CN103305476B - 肠道病毒71型的活体成像示踪系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠道病毒71型的活体成像示踪系统及其应用。本发明所提供系统为重组肠道病毒71型，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b；所述插入为在所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。本发明的EV71-LUC可与野生型病毒平行用于研究。另外，由于LUC的信号放大效应，EV71-LUC可极大提高病毒监测灵敏度，为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供新思路，为抗肠道病毒71型药物筛选等应用研究也提供新技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种肠道病毒71型的活体成像示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型肠道病毒71型安徽分离株1基因组中插入Gaussia荧光素酶基因后得到的重组肠道病毒71型。
背景技术
肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。自20世纪70年代发现肠道病毒71型，已有3次EV71引起的大范围手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）流行，每次都有死亡病例的发生。EV71病毒在学龄前儿童特别是5岁以下年龄组发病率最高，除引发一般的手足口病的临床症状外，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，给家庭和社会造成了沉重负担。
生物荧光示踪技术是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测技术。在分子生物学研究领域，结合荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子进行荧光示踪监测和检测。
Gaussia荧光素酶是分离于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类动物的新型荧光素酶。通过报告基因载体，Gaussia荧光素酶可用于哺乳动物细胞表达。表达后的Gaussia荧光素酶为单条肽链的单体酶，其分子较小（187aa），且具有分泌性信号肽，因此可通过内质网分泌到细胞外。该荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应并且发光（480nm），该反应无需ATP参与。与其他荧光素酶相比，使用Gaussia荧光素酶作为报告基因有更多的优势：1．分泌型荧光素酶，可直接取上清检测，无须裂解细胞；2．发光强度高，是其它荧光素酶的1千倍；3．反应无须ATP，不受ATP影响；4．稳定性高，对温度、pH值等耐受性强。
目前尚未有对EV71进行Gaussia荧光素酶示踪的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠道病毒71型的Gaussia荧光素酶示踪系统及其应用。所述肠道病毒71型的Gaussia荧光素酶示踪系统即为一种表达Gaussia荧光素酶的重组肠道病毒71型。
本发明所提供的重组肠道病毒71型，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；
所述替换为：将所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的片段a中的任一片段（可由1个、2个或更多个核糖核苷酸组成）替换为片段b；
所述插入为：在所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；
所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有Gaussia荧光素酶编码基因的DNA片段编码的RNA。
所述Gaussia荧光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
在本发明中，所述Gaussia荧光素酶的编码基因的序列为序列表中序列3的第15-575位。
进一步，所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。
在本发明的一个实施例中，所述野生型肠道病毒71型具体为肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）。
在本发明的一个实施例中，所述重组肠道病毒71型是将野生型肠道病毒71型基因组RNA进行插入得到的重组病毒；具体的，所述插入中，所述“片段a中的任一位点”为所述片段a中的序列1的第450位和第451位核苷酸之间。
由于所述野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为GQ994988.1的序列（Up date：2010-5-18），相应的，所述重组肠道病毒71型的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为在GQ994988.1的序列（Up date：2010-5-18）的第3346位和第3347位（对应序列1的第450位和第451位）之间插入序列表中序列3所示DNA片段，得到的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组肠道病毒71型的方法。
本发明所提供的制备所述重组肠道病毒71型的方法具体可包括如下步骤：
（a）将所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
（b）用含所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
（c）将步骤（b）中的所述重组痘苗病毒载体乙中的所述gpt基因替换为所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组肠道病毒71型。
在上述方法中，步骤（a）中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为GQ994988.1的序列（Up date：2010-5-18）的第2897-3346位（对应序列1的第1-450位）和第3347-3797位（对应序列1的第451-901位）。
在上述方法中，步骤（b）中所述“含所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲”为在野生型痘苗病毒WR株的基因组中的序列4所示核苷酸序列区（TK基因区）插入DNA片段A后得到的重组痘苗病毒（即下述“用含肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因组cDNA的痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1”）；所述DNA片段A为含有所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的核苷酸序列。
在本发明中，所述“含所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲”的基因组DNA具体为在野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Up date：2012-11-22）的第80725位和第80726位（对应序列4的第459位和第460位）之间插入序列表中序列5后得到的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，制备所述重组肠道病毒71型的方法具体包括如下步骤：
