BR112021014116A2

BR112021014116A2 - Meio sem soro para produção de vacinas aviárias e seus usos

Info

Publication number: BR112021014116A2
Application number: BR112021014116-2A
Authority: BR
Inventors: William Troy Hughes
Original assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-09-21
Also published as: EP3911731A1; US20220186191A1; CN113227354A; WO2020150411A1; EP4357447A2; EP4357448A2; EP4357448A3; TW202043458A; EP4357447A3; MX2021006115A

Abstract

meio sem soro para produção de vacinas aviárias e seus usos. a presente divulgação se refere a um método para o cultivo de células primárias. as células primárias são cultivadas em meio sem soro suplementado com peptídeos e peptonas derivados de plantas ou vegetais. o método para o cultivo de células primárias pode ser uma etapa em um método para a amplificação de vírus, como poxvirus.

Description

de um método de fabricação de vacinas com base em cultura de células.

[004] As células utilizadas para a produção de vírus / vacinas podem ser linhagens celulares ou animais primários. Fibroblastos de embrião de galinha (células CEF) são um exemplo de células primárias usadas para a produção de vírus. Os vírus atenuados são comumente propagados em culturas de células CEF. O crescimento celular e a propagação in vitro requerem condições de cultivo que incluem um meio que pode suportar o crescimento e a propagação celular. Convencionalmente, para a cultura de células derivadas de mamíferos, o meio de cultura de células comumente usados compreende uma solução rica em sal contendo vitaminas, aminoácidos, oligoelementos essenciais e açúcares. Além disso, hormônios de crescimento, enzimas e proteínas biologicamente ativas necessárias para o crescimento celular são geralmente adicionados como um suplemento ao meio na forma de um soro derivado de sangue animal ou, alternativamente, componentes de proteína separados do soro derivado de sangue animal.

[005] Exemplos de produtos de soro derivados de sangue animal são soro fetal de vitela, soro de galinha, soro de cavalo e soro suíno. Estes soros são derivados de sangue fracionado, do qual foram removidos os glóbulos vermelhos e os glóbulos brancos. As células primárias, como as células CEF, são ainda mais dependentes de fontes de soro animal do que as linhas celulares. Assim, as células primárias são normalmente cultivadas em meio de cultura de células compreendendo 5 a 10% de soro, na maioria dos casos soro fetal de vitela (FCS).

[006] Produtos de soro derivados de sangue animal podem conter agentes patogênicos adventícios, como vírus ou proteínas priônicas. Isso por dar origem a preocupações de segurança com o uso de soro devido ao risco potencial de que esses agentes patogênicos possam ser transmitidos ao animal / ser humano a ser tratado ou vacinado com a vacina ou qualquer outro produto farmacêutico produzido em cultura de células suplementada com soro. Essas preocupações são exemplificadas pelo suplemento de soro bovino comumente usados, onde um dos muitos problemas / riscos principais associados ao seu uso é a possibilidade de transmitir o agente causador da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) aos animais / humanos que entram em contato com os produtos / vacinas produzidas a partir de cultura de células com suplementação de soro bovino. Consequentemente, a utilização de um meio sem soro seria vantajosa para eliminar contaminantes no soro, tais como vírus ou prions patogênicos que não devem permanecer nos produtos finais, p. e., proteínas recombinantes ou vetores de vacinas virais.

[007] Tendo em vista o possível risco associado à utilização de soros de animais em cultura de células, tornou- se claro que seria preferido o desenvolvimento de um meio sem soro que não contivesse quaisquer proteínas ou peptídeos derivados de animais. Especificamente, a substituição de proteínas ou peptídeos derivados de animais por aquelas proteínas, peptídeos ou lipídeos separados de fontes não animais aliviaria as preocupações de segurança associadas ao soro.

[008] Permanece a necessidade de estratégias para melhorar a fabricação de vacinas sem soro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece um meio de cultura sem soro que é capaz de cultivar uma ampla gama de células em suspensão, e, em monocamada, embora seja capaz de suportar a produção de vacina aviária.

