CN103305475B - 肠道病毒71基因修饰系统的建立及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠道病毒71型突变株及其应用。本发明所提供肠道病毒71型突变株，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA中编码2C蛋白的第25位氨基酸Ile的密码子替换为编码Val的密码子后得到的重组病毒。实验证明，本发明以痘苗病毒载体为基础，建立了EV71病毒的反向遗传学技术平台，构建得到了EV71病毒突变株，该突变株是很好的疫苗候选株。同时本发明对于从分子、细胞和动物三级水平开展EV71病毒致病机理的研究，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种肠道病毒71型基因修饰系统的建立及其突变株应用，特别涉及一种在野生型肠道病毒71型安徽分离株1基础上进行突变后得到的肠道病毒71型突变株。
背景技术
肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。自20世纪70年代发现肠道病毒71型，已有3次EV71引起的大范围手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）流行，每次都有死亡病例的发生。EV71病毒在学龄前儿童特别是5岁以下年龄组发病率最高，除引发一般的手足口病的临床症状外，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，给家庭和社会造成了沉重负担。
由于近年来手足口疾病疫情的持续暴发，因此，开展EV71病毒致病机制的研究和研制稳定、高效的EV-71病毒疫苗，一直是目前该研究领域的热点和重点。
目前，尚未有利用痘苗病毒载体反向遗传学技术研究EV71病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠道病毒71型突变株及其应用。
本发明所提供的肠道病毒71型突变株，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA中编码2C蛋白的第25位氨基酸Ile的密码子替换为编码Val的密码子后得到的重组病毒。
在本发明中，所述编码Val的密码子具体为GUG。
在本发明的一个实施例中，所述野生型肠道病毒71型具体为肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）。
所述肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组RNA反转录的cDNA序列为GenBank号为GQ994988.1的序列。
在本发明的一个实施例中，所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第45-7439位，即为将GenBank号为GQ994988.1的序列的第4148-4150位的AUC替换为GUG后得到的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述肠道病毒71型突变株的方法。
本发明所提供的制备所述肠道病毒71型突变株的方法具体可包括如下步骤：
（a）将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述肠道病毒71型突变株。
在上述方法中，所述野生型痘苗病毒具体可为野生型痘苗病毒WR株。
进一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1的序列。
在上述方法中，步骤（a）中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22）的第80267-80725位和第80726-81194位（对应序列1的第1-459位和第460-928位）的序列。
在上述方法中，在所述核苷酸片段A中，在所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列前，含有T7启动子相关序列。所述T7启动子相关序列具体可为序列表中序列2的第10-44位。
进一步，在本发明中，所述核苷酸片段A的序列为序列表中序列2。
在本发明的一个实施例中，制备所述肠道病毒71型突变株的方法具体包括如下步骤：
（a）将GenBank号为NC_006998.1的野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（Up date：2012-11-22）的第80267-80725位（对应序列1的第1-459位，命名为上游同源臂）和第80726-81194位（对应序列1的第460-928位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游（如酶切位点Sal I和Pst I之间）和下游（如酶切位点Not I和Sac II之间），得到重组质粒，将其命名为pGPT-in；
（b）用所述野生型痘苗病毒WR株感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒pGPT-in转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒WR株与所述重组质粒pGPT-in通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因插入到所述野生型痘苗病毒WR株中的GenBank号为NC_006998.1的序列的第80725位和第80726位（对应序列1的第459位和第460位）之间后得到的重组痘苗病毒载体，将其命名为v.v.-GPT-in；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒pGPT-in中的所述gpt基因替换为含有所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段（序列2），得到重组质粒，分别将其命名为pGPT-out-mut；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体v.v.-GPT-in感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒pGPT-out-mut，转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体v.v.-GPT-in与所述重组质粒pGPT-out-mut通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以含有所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段（序列2）替代所述重组痘苗病毒载体v.v.-GPT-in中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体，分别将其命名为V.V.-EV71-2C-mut；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体V.V.-EV71-2C-mut的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体V.V.-EV71-2C-mut的基因组的全长RNA；将所述全长RNA分别转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述肠道病毒71型突变株（EV71-Mut）。