（a）将GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）的第2897-3346位（对应序列1的第1-450位，命名为上游同源臂）和第3347-3797位（对应序列1的第451-901位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游（如酶切位点Not I和Sal I之间）和下游（如酶切位点Pst I和BamH I之间），得到重组质粒，将其命名为pGPT-IN；；
（b）用含肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因组cDNA的痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒pGPT-IN转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1与所述重组质粒pGPT-IN通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因插入所述v.v.-EV71-inf-1中的位于GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）的第3346位和第3347位核苷酸之间的重组痘苗病毒载体，将其命名为V.V-inf-gpt-in；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒pGPT-IN中的所述gpt基因替换为所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段（序列3），得到重组质粒，将其命名为pGPT-OUT-LUC；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒pGPT-OUT-LUC转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in与所述重组质粒pGPT-OUT-LUC通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以所述含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段（序列3）替代所述重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体，将其命名为V.V.-inf-LUC-GPT-OUT；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组肠道病毒71型（EV71-LUC）。
在上述方法的步骤（e）中，所述培养转染后的细胞，具体为将所述转染后的细胞（BHK-21）与Vero细胞按照1：4的比例混合培养。之后，待细胞出现病变后，收集细胞培养物，感染新的Vero细胞，进而获得所述重组肠道病毒71型（EV71-LUC）。
所述重组肠道病毒71型在如下（a1）或（a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a1）制备研究肠道病毒71型感染机制的产品；
（a2）制备筛选抗肠道病毒71型药物的细胞模型。
本发明的又一个目的是提供如下（b1）或（b2）的生物材料：
（b1）含有所述重组肠道病毒71型的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有所述重组肠道病毒71型的基因组RNA或cDNA的载体。
在本发明的一个实施例中，所述动物细胞具体为BHK-21细胞。
本发明选择Gaussia荧光素酶（LUC）作为示踪蛋白具有以下优点：
1、对细胞既无毒性，也无种属、组织和位置特异性；
2、不需要任何反应底物及其他辅助因子，只需要激发光源的激发即可发光；
3、荧光品质稳定，能够克服穿透、毒素、光漂白，高温等不利因素。
本发明选择基于痘苗病毒为载体的EV71反向遗传学系统，与其他反向遗传学系统相比，痘苗病毒载体具有其他载体所没有的优势。
首先，痘苗病毒载体的载容量比较大，可容纳至少26Kb外源序列。
其次，插入片段在痘苗病毒中比较稳定，随着重组痘苗病毒的增殖，可以获得高拷贝的外源基因。
第三，痘苗病毒载体可介导高频率的同源重组，便于对基因进行修饰改造。
实验证明，本发明建立的EV71活体成像示踪系统—重组肠道病毒71型（EV71-LUC）与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）相比，EV71-LUC重组病毒的毒力、复制能力和致病力均无明显差异，即EV71-LUC重组病毒中，外源基因LUC的导入，对病毒的致病性无显著影响，因此，可以极大丰富传统的模型系统。本发明的EV71-LUC可与野生型病毒平行用于研究。另外，本发明所提供的重组病毒EV71-LUC由于Gaussia荧光素酶的信号放大效应，可以极大的提高病毒监测的灵敏度，能够对病毒在小鼠脏器中的存在与否和病毒的增值情况进行直观初步的观测，设备要求简单。因此，利用动物模型开展EV71的感染和抗病毒治疗研究时，EV71示踪系统可以对传统的病毒学研究方法起到很好的辅助和补充作用，不仅极大地扩展了经典模型系统在细胞水平和动物水平的应用，同时，也为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供了一个新思路。再则，本发明为抗EV71药物的筛选等应用研究也提供新的技术平台。
附图说明
图1为重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的PCR扩增产物电泳结果。其中，1为DNAMarkers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；2，3样品的模板为V.V-inf-gpt-in的DNA；4样品的模板为v.v.-EV71-inf-1的DNA；2，4为引物EV71-L-up和GPT L的扩增产物；3为引物GPT R和EV71-R-down的扩增产物。
图2为重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的PCR扩增产物电泳结果。其中，1,2样品的模板为V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的DNA；3为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；4,5样品的模板为V.V-inf-gpt-in的DNA；1,4为引物EV71-L-up和LUC L的扩增产物；2,5为引物LUC R和EV71-R-down的扩增产物。
图3为LUC重组基因片段PCR扩增产物电泳结果。其中，1样品的模板为重组病毒EV71-LUC的cDNA模板，扩增引物为EV71-L-up和EV71-R-down；2为DNAMarkers（由大到小依次为15000bp、10000bp、75000bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp）。
图4为LUC外源基因插入EV71安徽分离株（GQ994988.1）基因组的3346-3347位的序列示意图。
图5为重组EV71病毒株（EV71-LUC）与野生型EV71（EV71-WT）一步生长曲线的比较。
图6为重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的PCR检测结果。其中，1,2样品的模板为痘苗病毒WR株；4,5样品的模板为V.V.-GPT-in；3为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1,4为引物vv L-up和GPT L的扩增产物；2,5为引物GPT R和vv R-down的扩增产物。