[0010] A presente invenção fornece um meio de cultura sem soro compreendendo vários sais inorgânicos, carboidratos, aminoácidos, agentes tamponantes, vitaminas e compostos para simular o ambiente celular natural. Se desejado, muitos dos aminoácidos, carboidratos, sais, vitaminas e compostos podem ser obtidos a partir de um meio sintético disponível comercialmente sem proteínas ou agentes promotores de crescimento, tais como EMEM ou DMEM.

[0011] A presente invenção fornece um meio de cultura sem soro compreendendo triptona (peptídeos e peptonas) derivado de fontes vegetais ou vegetais.

[0012] Além disso, a presente invenção também fornece um método para usar um meio sem soro para a cultura de células e linhas celulares para propagação e multiplicação viral.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] Um objetivo da presente divulgação é desenvolver um meio de cultura sem soro que seja capaz de cultivar uma ampla gama de células em suspensão e em monocamada, embora seja capaz de suportar a produção de vacina aviária.

[0014] O meio do presente relatório descritivo também inclui vários sais inorgânicos, carboidratos, aminoácidos, agentes tamponantes, vitaminas e compostos para simular o ambiente natural da célula. Se desejado, muitos dos aminoácidos, carboidratos, sais, vitaminas e compostos podem ser obtidos a partir de um meio sintético disponível comercialmente sem proteínas ou agentes promotores de crescimento, tais como EMEM ou DMEM. Além do substituto de soro descrito acima, vários aminoácidos adicionais, sais, carboidratos, vitaminas e compostos, como extrato de levedura e antibióticos, podem ser adicionados ao meio a fim de compor o meio livre de soro completo do presente relatório descritivo.

[0015] Outro objetivo da presente divulgação se refere a um processo para a utilização de um meio sem soro para a cultura de células e linhas celulares para propagação e multiplicação viral. O meio sem soro inclui triptona (peptídeos e peptonas) derivado de plantas ou fontes vegetais.

[0016] A presente divulgação fornece um método para o cultivo de células primárias, em particular, células aviárias primárias, em meio sem soro e um método para a produção de vírus em células primárias sob condições livres de soro. O presente método para o cultivo de células primárias pode ser caracterizado por as células serem cultivadas em meio sem soro suplementado com peptídeos e peptonas derivados de plantas ou vegetais.

[0017] Note-se que nesta divulgação e particularmente nas reivindicações, termos como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e semelhantes; e que termos como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" permitem elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

[0018] Salvo indicação em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0019] Os termos singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" pretende incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. A palavra "ou" significa qualquer membro de uma lista específica, e, também inclui qualquer combinação de membros dessa lista.

[0020] O termo "células primárias", conforme usado no presente relatório descritivo, é bem conhecido por um técnico versado no assunto. Sem estar restrito à seguinte definição, o termo "células primárias" pode se referir a células que foram isoladas recentemente de um tecido animal ou humano, órgão ou organismo, em que as células não são capazes de se replicar e se dividir contínua e indefinidamente. Normalmente, as células primárias se dividem em cultura de células menos de 100 vezes, frequentemente menos de 50 vezes, frequentemente menos de 25 vezes. Assim, as células primárias não sofreram um evento de imortalização. Um exemplo de células primárias são fibroblastos animais, tais como, mas não se limitando a, fibroblastos de embrião de galinha (células CEF). Os métodos de isolamento de células primárias são bem conhecidos. Geralmente, as culturas de células primárias são derivadas diretamente de tecidos, órgãos ou embriões, submetendo os tecidos, órgãos ou embriões a tratamento com protease para obter células individuais.

[0021] O método do presente relatório descritivo não se restringe a células que formam monocamadas. De acordo com uma concretização alternativa, o método de acordo com o presente relatório descritivo pode ser usado para todos os outros tipos de células primárias, tais como células que crescem naturalmente em cultura em suspensão (por exemplo, linfócitos ou outros tipos de células sanguíneas) ou células que cresceriam naturalmente como células aderentes, mas foram adaptados para crescer em cultura em suspensão.

[0022] Conforme mostrado abaixo, as células também podem ser usadas para a amplificação livre de soro de vírus que podem ser úteis como vacinas.

