матриксом.
Создание фидеров бычьих эмбриональных фибробластов (BEF).
1. Поместить бычий эмбрион 35 дней от роду в PBS.
2. Удалить голову и висцеральные органы, включая гонады.
3. Разрезать эмбрион на небольшие части стерильным лезвием.
4. Переварить ткани в растворе трипсина путем инкубирования при 37°C.
5. Дать тканям осесть на лед, затем тщательно собрать пипеткой.
6. Добавить больше раствора трипсина и инкубировать при 37°C.
7. Дать ткани осесть на лед, собрать надосадочную жидкость и центрифугировать при 300 xg в течение 5 мин.
8. Повторно суспендировать осажденные клетки в DMEM питательной среде и поместить в лунки для культивирования.
9. Выращивать клетки при 37°C в атмосфере 5% CO2 на воздухе.
10. Обессмертить клетки путем трансфектирования с рекомбинантной ДНК, сконструированной для гиперэкспрессии теломеразы.
Создание фидеров бычьих соматических клеток (BSC).
1. Бычьи клетки семенников, которые прилипают к покрытым желатином лункам для культивирования во время процедуры дифференциального чашечного метода для выделения сперматогоний, поддерживаются в DMEM питательной среде после удаления сперматогоний.
2. Эта популяция клеток представляет собой смесь соматических клеток из бычьих семенников, включая клетки Сертоли, клетки Лейдига и фибробласты.
3. Клетки растут при 37°C в атмосфере 5% СО2 на воздухе и обессмерчиваются путем трансфектирования с рекомбинантной ДНК, сконструированной для гиперэкспрессии теломеразы.
StemPro среда для бычьих недифференцированных сперматогоний Реагент Конечная конц. Поставщик
DMEM/F12 Invitrogen
Пенициллин и Стрептомицин П: 50 Ед/мл С: 50 мкг/мл Invitrogen
- 14 034065
Насыщенный железом трансферрин 10 мкг/мл Sigma
Na2SeO3 3x10^ моль Sigma
2-ME 50 мкмоль Sigma
Инсулин 5 мкг/мл Sigma
Путресцин 6 0 мкмоль Sigma
МЕМ Заменимые аминокислоты 1х Invitrogen
МЕМ Витамины 1х Invitrogen
Фетальная бычья сыворотка (FBS) 0, 1% Invitrogen
Глутамин 2 ммоль Invitrogen
StemPro Добавка 2% Invitrogen
Депозиты.
Депозит линий клеток BEF1 и BSC1 поддерживается автором изобретения этой заявки с даты подачи этой заявки. Доступ к этому хранению будет доступен во время нахождения заявки на рассмотрении у Комиссара по патентам и товарным знакам, и человека, определенного Комиссаром по запросу. После разрешения любых пунктов формулы изобретения в заявке заявитель(и) сделает хранения доступными для публики без ограничений каждой линии с Американской Коллекцией Типовых Культур (АТСС), Manassas, Virginia, 20110. Клеточные линии, хранящиеся в АТСС, заберут из того же депозита, поддерживаемого авторами изобретения и описанного здесь. В дополнение заявитель(и) удовлетворяет требованиям Свода Федеральных Правил (C.F.R.) §1.801-1.809, включая предоставление показания жизнеспособности образца при создании депозита. Этот депозит линии клеток BEF1 и BSC1 будет поддерживаться в хранилище АТСС, которое является публичным, в течение 30 лет, или 5 лет после самого последнего запроса, или в течение времени осуществимости образца, каким бы долгим оно не было, и будет замещен, если он станет нежизнеспособным в течение этого периода. Заявитель не встретит ограничений по доступности хранящегося материала со стороны АТСС, тем не менее, заявитель не обладает авторитетом для отклонения каких-либо ограничений, наложенных законом на трансфер биологического материала или его перемещение в торговле.

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ кондиционирования минимальной среды для поддержания и обогащения сперматогониальных стволовых клеток (SSC), включающий:
    (a) обеспечение контактирования среды с клетками из линии бычьих или свиных эмбриональных фибробластов и/или бычьих или свиных соматических клеток, выделенных из бычьих или свиных семенников, с размножением указанных клеток в указанной среде; и (b) удаление указанных в (а) клеток-фидеров и сбор кондиционированной среды.
