TW202043458A - 用於禽類疫苗製造之無血清培養基及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於培養初級細胞之方法。該等初級細胞係培養在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖之無血清培養基中。培養初級細胞之方法可為用於擴增病毒(諸如痘病毒)之方法中的一個步驟。
Description
本發明大體上係關於細胞培養基調配物及用於在培養中細胞之病毒繁殖及倍增,詳言之用於製造疫苗之方法。具體言之,本發明提供無血清、經確定成分之細胞培養基調配物,其促進用於製造禽類疫苗之初級或二級細胞培養的活體外
培養,其中該生長培養基包含植物源營養。此外,本發明提供使用無血清生長培養基在培養中細胞之病毒繁殖及倍增之方法。本發明之培養基尤其適用於諸如雞胚胎纖維母細胞之纖維母細胞之貼壁培養。
大多數病毒疫苗由細胞培養系統製造。病毒產生在基於疫苗製造之細胞培養中為至關重要的,不僅因為較高產率導致疫苗製造較快,而且因為其對於測定基於疫苗製造方法之細胞培養之經濟可行性為重要的。
用於病毒/疫苗製造之細胞可為細胞株或初級動物。雞胚胎纖維母細胞(CEF細胞)為用於病毒製造之初級細胞的實例。減毒病毒通常在CEF細胞培養中繁殖。活體外細胞生長及繁殖需要包括可支持細胞生長及繁殖之培養基的培養條件。習知地,為了培養源自哺乳動物之細胞,常用細胞培養基包含含有維生素、胺基酸、基本微量元素及糖之富鹽溶液。另外,細胞生長所需之生長激素、酶及生物活性蛋白質通常作為補充劑以源自動物血液之血清形式或替代地與源自動物血液之血清分離的蛋白質組分形式添加至培養基中。
源自動物血液之血清產品之實例為胎牛血清、雞血清、馬血清及豬血清。此等血清源自部分分離之血液,已自其中移除紅血球及白血球。諸如CEF細胞之初級細胞甚至比細胞株更取決於動物血清源。因此,通常在包含5至10%血清,在大多數情況下為胎牛血清(FCS)之細胞培養基中培養初級細胞。
源自動物血液之血清產品可能含有外來病原體,諸如病毒或朊病毒蛋白質。由於此等病原體會有傳輸至待經疫苗處理或接種之動物/人類或在補充有血清之細胞培養物中製造的任何其他醫藥產物的潛在風險,因此使用血清產生安全問題。此等問題由常用牛血清補充例示,其中與使用牛血清補充相關之許多主要問題/風險中之一者為將引起牛海綿狀腦病(BSE)之藥劑傳輸至與由使用牛血清補充之細胞培養製造之產物/疫苗接觸的動物/人類的可能性。因此,使用無血清培養基是有利的,以便消除血清中諸如病毒或病原性朊病毒的污染物,該等污染物絕不能保留於例如重組蛋白或病毒疫苗載體之最終產物中。
鑒於與在細胞培養中使用動物血清相關之可能風險,已變得顯而易見的是不含任何源自動物之蛋白質或肽之無血清培養基之開發將為較佳的。具體言之,用自非動物源分離之彼等蛋白質、肽或脂質替代源自動物之蛋白質或肽將減輕與血清相關之安全問題。
仍需要用於改良無血清疫苗製造之策略。
本發明提供無血清培養基,該培養基能夠使廣泛範圍之懸浮及單層細胞生長,同時能夠支持禽類疫苗製造。
本發明提供一種無血清培養基,其包含各種無機鹽、碳水化合物、胺基酸、緩衝劑、維生素及模擬天然細胞環境之化合物。需要時,許多胺基酸、碳水化合物、鹽、維生素及化合物可從不含蛋白質或生長促進劑之市售合成性培養基獲得,諸如EMEM或DMEM。
本發明提供一種無血清培養基,其包含源自植物或蔬菜源之胰化蛋白(肽及蛋白腖)。
另外,本發明亦提供一種使用無血清培養基用於培養細胞及細胞株以便病毒繁殖及倍增之方法。
其他申請案之交叉參考
本申請案主張2019年1月17日申請之美國臨時專利申請案62/793,674之優先權,其以全文引用之方式併入本文中。
本發明之目標為開發一種無血清培養基,該培養基能夠使廣泛範圍之懸浮及單層細胞生長,同時能夠支持禽類疫苗製造。
本發明之培養基亦包括各種無機鹽、碳水化合物、胺基酸、緩衝劑、維生素及模擬天然細胞環境之化合物。需要時,許多胺基酸、碳水化合物、鹽、維生素及化合物可從不含蛋白質或生長促進劑之市售合成性培養基獲得,諸如EMEM或DMEM。除上文所描述之血清取代之外,可將各種額外胺基酸、鹽、碳水化合物、維生素及化合物(諸如酵母提取物及抗生素)添加至培養基以便構成本發明之完整無血清培養基。
