CN113227354A - 用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于原代细胞培养的方法。在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中培养原代细胞。原代细胞培养的方法可以是扩增诸如痘病毒的病毒的方法中的一个步骤。

Description

用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途
相关信息
本申请要求2019年1月17日提交的美国临时专利申请62/793,674的优先权，并通过引用将其全部包括在内。
技术领域
本公开总体上涉及一种细胞培养基配方以及用于在培养中的细胞的病毒繁殖和增殖的方法，特别是用于生产疫苗。具体来讲，本公开提供了有助于促进用于禽类疫苗生产的初代或次代细胞培养物体外培养的无血清的确定的细胞培养基配方，其中生长培养基包含素食(vegetarian diet)。此外，本公开提供了使用无血清生长培养基进行在培养中的细胞的病毒繁殖和增殖的方法。本公开的培养基特别适合于成纤维细胞，例如鸡胚成纤维细胞的贴壁培养。
背景技术
大多数病毒疫苗是通过细胞培养系统来生产的。在基于细胞培养的疫苗生产中，病毒产量至关重要，不仅因为更高的病毒产量使得更多的疫苗生产更快，而且因为这对于确定基于细胞培养的疫苗生产方法的经济可行性是重要的。
用于病毒/疫苗生产的细胞可以是细胞系或原代动物。鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)是用于病毒生产的原代细胞的一个例子。减毒病毒通常在CEF细胞培养中繁殖。体外细胞生长和繁殖需要培养条件，其包括可以支持细胞生长和繁殖的培养基。一般来说，用于培养哺乳动物来源的细胞所常用的细胞培养基包含富盐溶液，其含有维生素、氨基酸、必需微量元素和糖。另外，细胞生长所需的生长激素、酶和生物活性蛋白，通常以动物血来源的血清或可替代地从动物血来源的血清中分离出的蛋白质组分的形式作为补充剂而添加。
动物血来源的血清制品的实例是胎牛血清、鸡血清、马血清和猪血清。这些血清来源于分级分离(fractionated)的血液，其中已经去除了红细胞和白细胞。原代细胞，比如CEF细胞甚至比细胞系更依赖于动物血清来源。因此，原代细胞通常在含有5％至10％血清的细胞培养基中培养，多数情况下该血清为胎牛血清(FCS)。
动物血来源的血清制品可能含有外源性致病因子，例如病毒或朊蛋白。这些病原体可能会传播给待用疫苗或任何其他在补充有血清的细胞培养中生产的药物制品来治疗或接种的动物/人类，由于该潜在风险，由此也引发了使用血清的安全担忧。常用的牛血清补充剂例证了这些担忧，其中与其使用相关的许多主要问题/风险之一是将引起牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)的因子传播给与从使用牛血清补充剂的细胞培养中生产的制品/疫苗接触的动物/人类的可能性。因此，使用无血清培养基是有优势的，以去除血清中的污染物，比如病毒或致病性朊蛋白，其一定不能留在例如重组蛋白或病毒疫苗载体的最终制品中。
考虑到与在细胞培养中使用动物血清相关的可能风险，开发不含任何动物来源的蛋白质或肽的无血清培养基显然会是优选。具体来说，用从非动物来源分离的蛋白质、肽或脂类来替代动物来源的蛋白质或肽，将减少与血清相关的安全担忧。
因此，仍然需要改善无血清疫苗生产的策略。
发明概述
本公开提供了无血清培养基，其能培养大范围的悬浮和单层细胞，同时能够支持禽类疫苗生产。
本公开提供了无血清培养基，其包含各种无机盐、碳水化合物、氨基酸、缓冲剂、维生素和化合物以模拟自然细胞环境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、盐类、维生素和化合物中的许多可从不含蛋白质或生长促进剂的市售合成培养基中获得，例如EMEM或DMEM。
本公开提供了无血清培养基，其包含源自植物或蔬菜来源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。
此外，本公开还提供了使用无血清培养基培养细胞和细胞系用于病毒繁殖和增殖的方法。
发明详述