  2. 2. Способ обогащения популяции клеток, полученных из семенников, содержащих по меньшей мере одну SSC, бычьими или свиными сперматогониальными стволовыми клетками (SSC), где указанный способ включает:
    a) получение кондиционированной минимальной среды в соответствии со способом по п.1;
    b) обеспечение контактирования указанной популяции клеток с указанной кондиционированной средой в условиях, подходящих для поддержания и обогащения SSC клеток, что приводит к обогащению указанной популяции указанными SSC.
  3. 3. Способ по п.2, где указанные SSC представляют собой бычьи клетки.
  4. 4. Способ по п.1, где указанная кондиционированная среда представляет собой среду DMEM/F12.
  5. 5. Способ по п.1, где в указанную среду добавляют заменитель сыворотки.
  6. 6. Способ по п.5, где заменителем сыворотки является StemPro.
  7. 7. Способ по п.1, где стадия b) осуществляется в пластиковых лунках для культивирования клеток.
  8. 8. Способ по п.7, где указанные пластиковые лунки покрыты Matrigel для адгезии к ним SSC.
  9. 9. Способ по п.1, дополнительно содержащий стадию
    - 15 034065
    c) добавления в указанную кондиционированную среду факторов роста GDNF, FGF2, SDF-1 и CSF1.
  10. 10. Кондиционированная среда для поддержания и обогащения бычьих или свиных сперматогониальных стволовых клеток (SSC), полученная способом по п.1.
  11. 11. Популяция клеток обогащенная бычьими или свиными сперматогониальными стволовыми клетками для трансплантации, оплодотворения или генной терапии, полученная способом по п.2.
  12. 12. Популяция клеток по п.11, где указанные SSC представляют собой бычьи клетки.
  13. 13. Способ получения спермы у млекопитающего-реципиента, где указанный способ включает:
    a) введение SSC-обогащенной популяции, полученной способом по п.2, в семенники млекопитающего-реципиента мужского пола;
    b) создание колонии сперматогенеза указанными обогащенными SSC в указанном млекопитающемреципиенте.
  14. 14. Способ по п.13, где указанную популяцию SSC вводят в просвет семенных канальцев указанного млекопитающего-реципиента.
  15. 15. Способ по п.13, где указанное млекопитающее-реципиент бесплодно.
  16. 16. Способ по п.13, где указанное млекопитающее-реципиент выбирают из грызуна, примата, собаки, быка, свиньи и человека.
  17. 17. Способ по п.16, где указанное млекопитающее представляет собой быка.
EA201491526A 2012-02-14 2013-02-11 Способ культивирования бычьих и свиных сперматогониальных стволовых клеток без использования клеток-фидеров EA034065B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261598437P 2012-02-14 2012-02-14
PCT/US2013/025537 WO2013122864A1 (en) 2012-02-14 2013-02-11 Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201491526A1 EA201491526A1 (ru) 2014-12-30
EA201491526A8 EA201491526A8 (ru) 2017-10-31
EA034065B1 true EA034065B1 (ru) 2019-12-24

Family

ID=47750061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491526A EA034065B1 (ru) 2012-02-14 2013-02-11 Способ культивирования бычьих и свиных сперматогониальных стволовых клеток без использования клеток-фидеров

Country Status (11)

Country Link
US (3) US8998793B2 (ru)
EP (2) EP3243903A1 (ru)
JP (1) JP5782200B2 (ru)
CN (2) CN109486751B (ru)
AU (1) AU2013221839B2 (ru)
