CN103555679B - 一种重组增强型绿色荧光蛋白h5n1亚型流感病毒及其应用 - Google Patents
一种重组增强型绿色荧光蛋白h5n1亚型流感病毒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用。该重组H5N1亚型流感病毒的基因组由如下a）和b）的8个RNA片段组成：a）与野生型H5N1亚型流感病毒基因组相同的7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1和NS2蛋白的RNA片段8；b）在野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’-非编码区前插入含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段后得到的RNA片段6’。本发明可通过观察绿色荧光阳性细胞数和荧光强度，快速对重组病毒进行定量检测，省了常规滴定的繁琐程序，为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评价提供便捷有效工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用，特别涉及一种以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒及其应用。
背景技术
H5N1亚型流感病毒是甲型流感病毒的一种，主要在禽类传播。近年来，H5N1亚型流感病毒感染人类的报道逐年增多，截至2012年8月，全球已有15个国家和地区报告608人感染，其中359人死亡，死亡率高达59%。感染滴度是病毒相关基础研究以及药物、疫苗研发所需的基础数据。目前H5N1亚型流感病毒的感染滴度主要依靠测定病毒的半数组织培养感染剂量（TCID50）或空斑形成单位（PFU）来确定，操作复杂且准确程度易受到主观经验影响。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），简称GFP，是由下村修等人[ShimomuraO,Johnson F,Saiga Y.Extraction,purification and properties of aequorin,a bioluminescentprotein from the luminous hydromedusan,Aequorea.J Cell Comp Physiol.1962;59(3):223-39.]在1962年从一种水母中发现的、在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光的蛋白。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）是对GFP上几个氨基酸进行修改后获得的发光效率更强的绿色荧光蛋白[Heim R,Cubitt A,Tsien R.Improved green fluorescence.Nature.1995;373(6516):663-4.]。GFP或EGFP的荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定[Prendergast F,MannK.Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolatedfrom Aequorea forskalea.Biochemistry.1978;17(17):3448-53.]。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白[Phillips G.Green fluorescent protein--a brightidea for the study of bacterial protein localization.FEMS Microbiol Lett.2001;204(1):9-18.]，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
目前，尚未有以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用。
本发明所提供的重组H5N1亚型流感病毒是以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒，其基因组RNA由如下（a）和（b）中所述的8个独立的RNA片段组成：
（a）与野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1蛋白和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1蛋白和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1蛋白和NS2蛋白的RNA片段8；
（b）与所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA不同的如下RNA片段：在所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’-非编码区前插入RNA片段A得到RNA片段6’；所述RNA片段A为含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段。