本公开的一个目的是开发一种无血清培养基，所述培养基能培养大范围的悬浮和单层细胞，同时能支持禽类疫苗生产。
本公开的培养基还包括各种无机盐、碳水化合物、氨基酸、缓冲剂、维生素和化合物以模拟自然细胞环境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、盐类、维生素和化合物中的许多可从不含蛋白质或生长促进剂的市售合成培养基中获得，例如EMEM或DMEM。除了上述的血清替代品之外，还可以向培养基中添加各种额外的氨基酸、盐类、碳水化合物、维生素和化合物，比如酵母提取物和抗生素，以组成本公开的完全无血清培养基。
本公开的另一个目的涉及使用无血清培养基来培养细胞和细胞系用于病毒繁殖和增殖的过程。无血清培养基包括源自植物或蔬菜来源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。
本公开提供了一种在无血清培养基中培养原代细胞，特别是原代禽类细胞的方法，以及在无血清条件下在原代细胞中生产病毒的方法。用于培养原代细胞的本发明方法的特征可在于在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中培养细胞。
注意，在本公开中，尤其是在权利要求中，术语比如“包含”、“包含”、“包含”等可以意为“包括”、“包括”、“包括”等。术语“基本上由...组成”和“基本上由...组成”允许存在未明确表述的元件，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基础的或新型的特征的元件。
除非明确说明，技术术语按照惯例使用。分子生物学中常见术语的定义见于牛津大学出版社1994年出版的由Benjamin Lewin编写的《Genes V》(ISBN 0-19-854287-9)，Blackwell Science Ltd 1994年出版的由Kendrew等人编写的《The Encyclopedia ofMolecular Biology》(ISBN 0-632-02182-9)以及由VCH出版商1995年出版的由RobertA.Meyers编写的《Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference》(ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文另有明确说明，单数名词“一”、“一个”和“该”包括复数指代。类似地，除非上下文另有明确说明，“或”一词旨在包括“和”。“或”一词指特定列表中的任何一个成员，也包括该列表中成员的任何组合。
本文中使用的术语“原代细胞”是本领域技术人员众所周知的。不受限于以下定义，术语“原代细胞”可以指已经从动物或人类组织、器官或生物体中新鲜分离的细胞，其中细胞不能连续且无限地复制和分裂。通常情况下，原代细胞在细胞培养中分裂少于100次，经常是少于50次，经常是少于25次。因此，原代细胞没有经历永生化事件。原代细胞的例子是动物成纤维细胞，例如但不限于鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。分离原代细胞的方法是众所周知的。通常情况下，原代细胞培养物是通过使用蛋白酶处理组织、器官或胚胎以获得单细胞而直接源自组织、器官或胚胎的。
本公开的方法不局限于形成单层的细胞。根据一个替代实施方案，本公开中的方法可以用于所有其他类型的原代细胞，比如自然生长于悬浮培养的细胞(例如淋巴细胞或其他类型的血细胞)或自然将作为贴壁细胞生长但已经适应在悬浮培养中生长的细胞。
如下所示，细胞也可以用于可作为疫苗而有用的病毒的无血清扩增。
一般来说，用作疫苗的病毒，包括野生型病毒、减毒病毒和重组病毒，是在含血清的条件下生长和扩增的。然而如上所述，存在血清含有致病因子可能传播给用疫苗治疗或接种的动物/人类的潜在风险。为了减少疫苗中污染物的风险，本公开的另一个方面是在无血清条件下传代和/或培养那些前期已经在含血清条件下增殖并计划用作疫苗的病毒。