BR (1) BR112014020183A8 (ru)
CA (1) CA2864510C (ru)
EA (1) EA034065B1 (ru)
MX (1) MX357280B (ru)
NZ (1) NZ627835A (ru)
WO (1) WO2013122864A1 (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5782200B2 (ja) 2012-02-14 2015-09-24 ワシントン ステイト ユニバーシティ ウシ及びブタ精原幹細胞の培養のためのフィーダーフリー法
WO2015009571A1 (en) * 2013-07-13 2015-01-22 Mice With Horns, Llc Improved methods for spermatogonial stem cell (ssc) transfer
KR101777160B1 (ko) * 2014-03-31 2017-09-11 강원대학교산학협력단 포유동물 유래 정원줄기세포의 분리방법
KR101618237B1 (ko) * 2014-07-09 2016-05-09 건국대학교 산학협력단 개의 정원줄기세포를 체외배양하는 방법
CN104830756A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 湖州师范学院 翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法
CN105316282B (zh) * 2015-12-09 2018-10-30 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用
US20170258495A1 (en) * 2016-02-29 2017-09-14 The Curators Of The University Of Missouri Medium supplement to increase the efficiency of oocyte maturation and embryo culture in vitro
WO2018160920A1 (en) * 2017-03-02 2018-09-07 Orig3N, Inc. Systems and methods of assisted reproduction and prevention of genetic defects in offspring using induced pluripotent stem cells
CN109055306A (zh) * 2018-06-25 2018-12-21 佛山科学技术学院 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法
CN109182269B (zh) * 2018-07-26 2022-07-05 佛山科学技术学院 一种使精原干细胞高效向神经细胞分化的培养体系和方法
CN109402045A (zh) * 2018-10-15 2019-03-01 卢克焕 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法
CN109385395A (zh) * 2018-10-15 2019-02-26 卢克焕 一种用于体外培养的水牛精原干细胞样细胞的纯化方法
KR20210092343A (ko) * 2018-12-19 2021-07-23 방동하 정조 줄기 세포의 집단을 증가시키는 방법
US20230287340A1 (en) * 2020-07-27 2023-09-14 Washington State University Methods for spermatogonial culture
CN113957039A (zh) * 2021-09-06 2022-01-21 西南民族大学 一种冷冻保存的牛生精细胞体外培养方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858354A (en) 1991-12-06 1999-01-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Repopulation of testicular Seminiferous tubules with foreign cells, corresponding resultant germ cells, and corresponding resultant animals and progeny
ES2705683T3 (es) * 2002-12-16 2019-03-26 Technion Res & Dev Foundation Medio de cultivo de células madre pluripotentes
US7666673B2 (en) * 2003-04-15 2010-02-23 Kyoto University Method of growing sperm stem cells in vitro, sperm stem cells grown by the method, and medium additive kit to be used in growing sperm stem cells in vitro
CA2561690A1 (en) * 2004-03-30 2005-10-27 Kyoto University Process for producing multipotential stem cell originating in testoid cell
WO2005105984A2 (en) * 2004-04-12 2005-11-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Culture conditions and growth factors affecting fate determination, self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells
JP2006115767A (ja) * 2004-10-21 2006-05-11 Kyoto Univ フィーダー細胞の不在下で精原幹細胞を増殖させる方法
EP2410043A3 (en) * 2004-12-29 2013-01-23 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Stem cells culture systems
JP6087043B2 (ja) * 2007-07-31 2017-03-01 ライフスキャン・インコーポレイテッドＬｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ． ヒトフィーダー細胞を用いた多能性幹細胞の分化
MX2010001528A (es) * 2007-08-07 2010-10-15 Primegen Biotech Llc Aislamiento, caracterizacion y propagacion de celulas madre de linea germinal.