其中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；
在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码RNA具体为序列表中序列9的第1434-2157位；
进一步，所述RNA片段A自上游到下游依次为：猪捷申病毒（porcineteschovirus–1，PTV-1）的2A肽序列的编码RNA、增强型绿色荧光蛋白的编码RNA；所述RNA片段A的序列具体为序列表中序列9的第1368-2157位（序列9的1368-1433位为“2A肽”的编码RNA）。
相应的，所述RNA片段6’自上游到下游依序为：所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的3’非编码区，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的编码区，所述猪捷申病毒（porcine teschovirus–1，PTV-1）的2A肽序列的编码RNA，所述增强型绿色荧光蛋白的编码RNA，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’包装信号，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’非编码区。
在本发明中，所述野生型H5N1亚型流感病毒具体为H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004(简称VN1194)毒株。
具体的，在所述H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004毒株的基因组中，所述RNA片段1的序列为序列表中序列1，所述RNA片段2的序列为序列表中序列2，所述RNA片段3的序列为序列表中序列3，所述RNA片段4的序列为序列表中序列4，所述RNA片段5的序列为序列表中序列5，所述RNA片段6的序列为序列表中序列6，所述RNA片段7的序列为序列表中序列7，所述RNA片段8的序列为序列表中序列8。
所述RNA片段6的5’-非编码区序列具体为序列6的第1371-1399位。
更加具体的，在本发明中，在所述重组H5N1亚型流感病毒基因组RNA中，所述RNA片段6’的序列具体为序列表中序列9。
序列1-序列9为RNA序列。序列1共由2341个核糖核苷酸组成；序列2共由2340个核糖核苷酸组成；序列3共由2233个核糖核苷酸组成；序列4共由1779个核糖核苷酸组成；序列5共由1565个核糖核苷酸组成；序列6共由1399个核糖核苷酸组成；序列7共由1028个核糖核苷酸组成；序列8共由876个核糖核苷酸组成；序列9共由2343个核糖核苷酸组成。序列10共由263个氨基酸组成。
对于序列9，第1-20位为3’-非编码区序列，第21-1367位为NA蛋白的编码RNA序列，第1368-1433位为猪捷申病毒（porcine teschovirus–1，PTV-1）的2A肽序列的编码RNA序列，第1434-2157位为EGFP的编码RNA序列（第1434-1440位的“CGCCACC”起到增强表达的作用，EGFP真实的编码是以其后的第一个ATG开始的），第2158-2311位为5’包装信号，第2312-2343位为5’-非编码区序列。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组H5N1亚型流感病毒的方法。
本发明所提供的制备所述重组H5N1亚型流感病毒的方法，可包括如下步骤：
（1）将所述RNA片段1、所述RNA片段2、所述RNA片段3、所述RNA片段4、所述RNA片段5、所述RNA片段6’、所述RNA片段7和所述RNA片段8，共8个RNA片段的cDNA序列分别克隆到pHW2000载体的多克隆位点，得到8个重组表达载体；
（2）将步骤（1）构建的8个重组表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到所述重组H5N1亚型流感病毒。
在上述方法中，所述8个重组表达载体为如下（I）和（II）：
（I）含有所述RNA片段1的cDNA（将序列1中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-PB2；含有所述RNA片段2的cDNA（将序列2中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-PB1；含有所述RNA片段3的cDNA（将序列3中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-PA；含有所述RNA片段4的cDNA（将序列4中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-HA；含有所述RNA片段5的cDNA（将序列5中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-NP；含有所述RNA片段7的cDNA（将序列7中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-M；含有所述RNA片段8的cDNA（将序列8中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体具体为重组表达载体pHW2000-VN-NS。以上7个重组表达载体均记载在“Li,J.,Li,Y.,Hu,Y.,Chang,G.,Sun,W.,Yang,Y.,Kang,X.,Wu,X.&Zhu,Q.(2011).PB1-mediated virulence attenuation ofH5N1influenza virus in mice is associated with PB2.J Gen Virol92,1435-1444.”一文中。