在上述方法的步骤（e）中，所述培养转染后的细胞，具体为将所述转染后的细胞（BHK-21）与Vero细胞按照1：4的比例混合培养。之后，待细胞出现病变后，收集细胞培养物，感染新的Vero细胞，进而获得所述肠道病毒71型突变株（EV71-Mut）。
当然，在所述制备所述肠道病毒71型突变株的方法的基础上，将所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列替换为野生型肠道病毒71型（如肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China））基因组RNA反转录的cDNA序列，由此形成的肠道病毒71型拯救方法也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，为肠道病毒71型突变株（EV71-Mut）基因组编码的蛋白质，其氨基酸具体如序列表中序列3所示。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子具体可为如下1）-3）中任一DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2的第787-7368位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2的第10-7496位核苷酸所示的DNA分子；
3）序列表中序列2所示的DNA分子。
所述肠道病毒71型突变株或所述蛋白质或所述核酸分子在制备抗病毒疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
所述抗病毒疫苗具体可为手足口病疫苗；
所述手足口病疫苗具体可为肠道病毒71型引起的手足口病疫苗。
本发明的又一个目的是提供如下（b1）-（b3）任一中的生物材料：
（b1）含有所述肠道病毒71型突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA或cDNA的载体；
（b3）活性成分为所述肠道病毒71型突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的抗病毒（如肠道病毒，具体如肠道病毒71型）疫苗。
实验证明，本发明以痘苗病毒载体为基础，建立了EV71病毒的反向遗传学技术平台，构建得到了EV71病毒突变株，该突变株是很好的疫苗候选株。同时本发明对于从分子、细胞和动物三级水平开展EV71病毒致病机理的研究，具有重要意义。
附图说明
图1为痘苗病毒TK基因上下游同源序列的PCR扩增结果。其中，1为上游同源片段（L）；2为下游同源片段（R）；3为DNA Markers(DL2000)。
图2为EV71基因组全长cDNA扩增结果。其中，1为DNA Marker；2为EV71基因组全长cDNA扩增片段；3为含2C突变位点的EV71基因组全长cDNA扩增片段。
图3为重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的PCR检测结果。其中，1,2样品的模板为痘苗病毒WR株；4,5样品的模板为V.V.-GPT-in；3为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、7500bp、500bp、250bp、100bp）；1,4为引物vv L-up和GPT L的扩增产物；2,5为引物GPT R和vv R-down的扩增产物。
图4为重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的PCR扩增产物电泳结果。其中，1为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、bp）；2,3样品的模板为V.V.-EV71-inf-1；4,5样品的模板为V.V.-EV71-2C-mut；6样品的模板为V.V.-GPT-in；2,4,6为引物vv L-up和EV71L的扩增产物；3,5为引物EV71R和vv R-down的扩增产物。
图5为EV71-wt、EV71-res和EV71-2C-mut的一步生长曲线。wt:EV71-wt；res:EV71-res；mut:EV71-2C-mut。
图6为乳鼠染毒后临床观察结果。其中，Ａ：腹腔接种EV71-wt，接种量为3×105PFU/只；Ｂ：腹腔接种EV71-res，接种量为3×105PFU/只；Ｃ：腹腔接种EV71-mut，接种量为3×105PFU/只；D：正常对照，腹腔注射PBS，剂量1ml/只。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毒株、细胞与小鼠：
野生型痘苗病毒WR株（Vaccinia virus WR strain）：（参见文献：Thiel,V.,J.Herold,B.Schelle,and S.G.Siddell.2001.Infectious RNAtranscribed in vitro from a cDNA copyof the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.J.Gen.Virol.82:1273–1281.）。
肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）（Anhui1-09-China）：（参见文献：Chang Guohui,Lin Lei,Luo Yanjun,Cai Lijun,Wu Xiaoyan,Xu Hongmei,Zhu Qingyu.Sequence analysis of six enterovirus71strains with different virulences in humans.VirusResearch,2010,151:66–73）。
质粒pSV2-gpt（购自ATCC公司，产品目录号：37145TM）、CV-1细胞（购自ATCC，产品目录号：CCL-70）、BHK-21细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL-10）、D980R细胞（参见文献：Kerr,S.M.,and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase isnonessential for virus replication:recovery of plasmids from virus-infected cells.Virology，180:625–632.）、Vero细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL-81）。
Balb/c小鼠：2日龄，雌性，购自维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂和材料：