图7为重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的PCR扩增产物电泳结果。其中，1为DNAMarkers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；2,3样品的模板为V.V.-EV71-inf-1；4样品的模板为V.V.-GPT-in；2,4为引物vv L-up和EV71L的扩增产物；3为引物EV71R和vv R-down的扩增产物。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毒株、细胞与小鼠：
含肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因组全长cDNA的痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1：构建及鉴定过程见实施例2后。
质粒pSV2-gpt（购自ATCC公司，产品目录号：37145TM）、质粒pGL3-Basic（购自Promega公司，产品目录号：E1751）、CV-1细胞（购自ATCC，产品目录号：CCL-70）、BHK-21细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL-10）、D980R细胞（参见文献：Kerr,S.M.,and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virusreplication:recovery of plasmids from virus-infected cells.Virology，180:625–632.）、Vero细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL-81）。
雌性Balb/c小鼠：2日龄，购自维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂和材料：
DMEM培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase，Suoerscript Ⅲ反转录酶，脂质体（Lipofectamine2000）转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX RNAT7试剂盒购自Promega公司；Gelrite等均购自sigma公司；Eag Ⅰ限制性内切酶购自NEB公司；RNeasy Mini Kit购自QIAGEN。
实施例1、LUC标记的重组肠道病毒71型的构建
一、同源重组质粒的构建
1、重组质粒pGPT-IN的构建及鉴定
将野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（GenBank号:GQ994988.1，Up date：2010-5-18）的第2897-3346位（对应序列1的第1-450位，命名为上游同源臂）和第3347-3797位（对应序列1的第451-901位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-IN。具体操作如下：
（1）痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1基因组DNA的提取
由于痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1含野生型肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因组全长cDNA，所以提取其基因组DNA作为模板，用于扩增所述上游同源臂和所述下游同源臂。具体操作如下：
将痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
提取病毒DNA具体步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比为25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃冻存备用。
（2）引物的设计与合成
根据野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（GenBank：GQ994988.1，Up date：2010-5-18）设计并合成如下两个引物对：
扩增上游同源臂的引物对：
EV71-L-up：5’-GCGGCCGCATGTTTGTGCCACCTGG-3’（下划线部分为酶切位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第2897-2913位，即序列1的第1-17位）。
EV71-L-down：5’-GTCGACCTGTTGTCCAAATTTCCC-3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第3329-3346位的反向互补序列，即序列1的第433-450位的反向互补序列）。
扩增下游同源臂的引物对：
EV71-R-up：5’-CTGCAGTCTGGGGCCATTTATG-3’（下划线部分为酶切位点PstI的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第3347-3362位，序列1的第451-466位）。
EV71-R-down：5’-GGATCCTGATGTAGTCGGAC-3’（下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第3784-3797位的反向互补序列，序列1的第888-901位的反向互补序列）。
（3）重组质粒pGPT-IN的构建及鉴定
以步骤（1）获得的痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1基因组DNA为模板，以步骤（2）设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂。首先用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切所述上游同源臂，将其与经过同样双酶切的质粒pSV2-gpt大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2-gpt质粒的酶切位点Not I和Sal I之间插入了GenBank号为GQ994988.1（Up date：2010-5-18）的序列的第2897-3346位核苷酸（对应序列1的第1-450位），同时在酶切位点Pst I和BamH I之间插入了GenBank号为GQ994988.1（Up date：2010-5-18）的序列的第3347-3797位核苷酸（对应序列1的第451-901位）的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-IN。
2、重组质粒pGPT-OUT-LUC的构建及鉴定
（1）LUC基因片段的获得
从质粒pGL3-Basic中获得本发明所需的Gaussia荧光素酶的编码基因，并在其两端添加上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
利用LUC特异引物LUC up和LUC down从质粒pGL3-Basic中获得带有相应酶切位点的LUC基因片段。
LUC up:5’-GTCGACCTAGACCCATGGGCGTGAAGG-3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，整个序列为序列3的第1-27位的序列）
LUC down:5’-CTGCAGGAATTCTTACGTATCGCCGCC-3’（下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列，整个序列为序列3的第561-587位反向互补序列）