（II）含有所述RNA片段6’的cDNA（将序列9中的U替换为T后得到的序列）的重组表达载体（命名为pHW-VN-NA-EGFP）具体为在pHW2000载体的多克隆位点（如BsaⅠ）处正向插入如下序列后得到的重组质粒：将序列9中的U替换为T后得到的序列。
在上述方法中，步骤（2）中，所述培养的时间可为48h，所述培养的温度为37℃。
在上述方法中，步骤（2）中，在培养所述重组细胞后，还可包括将培养体系的上清液接种MDCK细胞，得到重组MDCK细胞，培养（如37℃培养48h）所述重组MDCK细胞，取细胞上清液离心（如3000g离心5min），弃沉淀，从离心上清中获得所述重组H5N1亚型流感病毒的步骤。
在所述方法中，将所述8个重组表达载体共转染所述293T细胞时，所述8个重组表达载体为等质量混合。
所述重组H5N1亚型流感病毒在如下（a1）或（a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a1）制备筛选抗H5N1亚型流感病毒药物的细胞模型；
（a2）制备研究H5N1亚型流感病毒感染机制的产品。
本发明的再一个目的是提供一种利用所述重组H5N1亚型流感病毒进行抗H5N1亚型流感病毒药物筛选的方法。
本发明所提供的利用所述重组H5N1亚型流感病毒检测待测药物是否具有抗H5N1亚型流感病毒活性的方法，具体可包括以下步骤：
（b1）实验组：将MDCK细胞感染所述重组H5N1亚型流感病毒（如按照以1.0MOI或0.1MOI的病毒量感染），得到感染后MDCK细胞，向所述感染后MDCK细胞中加入待测药物（如感染后1h时加入）；
对照组：与实验组相比，差别仅在于向所述感染后MDCK细胞中不加入所述待测药物；
（b2）将步骤（b1）的实验组和对照组分别孵育24h-72h（如24h），分别观察所述实验组和所述对照组细胞中绿色荧光蛋白的表达量（具体可为分别在荧光显微镜下观察所述实验组和所述对照组的绿色荧光强度），按照如下方法确定所述待测药物是否具有抗H5N1亚型流感病毒活性：若所述实验组细胞中绿色荧光蛋白的表达量在统计学上显著低于（p<0.05）所述所述对照组，则所述待测药物具有抗H5N1亚型流感病毒活性；反之，则所述待测药物不具有抗H5N1亚型流感病毒活性。
在上述方法的步骤（b1）中，向所述感染后MDCK细胞中加入的所述待测药物的浓度需满足如下条件：所述待测药物的浓度需保证在所述浓度下能够发挥药效。
在本发明的一个实施例中，向所述感染后MDCK细胞中加入的所述待测药物的浓度具体为2nM。所述待测药物具体为磷酸奥司他韦（达菲）。
本发明的又一个目的是提供如下（c1）和/或（c2）的生物材料。
（c1）含有所述重组H5N1亚型流感病毒的离体动物细胞或重组菌；
（c2）含有所述重组H5N1亚型流感病毒基因组RNA或cDNA的载体或载体组合物。
在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为MDCK细胞或293T细胞。
在（c2）中，所述重组H5N1亚型流感病毒基因组RNA可为组成所述重组H5N1亚型流感病毒基因组的所述8个独立的RNA片段中的至少一个。
在本发明中，（c2）中所述载体具体可为如下8个重组表达载体中的一个，所述载体组合物具体可为所述如下8个重组表达载体中的两个或两个以上：所述重组表达载体pHW2000-VN-PB2、所述重组表达载体pHW2000-VN-PB1、所述重组表达载体pHW2000-VN-PA、所述重组表达载体pHW2000-VN-HA、所述重组表达载体pHW2000-VN-NP、所述重组表达载体pHW2000-VN-M、所述重组表达载体pHW2000-VN-NS和所述重组表达载体pHW-VN-NA-EGFP。
本发明制备的重组H5N1亚型流感病毒，可通过观察和测定EGFP荧光强度，快速、准确、客观地对样品中包含的病毒进行定量检测，既节约了时间，也提高了检测结果的准确性和可靠性，从而为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评估提供新的便捷、有效的工具。更加具体的，本发明的优点如下：本发明所提供的重组H5N1亚型流感病毒携带EGFP表达基因，可以在细胞或宿主体内复制时表达EGFP，可以实时、快捷、定量展示H5N1禽流感病毒在宿主细胞或机体内增殖和组织嗜性，不需要采用传统的空斑滴定、TCID50等耗时、繁琐的病毒定量测定方法，也可替代测定病毒在体内组织嗜性的免疫组化等方法，极大地简化、加快了H5N1禽流感病毒致病机理、药物和疫苗研发等研究。
附图说明