本發明之另一目標係關於一種利用無血清培養基來培養細胞及細胞株以便病毒繁殖及倍增之方法。無血清培養基包括源自植物或蔬菜源之胰化蛋白(肽及蛋白腖)。
本發明提供一種在無血清培養基中培養初級細胞,詳言之初級禽類細胞之方法及一種在無血清條件下在初級細胞中製造病毒之方法。用於培養初級細胞之本發明方法的特徵係該等細胞培養在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖之無血清培養基中。
應注意,在本發明中且特定言之在申請專利範圍中,諸如「包含(comprises/comprised/comprising)」之術語及類似術語意謂「包括(includes/included/including)」及類似術語;且諸如「基本上由…組成(consisting essentially of/consists essentially of)」之術語允許未明確敍述之要素,但排除發現於先前技術中或影響本發明之基本或新穎特徵之要素。
除非另外指出,否則根據習知用途使用技術術語。分子生物學中常見術語之定義可見於Benjamin Lewin, Genes V. 由Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew 等人(編), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及Robert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
除非上下文另外清楚指示,否則單數術語「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。類似地,除非上下文另外清楚地指示,否則措辭「或」意欲包括「及」。措辭「或」意謂特定清單中之任一個成員且亦包括彼清單之成員的任何組合。
如在本說明書中所使用之術語「初級細胞」為熟習此項技術者所熟知。在不受限於以下定義之情況下,術語「初級細胞」係指已從動物或人類組織、器官或生物體中新分離之細胞,其中該等細胞不能夠連續且無限複製及分裂。通常,初級細胞在細胞培養中分裂少於100次、常常少於50次、常常少於25次。因此,初級細胞尚未經歷永生化事件。初級細胞之實例為動物纖維母細胞,諸如但不限於雞胚胎纖維母細胞(CEF細胞)。分離初級細胞之方法為熟知的。一般而言,初級細胞培養係直接源自於組織、器官或胚胎,藉由將組織、器官或胚胎經受蛋白酶處理以獲得單細胞。
本發明之方法不受限於形成單層之細胞。根據替代實施例,根據本發明之方法可用於所有其他類型之初級細胞,諸如以懸浮培養形式自然生長的細胞(例如淋巴細胞或其他類型之血細胞)或自然地是呈貼壁細胞生長但已適於在懸浮培養中生長之細胞。
如下文所示,細胞亦可用於對可適用作疫苗之病毒進行無血清擴增。
一般而言,在含有血清之條件下生長及擴增包括用作疫苗之野生型病毒、減毒病毒及重組病毒之病毒。然而如上文所指出,有可能存在血清含有可傳輸至經疫苗處理或接種之動物/人類之病原體的風險。為降低疫苗中污染物之風險,本發明之另一態樣為在無血清條件下傳代及/或培養先前已在含有血清之條件下擴增且意欲用作疫苗之彼等病毒。
意外地是自然生長為貼壁細胞之初級細胞可有效地附著至細胞培養容器之表面而不形成不可接受量之聚集體且可在無血清存在下以對數期生長,因為通常認為初級細胞取決於含於血清中之多種不同因素及組分。此外,認為當在無血清培養基中培養時,貼壁細胞形成不附著至細胞培養容器表面之非活性聚集體。因此,意外地是其足以用源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖補充無血清培養基以獲得貼壁初級細胞之附著及生長。此外,亦意外地是培養於懸浮培養中之初級細胞可經用於根據本發明之方法中之培養基生長。