出乎意料的是，自然作为贴壁细胞生长的原代细胞可以有效地附着于细胞培养容器的表面，而不形成不可接受量的聚集体，并且可以在不存在血清的情况下在对数期生长，因为通常认为原代细胞依赖于血清中包含的多种不同因子和组分。此外，通常认为在无血清培养基中培养时，贴壁细胞形成不存活的聚集体，其不附着于细胞培养容器的表面。由此，出乎意料的是，足以用源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨补充无血清培养基以获得贴壁原代细胞的附着和生长。此外，还出乎意料的是，在悬浮培养中培养的原代细胞可以用根据本公开的方法中所用的培养基培养。
特别地，令人惊讶的是，原代禽类细胞，例如本发明的鸡胚成纤维细胞(CEF)，在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中可被培养以附着在细胞培养容器的表面，而不形成不可接受量的细胞聚集体。然而，人们理解在不包含血清中发现的生长因子或附着因子的无血清培养基中禽类细胞生长不利，即令人意想不到的是，通过在无血清培养基中补充来自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨，可以显著改善原代禽类细胞较差的生长特征。
在贴壁原代细胞的上下文中术语在无血清培养基中进行“细胞培养”指的是将细胞接种于培养容器在无血清培养基中，在无血清培养基中细胞在对数期生长直到形成单层和/或形成单层后在无血清培养基中细胞的维持。术语在无血清培养基中进行“细胞培养”也指上述所有步骤是在无血清培养基中进行的方法，从而在整个细胞培养过程中不存在动物血清制品。因此，从更普遍的意义上来说，术语“在无血清培养基中培养细胞”指的是在形成单层的过程中所有的培养基是无血清培养基。上述所有步骤中使用的培养基可以补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨。
在悬浮培养中生长的细胞的上下文中术语在无血清培养基中进行“细胞培养”指的是将细胞接种于培养容器中在无血清培养基中，在无血清培养基中细胞在对数期生长和/或达到复制不再发生的饱和密度后在无血清培养基中细胞的维持。术语在无血清培养基进行“细胞培养”指上述所有步骤都是在无血清培养基中进行的方法，从而在整个细胞培养中不存在动物血清制品。上述所有步骤中使用的培养基可以补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨。
术语“无血清”培养基指的是不包含来自动物或人源的血清的任何细胞培养基。合适的细胞培养基对于本领域技术人员来说是众所周知的。这些培养基包含盐类、维生素、缓冲液、碳水化合物、氨基酸以及其他化合物，比如酵母提取物和抗生素。
根据本公开的方法使用的培养基，特别是用于诸如CEF细胞的贴壁细胞的培养基，包含源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨。肽和蛋白胨的例子是蔬菜胰蛋白胨。
无血清培养基还可以包括一种或多种选自微生物提取物、植物提取物和来自非哺乳类动物的提取物的添加剂。微生物提取物可以是酵母提取物或酵母粉超滤液(yeastolate ultrafiltrate)。植物提取物可以是大米提取物或大豆提取物。来自非哺乳类动物的提取物可以是鱼类提取物。
无血清培养基也可以与添加动物血来源的血清制品(比如0.5％到3％)一起使用，作为降低支持原代贴壁细胞或细胞系生长通常所需的总体血清浓度(5％到10％)的方法。
病毒的扩增可包括以下步骤：第一步，根据上述方法培养原代细胞，即在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中培养原代细胞。上述在原代细胞培养方法中描述的所有条件和定义，也适用于根据本公开的此实施方案的病毒扩增方法的第一步的定义。第二步，用病毒感染原代细胞。第三步，将被感染的细胞在无血清培养基中孵育，直至产生子代病毒。最后，在第四步将病毒从被感染的细胞中分离出来，或收集带有病毒的细胞以保持这些被感染的细胞存活。
根据本发明的用于病毒扩增的方法的第二步的感染原代细胞的方法是已知的。例如，可以简单地将病毒添加到培养基中。可替代地，可以将培养基去除，并可以将病毒添加到新鲜的培养基中，然后将其添加给细胞。为了获得有效的感染，病毒/培养基悬液的量应尽可能低，以具有高的病毒浓度。在病毒附着之后，可以添加额外的培养基。