DMEM培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase，SuoerscriptⅢ反转录酶，脂质体（Lipofectamine2000）转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX RNAT7试剂盒购自Promega公司；Gelrite等均购自sigma公司；EagⅠ限制性内切酶购自NEB公司；RNeasy Mini Kit购自QIAGEN。
实施例1、肠道病毒71型突变株的构建
一、同源重组质粒的构建
1、重组质粒pGPT-in的构建及鉴定
将野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）的第80267-80725位（对应序列1的第1-459位，命名为上游同源臂）和第80726-81194位（对应序列1的第460-928位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-in。具体操作如下：
（1）野生型痘苗病毒WR株基因组DNA的提取
具体操作如下：
将野生型痘苗病毒WR株用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
提取痘苗病毒DNA，具体步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入对倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比为25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃冻存备用。
（2）引物的设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组cDNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）设计并合成如下两个引物对：
扩增上游同源臂的引物对：
vv L-up：5’-cttaacgatgttcttcgcagatg-3’（下划线粗体部分为酶切位点Sal Ⅰ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80267-80289位，即序列1的第1-23位）；
vv L-down：5’-gatgatgacaataaagaattaattattg-3’（下划线粗体部分依次为酶切位点Pst I和Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80699-80725位的反向互补序列，即序列1的第433-459位的反向互补序列）
扩增下游同源臂的引物对：
vv R-up：5’-ggaacggcggacatattcagttgataatc-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第80726-80753位，即序列1的第460-487位）
vv R-down：5’-tatctcggtttcctcacccaatcgt-3’（下划线粗体部分为酶切位点SacⅡ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_006998.1的第81170-81194位的反向互补序列，序列1的第904-928位的反向互补序列）
（3）重组质粒pGPT-in的构建及鉴定
以步骤（1）获得的野生型痘苗病毒WR株基因组DNA为模板，以步骤（2）设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂。
PCR扩增体系组成：
| DNA模板 | 2μl |
| dNTP mix（10mM） | 1μl |
| 引物vv L/R-up | 1μl |
| 引物vv L/R-down | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| Taq酶 | 1μl |
| 无核酸酶水 | 40μl |
| 总体积 | 50μl |
扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增25个循环，最后72℃延伸10min。
扩增反应结果：扩增出目的片段，大小约为500bp（上游同源臂：480bps；下游同源臂：484bps），结果如图1。
首先用限制性内切酶Not I和SacⅡ双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的质粒pSV2-gpt大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶SalⅠ和Pst I双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2-gpt质粒的酶切位点Not I和Sac Ⅱ之间插入了GenBank号为NC_006998.1（Up date：2012-11-22）的序列的第80726-81194位核苷酸（对应序列1的第460-928位），同时在酶切位点SalⅠ和Pst I之间插入了“GenBank号为NC_006998.1（Up date：2012-11-22）的序列的第80267-80725位（对应序列1的第1-459位）+gcggccgcc”的核苷酸序列的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-in。
2、重组质粒pGPT-out-wt和pGPT-out-mut的构建及鉴定
（1）EV71病毒全基因组cDNA序列的获得
从肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）中提取其基因组RNA，并反转录得到cDNA（GenBank号：GQ994988.1，Up date：2010-5-18），同时在两端添加上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取肠道病毒71型（EV71）安徽分离株1（Anhui1-09-China）的RNA，通过RT-PCR技术，用Invitrogen公司SuperscriptⅢ反转录酶进行反转录，扩增病毒基因。
A.配制反转录酶反应体系如下：
EV71down：5’-gccacggtggccttaattaatttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’（粗体下划线部分为Not I的识别序列，其余为添加序列的反向互补序列，整个序列为序列2的第7440-7505位的反向互补序列）
B.向上述体系中补加以下成分：
| 5×反应缓冲液 | 4μl |
| 0.1M DTT | 1μl |
| RNase抑制剂 | 1μl |
| Superscript Ⅲ反转录酶 | 1μl |
混匀后，55℃扩增反应1h，70℃加热15min进行酶失活。
补加1μl的RNase抑制剂，37℃作用20min。收集反应物，-20℃保存备用。
C.以上述反转录产物为模板，以引物EV71up和EV71down进行PCR扩增。
EV71up：
5’-gcccgacgtcgagctctaatacgactcactatagggTTAAAACACCCTGTGGGTTGCACC-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，该序列的第10-44位为T7启动子相关序列，其后大写字母部分为GenBank：GQ994988.1第1-24位，该序列也与序列2的第1-68位一致）