詳言之,意外地是可培養諸如本發明之雞胚胎纖維母細胞(CEF)之初級禽類細胞以附著至細胞培養容器之表面而在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖之無血清培養基中不形成不可接受量之聚集體。以其他方式理解,禽類細胞在不包含生長因子或存在於血清中之附著因素之無血清培養基中不利地生長,亦即意外地是初級禽類細胞之不良生長特性可藉由用源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖補充無血清培養基而得到顯著改良。
在貼壁初級細胞之情形下術語在無血清培養基中「培養細胞」指將細胞接種至培養容器中之無血清培養基中、細胞在無血清培養基中以對數期生長直至形成單層及/或一旦單層形成即將細胞維持在無血清培養基中。術語在無血清培養基中「培養細胞」亦指如下方法:其中所有上文所提及之步驟均使用無血清培養基進行,以使得在整個細胞培養過程期間不存在動物血清產品。因此,在更一般含義中術語「在無血清培養基中培養細胞」指導致形成單層之所有培養基均為無血清培養基。所有以上步驟中使用之培養基均可補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖。
在細胞生長在懸浮培養物中之情形下術語在無血清培養基中「培養細胞」指將細胞接種至培養容器中之無血清培養基中中、細胞在無血清培養基中以對數期生長及/或一旦獲得無進一步複製發生之飽和密度即將細胞維持在無血清培養基中。術語在無血清培養基中「培養細胞」指如下方法:其中所有上文所提及之步驟均使用無血清培養基進行,以使得在整個細胞培養期間不存在動物血清產品。用於所有以上步驟中之培養基均可補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖。
術語「無血清」培養基指不含來自動物或人類源之血清的任何細胞培養基。適合之細胞培養基為熟習此項技術者所已知。此等培養基包含鹽、維生素、緩衝劑、碳水化合物、胺基酸及其他化合物,諸如酵母提取物及抗生素。
根據本發明之方法使用之培養基,尤其用於諸如CEF細胞之貼壁細胞之培養基含有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖。肽及蛋白腖之實例為蔬菜胰化蛋白。
無血清培養基可進一步包含一或多種選自微生物提取物、植物提取物及來自非哺乳動物之提取物的添加劑。微生物提取物可為酵母提取物或酵母超濾物。植物提取物可為稻米提取物或大豆提取物。來自非哺乳動物之提取物可為魚類提取物。
此無血清培養基亦可添加源自動物血液之血清產品(例如0.5至3%)使用,以作為降低支持初級貼壁細胞或細胞株之生長通常所需之總血清濃度(5至10%)的方法。
病毒之擴增可包含以下步驟:在第一步驟中,根據上文所描述之方法培養初級細胞,亦即在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖之無血清培養基中培養初級細胞。上文用於培養初級細胞之方法的描述中所給出之所有條件及定義亦適用於根據本發明之此實施例擴增病毒之方法的第一步驟的定義。在第二步驟中,初級細胞經病毒感染。在第三步驟中,將經感染細胞在無血清培養基中培育直至產生後代病毒。最後,在第四步驟中,自經感染細胞分離病毒或採集窩藏病毒之細胞以便保持此等經感染細胞存活。
根據用於病毒擴增之本發明方法之第二步驟感染初級細胞之方法為已知的。例如,可向培養基簡單地添加病毒。替代地,可移除培養基且可將病毒添加至新鮮培養基中,隨後又將其添加至細胞中。為獲得高效感染,病毒/培養基懸浮液之量應儘可能低以便具有高病毒濃度。在附著病毒之後,可添加額外培養基。
在本發明方法之第三步驟中,將經感染細胞在無血清培養基中培養直至產生後代病毒。
後代病毒可根據熟習此項技術者已知之方法濃縮及純化。
根據本發明之方法係關於一種用於擴增痘病毒之方法,其包含以下步驟:(I)根據如上文所描述之方法培養初級細胞,亦即在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖的無血清培養基中培養初級細胞之方法,(II)用痘病毒感染初級細胞,(III)在無血清培養基中培養經感染細胞直至產生後代病毒及(iv)自經感染細胞分離病毒。根據本發明方法分離之病毒不含包含於動物血清中之任何產物及/或感染物。