在本发明方法的第三步，在无血清培养基中培养被感染的细胞，直到产生子代病毒。
可根据本领域技术人员周知的方法浓缩和纯化子代病毒。
本公开所述的方法涉及一种痘病毒的扩增方法，其包括以下步骤：(Ⅰ)根据上述方法，即在补充有源自植物或蔬菜来源的多肽和蛋白胨的无血清培养基中培养原代细胞的方法培养原代细胞；(Ⅱ)用痘病毒感染原代细胞；(Ⅲ)在无血清培养基中培养被感染的细胞，直到产生子代病毒；和(Ⅳ)从被感染的细胞中分离病毒。根据本发明的方法分离出的病毒不含有任何包含在动物血清中的制品和/或感染因子。
在无血清条件下对那些之前已经在含血清条件下扩增的病毒进行传代、培养和/或纯化的过程称为“再衍生”。如果不完全清楚如何获得用于疫苗生产的主病毒株(masterseed)，也可以使用这种再衍生。而在无血清条件下进行的再衍生大大降低了疫苗中污染的风险，尤其是不希望的感染因子。
根据本公开的方法涉及培养原代禽类细胞和扩增病毒，其中病毒是要再衍生的病毒。例如，本发明的方法对于病毒和病毒原株(stock)的再衍生是有用的，特别是对于已经、或者可能之前已经在含有血清的培养基中进行过传代的原株。
起始材料(即要再衍生的病毒)在无血清条件下的一次传代可能对于病毒的再衍生就足够了。术语“传代”指的是在无血清条件下培养细胞、用要再衍生的病毒感染细胞以及获取在被感染的细胞中产生的病毒的步骤。虽然一次传代可能就足够了，但可优选在无血清条件下将病毒传代数次。在这种情况下，用从第一次传代步骤获得的病毒来再次感染新鲜细胞。无血清条件下进行的传代可与一种或多种在无血清条件下纯化病毒的方法相结合。传代的总数目可选地通过包括纯化，范围为1至大于10，比如3至8或4至6。纯化的技术是本领域技术人员所掌握的标准病毒学方法。
如前所述，本领域技术人员周知原代禽类细胞在无血清条件下生长不好。与痘病毒感染相关联的额外压力可能会导致已经受到压力的细胞在痘病毒显著扩增发生之前死亡。令人惊讶的是，根据本发明的方法，在补充有源自植物或蔬菜来源的多肽和蛋白胨的无血清培养基中培养的禽类细胞有效支持痘病毒病毒复制和扩增。
痘病毒优选是正痘病毒(orthopox virus)。正痘病毒的例子是禽痘病毒(avipoxvirus)和牛痘病毒(vaccinia virus)。
术语“禽痘病毒”指的是任何禽痘病毒，比如禽痘病毒(Fowlpoxvirus)、金丝雀痘病毒、Uncopoxvirus、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、孔雀痘病毒、企鹅痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒和火鸡痘病毒。优选的禽痘病毒是金丝雀痘病毒和禽痘病毒。
术语“马立克氏病病毒”指的是任何一种用于生产马立克氏病疫苗的甲疱疹病毒血清型，包括但不限于病毒血清型1、2和3。
本公开的目的之一是开发一种疫苗生产的方法，特别是通过上述方法获得的痘病毒疫苗。根据优选的实施方案痘病毒是禽痘(FP)病毒。
本公开的另一个目的是开发一种在无血清培养基中利用马立克氏病疫苗(血清型1、2和3)生产来进行疫苗生产的方法。
本公开的另一个目的是开发一种包含病毒，特别是根据本公开的方法生产的重组马立克氏血清型3病毒(HVT)的组合物。由于病毒扩增的方法，该组合物不含任何包含在动物血清内的制品和/或感染因子。相反的，根据传统方法生产出来的含病毒的组合物包含源自动物血清的残留化合物。对于根据传统方法生产的包含马立克氏病毒疫苗的组合物尤其如此，比如HVT病毒血清型。
本公开的另一个目的是开发一种在无血清培养基中利用传染性法氏囊病疫苗生产来进行疫苗生产的方法。
本公开的另一个目的是开发一种用于治疗或免疫接种有此需要的动物(包括人类)的方法，其包括对动物或人体施用上述定义的病毒或上述定义的组合物。
结合以下的实施例将更好地理解本公开，这些实施例旨在对本公开进行说明，而非限制本公开的范围。
实施例
实施例1：原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞培养
细胞培养准备
酶准备：使用GIBCO的TrypLE Select Enzyme(1X)，无需进一步稀释。
生长培养基准备：准备培养基，其包含EMEM培养基和VEGITONE(1X)(来自SIGMA)，EMEM培养基中VEGITONE约为5％v/v。