[0023] Geralmente, os vírus, incluindo vírus de tipo selvagem, vírus atenuados e vírus recombinantes que são usados como vacinas, são cultivados e amplificados sob condições contendo soro. No entanto, conforme observado acima, existe um risco potencial de que o soro contenha agentes patogênicos possa ser transmitido ao animal / humano tratado ou vacinado com a vacina. Para reduzir o risco de contaminantes na vacina, é um aspecto adicional da divulgação a passagem e / ou cultivo sob condições livres de soro aqueles vírus que foram previamente amplificados sob condições contendo soro e se destinam a ser usados como vacina.

[0024] Foi inesperado que as células primárias que crescem naturalmente como células aderentes pudessem se ligar efetivamente à superfície do recipiente de cultura de células sem formar quantidades inaceitáveis de agregados e pudessem ser cultivadas na fase logarítmica na ausência de soro, uma vez que geralmente se acredita que as células primárias são dependentes de uma infinidade de diferentes fatores e componentes contidos no soro. Além disso, acredita- se que as células aderentes formam agregados não viáveis que não se fixam à superfície do recipiente de cultura de células, quando cultivadas em meio sem soro. Assim, era inesperado que fosse suficiente suplementar um meio livre de soro com peptídeos e peptonas derivados de fontes vegetais ou vegetais para obter ligação e crescimento de células primárias aderentes. Além disso, também foi inesperado que células primárias cultivadas em cultura em suspensão possam ser cultivadas com o meio usado no método de acordo com o presente relatório descritivo.

[0025] Em particular, foi surpreendente que as células aviárias primárias, como os instantâneos Fibroblastos de Embrião de Galinha (CEF), podem ser cultivadas para se anexar à superfície de um recipiente de cultura de células sem formar quantidades inaceitáveis de agregados em um meio livre de soro suplementado com peptídeos e peptonas derivadas de fontes vegetais ou vegetais. As células aviárias são entendidas como crescendo adversamente em meio livre de soro não compreendendo fatores de crescimento ou fatores de fixação encontrados no soro, ou seja, era inesperado que as propriedades de crescimento fracas das células aviárias primárias pudessem ser melhoradas significativamente por suplementação do meio livre de soro com peptídeos peptonas derivadas de fontes vegetais ou vegetais.

[0026] O termo "cultivo de células" em um meio livre de soro no contexto de células primárias aderentes se refere à semeadura das células no recipiente de cultura em um meio livre de soro, ao crescimento das células em um meio livre de soro no período logarítmico fase até a formação de uma monocamada e / ou para a manutenção das células em meio isento de soro assim que a monocamada for formada. O termo "cultivo de células" em um meio sem soro também se refere a um método no qual todas as etapas acima mencionadas são realizadas com meio sem soro, de modo que nenhum produto de soro animal esteja presente durante todo o processo de cultivo das células. Assim, em um significado mais geral, o termo "cultivo de células em um meio sem soro" se refere ao fato de que todos os meios que levam à formação de uma monocamada são meios sem soro. Os meios utilizados em todos os passos anteriores podem ser suplementados com peptídeos e peptonas derivados de fontes vegetais ou vegetais.

[0027] O termo "cultivo de células" em um meio livre de soro no contexto de células que crescem em cultura em suspensão se refere à semeadura das células no recipiente de cultura em um meio livre de soro, o crescimento das células em um meio livre de soro na fase logarítmica e / ou a manutenção das células em meio isento de soro assim que a densidade de saturação na qual não ocorre mais replicação é obtida. O termo "cultivo de células" em um meio sem soro se refere a um método no qual todas as etapas acima mencionadas são realizadas com meio sem soro, de modo que nenhum produto de soro animal esteja presente durante todo o cultivo das células. Os meios usados em todos os passos anteriores podem ser suplementados com peptídeos e peptonas derivados de plantas ou fontes vegetais.

[0028] O termo meio "sem soro" se refere a qualquer meio de cultura de células que não contenha soros de origem animal ou humana. Os meios de cultura de células adequados são conhecidos do especialista na técnica. Esses meios compreendem sais, vitaminas, carboidratos tampões, aminoácidos e outros compostos, como extrato de levedura e antibióticos.

[0029] Os meios usados de acordo com o método da presente divulgação, em particular, os meios usados para células aderentes, como células CEF, contêm peptídeos e peptonas derivados de fontes vegetais ou vegetais. Um exemplo de peptídeos e peptonas é a triptona vegetal.