在無血清條件下傳代、培養及/或純化成先前已在含有血清之條件下擴增之彼等病毒的方法稱為「重衍生」。若不完全清楚如何獲得用於製造疫苗之種源,則亦可使用此類重衍生。在無血清下之重衍生大幅度降低疫苗中之污染,尤其非所需感染物之風險。
根據本發明之方法係關於培養初級禽類細胞及擴增病毒,其中病毒為待重衍生之病毒。例如,本發明方法適用於重衍生病毒及病毒原液,尤其適用於已經或可能已經在含有血清之培養基中預先傳代之原液。
起始物質(亦即待在無血清條件下重衍生之病毒)之一次傳代可能足以使病毒重衍生。術語「傳代」指在無血清條件下培養細胞、用待重衍生之病毒感染細胞及獲得在經感染細胞中產生之病毒的步驟。儘管一次傳代可能足夠,但可較佳的在無血清條件下使病毒傳代若干次。在此情況下,使用獲自第一傳代步驟之病毒再次感染新鮮細胞。在無血清條件下之傳代可與用於在無血清條件下純化病毒之一或多種方法組合。視情況藉由包括純化之總傳代次數在1至大於10,諸如3至8或4至6範圍內。純化技術為由熟習此項技術者實踐之標準病毒學方法。
如先前所論述,熟習此項技術者應理解初級禽類細胞在無血清條件下不利地生長。與痘病毒感染有關的額外應激可預期在痘病毒發生顯著擴增之前使已應激之細胞死亡。意外地,根據本發明方法生長之禽類細胞在補充有源自植物或蔬菜源之肽及蛋白腖的無血清培養基中有效支持痘病毒之病毒複製及擴增。
痘病毒較佳為正痘病毒。正痘病毒之實例為禽類痘病毒及痘苗病毒。
術語「禽類痘病毒」指任何禽類痘病毒,諸如家禽痘病毒、金絲雀痘病毒、Uncopoxvirus、八哥痘病毒、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、孔雀痘病毒、企鵝痘病毒、麻雀痘病毒、燕八哥痘病毒及火雞痘病毒。較佳的禽類痘病毒為金絲雀痘病毒及家禽痘病毒。
術語「馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)」指用於製造馬立克氏病疫苗之α疱疹病毒血清型中之任一者包括但不限於病毒血清型1、2及3。
本發明之一個目標為開發一種用於疫苗(尤其是藉由上述方法獲得的痘病毒疫苗)製造之方法。根據一較佳實施例,痘病毒為家禽痘(FP)病毒。
本發明之另一目標為開發一種用於在無血清培養基中利用馬立克氏病疫苗(血清型1、2及3)製造之疫苗製造的方法。
本發明之另一目標為開發包含由根據本發明之方法製造之病毒,詳言之重組馬立克氏血清型3病毒(HVT)的組合物。由於用於擴增病毒之方法,組合物不含包含於動物血清中之任何產品及/或感染物。相比之下,根據習知方法製造之包含病毒的組合物包含源自動物血清之殘餘化合物。此尤其為包含根據習知方法(諸如HVT病毒血清型)製造之馬立克病毒疫苗之組合物的情況。
本發明之另一目標為開發一種用於在無血清培養基中利用傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease)疫苗製造之疫苗製造的方法。
本發明之另一目標為開發一種用於治療或疫苗接種有需要之動物(包括人類)的方法,包含向動物或人體投與如上文所定義之病毒或如上文所定義之組合物。
結合以下實例將更好地理解本發明,該等實例意欲作為對本發明之範疇之說明且不為對本發明之範疇之限制。
實例 實例 1 :初級雞胚胎纖維母細胞 ( CEF ) 細胞培養 細胞培養製備
酶製備;使用來自GIBCO之未經進一步稀釋的TrypLE Select酶(1X)。
生長培養基製備;製備包含EMEM培養基及來自SIGMA之VEGITONE(1X)在EMEM培養基中作為約5% VEGITONE v/v之培養基。
胚胎分解;胚胎在50 mL來自GIBCO之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌三次且隨後在TrypLE溶液中分解四次,其中各分解時段持續五分鐘。
將細胞收集至具有50/50 VEGITONE及EMEM溶液之燒杯中,且用細胞製備培養基(在EMEM培養基中之5% VEGITONE v/v)沖洗。細胞在750 RPM下離心12分鐘且在2-7℃下儲存長達72小時。