EV71down：
5’-gccacggtggccttaattaatttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其余为添加序列的反向互补序列，整个序列为序列2的第7440-7505位的反向互补序列）
EV71基因组全长cDNA的扩增反应如下：
反应体系组成：
| EV71cDNA模板 | 2μl |
| dNTP mix（10mM） | 1μl |
| 引物EV71up | 1μl |
| 引物EV71down | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| Taq酶 | 1μl |
| 无核酸酶水 | 40μl |
| 总体积 | 50μl |
反应条件：
94℃,2min；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,7min，5个循环；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,4min，20个循环；
72℃,10min；
4℃,保存。
反应结束后，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（7505bp），如图2中的泳道2所示。将回收的目的条带送样测序。测序结果显示，PCR产物具有GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）。
（2）2C蛋白第25位点突变（Ile：AUC4148-4150/Val：GUG4148-4150）的EV71病毒全基因组cDNA序列的获得
以步骤（1）获得的PCR产物（带有相应酶切位点及polyA尾巴的EV71病毒基因组序列）为模板，通过重叠延伸PCR获得2C蛋白第25位点突变（Ile：AUC4148-4150/Val：GUG4148-4150）的EV71病毒基因组序列，具体操作如下：
引物设计：
EV71-mut-up：5’-ttagagtgggtttccaacaagagcaaatttattg-3’（引物序列位于GenBank：GQ994988.1第4127-4163位，也与序列2的第4171-4207位一致，粗体序列为突变位点处）
EV71-mut-down：5’-ttaagccaatcaataaatttgctcttgttgg-3’（引物序列位于GenBank：GQ994988.1第4140-4173位，也与序列2的4184-4217位一致，粗体序列为突变位点处）
第一次PCR扩增反应：
反应体系组成：
| EV71cDNA模板 | 2μl |
| dNTP mix（10mM） | 1μl |
| 引物EV71up | 1μl |
| 引物EV71-mut-down | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| Platinum Pfx DNA Polymerase(2.5U/μl) | 0.4μl |
| 无核酸酶水 | 40μl |
| 总体积 | 50μl |
反应条件：
94℃,2min；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,4min，5个循环；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,2.5min，20个循环；
72℃,10min；
4℃,保存。
第二次PCR扩增反应：
反应体系组成：
| EV71cDNA模板 | 2μl |
| dNTP mix（10mM） | 1μl |
| 引物EV71-mut-up | 1μl |
| 引物EV71down | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| Platinum Pfx DNA Polymerase(2.5U/μl) | 0.4μl |
| 无核酸酶水 | 40μl |
| 总体积 | 50μl |
反应条件：
94℃,2min；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,4min，5个循环；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,2.5min，20个循环；
72℃,10min；
4℃,保存。
第三次PCR扩增反应：
反应体系组成：
| 第一次PCR扩增产物 | 1μl |
| 第二次PCR扩增产物 | 1μl |
| dNTP mix（10mM） | 1μl |
| 引物EV71up | 1μl |
| 引物EV71down | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| Platinum PfxDNA Polymerase(2.5U/μl) | 0.4μl |
| 无核酸酶水 | 40μl |
| 总体积 | 50μl |
反应条件：
94℃,2min；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,7min，5个循环；
94℃,15Sec，55℃,30Sec，72℃,4min，20个循环；
72℃,10min；
4℃,保存。
三次PCR反应结束后，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（7505bp），如图2中的泳道3所示。将回收的目的条带送样测序。测序结果显示，PCR产物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，将GenBank号为GQ994988.1的野生型肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列（Up date：2010-5-18）的第4148-4150位的ATC成功的突变为了GTG（Ile：AUC4148-4150/Val：GUG4148-4150）。
（3）重组质粒pGPT-out-wt和pGPT-out-mut的构建及鉴定
A.重组质粒pGPT-out-wt的构建及鉴定
用限制性内切酶Not I酶切步骤（1）获得的PCR产物（带有相应酶切位点的EV71病毒基因组序列），将其与经过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT-in的载体大片段相连，获得重组质粒。将经测序表明将重组质粒pGPT-in的两个Not I酶切位点之间的gpt基因取代为（且为正向插入）DNA片段甲的重组质粒命名为pGPT-out-wt；DNA片段甲为在序列表中序列2的第10-7496位核苷酸基础上将第4192-4194位的GTG替换为ATC后的DNA片段。
B.重组质粒pGPT-out-mut的构建及鉴定
用限制性内切酶Not I酶切步骤（2）获得的PCR产物（带有相应酶切位点的EV71病毒突变基因组序列），将其与经过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT-in的载体大片段相连，获得重组质粒。将经测序表明将重组质粒pGPT-in的两个Not I酶切位点之间的gpt基因取代为（且为正向插入）序列表中序列2的第10-7496位核苷酸所示的DNA片段的重组质粒命名为pGPT-out-mut。