图1为NA基因、EGFP基因、5’-非编码区及其融合PCR产物琼脂糖电泳图。其中，泳道M为DNA Marker（片段大小从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；泳道1为5’-包装信号片段；泳道2为2A肽与EGFP基因的PCR产物；泳道3为NA基因PCR产物；泳道4为NA基因、EGFP基因以及5’-包装信号的融合PCR产物（即重组病毒NA节段）。
图2为重组表达载体pHW-VN-NA-EGFP的结构示意图。其中NCR（noncodingregion）为VN1194病毒NA节段非编码区，NA为VN1194病毒的NA基因，EGFP为增强型绿色荧光蛋白基因，PTV-12A为猪捷申病毒（porcine teschovirus–1）2A肽基因，Sig为VN1194病毒NA节段5’-包装信号。PolⅡ表示Ⅱ型RNA聚合酶启动子，tⅡ表示Ⅱ型RNA聚合酶终止子；PolⅠ表示Ⅰ型RNA聚合酶启动子，tⅠ表示Ⅰ型RNA聚合酶终止子。
图3为重组病毒rVN-EGFP在MDCK细胞上形成的空斑（病毒1:1000稀释）。其中，A为重组病毒rVN-EGFP在MDCK细胞上形成的带绿色荧光的空斑；B为重组病毒rVN-EGFP在MDCK细胞上形成的空斑经中性红染色后的结果。C：为野生型病毒VN1194在荧光显微镜下不能形成带绿色荧光的空斑；D：为野生型病毒VN1194在在MDCK细胞上形成的空斑经中性红染色后的结果。
图4为重组病毒rVN-EGFP的RT-PCR鉴定。其中，泳道M为DL2000DNA Marker；泳道1为重组病毒rVN-EGFP基因组RNA的RT-PCR检测结果；泳道2为VN1194病毒基因组RNA的RT-PCR检测结果。
图5为重组病毒rVN-EGFP感染MDCK细胞后24小时后，细胞中绿色荧光蛋白表达。
图6为利用重组病毒rVN-EGFP测定磷酸奥司他韦（达菲）抗H5N1禽流感病毒活性的结果。其中，A：MOI=1；B：MOI=0.1。A和B中，第一行均为可见光下的检测结果；第二行均为荧光显微镜观测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pEGFP-C1质粒：Clontech公司，6084-1。
pHW2000质粒：记载在“Hoffmann,E.,Neumann,G.,Kawaoka,Y.,Hobom,G.&Webster,R.G.(2000).A DNA transfection system for generation of influenza A virus fromeight plasmids.Proceedings of the National Academy of Sciences97,6108-6113.”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
反向遗传学拯救VN1194病毒的8个质粒：pHW2000-VN-PB2，pHW2000-VN-PB1，pHW2000-VN-PA，pHW2000-VN-HA，pHW2000-VN-NP，pHW2000-VN-NA，pHW2000-VN-M，pHW2000-VN-NS，均记载于“Li Jing,LiYongqiang,Hu Yi,et al.PB1-mediated virulence attenuation of H5N1influenza virus inmice is associated with PB2.J Gen Virol.2011Jun;92(Pt6):1435-44.”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
在pHW2000-VN-PB2质粒中含有编码PB2蛋白的DNA序列（将序列1中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-PB1质粒中含有编码PB1蛋白和PB1-F2蛋白的DNA序列（将序列2中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-PA质粒中含有编码PA蛋白的DNA序列（将序列3中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-HA质粒中含有编码HA蛋白的DNA序列（将序列4中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-NP质粒中含有编码NP蛋白的DNA序列（将序列5中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-NA质粒中含有编码NA蛋白的DNA序列（将序列6中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-M质粒中含有编码M1蛋白和M2蛋白的DNA序列（将序列7中的U替换为T后的序列）；在pHW2000-VN-NS质粒中含有编码NS1蛋白和NS2蛋白的DNA序列（将序列8中的U替换为T后的序列）。
VN1194病毒：A/Vietnam/1194/2004(简称VN1194),记载于“李靖.同一人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒致病性差异研究.中国人民解放军军事医学科学院，博士论文，2008”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得.