以6.0×106
個細胞/毫升之細胞密度收集110 mL總體積之細胞。
根據下表1各製備初級細胞培養容器(總計6個)。
表1:初級細胞培養容器條件
容器 | 滾瓶 編號 | EMEM 體積 (mL) | 細胞 /(mL) | 細胞體積 (mL) | VEGITONE 體積 (mL) |
滾瓶(RB) | 6 | 285 | 6.0 x 106 | 18 | 15 |
在35-39.0℃及0.2 RPM下培育48小時之後,滾瓶100%匯合。
細胞培養物中之 HVT 病毒傳代
以1億個CEF細胞/瓶之速率將五個滾瓶接種初級(1°) CEF細胞培養。在培養基(EMEM)中以約5%之速率使用1×VEGITONE,向CEF細胞提供額外營養。在39.0℃及0.2 RPM下培育48小時之後,滾瓶100%匯合。
將CEF細胞用1安瓿的HVT SR-3接種,隨後在35-39℃及0.2 RPM下培育,且在約46小時之後,測定細胞病變效應(CPE)為約60%。藉由胰蛋白酶消化採集此等經HVT感染之CEF細胞之此首次傳代(X+1),隨後離心且再懸浮於含有6種不同低溫保存培養基調配物之小瓶中。隨後使用控制速率冷凍器將小瓶冷凍至約-110℃。針對條件1,再懸浮小瓶經標記以形成X+1(1),針對條件2為X+1(2),針對條件3為X+1(3),針對條件4為X+1(4),針對條件5為X+1(5),且針對條件6為X+1(6)。低溫保存培養基及冷凍資料展示於下表2中。
表2:低溫保存培養基及冷凍資料
1
來自RMBio之經輻射之胎牛血清、2
來自SIGMA之1×LB VEGITONE、3
在1% PBS溶液中1%來自SIGMA之甲基纖維素(4000CP)及4
以0.5 mL經調配疫苗至49.5 mL馬立克稀釋劑中之比率稀釋的樣品,接著1:500倍稀釋用於滴定及活細胞計數(1:1錐蟲藍)。
在 1x EMEM 中用 0.35 g/L 碳酸氫鈉之不同低溫保存 | ||||||||
條件 | DMSO% | 胎牛血清%1 | LB Veg%2 | MC %3 | 預冷凍細胞計數(0.2 mL劑量) | 預冷凍力價(0.2 mL 劑量)4 | 冷凍後細胞計數(0.2 mL劑量) | 冷凍後力價(0.2 mL 劑量)4 |
1 (對照組) | 3.5 | 15 | 0 | 0 | 12000/劑量 | 4040 | 15000/劑量 | 4820 |
2 | 3.5 | 0 | 0 | 0 | 23000/劑量 | 4880 | 11000/劑量 | 4340 |
3 | 3.5 | 0 | 5 | 0 | N/A | N/A | 18000/劑量 | 4560 |
4 | 5.0 | 0 | 0 | 0 | 16000/劑量 | 4160 | 13000/劑量 | 4940 |
5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 15000/劑量 | 4120 | 9000/劑量 | 4340 |
6 | 10 | 0 | 0 | 10 | 14000/劑量 | 4400 | 12000/劑量 | 4480 |
實例 2 : 初級雞胚胎纖維母細胞 ( CEF ) 細胞培養 細胞培養物製備
酶製備;使用來自GIBCO之未經進一步稀釋的TrypLE Select酶(1X)。
生長培養基製備;製備包含RS-EMEM培養基及來自SIGMA之VEGITONE(1X)在EMEM培養基中作為約5% VEGITONE v/v之培養基。
胚胎分解;胚胎在1000 mL來自GIBCO之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌三次且隨後在50 ml之TrypLE溶液中分解四次,其中各分解時段持續五分鐘。
將細胞收集至具有20 mL含有20% VEGITONE之EMEM的燒杯中,且用10 mL細胞製備培養基(在EMEM培養基中之5% VEGITONE v/v)沖洗。細胞在750 RPM下離心12分鐘且在2-7℃下儲存長達72小時。
以28×106