二、重组痘苗病毒的构建
1、重组痘苗病毒V.V-GPT-in的构建及鉴定
（1）GPT-in同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90%，感染野生型痘苗病毒WR株（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT-in转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-IN同源重组细胞培养物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阳性筛选
GPT阳性的DMEM培养基（pH7.0）：由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培养基组成；所述霉酚酸在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为250μg/ml。
2×MEM培养基（pH7.0）：将100ml10×MEM、10ml100×MEM非必需氨基酸和100ml胎牛血清混合后，用水定容至500ml。
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至80%汇合度时，换成GPT阳性的DMEM培养基继续培养24h。
取上述步骤（1）获得的GPT-in同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阳性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阳性的DMEM培养基中培养的CV-1细胞（MOI=1），37℃吸附1h。其间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃，且在2×MEM培养基中加入GPT阳性筛选药物（霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2×MEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为250μg/ml）。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25%Gelrite和加入了GPT阳性筛选药物的2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温防治3-5min，待其凝固后，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组痘苗病毒V.V-GPT-in，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V-GPT-in的鉴定
A.引物设计
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_006998.1，Update：2012-11-22）及GPT基因序列设计鉴定引物如表1。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表1重组痘苗病毒V.V-GPT-in的PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| vv L-up（上游引物） | GTCGACCTTAACGATGTTCTTCGCAGATG | NC_006998.1的第80267-80289位 |
| GPT L（下游引物） | CACACCTCCCCCTGAACCTGAA | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠左侧 |
| GPT R（上游引物） | GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC | 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠右侧 |
| vv R-down（下游引物） | CCGCGGTATCTCGGTTTCCTCACCCAATCGT | NC_006998.1的第81170-81194位 |
B.重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的PCR检测
为了鉴定野生型痘苗病毒WR株的基因组内相应序列（序列1）与gpt基因的重组情况，以已纯化的相应重组痘苗病毒V.V.-GPT-in的DNA为模板，分别以两对引物vv L-up和GPT L、GPT R和vv R-down进行PCR检测反应。同时设置以野生型痘苗病毒WR株的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min，反应30个循环；68℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图3所示，以引物对vv L-up和GPT L、GPT R和vv R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V.-GPT-in均扩增出相应的目的条带（图3中泳道4，5），而作为对照的野生型痘苗病毒WR株无目的条带（图3中泳道1，2）。以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V-GPT-in构建成功。
2、重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的构建及鉴定
再次通过感染-转染CV-1细胞，使重组痘苗病毒V.V-GPT-in分别与重组质粒pGPT-out-wt（或pGPT-out-mut）通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coligpt基因作为阴性筛选标记，利用蚀斑纯化，最终获得分别以EV71病毒基因组序列的DNA片段（在序列表中序列2的第10-7496位核苷酸基础上将第4192-4194位的GUG替换为ATC后的DNA片段）或含有2C蛋白25位点突变的EV71病毒基因组序列的DNA片段（序列2）替代重组痘苗病毒载体V.V-GPT-in中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体V.V.-EV71-inf-1或V.V.-EV71-2C-mut。具体操作如下：
（1）GPT-out同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90%汇合度，感染步骤1制备的重组痘苗病毒V.V-GPT-in（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT-out-wt和pGPT-out-mut分别转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，分别得到pGPT-out-wt同源重组细胞培养物和pGPT-out-mut同源重组细胞培养物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阴性筛选