293T细胞：中国科学院细胞库，293T人胚肾细胞。
MDCK细胞：“李靖.同一人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒致病性差异研究.中国人民解放军军事医学科学院，博士论文，2008”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
实施例1、重组H5N1亚型流感病毒的获得及鉴定
一、重组表达载体pHW-VN-NA-EGFP的构建
1、引物设计
根据pEGFP-C1质粒中的EGFP基因序列、VN1194病毒基因组中的NA节段序列（编码NA蛋白的RNA片段6，其序列如序列表中序列6所示）设计用于扩增NA基因（含3’-非编码区）、EGFP基因以及5’-包装信号的引物，并在EGFP基因和NA基因之间引入猪捷申病毒（porcine teschovirus–1，PTV-1）2A肽序列（序列9的第1368-1433位），在用于扩增NA基因的正向引物（PF-NA）和用于扩增5’-包装信号的反向引物（PR-NA）末端均加入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点（下划线斜体部分），具体引物序列及扩增产物长度见表1。
表1RT-PCR引物及扩增基因产物长度
2、NA基因、EGFP基因以及5’-包装信号的扩增
以pHW2000-VN-NA质粒为模板，用引物PF-NA和引物PR-NA-2A扩增NA基因，用引物PF-EGFP-NA157和引物PR-NA扩增5’-包装信号。以pEGFP-C1质粒为模板，用引物PF-2A-EGFP和引物PR-2A-EGFP扩增EGFP基因。
PCR反应体系为：10×buffer5μL，dNTP（2.5mM）4μL，MgSO4（50mM）1μL，引物各2μL，模板100ng，pfx聚合酶（Invitrogen）0.5μL，加水至50μL。扩增条件为：94℃变性5min；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸1min30s，30个循环；68℃延伸7min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中泳道1-3所示。从图中可以看出，目的条带大小与预期结果一致。
3、融合PCR
利用DNA凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）纯化、回收以上步骤2所得的3个PCR产物。取EGFP基因和5’-包装信号的PCR产物各3μL，混合后作为模板，加入10×buffer5μL，dNTP（2.5mM）4μL，MgSO4（50mM）1μL，引物PF-2A-EGFP和PR-NA各2μL，pfx聚合酶（Invitrogen）0.5μL，水29.5μL，进行PCR扩增，扩增条件同步骤2。
纯化、回收EGFP基因和5’-包装信号的融合PCR产物，将其与NA基因的PCR产物各3μL，混合后作为模板，加入10×buffer5μL，dNTP（2.5mM）4μL，MgSO4（50mM）1μL，引物PF-NA和PR-NA各2μL，pfx聚合酶（Invitrogen）0.5μL，水29.5μL，进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5min；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环；68℃延伸7min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中泳道4所示。从图中可以看出，目的条带大小与预期结果一致。
4、酶切和连接
纯化、回收步骤3得到的NA基因、EGFP基因和5’-包装信号的融合PCR产物，取2μg加入10×buffer2μL，BSA0.2μL，限制性内切酶BsaI0.5μL，水9.3μL，37℃酶切3小时。同时取pHW2000质粒2μg，同等体系，37℃酶切6小时。
纯化、回收酶切产物。取PCR酶切产物8μL，加入pHW2000质粒酶切产物1μL，10×Ligation buffer2μL，T4连接酶（Promega）1μL，水8μL，4℃连接过夜。
5、转化与鉴定
取步骤4所得连接产物20μL，加入到100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s。加入1mL无抗性培养基培养45min后涂于Amp抗性LB平皿，37℃继续培养12小时。
挑取菌落，加入500μL Amp抗性LB，37℃培养6小时。取2μL菌液，加入10×PCRbuffer5μL，dNTP（2.5mM）4μL，采用T7和BGH通用引物（pHW2000质粒上带有T7启动子和BGH转录终止子）各2μL，rTaq（TaKaRa）0.25μL，进行PCR鉴定，扩增条件为：94℃变性5min；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环；68℃延伸7min。