PCR扩增产物的序列为序列表中的序列3。
（2）重组质粒pGPT-OUT-LUC的构建及鉴定
用限制性内切酶Sal I和Pst I双酶切步骤（1）获得的LUC基因片段，与将其与经过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT-IN的载体大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定将重组质粒pGPT-IN的酶切位点Sal I和Pst I之间的gpt基因取代为序列表中序列3的第7-581位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-OUT-LUC。序列表中序列3的第15-575位为Gaussia荧光素酶的编码基因。
二、重组痘苗病毒的构建
1、重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的构建及鉴定
利用肠道病毒71型的痘苗病毒载体反向遗传学系统，通过感染-转染CV-1细胞，使痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1与重组质粒pGPT-IN通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阳性筛选标记，利用蚀斑纯化，获得以所述gpt基因插入所述v.v.-EV71-inf-1中的位于GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）的第3346位和第3347位核苷酸之间的重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in。具体操作如下：
（1）GPT-IN同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90%，感染痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT-IN转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-IN同源重组细胞培养物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阳性筛选
GPT阳性的DMEM培养基（pH7.0）：由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培养基组成；所述霉酚酸在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为250μg/ml。
2×MEM培养基（pH7.0）：将100ml10×MEM、10ml100×MEM非必需氨基酸和100ml胎牛血清混合后，用水定容至500ml。
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至80%汇合度时，换成GPT阳性的DMEM培养基继续培养24h。
取上述步骤（1）获得的GPT-IN同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阳性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阳性的DMEM培养基中培养的CV-1细胞（MOI=1），37℃吸附1h。其间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃，且在2×MEM培养基中加入GPT阳性筛选药物（霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2×MEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为250μg/ml）。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25%Gelrite和加入了GPT阳性筛选药物的2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温防治3-5min，待其凝固后，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的鉴定
A.引物设计
根据肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的mRNA序列（GenBank：GQ994988.1）及GPT基因序列设计鉴定引物如表1。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表1重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| EV71-L-up（上游引物） | GCGGCCGCATGTTTGTGCCACCTGG | GQ994988.1的第2897-2913位 |
| GPT L（下游引物） | CACACCTCCCCCTGAACCTGAA | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠左侧 |
| GPT R（上游引物） | GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠右侧 |
| EV71-R-down（下游引物） | GGATCCTGATGTAGTCGGAC | GQ994988.1的第3784-3797位 |
B.重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的PCR检测
为了鉴定EV71基因组内相应序列（序列1）与gpt基因的重组情况，以已纯化的相应重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的DNA为模板，以引物对EV71-L-up和GPT L、GPTR和EV71-R-down分别进行PCR反应。同时设置以痘苗病毒v.v.-EV71-inf-1的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min，反应30个循环；68℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图1所示，以引物对EV71-L-up和GPT L、GPT R和EV71-R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的DNA模板均扩增出相应的目的条带（图1中泳道2和3）。以引物对EV71-L-up和GPT L进行PCR扩增，作为对照的痘苗病毒v.v.-EV71-inf-1的模板DNA无相应的目的条带（图1中泳道4），以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in构建成功。
2、重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的构建及鉴定
再次通过感染-转染CV-1细胞，使重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in与重组质粒pGPT-OUT-LUC通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阴性筛选标记，利用蚀斑纯化，最终获得以含有Gaussia荧光素酶的编码基因的DNA片段（序列3）替代重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体V.V.-inf-LUC-GPT-OUT。并通过序列测定，验证LUC基因是否准确导入EV71基因组相应位点。具体操作如下：
（1）GPT-OUT同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90%汇合度，感染步骤1制备的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT-OUT-LUC转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-OUT同源重组细胞培养物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阴性筛选
GPT阴性的DMEM培养基（pH7.0）：由6-硫鸟嘌呤和DMEM培养基组成；所述6-硫鸟嘌呤在GPT阴性的DMEM培养基中的终浓度为0.5μg/ml。
将D980R细胞按照1：6的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至60-70%汇合度时，换成GPT阴性的DMEM培养基继续培养6h。
取上述步骤（1）获得的GPT-OUT同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阴性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阴性的DMEM培养基中培养的D980R细胞（MOI=1），37℃吸附1h。待吸附完成后，吸除病毒液，每孔补加GPT阴性DMEM培养基3ml，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的鉴定
A.引物设计
根据肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的mRNA序列（GenBank：GQ994988.1）、LUC基因序列设计鉴定引物如表2。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表2重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| EV71-L-up（上游引物） | GCGGCCGCATGTTTGTGCCACCTGG | GQ994988.1的第2897-2913 |
| LUC L（下游引物） | CGGCGTCCAGATCGGTGG | 序列3的第124-141位 |
| LUC R（上游引物） | CCTGTGCGTGGACTGCACGA | 序列3的第419-438位 |
| EV71-R-down（下游引物） | GGATCCTGATGTAGTCGGAC | GQ994988.1的第3784-3797 |
B.重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的PCR检测
为了鉴定EV71基因组内相应序列（序列1）与LUC基因的重组情况，以纯化的相应重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的DNA为模板，以引物对EV71-L-up和LUC L、LUC R和EV71-R-down分别进行PCR反应。同时设置以重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min反应30个循环；68℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图2所示，以引物对EV71-L-up和LUC L、LUC R和EV71-R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT均扩增出相应的目的条带（图2中泳道1,2），而作为对照的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in无目的条带（图2中泳道4,5）。以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT构建成功。
三、LUC标记的重组肠道病毒71型的构建及鉴定
提取步骤二中纯化并鉴定正确的V.V.-inf-LUC-GPT-OUT重组痘苗病毒的DNA，进行体外转录，获得V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的RNA，通过脂质体（Lipofectamine2000）转染BHK-21细胞，培养转染后细胞，可从中收获EV71-LUC重组病毒。实际操作中，再将转染的BHK-21细胞与Vero细胞按1：4混合，按适量密度接种6孔板，继续培养，直至观察到EV71特异性的细胞病变，收取培养上清，得到EV71-LUC的第一代病毒液。对收取的病毒液进行测序分析，比较EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）野生型病毒的基因序列，再次对同源重组进行确认分析。具体操作如下：
1、重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT基因组DNA的提取
将重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
提取病毒DNA，具体操作步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃冻存备用。
DNA纯度=A260/A280=2.0，浓度达2000ng/μl。
2、体外转录
取上述步骤1提取的重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的基因组DNA（约10μg），加入50μl 10×NEB Buffer3和100U Eag I内切酶，加水补足体积至500μl；混匀后，于37℃酶切2h。经酚/氯仿/异丙醇（体积比25:24:1）抽提后，加入2.5倍体积的污水乙醇沉淀，13000rpm离心15min，弃上清，加0.5ml70%乙醇洗涤，13000rpm离心15min，吸除上清液，加入20μl无核酸酶的水，获得酶切回收的DNA，-20℃保存备用。以上述酶切回收的DNA为模板，用Promega公司RiboMAX RNA T7试剂盒进行体外转录反应，得到V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的RNA，于-80℃保存备用。
3、RNA转染及EV71-LUC重组病毒的获得
将长至汇合度为100%的BHK-21细胞按1:15的比例接种到六孔板，于常规条件下培养。当细胞长至汇合度为80-90%时，进行RNA的转染。取12μl的Lipofectamine2000，稀释于100μl的Opti-MEM中，另取步骤2得到的重组痘苗病毒V.V.-inf-LUC-GPT-OUT的RNA溶液45μl稀释于100μl的Opti-MEM中，室温静置10min后，将两者轻轻混匀，静置20min，然后将转染混合物用Opti-MEM补足到1ml；吸出BHK-21细胞原有培养液，用Opti-MEM清洗六孔板内BHK-21细胞，然后将转染液加到六孔板待转染孔中，并将细胞于37℃细胞培养箱中培养6h。6h后弃掉含转染试剂的培养液，加入3ml DMEM培养液，37℃、5%CO2恒温培养箱继续培养24h。
将长至汇合度为100%的Vero细胞按1:10的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃、5%CO2条件下培养，使其在BHK-21细胞转染24h后，刚好长至汇合度为100%。将Vero细胞及转染后的BHK-21细胞用胰酶消化后，按4：1比例混合，接种至75cm2细胞培养瓶中，33℃，5%CO2恒温培养箱进行培养，并观察细胞病变（CPE）。待细胞出现病变后，收集细胞培养物，-70℃保存、备用。
Vero细胞按1:8的比例接种至6孔板内，于37℃、5%CO2条件下培养，至细胞90%时进行病毒感染。
将病变细胞培养物冻融3次后，用DMEM完全培养基将病毒液分别作10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6等10倍梯度稀释，移除Vero细胞六孔板原有的培养基，取病毒稀释液感染六孔板Vero细胞（1ml/孔），37℃孵育2h；期间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃；待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将0.25%Gelrite和2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加到六孔板各孔中；室温放置3-5min，待其凝固后，置于37℃培养箱继续培养，直至观察到明显蚀斑。挑取单个蚀斑，-70℃保存备用。
如上方法，进行3-4次蚀斑纯化，即可获得较纯的相应EV71-LUC重组病毒。
4、EV71-LUC重组病毒的扩增
Vero细胞按1:8的比例接种至75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长至汇合度为90%时，感染步骤3所得的蚀斑纯化后的EV71-LUC重组病毒，进行增殖，待细胞100%病变后，收取感染细胞培养混合物，获得大量的EV71-LUC重组病毒。
5、EV71-LUC重组病毒基因组的鉴定
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取步骤4获得的EV71-LUC重组病毒的RNA，通过RT-PCR技术，用Invitrogen公司SuperscriptⅢ反转录酶进行反转录，扩增病毒基因，通过序列测定，完成EV71-LUC重组病毒与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因序列的比对。
（1）配制反转录酶反应体系如下：
EV71-R-down：5’-GGATCCTGATGTAGTCGGAC-3’（下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第3784-3797位的反向互补序列，序列1的第888-901位的反向互补序列）
（2）向上述体系中补加以下成分：
| 5×反应缓冲液 | 4μl |
| 0.1M DTT | 1μl |
| RNase抑制剂 | 1μl |
| Superscript Ⅲ反转录酶 | 1μl |
混匀后，55℃扩增反应1h，70℃加热15min进行酶失活。
补加1μl的RNase抑制剂，37℃作用20min。收集反应物，-20℃保存备用。
（3）以上述反转录产物为模板，以引物EV71-L-up：5’-GCGGCCGCATGTTTGTGCCACCTGG-3’（下划线部分为酶切位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第2897-2913位，即序列1的第1-17位）和EV71-R-down：5’-GGATCCTGATGTAGTCGGAC-3’（下划线部分为酶切位点BamHI的识别序列，其后的序列为GenBank：GQ994988.1的第3784-3797位的反向互补序列，序列1的第888-901位的反向互补序列）进行PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（约1488bp），如图3所示，将回收的目的条带送样测序。将测序结果与野生型EV71病毒安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列进行比对，再次对同源重组进行确认分析。结果显示：EV71-LUC重组病毒基因组的cDNA序列为在野生型EV71病毒安徽分离株1（Anhui1-09-China）cDNA序列（GenBank号：GQ994988.1，Up date：2010-5-18）的第3346位和第3347位（对应序列1的第450位和第451位）之间插入序列表中序列3所示的含有LUC编码基因的DNA片段后得到的核苷酸序列（图4）。
实施例2、EV71-LUC重组病毒的生物学活性检测
一、EV71-LUC重组病毒一步生长曲线的测定
用实施例1制备的EV71-LUC重组病毒感染（MOI=1）Vero细胞，37℃吸附1h后，移除病毒液，用DMEM清洗细胞3次，以去除残留的未感染病毒，然后于33℃用含有10%（体积百分含量）FBS的DMEM培养细胞。于感染后0-24h内不同时间点（0、2、4、6、8、10、12、24h）收取病毒，对收取病毒在33℃进行蚀斑分析以测定其病毒滴度（PFU/ml），进而绘制一步生长曲线。实验同时以野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）作为对照，检测EV71-LUC重组病毒与其一步生长曲线的差异。实验重复三次。
病毒一步生长曲线的测定结果如图5所示，从图中可以看出，EV71-LUC重组病毒的复制周期和病毒的最高滴度，与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）没有明显差异。
二、EV71-LUC重组病毒的细胞水平评价
用实施例1制备的EV71-LUC重组病毒感染Vero细胞（MOI=1），分别在病毒感染后0-24h内每隔2h吸取细胞上清10μl，加腔肠素底物50μl（100mM），测定其RLU值）。采用Beyotime公司的荧光素酶报告基因检测试剂盒（产品目录号：RG009）进行测定，具体操作参见试剂盒说明书。同时设置PBS的对照组。实验重复三次，结果取平均值。
感染细胞培养上清中LUC酶促底物RLU值的测定结果如表3所示：感染EV71-LUC重组病毒细胞出现细胞病变（CPE）时（感染后的24h），其RLU值为9.5×108，比对照组高1.6×105；没有出现明显细胞病变时（感染后的12h），同样可以测到其RLU值为6.7×105，比对照组高1.5×102倍。以上结果表明，获得的重组病毒EV71-LUC，不仅可通过RLU值的测定，准确、清晰的反映病毒在细胞水平的增殖感染情况，同时，也可通过酶促反应和荧光信号的放大示踪效果，实现对病毒的早期感染进行定量监测。
表3感染细胞培养上清中LUC酶促底物RLU值的测定结果
注：感染后24h时，感染EV71-LUC重组病毒的细胞出现CPE；感染感染后12h时，感染EV71-LUC重组病毒的细胞未出现明显CPE。
三、EV71-LUC重组病毒的动物水平评价
将30只2日龄的雌性Balb/c乳鼠随机分为3组：野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）（EV71-WT）组、EV71-LUC重组病毒组和PBS对照组，每组10只。
每组的接种方案如表4所示。接种方式为腹腔注射，三组均为单次注射，每次注射剂量均为1.0ml。
表4各组的接种方案
| 组别 | EV71-WT组 | EV71-LUC组 | PBS组 |
| 剂量 | 3×105PFU/ml | 3×105PFU/ml | 1.0ml |
注：EV71-WT组和EV71-GFP组中的EV71-WT病毒或EV71-GFP重组病毒的液体环境均为PBS。
感染后第7天和第12天分别，对各组乳鼠的发病及存活情况进行观察和统计。结果如表5所示。
表5各组乳鼠发病及死亡情况统计
从表5中可以看出，染毒7天后，EV71-WT组和EV71-Luc组被感染的乳鼠均出现：精神萎靡、体重减轻、行走不稳等症状，染毒12天后，感染EV71-WT和EV71-Luc的乳鼠全部死亡；PBS对照组乳鼠正常。
综合本实施例的实验结果，可见与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）相比，EV71-LUC重组病毒的毒力、复制能力和致病力均无明显差异，即EV71-LUC重组病毒中，外源基因LUC的导入，对病毒的致病性无显著影响，因此，可以极大丰富传统的模型系统。
本发明中所涉及的“含肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因组全长cDNA的痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1”的构建及鉴定如下：
一、实验材料
野生型痘苗病毒WR株（Vaccinia virus WR strain）：（参见文献：Thiel,V.,J.Herold,B.Schelle,and S.G.Siddell.2001.Infectious RNAtranscribed in vitro from a cDNA copyof the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.J.Gen.Virol.82:1273–1281.）。
肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）：（参见文献：Chang Guohui,LinLei,Luo Yanjun,Cai Lijun,Wu Xiaoyan,Xu Hongmei,Zhu Qingyu.Sequence analysis ofsix enterovirus71strains with different virulences in humans.Virus Research,2010,151:66–73）。
二、实验方法
（一）同源重组质粒的构建
1、重组质粒pGPT-in的构建及鉴定
将野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）的第80267-80725位（对应序列1的第1-459位，命名为上游同源臂）和第80726-81194位（对应序列1的第460-928位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-in。具体操作如下：
（1）野生型痘苗病毒WR株基因组DNA的提取
具体操作参见实施例1中“痘苗病毒载体v.v.-EV71-inf-1基因组DNA的提取”。
（2）引物的设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组cDNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）设计并合成如下两个引物对：
扩增上游同源臂的引物对：
vv L-up：5’-cttaacgatgttcttcgcagatg-3’（下划线粗体部分为酶切位点SalⅠ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80267-80289位，即序列4的第1-23位）；
vv L-down：5’-atgatgacaataaagaattaattattg-3’（下划线粗体部分依次为酶切位点Pst I和Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80699-80725位的反向互补序列，即序列4的第433-459位的反向互补序列）
扩增下游同源臂的引物对：
vv R-up：5’-ggaacggcggacatattcagttgataatc-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80726-80753位，即序列4的第460-487位）
vv R-down：5’-tatctcggtttcctcacccaatcgt-3’（下划线粗体部分为酶切位点SacⅡ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第81170-81194位的反向互补序列，序列4的第904-928位的反向互补序列）
（3）重组质粒pGPT-in的构建及鉴定
以步骤（1）获得的野生型痘苗病毒WR株基因组DNA为模板，以步骤（2）设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂（上游同源臂：480bps；下游同源臂：484bps）。首先用限制性内切酶Not I和SacⅡ双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的质粒pSV2-gpt大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶Sal Ⅰ和Pst I双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2-gpt质粒的酶切位点Not I和Sac Ⅱ之间插入了GenBank号为NC_006998.1（Up date：2012-11-22）的序列的第80726-81194位核苷酸（对应序列4的第460-928位），同时在酶切位点Sal Ⅰ和Pst I之间插入了“GenBank号为NC_006998.1（Up date：2012-11-22）的序列的第80267-80725位（对应序列4的第1-459位）+gcggccgcc”的核苷酸序列的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-in。
2、重组质粒pGPT-out-wt的构建及鉴定
（1）EV71病毒全基因组cDNA序列的获得
从肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）中提取其基因组RNA，并反转录得到cDNA（GenBank号：GQ994988.1，Up date：2010-5-18），同时在两端添加上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）的RNA，通过RT-PCR技术，用Invitrogen公司SuperscriptⅢ反转录酶进行反转录，以反转录产物为模板，以引物EV71 up和EV71 down进行PCR扩增。反应结束后，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（7505bp）。将回收的目的条带送样测序。测序结果显示，PCR产物具有GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）。
EV71up：
5’-gcccgacgtcgagctctaatacgactcactatagggTTAAAACACCCTGTGGGTTGCACC-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，该序列的第10-44位为T7启动子相关序列其后大写字母部分为GenBank：GQ994988.1第1-24位，该序列也与序列5的第1-68位一致）
EV71 down：
5’-gccacggtggccttaattaatttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其余为添加序列的反向互补序列，整个序列为序列5的第7440-7505位的反向互补序列）
（2）重组质粒pGPT-out-wt的构建及鉴定
用限制性内切酶Not I酶切步骤（1）获得的PCR产物（带有相应酶切位点的EV71病毒基因组序列），将其与经过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT-in的载体大片段相连，获得重组质粒。将经测序表明将重组质粒pGPT-in的两个Not I酶切位点之间的gpt基因取代为（且为正向插入）序列表中序列5的第10-7496位核苷酸所示的DNA片段的重组质粒命名为pGPT-out-wt。
（二）重组痘苗病毒的构建
1、重组痘苗病毒V.V-GPT-in的构建及鉴定
（1）GPT-in同源重组细胞培养物的获得
具体操作参见实施例1中“GPT-IN同源重组细胞培养物的获得”。
（2）GPT阳性筛选
具体操作参见实施例1中“GPT阳性筛选”，最终获得已纯化的重组痘苗病毒V.V-GPT-in，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V-GPT-in的鉴定
A.引物设计
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）及GPT基因序列设计鉴定引物如表6。