GPT阴性的DMEM培养基（pH7.0）：由6-硫鸟嘌呤和DMEM培养基组成；所述6-硫鸟嘌呤在GPT阴性的DMEM培养基中的终浓度为0.5μg/ml。
将D980R细胞按照1：6的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至60-70%汇合度时，换成GPT阴性的DMEM培养基继续培养6h。
取上述步骤（1）获得的pGPT-out-wt同源重组细胞培养物和pGPT-out-mut同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阴性的DMEM培养基稀释10倍，分别感染上述在GPT阴性的DMEM培养基中培养的D980R细胞（MOI=1），37℃吸附1h。待吸附完成后，吸除病毒液，每孔补加GPT阴性DMEM培养基3ml，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，分别获得已纯化的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1（对应重组质粒pGPT-out-wt）和V.V.-EV71-2C-mut（对应重组质粒pGPT-out-mut），于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的鉴定
A.引物设计
根据EV71病毒基因组序列、含有位点突变的EV71病毒基因组序列的DNA片段（序列2），及GPT基因序列设计鉴定引物如表2。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表2重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的PCR鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 位置 |
| vv L-up（上游引物） | GTCGACCTTAACGATGTTCTTCGCAGATG | NC_006998.1的第80267-80289位 |
| EV71L（下游引物） | TACTAACTAGCTCAGTAGACTC | 序列2的466-487位 |
| EV71R（上游引物） | TGCAGATAAGTCTCCTTGC | 序列2的7050-7068位 |
| vv R-down（下游引物） | CCGCGGTATCTCGGTTTCCTCACCCAATCGT | NC_006998.1的第81170-81194位 |
B.重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的PCR检测
为了EV71基因组内相应序列对gpt基因的取代情况，以纯化的相应重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1（或V.V.-EV71-2C-mut）的DNA为模板，分别以引物对vv L-up和EV71L、EV71R和vv R-down进行PCR反应。同时设置以重组痘苗病毒V.V-GPT-in的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：
PCR反应条件如下：
94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min反应30个循环；68℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图4所示，以引物对vv L-up和EV71L、EV71R和vv R-down进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut均扩增出相应的目的条带（图4中泳道2-5），而作为对照的野生型痘苗病毒WR株无目的条带（图4中泳道6）。以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut构建成功。
三、肠道病毒71型拯救株和突变株的构建及鉴定
分别提取步骤二中纯化并鉴定正确的V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut重组痘苗病毒的DNA，进行体外转录，分别获得EV71-inf-1和EV71-2C-mut的RNA，通过脂质体（Lipofectamine2000）转染BHK-21细胞，培养转染后细胞，可从中分别收获EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株。实际操作中，再将转染的BHK-21细胞与Vero细胞按1：4混合，按适量密度接种6孔板，继续培养，直至观察到EV71特异性的细胞病变，收取培养上清，分别得到EV71-res和EV71-2C-mut的第一代病毒液。对收取的病毒液进行测序分析，比较EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）野生型病毒的基因序列，再次对同源重组进行确认分析。具体操作如下：
1、重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut基因组DNA的提取
分别将重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
提取病毒DNA，具体操作步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃冻存备用。
DNA纯度=A260/A280=2.0，浓度达2000ng/μl。
2、体外转录
分别取上述步骤1提取的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的基因组DNA（约10μg），加入50μl10×NEB Buffer3和100U Eag I内切酶，加水补足体积至500μl；混匀后，于37℃酶切2h。经酚/氯仿/异丙醇（体积比25:24:1）抽提后，加入2.5倍体积的污水乙醇沉淀，13000rpm离心15min，弃上清，加0.5ml70%乙醇洗涤，13000rpm离心15min，吸除上清液，加入20μl无核酸酶的水，获得酶切回收的DNA，-20℃保存备用。以上述酶切回收的DNA为模板，用Promega公司RiboMAX RNAT7试剂盒进行体外转录反应，分别得到V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的RNA，于-80℃保存备用。
3、RNA转染及EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株的获得
将长至汇合度为100%的BHK-21细胞按1:15的比例接种到六孔板，于常规条件下培养。当细胞长至汇合度为80-90%时，进行RNA的转染。取12μl的Lipofectamine2000，稀释于100μl的Opti-MEM中，另取步骤2得到的重组痘苗病毒V.V.-EV71-inf-1和V.V.-EV71-2C-mut的RNA溶液45μl稀释于100μl的Opti-MEM中，室温静置10min后，将两者轻轻混匀，静置20min，然后将转染混合物用Opti-MEM补足到1ml；吸出BHK-21细胞原有培养液，用Opti-MEM清洗六孔板内BHK-21细胞，然后将转染液加到六孔板待转染孔中，并将细胞于37℃细胞培养箱中培养6h。6h后弃掉含转染试剂的培养液，加入3ml DMEM培养液，37℃、5%CO2恒温培养箱继续培养24h。