T7通用引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；
BGH通用引物：5’-TAGAAGGCACAGTCGAGGc-3’。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，从电泳条带正确（大小约为2400bp）的菌液中提取质粒进一步送样测序。将测序表明在pHW2000载体的多克隆位点BsaⅠ处正向插入序列表中序列9所示RNA片段对应的DNA片段（将序列9中的U替换为T后的序列）后得到的重组质粒，命名为pHW-VN-NA-EGFP。重组表达载体pHW-VN-NA-EGFP的结构示意图如图2所示。
二、重组H5N1亚型流感病毒的拯救与鉴定
1、病毒拯救
接种293T细胞于6孔板中。次日待细胞汇合度达到70%-80%时，取步骤一构建的重组表达载体pHW-VN-NA-EGFP与VN1194病毒其他7个节段的双向表达质粒（pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M和pHW2000-VN-NS）各1μg，混匀后加入到500μLopti-MEM中，再加入10μL转染试剂Lipofectamine LTX（Invitrogen），轻轻混匀，室温放置30min。30min后，用opti-MEM洗涤293T细胞一遍，将质粒与脂质体的混合液加入到293T细胞中，并用opti-MEM将体积补至1mL，37℃5%CO2培养48小时，8个重组表达载体在293T细胞内完成重组病毒的拯救。48小时后，吸取细胞上清液离心，弃沉淀，将离心上清分装冻存，备用。
取100μL转染产物（以上所得离心上清）接种至汇合度为90%的MDCK细胞，37℃继续培养48小时，使重组病毒在MDCK细胞内大量增殖。48小时后，取细胞上清，3000g离心5min，弃沉淀，将上清（重组病毒原液）分装后冻存于-70℃，备用。
2、空斑测定
实验前一天接种MDCK细胞于12孔板。当日（细胞汇合度为90%），用含2%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基将步骤1所得重组病毒原液按十倍进行系列稀释，同时弃MDCK细胞培养液，用PBS洗涤细胞一遍。按每孔100μL将不同浓度的病毒稀释液加至12孔板中，37℃5%CO2吸附1小时。弃病毒液，再用PBS洗涤细胞一遍，加盖1%琼脂糖胶300μL，37℃5%CO2培养48小时，荧光显微镜下一方面直接观察带绿色荧光的空斑，另一方面加入0.1%中性红染色后观察空斑形成。同时设置VN1194病毒作为对照。
结果如图3（病毒1:1000稀释）所示。从图中可以看出，步骤1所得重组病毒与作为对照的VN1194病毒的中性红染色结果均显示在红色背景下存在白色圆形或类圆形斑点，同时步骤1所得重组病毒处理组形成明显具有绿色荧光的空斑，而作为对照的VN1194病毒则没有绿色荧光产生。
3、RT-PCR鉴定
用RNeasy mini kit（QIAGEN）分别提取步骤1拯救出的重组病毒和VN1194病毒（对照）的基因组RNA，用AMV Reverse Transcriptase试剂盒（Promega）进行反转录。
反转录体系及条件如下：病毒基因组RNA和Uni12引物（5’-AGCAAAAGCAGG-3’）在65℃条件下变性10min。随后冰浴5min，加入5×RT buffer4μL，RNase Inhibitor(5U/L)10mmol/L dNTPs2μL，AMV ReverseTranscriptase(5U/L)灭菌双蒸水补足至42℃水浴60min，94℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase，-20℃保存待用。反转录体系中除病毒基因组RNA外的其他组分，均为AMV Reverse Transcriptase试剂盒随附产品。
PCR反应体系为：2μL反转录产物，加入10×PCR buffer5μL，dNTP（2.5mM）4μL，EGFP特异的上下游引物（表1中的引物PF-2A-EGFP和PR-2A-EGFP）各2μL，rTaq（TaKaRa）0.25μL。扩增条件为：94℃变性5min；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸7min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。从图中可以看出，步骤1拯救出的重组病毒扩增得到了大小约为850bp的目的条带，而作为对照的VN1194病毒无目的条带产生。
4、EGFP表达测定
实验前一天接种MDCK细胞于12孔板。当日（细胞汇合度为90%），用含2%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基将步骤1所得重组病毒原液按十倍进行系列稀释，同时弃MDCK细胞培养液，用PBS洗涤细胞一遍。按每孔100μL将不同浓度的病毒稀释液加至12孔板中，37℃5%CO2吸附1小时。弃病毒液，再用PBS洗涤细胞一遍，换含2%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基在37℃5%CO2培养24-48小时，荧光显微镜下直接观察细胞中EGFP表达情况。