胚胎的消化：在50mL来自GIBCO的磷酸盐缓冲液(PBS)中将胚胎洗三遍，然后在TrypLE溶液中消化四次，每次消化时期持续五分钟。
将细胞收集在含有50/50的VEGITONE和EMEM溶液的烧杯中，用细胞准备培养基(含5％VEGITONE v/v的EMEM培养基)进行冲洗。然后以750RPM将细胞离心十二分钟，并保存在2-7℃长达72小时。
收集总体积为110mL的细胞，细胞密度为6.0x106个细胞/mL。
根据下表1准备每个原代细胞培养容器(共6个)。
表1.原代细胞培养容器条件
Figure BDA0003130092960000091
在35-39.0℃和0.2RPM下孵育48小时后，转瓶100％汇合。
HVT病毒在细胞培养中传代
以每瓶1x108个细胞的比率将原代(1°)CEF细胞培养物接种到五个转瓶中。以培养基(EMEM)中约5％的比率使用1X VEGITONE来为CEF细胞提供额外的营养。在39.0℃和0.2RPM下孵育48小时后，转瓶100％汇合。
用1安瓿HVT SR-3接种CEF细胞，然后在35-39℃和0.2RPM下孵育，约46小时后确定细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)为约60％。通过胰蛋白酶消化收获这些HVT感染的CEF细胞的第一次传代(X+1)，然后离心并重悬在含有6种不同冷冻保存培养基配方的小瓶中。然后使用控速冷冻机(controlled rate freezer)将小瓶冷冻至约-110℃。将重悬的小瓶标记为条件1的X+1(1)、条件2的X+1(2)、条件3的X+1(3)、条件4的X+1(4)、条件5的X+1(5)和条件6的X+1(6)。冷冻保存培养基和冷冻数据显示在下表2中。
表2：冷冻保存培养基和冷冻数据
Figure BDA0003130092960000101
1RMBio的经辐照的小牛血清，2SIGMA的1x LB VEGITONE，31％的甲基纤维素(4000CP)(来自SIGMA)在1％PBS-溶液中，和4将以0.5mL配制的疫苗于49.5mL Marek稀释剂中的比率稀释样本，然后以1：500稀释用于滴定和活细胞计数(1:1台盼蓝)。
实施例2：原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞培养
细胞培养准备
酶准备：使用GIBCO的TrypLE Select Enzyme(1X)，无需进一步稀释。
生长培养基准备：准备培养基，其包含RS-EMEM培养基和VEGITONE(1X)(来自SIGMA)，EMEM培养基中VEGITONE约为5％v/v。
胚胎的消化：在1000mL来自GIBCO的磷酸盐缓冲液(PBS)中将胚胎洗3遍，然后在50mL TrypLE溶液中消化四次，每次消化时期持续五分钟。
将细胞收集在含有20mL的EMEM(含20％的VEGITONE)的烧杯中，用10mL细胞准备培养基(含5％VEGITONE v/v的EMEM培养基)进行冲洗。然后以750RPM将细胞离心十二分钟，并保存在2-7℃长达72小时。
收集总体积为200mL的细胞，为28x106个细胞/mL。
根据下表3准备每个原代细胞培养容器(共12个)。
表3.原代细胞培养容器条件
Figure BDA0003130092960000111
HVT病毒在细胞培养中第二次传代
以每转瓶4.5x108个CEF细胞的比率将原代(1°)CEF细胞接种在十个850cm2转瓶中并在35-39.0℃和0.15RPM下孵育。以培养基(EMEM)中约5％的比率使用1X VEGITONE来为CEF细胞提供营养。
用1mL来自表2的X+1(2)接种一个含有CEF细胞悬液的转瓶，并在35-39.0℃和0.15RPM下孵育。接种约50小时后，确定细胞病变效应(CPE)为约60％。使用1xTrypLESelect收集这些HVT感染的细胞的第二次传代(X+2)，并以750x g离心15分钟以沉淀细胞。将沉淀的细胞重悬在含有5％1X LB VEGITONE和0.1％甲基纤维素的PBS中。将2.0mL的该细胞悬液加入剩余的9个转瓶中以产生HVT感染的CEF细胞的第三次传代(X+3)。
HVT病毒在细胞培养中第三次传代