将长至汇合度为100%的Vero细胞按1:10的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃、5%CO2条件下培养，使其在BHK-21细胞转染24h后，刚好长至汇合度为100%。将Vero细胞及转染后的BHK-21细胞用胰酶消化后，按4：1比例混合，接种至75cm2细胞培养瓶中，33℃，5%CO2恒温培养箱进行培养，并观察细胞病变（CPE）。待细胞出现病变后收集细胞培养物，-70℃保存、备用。
Vero细胞按1:8的比例接种至6孔板内，于37℃、5%CO2条件下培养，至细胞90%时进行病毒感染。
将病变细胞培养物冻融3次后，用DMEM完全培养基将病毒液分别作10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6等10倍梯度稀释，移除Vero细胞六孔板原有的培养基，取病毒稀释液感染六孔板Vero细胞（1ml/孔），37℃孵育2h；期间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃；待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将0.25%Gelrite和2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加到六孔板各孔中；室温放置3-5min，待其凝固后，置于37℃培养箱继续培养，直至观察到明显蚀斑。挑取单个蚀斑，-70℃保存备用。
如上方法，进行3-4次蚀斑纯化，即可分别获得较纯的相应EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株。
4、EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株的扩增
Vero细胞按1:8的比例接种至75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长至汇合度为90%时，分别感染步骤3所得的蚀斑纯化后的EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株，进行增殖，待细胞100%病变后，收取感染细胞培养混合物，即可分别获得大量的EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株。
5、EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株基因组的鉴定
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒分别提取步骤4获得EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株的RNA，通过RT-PCR技术，用Invitrogen公司SuperscriptⅢ反转录酶进行反转录，扩增病毒基因，通过序列测定，分别完成EV71-res拯救株和EV71-2C-mut突变株与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）基因序列的比对。
（1）配制反转录酶反应体系如下：
EV71down：5’-ggcggccgcccacggtggccttaattaatttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’（EV71病毒PolyA尾巴等添加序列的反向互补序列，即序列2的第7440-7505位的反向互补序列）
（2）向上述体系中补加以下成分：
| 5×反应缓冲液 | 4μl |
| 0.1M DTT | 1μl |
| RNase抑制剂 | 1μl |
| SuperscriptⅢ反转录酶 | 1μl |
混匀后，55℃扩增反应1h，70℃加热15min进行酶失活。
补加1μl的RNase抑制剂，37℃作用20min。收集反应物，-20℃保存备用。
（3）以上述反转录产物为模板，以引物EV71up：5’-gcccgacgtcgagctctaatacgactcactatagggTTAAAACACCCTGTGGGTTGCACC-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I识别序列，第10-44位为T7启动子相关序列，其后大写字母部分为GenBank：GQ994988.1第1-24位，该序列与序列2的第1-68位一致）和引物EV71down：5’-gccacggtggccttaattaatttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-3’（下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其余为添加序列的反向互补序列，即序列2的第7440-7505位的反向互补序列）进行PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（约7505bp），送样测序。将测序结果与野生型EV71病毒安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列进行比对，再次对同源重组进行确认分析。结果显示：与野生型EV71病毒安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组cDNA序列相比，EV71-res拯救株的基因组序列与其完全一致，而EV71-2C-mut突变株基因组的cDNA序列将野生型EV71病毒安徽分离株1（Anhui1-09-China）cDNA序列（GenBank号：GQ994988.1，Up date：2010-5-18）的第4148-4150位的ATC突变为GTG（对应序列2的第4192-4194位）。
实施例2、EV71-2C-mut突变株的生物学活性检测
一、EV71-2C-mut突变株的细胞水平评价（病毒一步生长曲线的测定）
用实施例1制备的EV71-2C-mut突变株感染（MOI=1）Vero细胞，37℃吸附1h后，移除病毒液，用DMEM清洗细胞3次，以去除残留的未感染病毒，然后于33℃用含有10%（体积百分含量）FBS的DMEM培养细胞。于感染后0-24h内不同时间点（0、2、4、6、8、10、12、24h）收取病毒，对收取病毒在37℃进行蚀斑分析以测定其病毒滴度（PFU/ml），进而绘制一步生长曲线。实验同时以野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）和EV71-res拯救株作为对照，检测EV71-2C-mut突变株与其一步生长曲线的差异。实验重复三次。
测定结果如图5所示，各株病毒的一步生长曲线表明：EV71拯救株（EV71-res）和EV71突变株（EV71-2C-mut）的复制周期和病毒的最高滴度，与EV71野生型安徽分离株1（Anhui1-09-China），没有显著差异。
二、EV71-2C-mut突变株的动物水平评价
在动物水平上，对实施例1制备的EV71-2C-mut突变株的毒力进行分析，如下：