個細胞/毫升之細胞密度收集200 mL總體積之細胞。
根據下表3各製備初級細胞培養容器(總計12個)。
表3:初級細胞培養容器條件
容器 | 滾瓶 編號 | EMEM 體積 (mL) | 細胞數目 /(mL) | 細胞體積 (mL) | VEGITONE 體積 (mL) |
滾瓶 (RB) | 12 | 285 | 2.8 x 107 | 16 | 15.0 |
細胞培養物中之 HVT 病毒傳代第二次傳代
以4.5億個CEF細胞/瓶之速率將十個850 cm2
滾瓶接種初級(1°)CEF細胞且在35-39.0℃及0.15 RPM下培育。在培養基(EMEM)中以約5%之速率使用1×VEGITONE來向CEF細胞提供營養。
一個含有CEF細胞懸浮液之滾瓶用1 mL來自表2之X+1(2)接種且在35-39.0℃及0.15 RPM下培育。在接種約50小時之後,測得細胞病變效應(CPE)為約60%。使用1xTrypLE Select採集此等經HVT感染之細胞之此第二次傳代(X+2)且在750×g下離心15分鐘以使細胞集結。將粒化細胞再懸浮於含有5% 1×LB VEGITONE及0.1%甲基纖維素之PBS中。將2.0 mL此細胞懸浮液添加至剩餘9個滾瓶中以產生經HVT感染之CEF細胞之第三次傳代(X+3)。
細胞培養物中之 HVT 病毒傳代第三次傳代
將含有CEF細胞懸浮液之九個滾瓶接種2.0 mL之第二次傳代細胞(X+2)且在35-39.0℃及0.15 RPM下培育。在接種約48小時之後,細胞病變效應(CPE)測得為約75-80%。使用1xTrypLE Select採集含有第三次傳代細胞(X+3)之各滾瓶且在750×g下離心15分鐘以使細胞集結。在離心之前,用含有10% VEGITONE之約20 mL EMEM來中和TrypLE Select。使粒化細胞再懸浮於兩種不同低溫保存培養基中,且使用控制速率之冷凍器冷凍。低溫保存培養基及冷凍資料展示於下表4中。
表4:低溫保存培養基及冷凍資料
1
來自SIGMA之1×LB VEGITONE、2
在1% PBS溶液中來自SIGMA之1%甲基纖維素(4000CP)。
條件 | DMSO% | LB Veg%1 | MC%2 | 用於製備體積100 mL之培養基 | 冷凍後力價 (0.2 mL 劑量)3 |
1 | 10 | 0 | 0.1 | RS-EMEM | 7160 |
2 | 10 | 5 | 0.1 | PBS | 4680 |
用於CEF細胞培養物之例示性培養基調配物展示於表5中,且CEF細胞或經HVT病毒感染之CEF細胞之冷凍保存展示於表6中。
表5:CEF細胞培養基調配物。展示調配1 L無血清培養基之量。
表6:CEF/病毒低溫保存培養基。展示調配1 L培養基之量。
組分 | 量/公升 |
EMEM粉末(Sigma M1018) | 10-12公克 |
LB培養液, VEGITONE (Sigma 28713) | 0.5-2.0公克 |
碳酸氫鈉 | 0.35-1.0公克 |
抗生素溶液 | 0-20 mL |
無菌去離子水 | 適量至1000 mL |
組分 | 量/公升 |
EMEM粉末(Sigma M1018) | 10-12公克 |
碳酸氫鈉 | 0.35-1.0公克 |
二甲亞碸(DMSO) | 50 mL |
抗生素溶液 | 0-20 mL |
無菌去離子水 | 補足至1000 mL |
在類似生長/培育條件下使用根據表5之無血清培養基產生之HVT病毒產率與使用包含約6%胎牛血清之習知生長培養基(表7)產生之批次相當。
表7:重組HVT病毒原液產率資料。
*批次效率為每滾瓶回收之總PFU除以接種於滾瓶中之CEF細胞之總數。
批次 | 細胞/RB In (log) | 細胞/RB Out (log) | 回收率% | PFU/RB (log) | 批次效率* |
習知批次1 | 9.2 | 8.7 | 26.5% | 8.2 | 0.095 |
習知批次2 | 9.2 | 8.8 | 33.1% | 8.2 | 0.095 |
無血清批次1 | 8.4 | 7.9 | 30.7% | 7.5 | 0.141 |