用2mL的第二次传代细胞(X+2)接种九个含有CEF细胞悬液的转瓶，并在35-39.0℃和0.15RPM下孵育。接种约48小时后，确定细胞病变效应(CPE)为约75-80％。使用1xTrypLESelect收集每个转瓶含有第三次传代细胞(X+3)，并以750x g离心15分钟以沉淀细胞。在离心前用约20mL含有10％VEGITONE的EMEM中和TrypLE Select。将沉淀的细胞重悬在两种不同的低温保存培养基中，并使用控速冷冻机进行冷冻。冷冻保存培养基和冷冻数据显示在下表4中。
表4:冷冻保存培养基和冷冻数据
Figure BDA0003130092960000121
1SIGMA的1x LB VEGITONE，2 1％的甲基纤维素(4000CP)(来自SIGMA)在1％PBS-溶液中。
用于CEF细胞培养的示例性培养基配方示于表5，用于CEF细胞或感染HVT病毒的CEF细胞的冷冻保存的示例性培养基配方示于表6。
表5：CEF细胞培养基配方。示出了配制1L无血清培养基的量。
Figure BDA0003130092960000131
表6：CEF/病毒冷冻保存培养基。示出了配制1L培养基的量。
Figure BDA0003130092960000132
使用根据表5的无血清培养基产生的HVT病毒产量与使用包含约6％小牛血清的常规生长培养基在相似生长/孵育条件下产生的批次(batch)相当(表7)。
表7：重组HVT病毒原株产量数据
Figure BDA0003130092960000133
*批次效率是每个转瓶恢复的总PFU除以接种到转瓶中的CEF细胞的总数。
实施例3：禽痘疫苗病毒、法氏囊病疫苗病毒和马立克氏病疫苗病毒(血清型1、2和 3)在无血清培养基中的生长
使用根据表5的无血清培养基培养感染/接种了根据下表8的各种原株病毒的CEF细胞并置于类似生长条件，结果导致观察到的CPE至少为50％和病毒复制(如下表8所示)。
表8：疫苗病毒和结果产量数据
Figure BDA0003130092960000141
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。事实上，从前述出发，除了本文所述的那些之外，对本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

Claims (15)

1.培养基，所述培养基包括：不含人类或动物蛋白质的基础培养基，和植物蛋白来源。
2.权利要求1的培养基，其中基础培养基是EMEM。
3.权利要求1的培养基，其中基础培养基是DMEM。
4.权利要求1的培养基，其中植物蛋白来源是植物来源的胰蛋白胨。
5.权利要求4的培养基，其中植物来源的胰蛋白胨是VEGITONE。
6.权利要求1的培养基，所述培养基还包括抗生素。
7.权利要求1的培养基，所述培养基还包括酵母提取物。
8.权利要求1的培养基，所述培养基还包括盐类。
9.权利要求1的培养基，所述培养基还包括碳水化合物。
10.权利要求1的培养基，所述培养基还包括额外的氨基酸。
11.权利要求1的培养基，所述培养基还包括一种或多种金属离子、维生素和辅助因子。
12.权利要求1的培养基，所述培养基还包括动物血来源的血清制品。
13.权利要求12的培养基，其中动物来源的血清制品占培养基的0％到包含但不超过7％v/v。
14.权利要求1的培养基，所述培养基还包括至少一种选自下述的缓冲液：CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、丙酮酸钠、HEPES和MOPS，其以足以维持培养基的pH范围为6.5-7.5的量存在。
15.病毒繁殖的方法，所述方法包括：
a.在权利要求1的培养基中培养禽类胚胎细胞，
b.建立能够在无血清的基础培养基中增殖的贴壁或非贴壁细胞培养，
c.当细胞密度达到至少1.0x106个细胞/mL时，用选自痘病毒或痘病毒载体、传染性法氏囊病病毒、Rispens、SB-1、HVT或任何马立克氏血清型1、2或3病毒载体的病毒感染所述禽类胚胎细胞，
d.在权利要求1的培养基中培养所述感染的禽类胚胎细胞，直到CPE达到至少50％，和
e.收集所述病毒。
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