将50只2日龄的雌性Balb/c小鼠随机分为4组，A组：野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）（EV71-WT）组（20只）；B组：EV71-res拯救株（20只）；C组：EV71-2C-mut突变株组（20只）；D组：PBS对照组（10只）。
每组的接种方案如表3所示。接种方式为腹腔注射，四组均为单次注射，每次注射剂量均为1.0ml。
表3各组小鼠的接种方法
| 组别 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 接种毒株 | EV71-wt | EV71-res | EV71-2C-mut | PBS |
| 病毒滴度 | 3×105PFU/ml | 3×105PFU/ml | 3×105PFU/ml | 1.0ml |
注：A-C组中的EV71-wt或EV71-res或EV71-2C-mut的液体环境均为PBS。
感染后，观察各组小鼠的精神状态、测量体重，并统计发病率和死亡率。
结果显示，染毒7天后，EV71-wt组和EV71-res组被感染的乳鼠均出现：精神萎靡、体重减轻、行走不稳等症状，12天后，感染EV71-wt和EV71-res的乳鼠全部死亡；EV71-2C-mut组的试验乳鼠7天后，仅有20%的发病率，12天后症状均减轻，无乳鼠死亡；PBS对照组乳鼠正常，如图6。各组小鼠的发病率和死亡率的统计结果如表4所示。
表4各组乳鼠发病及死亡情况统计
综合本实施例的实验结果，与野生型EV71安徽分离株1（Anhui1-09-China）相比，在体外复制能力方面，EV71-2C-mut突变株与其并无显著差别，但在致病力方面，EV71-2C-mut突变株明显减弱，表明EV71-2C-mut突变株是一株很有开发前景的减毒活疫苗候选株。
Claims (18)
1.肠道病毒71型突变株，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA中编码2C蛋白的第25位氨基酸Ile的密码子替换为编码Val的密码子后得到的重组病毒；
所述野生型肠道病毒71型为肠道病毒71型安徽分离株1。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型突变株，其特征在于：所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第45-7439位。
3.制备权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株的方法，包括如下步骤：
(a)将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
(b)用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
(c)将步骤(a)中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有权利要求1或2中所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段，
(d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
(e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述肠道病毒71型突变株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述野生型痘苗病毒为野生型痘苗病毒WR株。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤(a)中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列的第80267-80725位和第80726-81194位。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述核苷酸片段A中，在所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列前，含有T7启动子相关序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述T7启动子相关序列为序列表中序列2的第10-44位；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述核苷酸片段A的序列为序列表中序列2的第10-7496位。
9.蛋白质，其氨基酸如序列表中序列3所示。
10.编码权利要求9所述蛋白质的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-3)中任一DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2的第787-7368位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2的第10-7496位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子。
12.权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株，或权利要求9所述蛋白质，或权利要求10或11所述核酸分子在制备抗病毒疫苗中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述抗病毒疫苗为抗肠道病毒疫苗。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述抗肠道病毒疫苗为抗肠道病毒71型疫苗。
15.含有权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株，或权利要求9所述蛋白质，或权利要求10或11所述核酸分子的离体动物细胞。
16.含有权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株，或权利要求9所述蛋白质，或权利要求10或11所述核酸分子的重组菌。
17.含有权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA或cDNA的载体。
18.活性成分为权利要求1或2所述肠道病毒71型突变株，或权利要求9所述蛋白质，或权利要求10或11所述核酸分子的抗病毒疫苗。
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| Sequence analysis of six enterovirus71strains with different virulences in humans;Chang Guohui ET AL.;《Virus Research》;20100414(第151期);第66–73页 * |
| Thiel,V. ET AL..Infectious RNAtranscribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.《J.Gen.Virol.》.2001,(第82期),第1273–1281页. * |
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