CN102131919B (zh) * 2008-03-31 2017-05-03 东方酵母工业株式会社 一种增殖多能性干细胞的方法
US7939322B2 (en) * 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
JP2013514760A (ja) * 2009-11-05 2013-05-02 プライムジェン バイオテック エルエルシー ディービーエイ リプロサイト 生殖系列幹細胞の生体外での成熟
CN101818127B (zh) * 2010-03-31 2011-12-28 安徽农业大学 一种小鼠精原干细胞分离培养方法
CN102031242A (zh) * 2010-11-19 2011-04-27 西北农林科技大学 用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系和使用方法
CN102344909B (zh) * 2011-10-20 2013-09-11 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种分离人精原干细胞的方法
JP5782200B2 (ja) * 2012-02-14 2015-09-24 ワシントン ステイト ユニバーシティ ウシ及びブタ精原幹細胞の培養のためのフィーダーフリー法
AU2012100720A4 (en) * 2012-05-22 2012-06-14 Kaul, Gautam Dr Immunomagnetic microbeads for enrichment of CD9+ spermatogonial stem cells

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOEL, S. ; REDDY, N. ; MANDAL, S. ; FUJIHARA, M. ; KIM, S.M. ; IMAI, H.: "Spermatogonia-specific proteins expressed in prepubertal buffalo (Bubalus bubalis) testis and their utilization for isolation and in vitro cultivation of spermatogonia", THERIOGENOLOGY, LOS ALTOS, CA, US, vol. 74, no. 7, 15 October 2010 (2010-10-15), US, pages 1221 - 1232, XP027300689, ISSN: 0093-691X *
J. J. LIM, S.-Y. SUNG, H. J. KIM, S.-H. SONG, J. Y. HONG, T. K. YOON, J. K. KIM, K.-S. KIM, D. R. LEE: "Long-term proliferation and characterization of human spermatogonial stem cells obtained from obstructive and non-obstructive azoospermia under exogenous feeder-free culture conditions", CELL PROLIFERATION, PUBLISHED FOR THE CELL KINETICS SOCIETY, THE EUROPEAN STUDY GROUP FOR CELL PROLIFERATION, AND THE INTERNATIONAL CELL CYCLE SOCIETY BY BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, vol. 43, no. 4, 1 August 2010 (2010-08-01), pages 405 - 417, XP055061728, ISSN: 09607722, DOI: 10.1111/j.1365-2184.2010.00691.x *
JINLONG YIN ; XUN JIN ; SAMUEL BECK ; DONG HO KANG ; ZHONGSHAN HONG ; ZHEHU LI ; YONGCHENG JIN ; QIANKUN ZHANG ; YUN-JAIE CHOI ; S: "In vitro myogenic and adipogenic differentiation model of genetically engineered bovine embryonic fibroblast cell lines", BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER NETHERLANDS, DORDRECHT, vol. 32, no. 2, 16 October 2009 (2009-10-16), Dordrecht, pages 195 - 202, XP019766786, ISSN: 1573-6776 *
M. BAHADORANI; S. M. HOSSEINI; P. ABEDI; M. HAJIAN; S. E. HOSSEINI; A. VAHDATI; H. BAHARVAND; MOHAMMAD H. NASR-ESFAHANI: "Short-term in-vitro culture of goat enriched spermatogonial stem cells using different serum concentrations", JOURNAL OF ASSISTED REPRODUCTION AND GENETICS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NE, vol. 29, no. 1, 11 December 2011 (2011-12-11), Ne, pages 39 - 46, XP019998629, ISSN: 1573-7330, DOI: 10.1007/s10815-011-9687-5 *
M. KANATSU-SHINOHARA, K. INOUE, N. OGONUKI, H. MORIMOTO, A. OGURA, T. SHINOHARA: "Serum- and Feeder-Free Culture of Mouse Germline Stem Cells", BIOLOGY OF REPRODUCTION, SOCIETY FOR THE STUDY OF REPRODUCTION, vol. 84, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 97 - 105, XP055061727, ISSN: 00063363, DOI: 10.1095/biolreprod.110.086462 *
M. KANATSU-SHINOHARA: "Long-Term Culture of Mouse Male Germline Stem Cells Under Serum-or Feeder-Free Conditions", BIOLOGY OF REPRODUCTION, SOCIETY FOR THE STUDY OF REPRODUCTION, vol. 72, no. 4, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 985 - 991, XP055061726, ISSN: 00063363, DOI: 10.1095/biolreprod.104.036400 *