實例 3 : 在無血清培養基中之家禽痘疫苗病毒、法氏囊病疫苗病毒及馬立克病疫苗病毒 ( 血清 型 1 、 2 及 3 ) 之生長
使用根據表5之無血清培養基生長根據下表8經各種原料病毒感染/接種之CEF細胞且經歷類似生長條件產生至少50%之觀測CPE及如表8中所示之病毒複製。
表8:疫苗病毒及所得產率資料。
疫苗病毒 | CEF細胞密度/RB | 無血清培養基之體積/RB | 培養後時間 | 觀測CPE百分比 | 觀測病毒複製 |
血清型1 (Rispens) | 108 至1010 | 200至350 mL | 48至120小時 | 50至80% | 是 |
血清型2 (SB-1) | 108 至1010 | 200至350 mL | 48至120小時 | 50至 80% | 是 |
血清型3 (HVT) | 108 至1010 | 200至350 mL | 16至120小時 | 50至80% | 是 |
傳染性法氏囊病病毒 | 108 至1010 | 200至350 mL | 20至72小時 | ≥ 80% | 是 |
重組家禽痘病毒 | 108 至1010 | 200至350 mL | 48至96小時 | ≥ 80% | 是 |
本發明之範疇不受本文中所描述之具體實施例限制。實際上,除彼等本文中所描述之修改以外,自前述描述本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。
Claims (15)
- 一種培養基,其包含:不含人類或動物蛋白質之基本培養基及植被蛋白源。
- 如請求項1之培養基,其中該基本培養基為EMEM。
- 如請求項1之培養基,其中該基本培養基為DMEM。
- 如請求項1之培養基,其中該植被蛋白源為源自蔬菜之胰化蛋白。
- 如請求項4之培養基,其中該源自蔬菜之胰化蛋白為VEGITONE。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含抗生素。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含酵母提取物。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含鹽。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含碳水化合物。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含額外胺基酸。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含一或多種金屬離子、維生素及輔因子。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含源自動物血液之血清產品。
- 如請求項12之培養基,其中該等源自動物之血清產品包含0%至多且包括7% v/v之該培養基。
- 如請求項1之培養基,其進一步包含至少一種選自CaCl2 ·2H2 O、MgSO4 ·7H2 O、NaH2 PO4 ·2H2 O、丙酮酸鈉、HEPES及MOPS之緩衝液,其量足以將該培養基維持在6.5-7.5之pH範圍內。
- 一種病毒繁殖方法,其包含 a. 在如請求項1之培養基中培養禽類胚胎細胞, b. 在無血清存在下,建立能夠在基本培養基中增殖之貼壁或非貼壁細胞培養, c. 當細胞密度達到至少1.0×106 個細胞/毫升時,用選自以下各者之病毒感染該等禽類胚胎細胞:痘病毒或痘病毒載體、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)、Rispens、SB-1、HVT或任何馬立克氏血清型1、2或3病毒載體(Marek's serotype 1, 2, or 3 viral vector), d. 在如請求項1之培養基中培養該等經感染之禽類胚胎細胞直至CPE達到至少50%,及 e. 收集該病毒。
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