[0030] O meio sem soro pode compreender ainda um ou mais aditivos selecionados de extratos microbianos, extratos de plantas e extratos de animais não mamíferos. O extrato microbiano pode ser um extrato de levedura ou ultrafiltrado de olato de levedura. O extrato da planta pode ser um extrato de arroz ou extrato de soja. O extrato de animais não mamíferos pode ser um extrato de peixe.

[0031] Este meio livre de soro também pode ser usado com a adição de produtos de soro derivados de sangue animal (por exemplo, 0,5 a 3%) como um meio de reduzir a concentração sérica geral normalmente necessária (5 a 10%) para apoiar o crescimento de células aderentes primárias ou linhas de células.

[0032] A amplificação de um vírus pode compreender as seguintes etapas: na primeira etapa as células primárias são cultivadas de acordo com o método descrito acima, isto é, as células primárias são cultivadas em um meio sem soro suplementado com peptídeos e peptonas derivadas de fontes vegetais ou vegetais. Todas as condições e definições fornecidas na descrição do método para o cultivo de células primárias acima também se aplicam à definição da primeira etapa do método para a amplificação de vírus de acordo com esta modalidade da presente divulgação. Em uma segunda etapa, as células primárias são infectadas com o vírus. Na terceira etapa, as células infectadas são incubadas em meio sem soro até que a progênie do vírus seja produzida. Finalmente, em uma quarta etapa, o vírus é isolado das células infectadas, ou as células que abrigam o vírus são colhidas para manter as células infectadas viáveis.

[0033] Métodos para infectar células primárias de acordo com a segunda etapa do método instantâneo para amplificação de vírus são conhecidos. A título de exemplo,

o vírus pode simplesmente ser adicionado ao meio. Alternativamente, o meio pode ser removido e o vírus pode ser adicionado a meio fresco, que por sua vez é adicionado às células. Para obter uma infecção eficiente, a quantidade de vírus / suspensão de meio deve ser tão baixa quanto possível para ter uma alta concentração de vírus. Após a fixação do vírus, meio adicional pode ser adicionado.

[0034] Na terceira etapa do presente método, as células infectadas são cultivadas em meio sem soro até a progênie do vírus ser produzida.

[0035] A progênie viral pode ser concentrada e purificada, de acordo com métodos conhecidos do técnico versado no assunto.

[0036] Os métodos de acordo com a presente divulgação se referem a um método para a amplificação de um poxvírus compreendendo as seguintes etapas: (I) cultivar as células primárias de acordo com um método como descrito acima, isto é, um método no qual as células primárias são cultivadas em meio sem soro suplementado com peptídeos e peptonas derivadas de fontes vegetais ou vegetais, (II) infectar as células primárias com o poxvírus, (III) cultivar as células infectadas em meio livre de soro até que a progênie do vírus seja produzida e (iv) isolar o vírus das células infectadas. Os vírus isolados de acordo com o presente método são isentos de quaisquer produtos e / ou agentes infecciosos compreendidos em soros de animais.

[0037] O processo de passagem, cultivo e / ou purificação sob condições livres de soro para aqueles vírus que foram previamente amplificados sob condições contendo soro é denominado "derivação". Essa derivação também pode ser usada se não for completamente claro como uma semente- mãe foi obtida para a produção de uma vacina. Uma derivação sob sem soro reduz drasticamente o risco de contaminações na vacina, em particular de agentes infecciosos indesejáveis.

[0038] Os métodos de acordo com a presente divulgação se referem ao cultivo de células aviárias primárias e à amplificação de um vírus, em que o vírus é o vírus que deve ser re-derivado. Por exemplo, os métodos instantâneos são úteis para a derivação de vírus e estoques de vírus, em particular para estoques que foram, ou podem ter sido previamente passados em meio contendo soro.

[0039] Uma passagem do material de partida, isto é, do vírus a ser derivado em condições livres de soro, pode ser suficiente para a derivação de um vírus. O termo "passagem" se refere às etapas de cultivo de células em condições livres de soro, infecção das células com o vírus a ser derivado e obtenção do vírus produzido nas células infectadas. Embora uma passagem possa ser suficiente, pode ser preferível passar o vírus várias vezes em condições sem soro. Neste caso, o vírus obtido na primeira etapa de passagem é usado para infectar novamente células frescas. A passagem em condições sem soro pode ser combinada com um ou mais métodos para a purificação de um vírus em condições sem soro. O número total de passagens, opcionalmente incluindo a purificação está na faixa de 1 a mais de 10, tal como 3 a 8 ou 4 a 6. As técnicas de purificação são métodos virológicos padrão praticados pelos técnicos versados no assunto.

[0040] Como discutido anteriormente, é entendido pelos técnicos versados no assunto que as células aviárias primárias crescem adversamente em condições livres de soro. Pode-se esperar que o estresse adicional associado a uma infecção por poxvírus faça com que as células já estressadas morram antes que ocorra uma amplificação significativa do poxvírus. Surpreendentemente, as células aviárias cultivadas de acordo com o presente método, em um meio sem soro suplementado com peptídeos e peptonas derivadas de fontes vegetais ou vegetais, suportam eficazmente a replicação viral e a amplificação de poxvírus.

[0041] O poxvírus é preferencialmente um ortopoxvírus. Exemplos de vírus ortopox são avipoxvírus e vírus vaccinia.

[0042] O termo "avipoxvirus" se refere a qualquer avipoxvirus, como Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus e Turkeypoxvirus. Os avipoxvírus preferidos são Canarypoxvirus e Fowlpoxvirus.

[0043] O termo "vírus da doença de Marek" se refere a qualquer um dos sorotipos de alfaherpesvirus usados para produzir vacinas da doença de Marek, incluindo, mas não se limitando aos sorotipos virais 1, 2 e 3.

[0044] Um objetivo da presente divulgação é desenvolver um método para a produção de vacinas, em particular, vacinas de poxvírus obtidas pelo método descrito acima. De acordo com uma modalidade preferida, o poxvírus é um vírus Fowlpox (FP).

[0045] Outro objetivo da presente divulgação é desenvolver um método para a produção de vacina utilizando a produção da vacina da doença de Marek (sorotipos 1, 2 e 3) em um meio sem soro.

[0046] Outro objetivo da presente divulgação é desenvolver uma composição compreendendo um vírus, em particular um vírus do sorotipo 3 de Marek recombinante (HVT) produzido pelo método de acordo com a presente divulgação. Devido ao método de amplificação do vírus, a composição é isenta de quaisquer produtos e / ou agentes infecciosos compreendidos em soros de animais. Em contraste, as composições compreendendo vírus produzidos de acordo com métodos convencionais compreendem compostos residuais derivados de soro animal. Este é especialmente o caso para composições que compreendem vacinas de vírus de Marek produzidas de acordo com métodos convencionais, como o sorotipo do vírus HVT.

[0047] Outro objetivo da presente divulgação é desenvolver um método para a produção de vacina utilizando a produção de vacina contra a doença infecciosa da bolsa em um meio sem soro.

[0048] Outro objetivo da presente divulgação é desenvolver um método para o tratamento ou vacinação de um animal, incluindo um humano, em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de um vírus como definido acima ou uma composição como definida acima ao animal ou corpo humano.

[0049] A presente divulgação será melhor compreendida em conexão com os exemplos a seguir, que se destinam a ser uma ilustração e não uma limitação do escopo da divulgação.

EXEMPLOS Exemplo 1: Cultura de células de fibroblastos embrionários primários de galinha (CEF) Preparação de cultura celular

[0050] Preparação de enzimas; TrypLE Select Enzyme (1X) de GIBCO foi usado sem diluição adicional.

[0051] Preparação de meios de crescimento; o meio foi preparado compreendendo meio EMEM e VEGITONE (1X) da SIGMA como um VEGITONE ~ 5% v / v em meio EMEM.

[0052] Digestão de embriões; os embriões foram lavados três vezes em 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) da GIBCO e posteriormente digeridos em uma solução de TrypLE quatro vezes, com cada período de digestão durando cinco minutos.

[0053] As células foram coletadas em béqueres com solução 50/50 de VEGITONE e EMEM e enxaguadas com meio de preparação de células (5% VEGITONE v / v em meio EMEM). As células foram centrifugadas a 750 RPM por doze minutos e armazenadas a 2 - 7 ° C por até 72 horas.

[0054] Um volume total de 110 mL de células foi coletado com uma densidade celular de 6,0 x 106 células / mL.

[0055] Os recipientes de cultura de células primárias (6 no total) foram cada um preparado de acordo com a Tabela 1 abaixo.

[0056] Tabela 1: condições do recipiente de cultura de células primárias. Recipiente No. RB Vol. Células Vol. Vol. EMEM per (mL) celular VEGITONE (mL) (mL) (mL) Garrafa 6 285 6,0 x 18 15 giratória 106 (RB)

[0057] As garrafas giratórias estavam 100% confluentes após 48 horas de incubação a 35 - 39,0° C e 0,2 RPM. Passagem do vírus HVT em cultura de células

[0058] Cinco garrafas giratórias foram semeadas com uma cultura de células CEF primária (1 °) a uma taxa de 100 milhões de células CEF por garrafa. 1X VEGITONE foi usado a uma taxa de ~ 5% no meio (EMEM) para fornecer nutrição adicional às células CEF. As garrafas giratórias estavam 100% confluentes após 48 horas de incubação a 39,0 ° C e 0,2 RPM.

[0059] As células CEF foram inoculadas com 1 ampola de HVT SR-3, depois incubadas a 35 - 39° C e 0,2 RPM, e após ~ 46 horas o efeito citopático (CPE) foi determinado como sendo cerca de 60%. Esta primeira passagem destas células CEF infectadas com HVT (X + 1) foi colhida por tripsinização, seguida de centrifugação e ressuspensão em frascos contendo 6 formulações de meios de criopreservação diferentes. Os frascos foram então congelados a cerca de -110 ° C usando um congelador de taxa controlada. Os frascos ressuspensos foram rotulados para formar X + 1 (1) para a condição 1, X + 1 (2) para a condição 2, X + 1 (3) para a condição 3, X + 1 (4) para a condição 4, X + 1 (5) para a condição 5 e X + 1 (6) para a condição 6. Os meios de criopreservação e os dados de congelamento são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Meios de criopreservação e dados de congelamento. Vários crio-conservantes em 1x EMEM com 0,35 g / L de Bicarbonato de Sódio Condição % de % de % % Contagem de Título de Contagem de Título de DMSO soro de de de células pré- Pre- células pós- Pós- bezerro1 LB MC3 congelamento congelamento congelamento congelamento Veg2 (0,2 mL (0,2 mL (0,2 mL (0,2 mL Dose) Dose)4 Dose) Dose)4 1 3.5 15 0 0 12k/dose 4040 15k/dose 4820 (controle) 2 3.5 0 0 0 23k/dose 4880 11k/dose 4340 3 3.5 0 5 0 N/A N/A 18k/dose 4560 4 5.0 0 0 0 16k/dose 4160 13k/dose 4940 5 10 0 0 0 15k/dose 4120 9k/dose 4340 6 10 0 0 10 14k/dose 4400 12k/dose 4480 1Soro de bezerro irradiado de RMBio, 2 1x LB VEGITONE de SIGMA, 3 1% de metilcelulose (4000CP) de SIGMA em solução de PBS a 1% e 4 amostras diluídas a uma taxa de 0,5 mL de vacina formulada em 49,5 mL de diluente de Marek e então diluída 1: 500 para titulação e contagem de células viáveis (Azul tripano 1:1). Exemplo 2: Cultura de células de fibroblastos embrionários primários de galinha (CEF) Preparação de cultura celular

[0060] Preparação de enzimas; TrypLE Select Enzyme (1X) de GIBCO foi usado sem diluição adicional.

[0061] Preparação de meios de crescimento; o meio foi preparado compreendendo meio RS-EMEM e VEGITONE (1X) da SIGMA como um VEGITONE ~ 5% v / v em meio EMEM.

[0062] Digestão de embriões; os embriões foram lavados três vezes em 1000 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) da GIBCO e posteriormente digeridos em 50 mL de solução TrypLE quatro vezes, com cada período de digestão durando cinco minutos.

[0063] As células foram coletadas em provetas com 20 mL de VEGITONE a 20% em EMEM e enxaguadas com 10 mL de meio de preparação de células (VEGITONE a 5% v / v em meio EMEM).

As células foram centrifugadas a 750 RPM por doze minutos e armazenadas a 2 - 7° C por até 72 horas.

[0064] Um volume total de 200 mL de células foi coletado com 28 x 106 células / mL.

[0065] Os recipientes de cultura de células primárias (12 no total) foram cada um preparado de acordo com a Tabela 3 abaixo.

[0066] Tabela 3: condições do recipiente de cultura de células primárias Recipiente No. RB Vol. No Vol. Vol. EMEM células celular VEGITONE (mL) per (mL) (mL) (mL) Garrafa 12 285 2,8 x 16 15,0 giratória 107 (RB) Passagem de vírus HVT na segunda passagem de cultura de células

[0067] Dez garrafas giratórias de 850 cm2 foram semeadas com células CEF primárias (1°) a uma taxa de 450 milhões de células CEF por garrafa giratória e incubadas a 35 - 39,0° C e 0,15 RPM. 1X VEGITONE foi usado a uma taxa de ~ 5% no meio (EMEM) para fornecer nutrição às células CEF.

[0068] Uma garrafa giratória contendo a suspensão de células CEF foi inoculado com 1 mL de X + 1 (2) da Tabela 2 e incubado a 35 - 39,0° C e 0,15 RPM. Após ~ 50 horas de inoculação, o efeito citopático (CPE) foi determinado em cerca de 60%. Esta segunda passagem dessas células infectadas com HVT (X + 2) foi colhida usando 1x TrypLE Select e centrifugação a 750x g por 15 minutos para sedimentar células. As células sedimentadas foram ressuspensas em PBS contendo 5% 1X LB VEGITONE e 0,1% de metilcelulose. 2,0 mL desta suspensão de células foram adicionados às 9 garrafas giratórias restantes para produzir a terceira passagem de células CEF infectadas com HVT (X + 3). Passagem do vírus HVT na terceira passagem da cultura celular

[0069] Nove garrafas giratórias contendo a suspensão de células CEF foram inoculados com 2,0 mL de células de segunda passagem (X + 2) e incubados a 35-39,0 ° C e 0,15 RPM. Após ~ 48 horas de inoculação, o efeito citopático (CPE) foi determinado como sendo cerca de 75-80%. Cada frasco rolante contendo as células da terceira passagem (X + 3) foi colhido usando 1x TrypLE Select e centrifugação a 750xg por 15 minutos para as células do sedimento. O TrypLE Select foi neutralizado com cerca de 20 mL de EMEM contendo 10% de VEGITONE antes da centrifugação. As células peletizadas foram ressuspensas em dois meios diferentes de criopreservação e congeladas em um freezer de taxa controlada. Os meios de criopreservação e os dados de congelamento são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[0070] Tabela 4: Meios de criopreservação e dados de congelamento. Condição % de % de Meio % de Título Pós- DMSO LBusado MC2 congelamento Veg1 para (0,2 mL Dose)3 produzir volume 100 mL 1 10 0 0,1 RS-EMEM 7160 2 10 5 0,1 PBS 4680 1 1x LB VEGITONE de SIGMA, 2 Metilcelulose a 1% (4000CP) de SIGMA em solução de PBS a 1%.

[0071] Formulações de meio exemplificativas usadas para cultura de células CEF são mostradas na Tabela 5 e a Crio-preservação de células CEF ou células CEF infectadas com o vírus HVT é mostrada na Tabela 6.

[0072] Tabela 5: Formulação de meio de cultura de células CEF. As quantidades demonstradas formulam 1 L de meio sem soro Componente Quantidade/Litro EMEM em pó (Sigma M1018) 10 - 12 gramas Caldo LB, VEGITONE (Sigma 28713) 0,5 – 2,0 gramas Bicarbonato de sódio 0,35 - 1.0 gramas Solução Antibiótica 0 - 20 mL Água DI estéril q.s. a 1000 mL Tabela 6: CEF / meio de criopreservação viral. Quantidades apresentadas para formular 1 L de meio. Componente Quantidade/Litro EMEM em pó (Sigma M1018) 10 - 12 gramas Bicarbonato de sódio 0,35 – 1,0 gramas Dimetil Sulfóxido (DMSO) 50 mL Solução Antibiótica 0 - 20 mL Água DI estéril q.s. to 1000 mL

[0073] O uso de um meio de cultura sem soro de acordo com a Tabela 5 resultou em um rendimento viral HVT comparável as bateladas que foram produzidas usando o meio de crescimento convencional compreendendo aproximadamente 6% de soro de bezerro (Tabela 7) sob condições semelhantes de crescimento / incubação. Tabela 7: Dados de produção de estoque de vírus HVT recombinante. Batelada Célula/com Célula/sem % de PFU/RB Eficiência RB (log) RB (log) recuperação (log) da batelada*

Batelada 9,2 8,7 26,5% 8,2 0,095 Convencional 1 Batelada 9,2 8,8 33,1% 8,2 0,095 Convencional 2 Batelada 8,4 7,9 30,7% 7,5 0,141 livre de soro 1 1A eficiência da batelada é o total de PFU recuperado por garrafa giratória dividido pelo número total de células CEF que foram semeadas na garrafa giratória. Exemplo 3: Crescimento do vírus da vacina Fowlpox, vírus da vacina da doença da Bursa e vírus da vacina da doença de Marek (serotipos 1, 2 e 3) em meio livre de soro

[0074] O uso de um meio de cultura livre de soro de acordo com a Tabela 5 para cultivar células CEF infectadas / inoculadas com vários vírus de estoque de acordo com a Tabela 8 abaixo e submetidas a condições de crescimento semelhantes resultou em um CPE observado de pelo menos 50% e replicação viral como mostrado em Tabela 8. Tabela 8: Vírus da vacina e dados de rendimento resultantes. Vírus de Densidade Volume Horas Pós Porcentagem Replicação vacina celular de meio Inoculação CPE Viral CEF /RB livre observada observada de soro/RB Serotipo 1 108 a 1010 200 a 48 a 120 50 a 80% Sim (Rispens) 350 mL horas Serotipo 2 108 a 1010 200 a 48 a 120 50 a 80% Sim (SB-1) 350 mL horas Serotipo 3 108 a 1010 200 a 16 a 120 50 a 80% Sim (HVT) 350 mL horas Vírus da 108 ao 200 a 20 a 72 ≥ 80% Sim doença 1010 350 mL horas infecciosa da Bursa Vírus 108 a 1010 200 a 48 a 96 ≥ 80% Sim Fowlpox 350 mL horas recombinante

[0075] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas concretizações específicas aqui descritas.

Na verdade, várias modificações da invenção, além daquelas aqui descritas, tornar-se-ão evidentes para os técnicos versados no assunto a partir da descrição anterior.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Meio de cultura caracterizado pelo fato de que compreende: um meio basal livre de proteína humana ou animal, e, uma fonte de proteína vegetal.

2. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio basal é EMEM.

3. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio basal é DMEM.

4. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de proteína vegetariana é triptona derivada de vegetal

5. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a triptona derivada de vegetal é VEGITONE

6. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antibiótico.

7. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda extrato de levedura.

8. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um sal.

9. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um carboidrato.

10. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aminoácidos adicionais.

11. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais íons metálicos, vitaminas e cofatores.

12. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda produtos de soro derivados de sangue animal.

13. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os produtos de soro derivados de animais compreendem de 0% até e incluindo 7% v / v do meio de cultura.

14. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um tampão selecionado de CaCl2 · 2H2O, MgSO4 · 7H2O, NaH2PO4 · 2H2O, piruvato de sódio, HEPES e MOPS em uma quantidade suficiente para manter o meio dentro da faixa de pH de 6,5 - 7,5.

15. Método de propagação viral caracterizado pelo fato de que compreende, a. cultivar células embrionárias aviárias no meio conforme definido pela reivindicação 1, b. estabelecer uma cultura de células aderentes ou não aderentes capaz de proliferar em meio basal na ausência de soro, c. infectar as referidas células embrionárias aviárias com um vírus selecionado de poxvírus ou vetor de poxvírus, vírus de doença infecciosa da Bursa, Rispens, SB-1, HVT ou qualquer vetor viral de serotipo 1, 2 ou 3 de Marek quando a densidade celular atinge pelo menos 1,0 x 106 células / mL,

d. cultivar as referidas células embrionárias aviárias infectadas no meio conforme definido pela reivindicação 1 até que o CPE atinja pelo menos 50%, e e. coletar o referido vírus.