结果如图5（病毒1:1000稀释）所示。从图中可以看出，存在绿色荧光。
5、重组病毒的基因组测序
用RNeasy mini kit（QIAGEN）分别提取步骤1拯救出的重组病毒的基因组RNA，用AMV Reverse Transcriptase试剂盒（Promega）进行反转录，得到重组病毒基因组cDNA。反转录体系及条件如下：病毒基因组RNA和Uni12引物（5’-AGCAAAAGCAGG-3’）在65℃条件下变性10min。随后冰浴5min，加入5×RT buffer4μL，RNase Inhibitor(5U/L)10mmol/L dNTPs2μL，AMV ReverseTranscriptase(5U/L)灭菌双蒸水补足至42℃水浴60min，94℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase，-20℃保存待用。反转录体系中除病毒基因组RNA外的其他组分，均为AMV Reverse Transcriptase试剂盒随附产品。
对得到的重组病毒基因组cDNA进行序列测定，将测定的序列与目标序列进行比对分析，确认步骤1所得重组病毒的基因组是由如下8个独立的RNA片段组成的：（a）与VN1194病毒基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码PB1蛋白和PB1-F2蛋白的RNA片段1（序列1）、编码PB2蛋白的RNA片段2（序列2）、编码PA蛋白的RNA片段3（序列3）、编码HA蛋白的RNA片段4（序列4）、编码NP蛋白的RNA片段5（序列5）、编码M1蛋白和M2蛋白的RNA片段7（序列7），以及编码NS1蛋白和NS2蛋白的RNA片段8（序列8）；（b）在VN1194病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6（序列6）的3’末端连接绿色荧光蛋白的编码RNA后得到的RNA片段6’（序列9）。将该重组病毒命名为rVN-EGFP。
实施例2、利用重组病毒rVN-EGFP进行抗H5N1亚型流感病毒药物筛选
本实施例利用实施例1构建得到的重组病毒rVN-EGFP，检测待测药物是否具有抗H5N1亚型流感病毒活性。其中，以现有的抗流感药物磷酸奥司他韦（达菲）作为为待检测的抗病毒药物，从而验证实施例1构建得到的重组病毒rVN-EGFP可用于进行抗H5N1亚型流感病毒药物筛选。具体操作如下：
（1）将MDCK细胞传24孔细胞板，第二天细胞长满后进行细胞计数，然后根据细胞计数结果对实施例1构建得到的重组病毒rVN-EGFP用DMEM培养基进行稀释，使100μL的病毒稀释液感染细胞后，达到1个PFU/细胞或者0.1个PFU/细胞，即按照以1.0MOI或0.1MOI的病毒量感染细胞。37℃5%CO2培养。
（2）用DMEM培养基对磷酸奥司他韦（达菲）进行系列稀释，使其终浓度分别达到0.25nM、0.5nM、1nM、2nM。
（3）在MDCK细胞吸附病毒1h后弃掉细胞上清，用PBS洗两遍，然后加入DMEM培养基（对照组）或步骤（2）配制的DMEM培养基稀释的磷酸奥司他韦（达菲）（药物组）。37℃5%CO2培养。
（4）在病毒感染细胞24h后，利用荧光显微镜观察细胞中EGFP的表达量，通过对比病毒对照组和药物组的细胞中EGFP的表达量差异，确定磷酸奥司他韦（达菲）是否具有抗H5N1病毒感染的活性：若药物组细胞中绿色荧光蛋白的表达量在统计学上显著低于（p<0.05）病毒对照组，则待测药物具有抗H5N1亚型流感病毒活性；反之，则待测药物不具有抗H5N1亚型流感病毒活性。
结果如图6所示。磷酸奥司他韦（达菲）在2nM时，重组病毒rVN-EGFP感染的MDCK细胞中EGFP表达量（绿色荧光强度）显著降低（p<0.05），这说明重组病毒rVN-EGFP的复制受到明显抑制，因此，磷酸奥司他韦（达菲）具有抗H5N1亚型流感病毒的活性，且对于MDCK细胞来说在2nM时效果较好。可见，实施例1构建得到的重组病毒rVN-EGFP可用于进行抗H5N1亚型流感病毒药物筛选，其结果准确可靠。
Claims (7)
1.重组H5N1亚型流感病毒，其特征在于：所述重组H5N1亚型流感病毒的基因组RNA由如下(a)和(b)中所述的8个独立的RNA片段组成：
(a)与野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1蛋白和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1蛋白和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1蛋白和NS2蛋白的RNA片段8；