NEIL C. TALBOT, ANNE M. POWELL, MARY CAMP, ALAN D. EALY: "Establishment of a bovine blastocyst-derived cell line collection for the comparative analysis of embryos created in vivo and by in vitro fertilization, somatic cell nuclear transfer, or parthenogenetic activation", IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIOLOGY - ANIMAL, TISSUE CULTURE ASSOCIATION, vol. 43, no. 2, 5 April 2007 (2007-04-05), pages 59 - 71, XP055061731, ISSN: 10712690, DOI: 10.1007/s11626-007-9013-9 *
P. M APONTE, T. SODA, K. J TEERDS, S C. MIZRAK, H. J G VAN DE KANT, D. G DE ROOIJ: "Propagation of bovine spermatogonial stem cells in vitro", REPRODUCTION, JOURNALS OF REPRODUCTION AND FERTILITY, vol. 136, no. 5, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 543 - 557, XP055061730, ISSN: 14701626, DOI: 10.1530/REP-07-0419 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3243903A1 (en) 2017-11-15
EA201491526A8 (ru) 2017-10-31
JP2015508653A (ja) 2015-03-23
CN109486751A (zh) 2019-03-19
WO2013122864A1 (en) 2013-08-22
BR112014020183A2 (ru) 2017-06-20
CN104350145B (zh) 2018-11-27
AU2013221839A1 (en) 2014-08-14
CA2864510C (en) 2020-09-22
CN109486751B (zh) 2022-04-26
CN104350145A (zh) 2015-02-11
US10280397B2 (en) 2019-05-07
EP2814948B1 (en) 2017-07-26
US8998793B2 (en) 2015-04-07
MX2014009306A (es) 2014-10-30
US9434922B2 (en) 2016-09-06
NZ627835A (en) 2016-05-27
US20160362656A1 (en) 2016-12-15
MX357280B (es) 2018-07-03
BR112014020183A8 (pt) 2017-07-11
CA2864510A1 (en) 2013-08-22
AU2013221839B2 (en) 2015-07-30
JP5782200B2 (ja) 2015-09-24
EP2814948A1 (en) 2014-12-24
US20130211186A1 (en) 2013-08-15
EA201491526A1 (ru) 2014-12-30
US20150175957A1 (en) 2015-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10280397B2 (en) Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
RU2473688C2 (ru) Способ получения трансгенных птиц с использованием эмбриональных стволовых клеток
KR20200084916A (ko) 다능성 세포를 다시 생성하는 방법
US20030073233A1 (en) In vitro propagation of embryonic stem cells
CN101065478B (zh) 用于繁殖神经祖细胞的组合物和方法
JP2003516141A (ja) 長期細胞培養組成物とそれから誘導される遺伝的に修飾された動物
KR100502889B1 (ko) 조류 원시생식세포의 생식선 전이 효율의 개선방법
JP4376901B2 (ja) 精原細胞を利用した鳥類キメラの生産方法及び鳥類キメラ
AU2015225014B2 (en) Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
WO1996006160A1 (fr) Procede de culture de cellules aviaires et lignee cellulaire ainsi obtenue
Nabulindo et al. Culture of Kenyan goat (Capra hircus) undifferentiated spermatogonia in feeder-free conditions
US20230287340A1 (en) Methods for spermatogonial culture
JP2008104401A (ja) 精原幹細胞のインビトロ増殖方法
Nakami et al. Culture of Kenyan Goat (Capra Hircus) Undifferentiated Spermatogonia in Feeder-free Conditions
Armstrong et al. Neural stem cell technology as a novel treatment for Parkinson's disease
Pham The Reconstruction of the Physiological Environment for Growing In-Vitro Human Salivary Organoids
Junaidi et al. In Vitro and In Vivo Culture Systems for Development of Porcine Testis Cells and Tissue
WO2005040361A1 (ja) 幹細胞の簡易調製法およびそれに使用するフィーダー細胞
Savchenkova et al. Cultivation and transfer of porcine type A spermatogonia
CN103037939B (zh) 用iPS衍生的胰贝塔样细胞治疗糖尿病的方法和组合物
Gurer et al. Therapeutic use of cloning: Osmangazi turk identical embryonic stem cells and embryonic stem cell transfer to diabetic mice
ASTROCYTES et al. ASTROCYTES, VOLUME
VOLKOVA et al. Cell technologies in transgenesis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM