CN116679065A - 检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品，数据生物医学领域，采用本发明实施例提供的技术方案，可以在达雷目单抗(Daratumumab,Dara)一剂治疗前后各检测一次目标对象外周全血中NK细胞表面KIR‑NKP46+的表达量，并进行数据分析，确定治疗前后的NK细胞表面KIR‑NKP46+的表达量的比值，从而评估Dara对所述目标对象的临床疗效。采用本发明实施例提供的技术方案，临床应用时，可以确定目标对象当前情况下，是否适用于Dara治疗，以对目标对象提供最佳的治疗方案。

Description

检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma.MM)是一种恶性克隆性浆细胞异常增生。预后差异大，几乎所有的患者都面临疾病复发的风险。
CD38单克隆抗体是第一个获批于治疗MM的单克隆抗体药物，在复发难治性多发性骨髓瘤的治疗中已显示一定的疗效。Daratumumab（Dara）可通过多种机制如补体依赖的细胞毒作用（CDC）、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）及抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）发挥抗MM作用。
然而，相关技术中，缺乏一种预测多发性骨髓瘤治疗预后的评估方法。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供了检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品。
第一方面，本发明提供了一种细胞因子检测试剂的应用，应用于制备多发性骨髓瘤治疗预后评估试剂，所述细胞因子包括KIR-NKP46+，在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量，在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
可选地，在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
第二方面，本发明提供了一种多发性骨髓瘤治疗预后预测方法，所述方法包括：
获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
可选地，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效，包括：
在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
可选地，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
第三方面，本发明提供了一种多发性骨髓瘤治疗预后预测系统，所述系统包括：
第一获取模块，用于获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
第二获取模块，用于获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
评估模块，用于根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
可选地，所述评估模块，具体用于：
在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
可选地，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
第四方面，本发明提供了一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现如本发明第二方面所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法中的步骤。
第五方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现如本发明第二方面所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法中的步骤。
采用本发明实施例提供的技术方案，可以在Dara一剂治疗前后各检测一次目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量，并进行数据分析，确定治疗前后的NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量的比值，从而评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
采用本发明实施例提供的技术方案，临床应用时，可以确定目标对象当前情况下，是否适用于Dara治疗，以对目标对象提供最佳的治疗方案。
附图说明
图1示出了本发明实施例中健康人、Dara治疗前、Dara治疗后三组实验中CD3-CD56+（NK）和CD3+（T）细胞群以及CD19+（B）细胞在核细胞中的比例的统计图展示；
图2示出了本发明实施例中KIR-NKP46+比例在健康人、Dara治疗前、Dara治疗后的统计图展示；
图3A示出了本发明实施例中CD122在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图3B示出了本发明实施例中NKP30在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图3C示出了本发明实施例中CD38在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图4A示出了本发明实施例中TIGIT在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图4B示出了本发明实施例中PD-1在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图4C示出了本发明实施例中NKG2A在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度；
图5A示出了本发明实施例中各个实验组中CD107a占外周NK细胞比例；
图5B示出了本发明实施例中各个实验组中TNF-α占外周NK细胞比例；
图5C示出了本发明实施例中各个实验组中CFSE+占外周NK细胞比例；
图6示出了本发明实施例中ROC曲线预测Dara治疗后的KIR-NKP46+比例除以Dara治疗前的该亚群比例数值对疗效的预测。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
自然杀伤细胞（Natural killer cells，NK）是固有免疫系统的重要组成部分，在抗感染及抗肿瘤免疫中发挥重要的作用，并且已有不少研究证实NK细胞在多发性骨髓瘤防御及治疗中的作用，例如：通过使用抑制性受体阻断剂解除MM肿瘤微环境对NK细胞的抑制作用，或者过继性转移NK细胞以增加NK细胞对MM细胞的杀伤能力，或者使用免疫调节药物（如来那度胺或者CD38单克隆抗体）增强NK细胞的功能。
达雷木单抗(daratumumab，DARA)作为一种以CD38为靶点的单克隆抗体，可以用于治疗MM，Daratumumab（Dara）可通过多种机制如补体依赖的细胞毒作用（CDC）、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）及抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）发挥抗MM作用。然而由于NK细胞高表达CD38分子，使用Dara治疗后导致患者体内CD38高表达的NK细胞自杀而大幅降低NK细胞数量。早期使用DARA应该是利大于弊，但当体内肿瘤负荷减低，持续再使用反而不利于体内NK细胞数量的维持。
因此，需要对多发性骨髓瘤的治疗强度选择及预后进行评估，以确定最佳的治疗方案，但是，同样由于使用Dara治疗后导致患者体内CD38高表达的NK细胞自杀而大幅降低NK细胞数量，因此无法通过检测CD38高表达的NK细胞这一群细胞的比例或数量评估dara治疗效果。
由此，为了解决相关技术中存在的问题，发明人进行了一系列探索，发现了KIR-NKP46+NK细胞亚群，并证实了通过检测KIR-NKP46+NK细胞亚群在Dara治疗一剂前后的比值，可以评估MM患者接受Dara治疗后的疗效。
基于此，第一方面，本发明实施例提供了一种细胞因子检测试剂的应用，应用于制备多发性骨髓瘤治疗预后评估试剂，所述细胞因子包括KIR-NKP46+，在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量，在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
可选地，在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
高通量光谱流式细胞术是广泛评估免疫细胞表面标志物的强大工具。本发明实施例通过光谱流式细胞术进一步了解Daratumumab治疗的RRMM（复发难治多发性骨髓瘤）患者的NK细胞免疫，发现KIR-NKP46+NK亚群对dara诱导的细胞凋亡具有耐药性，并与dara治疗后的临床疗效相关。本发明实施例中，进一步的功能分析表明，在dara治疗期间，KIR-NKP46+NK亚群保持了强大的增殖能力和抗MM作用，表明dara治疗后较高的KIR-NKP46+NK细胞可以是临床反应的良好指标。
具体的，本发明实施例证实RRMM患者KIR-NKP46+NK细胞亚群比例相对于健康供者比例明显下降，但 Dara治疗能明显上调该KIR-NKP46+NK细胞亚群比例。并且，受试者工作特征曲线方法（ROC）发现一剂Dara治疗后与治疗前的KIR-NKP46+NK细胞亚群比值能预测RRMM患者的的治疗疗效。
本发明实施例中，细胞因子检测试剂包括可以检测出KIR-NKP46+表达量的检测试剂。
具体的，所述细胞因子检测试剂可以包括流式抗体(NKP46，CD158a，CD158b，CD158e，CD3，CD56)、溶血素、PBS等。
本发明实施例中，提出了一种该细胞因子检测试剂的新应用，可以将其应用于制备多发性骨髓瘤治疗预后评估试剂。具体可以利用该细胞因子检测试剂在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量，在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
本发明实施例中，目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量的检测方法可以为：
取新鲜肝素抗凝血 50~200μl至流式管中；
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
本发明实施例中，可以采用上述检测试剂制备多发性骨髓瘤治疗预后评估试剂，具体应用时，在Dara一剂治疗前后分别采用上述检测试剂及上述检测方法，检测目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量，以评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
基于同一发明构思，第二方面，本发明提供了一种多发性骨髓瘤治疗预后预测方法，所述方法包括：
获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
本发明实施例中，所述多发性骨髓瘤治疗预后预测方法可以由服务器执行，具体的，用户可以输入Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量和Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量。服务器获取到第一表达量和第二表达量后，根据二者的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
具体的，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效，包括：
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
具体的，本发明实施例中，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
S1，取新鲜肝素抗凝血 50~200μl至流式管中。
S2，向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46。
S3，向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞。
本发明实施例中，在步骤S3之前还需要配制 1×溶血素:取 10×溶血素和灭菌注射用水按 1:9 比例配制，置于室温，用前需新鲜配制。
S4，对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物。
本发明实施例中，若红细胞较多可重复加入 1ml 溶血素至流式管中，再进行1 次红细胞溶解，相应的，再离心一次，离心条件依然选择：1500rpm×5min，去除上清液。
S5，向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物。
本发明实施例中，在具体实施时，可以重复步骤S5一次。
S6，向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
本发明实施例中，可以采用上述步骤分别获取：在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量，以及在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量，再将第一表达量和第二表达量发送给服务器以使服务器根据二者的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
基于同一发明构思，第三方面，本发明提供了一种多发性骨髓瘤治疗预后预测系统，所述系统包括：
第一获取模块，用于获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
第二获取模块，用于获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
评估模块，用于根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
具体的，所述评估模块，具体用于：
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
本发明实施例中，所述多发性骨髓瘤治疗预后预测系统可以安装于特定服务器上，以使服务器运行该系统，根据输入的第一表达量和第二表达量，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
具体的，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
基于同一发明构思，第四方面，本发明提供了一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现如本发明第二方面所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法中的步骤。
基于同一发明构思，第五方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现如本发明第二方面所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法中的步骤。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品。
实施例1：临床研究：
本发明实施例中，收集了北京大学人民医院共19名RRMM患者在Daratumumab治疗前后的配对外周血样本。实验前使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMC）并冷冻保存。
MM细胞系（U266和LP-1）从北大人民医院阮国瑞教授的实验室获得，并在补充10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中获得。
多参数光谱细胞免疫表型研究：
首先，将Daratumumab治疗前后以及来自健康供体的冷冻PBMC在37℃水浴中快速解冻，然后在预热的生长培养基中休息过夜。在实验前，先对所有抗体进行滴定以找到抗体的最佳浓度。流式抗体组合列于表1中。
表1、流式抗体列表
本发明实施例中，流式细胞术使用5-Laser Cytek Aurora流式细胞仪（Aurora5L-1，美国加利福尼亚州弗里蒙特Cyteck®Biosciences Inc）进行。测量和光谱解混使用Spectroflo®软件（Cytech Bioscinces股份有限公司）进行。
在实验队列中，本发明实施例中纳入了13名接受Daratumumab治疗的RRMM配对患者，然后纳入了高维分析，同时额外纳入了6例经Dara治疗的RRMM配对患者。表2总结了19例RRMM配对患者临床特征，包括年龄、性别和对Daratumumab的反应。
表2、Dara一剂治疗RRMM患者的临床特征及疗效评估
本发明实施例中，基于光谱流式细胞术，用表1中列出的25种单克隆抗体对来自13名配对RRMM患者和7名健康供体的冷冻PBMC进行染色。
为了对循环免疫细胞群进行初步的高水平观察，本发明实施例，首先对来自横断面队列的免疫表型面板光谱细胞术数据进行了tSNE聚类，tSNE聚类结果可以清晰地显示不同的免疫细胞簇，包括主要的CD3+T细胞群、CD3-CD56+NK细胞、CD3-CD19+B细胞和CD3+CD56+NKT细胞。在这些高水平免疫细胞亚群中，无论是否接受Dara治疗，RRMM患者的CD3-CD56+（NK）和CD19+（B）细胞在核细胞中的比例均显著高于健康对照组，而Dara治疗前后RRMM患者CD3+（T）细胞群较低（如图1所示，图1示出了健康人、Dara治疗前、Dara治疗后三组实验中CD3-CD56+（NK）和CD3+（T）细胞群以及CD19+（B）细胞在核细胞中的比例的统计图展示）。
与健康对照组相比，RRMM患者在Dara治疗前后KIR-NKP46+（NK细胞）的百分比显著降低，而在Dara治疗后显著增加，如图2所示，图2示出了KIR-NKP46+占NK细胞的比例在健康供者（healthy），Dara治疗前（Pre），Dara治疗后（post）的统计图。
为了更详细地探索KIR-NKP46+NK亚群的特性，本发明实施例进一步评估了健康供体和配对RRMM患者中活化和抑制受体与KIR+、KIR-和NKP46+NK-亚群的表达。结果表明，未接受Dara治疗的RRMM患者的KIR-NKP46+NK亚群往往比健康对照组更活化，与健康对照组相比，无论有无接受Dara治疗，RRMM患者KIR-NKP46+NK亚群上的活化型受体CD122，NKP30及CD38表达均高于于KIR-，KIR+NK亚群及健康供者的KIR-NKP46+NK细胞亚群，如图3A、图3B、图3C所示，图3A示出了CD122在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度，图3B示出了NKP30在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度，图3C示出了CD38在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度，这表明未接受Dara治疗的RRMM患者NK细胞处于激活状态。
本发明实施例中，进一步对dara治疗前后KIR-NKP46+NK亚群和其他亚群之间的受体表达进行了详细分析。结果显示如图4A、图4B、图4C所示，图4A示出了TIGIT在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度，图4B示出了PD-1在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度，图4C示出了NKG2A在健康供者（healthy）、Dara治疗前（Pre）、Dara治疗后（post）各自的KIR-NKP46+NK亚群、KIR-、KIR+NK亚群中的平均荧光强度。虽然抑制性受体Tigit和PD-1在配对RRMM患者的NK亚群中没有显示出显著差异，除了Dara治疗前和治疗后患者的KIR-NKP46+细胞中NKG2A表达的百分比较高，但CD226、NKG2D和CD16等激活受体在各组之间没有显示出统计学差异。
因此，本发明实施例提出：KIR-NKP46+亚群更为活化的表型状态提示其可能具有更强的细胞毒作用。为了阐明dara刺激后KIR-NKP46+NK亚群的功能状态，本发明实施例首先评估了与U-266和LP-1细胞系共培养时NK亚群细胞毒性。结果显示，当与U266细胞共培养（有或没有dara刺激）时，KIR+、KIR-和KIR-NKP46+亚群在RRMM患者中的CD107a表达没有统计学差异，而在RRMM患者中，与KIR+NK和KIR-NKP46+NK亚群相比，当与LP-1细胞共培养时，在有或没有dara治疗的情况下，KIR-NK亚群中发现更高的CD107a表达。同时，RRMM患者骨髓中的KIR-NKP46+NK细胞在与LP-1细胞共培养时，与KIR+NK亚群相比，在dara刺激下杀死MM细胞系的趋势也有所增加。
本发明实施例还发现，当与LP-1和U266细胞共培养时，体外dara刺激后，RRMM患者NK亚群中CD107a和TNF-α的百分比与健康供体相比显著降低，如图5A、图5B所示，图5A示出了各个实验组中CD107a占外周NK细胞比例，图5B示出了各个实验组中TNF-α占外周NK细胞比例，这表明MM患者的NK细胞功能受损。
先前的研究表明，dara治疗会导致NK细胞自杀，这是体内dara治疗后NK细胞绝对数量减少的主要原因。然而，本发明实施例发现，dara治疗后，KIR-NKP46+NK亚群的百分比显著增加，这表明该亚群在NK细胞中的相对扩增。因此，本发明实施例评估了体外dara刺激下KIR-NKP46+NK细胞的增殖和自杀情况。结果显示，dara治疗显著降低了健康供体的NK细胞增殖，导致RRMM患者的dara治疗效果被削弱。
然而，进一步的亚群分析显示，在dara刺激下，KIR-NKP46+NK细胞亚群的增殖能力显著高于其他亚群（KIR-NKP46-；KIR+NKP46-；KIR+NKP46+）（如图5C所示，图5C示出了各个实验组中CFSE+占外周NK细胞比例），导致dara处理后KIR-NKP4 6+NK细胞的比例相对较高。
此外，本发明实施例评估了有或没有NKP46阻断的KIR+NK细胞和KIR-NK细胞的自杀情况。与没有NKP46阻断的KIR-亚群相比，在KIR+NK细胞中更频繁地观察到dara诱导的早期和晚期凋亡。与KIR-NKP46-NK细胞相比，没有NKP46-阻断的KIR-NK亚群倾向于削弱KIR-NKP46+NK细胞抵抗晚期凋亡的能力。
总之，这些结果表明，与KIR+NK细胞或KIR-NKP46-NK细胞相比，由于细胞凋亡减少和增殖能力相对增强，KIR-NKP46+亚群在与Dara协同作用以可持续地根除MM细胞方面表现优异。
本发明实施例中，还发现Dara治疗后较高的KIR-NKP46+NK亚群与较好的治疗反应相关。
由于单剂量Dara治疗后KIR-NKP46+NK细胞亚群的比例显著上调，本发明实施例推测Dara治疗后NK细胞中KIR-NKP46+的百分比是否与Dara治疗的疗效有关。在19名中位年龄为46岁（范围46-80）接受基于Dara方案的RRMM患者中，中位既往治疗线为2（范围1-8）。最佳反应的中位时间为66天（范围10-779）。本发明实施例评估了一剂Dara前后KIR-NKP46+百分比的变化，以预测治疗反应。本发明实施例结果表明，一剂治疗后KIR-NKP46+的倍数变化可以预测是否可以在一个月内获得最佳反应，即在第一个周期完成后，曲线下面积为0.857，log2倍数变化为0.26作为截止值，如图6所示，其示出了ROC曲线预测Dara治疗后的KIR-NKP46+比例除以Dara治疗前的该亚群比例数值对疗效的预测，这表明Dara治疗后KIR-NKP46+NK细胞具有指示作用。
由此，本发明实施例提出发明构思：在Dara一剂治疗前后各检测一次目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量，并进行数据分析，确定治疗前后的NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量的比值，从而评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
以上对本发明所提供的检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种细胞因子检测试剂的应用，其特征在于，应用于制备多发性骨髓瘤治疗预后评估试剂，所述细胞因子包括KIR-NKP46+，在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量，在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量，根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
2.根据权利要求1所述的细胞因子检测试剂的应用，其特征在于，在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
3.多发性骨髓瘤治疗预后预测方法，其特征在于，所述方法包括：
获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
4.根据权利要求3所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法，其特征在于，
根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效，包括：
在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值为不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
5.根据权利要求3所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法，其特征在于，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
取新鲜肝素抗凝血 50~200μl至流式管中；
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
6.多发性骨髓瘤治疗预后预测系统，其特征在于，所述系统包括：
第一获取模块，用于获取在Dara一剂治疗前目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第一表达量；
第二获取模块，用于获取在Dara一剂治疗后所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的第二表达量；
评估模块，用于根据所述第一表达量和第二表达量的比值，评估Dara对所述目标对象的临床疗效。
7.根据权利要求6所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测系统，其特征在于，所述评估模块，具体用于：
在所述比值大于1.97的情况下，确定所述目标对象适用Dara治疗；
在所述比值不大于1.97的情况下，确定所述目标对象不适用Dara治疗。
8.根据权利要求6所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测系统，其特征在于，所述目标对象外周全血中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量是通过以下步骤获取的：
向流式管中加入流式抗体，4°C避光孵育 20 min；所述流式抗体包括：CD45、CD3、CD56、CD158a、CD158b、CD158e、NKP46；
向流式管加入 2ml 1×溶血素混匀，在室温静置 10min，溶解红细胞；
对流式管进行离心，离心条件为：1500rpm×5min，离心结束后，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中再次加入 2ml PBS 重悬，对流式管进行离心，离心 条件为1500rpm×5min，去除上清液，保留沉淀物；
向流式管中加入 200μl PBS，混匀，流式细胞仪上机检测流式管中NK细胞表面KIR-NKP46+的表达量。
9.一种电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述计算机程序时实现权利要求3-5任一项所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法的步骤。
10.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该计算机程序被处理器执行时实现权利要求3-5任一项所述的多发性骨髓瘤治疗预后预测方法的步骤。
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