(b)在所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’-非编码区序列前插入RNA片段A后得到的RNA片段6’；
所述RNA片段A的序列为序列表中序列9的第1368-2157位；
所述RNA片段6’的序列为序列表中序列9；
所述野生型H5N1亚型流感病毒为H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004毒株。
2.根据权利要求1所述的重组H5N1亚型流感病毒，其特征在于：所述RNA片段1的序列为序列表中序列1，所述RNA片段2的序列为序列表中序列2，所述RNA片段3的序列为序列表中序列3，所述RNA片段4的序列为序列表中序列4，所述RNA片段5的序列为序列表中序列5，所述RNA片段6的序列为序列表中序列6，所述RNA片段7的序列为序列表中序列7，所述RNA片段8的序列为序列表中序列8；
所述RNA片段6的5’-非编码区序列为序列6的第1371-1399位。
3.制备权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1或2所述RNA片段1、所述RNA片段2、所述RNA片段3、所述RNA片段4、所述RNA片段5、所述RNA片段6’、所述RNA片段7和所述RNA片段8，共8个RNA片段对应的cDNA序列分别克隆到pHW2000载体的多克隆位点，得到8个重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的8个重组表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到所述重组H5N1亚型流感病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述方法中，将所述8个重组表达载体共转染所述293T细胞时，所述8个重组表达载体为等质量混合。
5.权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒在如下(a1)或(a2)中的应用：
(a1)制备筛选抗H5N1亚型流感病毒药物的细胞模型；
(a2)制备研究H5N1亚型流感病毒感染机制的产品。
6.利用权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒检测待测药物是否具有抗H5N1亚型流感病毒活性的方法，包括如下步骤：
(b1)实验组：将MDCK细胞感染权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒，得到感染后MDCK细胞，向所述感染后MDCK细胞中加入待测药物；
对照组：与所述实验组相比，差别仅在于向所述感染后MDCK细胞中不加入所述待测药物；
(b2)将步骤(b1)的实验组和对照组分别孵育24h-72h，分别观察所述实验组和所述对照组的细胞中绿色荧光蛋白的表达量，按照如下方法确定所述待测药物是否具有抗H5N1亚型流感病毒活性：若所述实验组细胞中绿色荧光蛋白的表达量低于所述所述对照组，则所述待测药物具有抗H5N1亚型流感病毒活性；反之，则所述待测药物不具有抗H5N1亚型流感病毒活性。
7.如下(c1)和/或(c2)的生物材料：
(c1)含有权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒的离体动物细胞；
(c2)含有权利要求1或2所述重组H5N1亚型流感病毒的基因组cDNA的载体组合物，由如下8个重组表达载体组成：pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M、pHW2000-VN-NS和pHW-VN-NA-EGFP；
所述pHW2000-VN-PB2含有将序列1中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-PB1含有将序列2中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-PA含有将序列3中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-HA含有将序列4中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-NP含有将序列5中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-M含有将序列7中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；所述pHW2000-VN-NS含有将序列8中的U替换为T后得到的序列所示的DNA片段；
所述pHW-VN-NA-EGFP为在pHW2000载体的多克隆位点处正向插入如下序列后得到的重组质粒：将序列9中的U替换为T后得到的序列。
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