表6重组痘苗病毒V.V-GPT-in的PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| vv L-up（上游引物） | GTCGACCTTAACGATGTTCTTCGCAGATG | NC_006998.1的第80267-80289位 |
| GPT L（下游引物） | CACACCTCCCCCTGAACCTGAA | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠左侧 |
| GPT R（上游引物） | GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠右侧 |
| vv R-down（下游引物） | CCGCGGTATCTCGGTTTCCTCACCCAATCGT | NC_006998.1的第81170-81194位 |
B.重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的PCR检测
为了鉴定野生型痘苗病毒WR株的基因组内相应序列（序列4）与gpt基因的重组情况，以已纯化的相应重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的DNA为模板，分别以两对引物vv L-up和GPT L、GPT R和vv R-down进行PCR检测反应。同时设置以野生型痘苗病毒WR株的DNA为模板的对照。反应结束后将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图6所示，以引物对vv L-up和GPT L、GPT R和vv R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V.-GPT-in均扩增出相应的目的条带（图6中泳道4，5），而作为对照的野生型痘苗病毒WR株无目的条带（图6中泳道1，2）。以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V-GPT-in构建成功。
2、重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的构建及鉴定
再次通过感染-转染CV-1细胞，使重组痘苗病毒V.V-GPT-in与重组质粒pGPT-out-wt通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阴性筛选标记，利用蚀斑纯化，最终获得分别以EV71病毒基因组序列的DNA片段（序列表中序列5的第10-7496位核苷酸）替代重组痘苗病毒载体V.V-GPT-in中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体V.V.-EV71-inf-1。具体操作如下：
（1）GPT-out同源重组细胞培养物的获得
具体操作参见实施例1中“GPT-IN同源重组细胞培养物的获得”。
（2）GPT阴性筛选
具体操作参见实施例1中“GPT阴性筛选”，最终获得已纯化的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的鉴定
A.引物设计
根据EV71病毒基因组序列（序列5），及GPT基因序列设计鉴定引物如表7。
表7重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| vv L-up（上游引物） | GTCGACCTTAACGATGTTCTTCGCAGATG | NC_006998.1的第80267-80289位 |
| EV71 L（下游引物） | TACTAACTAGCTCAGTAGACTC | 序列5的466-487位 |
| EV71 R（上游引物） | TGCAGATAAGTCTCCTTGC | 序列5的7050-7068位 |
| vv R-down（下游引物） | CCGCGGTATCTCGGTTTCCTCACCCAATCGT | NC_006998.1的第81170-81194位 |
B.重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的PCR检测
为了EV71基因组内相应序列对gpt基因的取代情况，以纯化的相应重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的DNA为模板，分别以引物对vv L-up和EV71L、EV71R和vvR-down进行PCR反应。同时设置以重组痘苗病毒V.V-GPT-in的DNA为模板的对照。反应结束后将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图7所示，以引物对vv L-up和EV71L、EV71R和vv R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1均扩增出相应的目的条带（图7中泳道2-3），而作为对照的野生型痘苗病毒WR株无目的条带（图7中泳道4）。以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1构建成功。
另外，本发明的发明人对构建所得的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1进行了全基因测序，结果表明重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1的基因组序列为在野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Up date：2012-11-22）的第80725位和第80726位（对应序列4的第459位和第460位）之间插入序列表中序列5后得到的核苷酸序列。
Claims (6)
1.重组肠道病毒71型，其特征在于：所述重组肠道病毒71型的基因组RNA反转录的cDNA序列为在GenBank号为GQ994988.1的序列的第3346位和第3347位之间插入序列表中序列3所示DNA片段后得到的核苷酸序列。
2.制备权利要求1所述重组肠道病毒71型的方法，包括如下步骤：
(a)将肠道病毒71型安徽分离株1基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述位于待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为GQ994988.1的序列的第2897-3346位和第3347-3797位的序列；
(b)用含所述肠道病毒71型安徽分离株1基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
(c)将步骤(a)中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为序列表中序列3所示的DNA片段，得到重组质粒乙；
(d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以序列表中序列3所示的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
(e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组肠道病毒71型。
3.权利要求1所述重组肠道病毒71型在如下(a1)或(a2)中的应用：
(a1)制备研究肠道病毒71型感染机制的产品；
(a2)制备筛选抗肠道病毒71型药物的细胞模型。
4.含有权利要求1所述重组肠道病毒71型的离体动物细胞。
5.含有权利要求1所述重组肠道病毒71型的重组菌。
6.含有权利要求1所述重组肠道病毒71型的基因组RNA或cDNA的载体。
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