CN111308071A - 解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂及抗原含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂及抗原含量检测方法。所述解吸附剂为柠檬酸钠溶液，并包含一种稳定蛋白构象并增加检测特异性的非离子型表面活性剂。本发明的解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂不但能够很好的解吸附，同时病毒抗原结构不受影响或者几乎不受影响，完整保持了其免疫原性。

Description

解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂及抗原含量检测 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及森林脑炎和出血热灭活疫苗中氢氧化铝佐剂的解吸附剂及其抗原含量检测方法。

背景技术

森林脑炎病毒抗原、肾综合征出血热病毒抗原是森林脑炎和肾综合征出血热疫苗中的主要有效成分，其有效含量与疫苗接种后的保护效果直接相关，因此，其抗原含量是森林脑炎、肾综合征出血热灭活疫苗质量控制中的一项重要检测指标。

森林脑炎病毒呈球形，直径为30～40nm，衣壳二十面体对称外有包膜，含血凝素糖蛋白E，是病毒的重要抗原成分，包含有中和抗原表位和型特异性抗原表位，决定了病毒的细胞嗜性和毒力，与病毒的吸附、穿入、致病等作用密切相关，并且具有血凝活性，能刺激机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，其结构的完整性代表了疫苗的有效性。

肾综合征出血热病毒属于汉坦病毒属，单负链RNA，基因组分为L、M、S三个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣壳蛋白(NP)。肾综合征出血热病毒颗粒表面有脂质双层包膜，包膜表面有Gn和Gc糖蛋白构成的突起。Gn和Gc糖蛋白上均有中和抗原位点和血凝活性位点，能够刺激机体产生特异性抗体，是主要的抗原决定簇。其结构的完整性代表了疫苗的有效性。

带有包膜病毒颗粒不稳定，易受到外界环境条件的影响，比如温度、紫外线、有机溶剂等，从而使病毒颗粒包膜受到破坏，导致免疫原性下降，无法通过酶联免疫(ELSIA)进行抗原定量。

目前国内临床接种应用的带有氢氧化铝佐剂的包膜病毒抗原疫苗主要为森林脑炎和双价肾综合征出血热疫苗。森林脑炎、肾综合征出血热疫苗中的抗原为灭活病毒，为使接种者更有效的获得免疫，需要加入氢氧化铝佐剂制备成吸附型疫苗，诱导机体对病毒抗原产生更强的免疫反应。氢氧化铝佐剂与抗原表面携带的电荷基团发生共价或配位结合，以颗粒的方式包裹抗原，与抗原一起形成可溶性大颗粒，增加病毒结构复杂性，从而使复合物更具免疫原性。氢氧化铝佐剂与病毒的结合屏蔽了抗原表面的特异性结合位点，进而在抗原的ELSIA检测过程中，无法与酶联反应板或酶标抗体上的特异性抗体相结合，从而导致抗原无法检出。针对这一类吸附疫苗还没有成熟的抗原含量检测方法，特别是对吸附森林脑炎、肾综合征出血热疫苗的病毒抗原检测，也未见文献报道。

为了能够准确测定吸附疫苗中的病毒抗原，需要首先解离抗原与铝盐佐剂之间的相互作用力，使抗原先从佐剂上解离下来，重新暴露出抗原表面上相应的抗原决定簇，再采用酶联免疫吸附法对其进行检测。据文献报道，部分金属离子螯合剂、表面活性剂、有机酸、无机碱等物质可以针对性破坏抗原与佐剂之间的相互作用力，达到解离抗原的目的。其中主要有十六烷基磺酸钠，Triton-100，盐酸胍、碳酸氢钠和磷酸根离子等作为铝盐佐剂解吸附剂，其作用机理可能是通过解离液与铝佐剂相互作用，破坏与抗原之间的相互作用力，从而使病毒抗原解离下来。但是，几乎所有解吸附剂都会或多或少的对蛋白质的结构造成破坏，引起蛋白质变性，特别对包膜病毒，极易受到化学试剂、pH和温度的影响，导致其结构被破坏，从而无法进行检测。研究表明，使用7.5％的碳酸氢钠溶液或浓度为1-5％的十二烷基磺酸钠溶液对铝佐剂吸附森林脑炎、肾综合征出血热灭活疫苗处理2小时，对其病毒抗原表面的特异性蛋白结构造成损害，导致抗原无法检出。罗翀等(一种处理液以及采用其测定铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法)采用磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，并包含蛋白质以及一种或多种酸和/或它们的盐作为解吸附剂对乙型脑炎疫苗中的氢氧化铝佐剂进行处理，成功检测了乙脑病毒抗原。

发明内容

有必要针对森林脑炎、肾综合征出血热抗原等带有包膜病毒的疫苗与铝佐剂之间的吸附特点，开发一种新型解吸附剂，使其可以破坏抗原与佐剂之间较强的配位交换作用力、疏水作用力以及静电吸引力，解离98％以上的抗原，同时保持病毒结构的完整性，可以通过ELSIA法对解离后的森林脑炎、肾综合征出血热病毒抗原进行定量检测。为解决上述技术问题，本发明主要通过以下技术方案实现：

一方面，本发明提供一种用于解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂，所述处理液为柠檬酸钠溶液，并包含一种稳定蛋白构象并增加检测特异性的非离子型表面活性剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的非离子型表面活性剂为吐温，优选为吐温20。本发明所使用的吐温20能够有效破坏森林脑炎和双价肾综合征出血热疫苗中铝佐剂和病毒颗粒之间的作用力，并能够保持病毒颗粒的完整性，方便进行抗原检测。

在本发明的一个优选实施方式中，所述解吸附剂的柠檬酸盐溶液的浓度为8-16％(w/v)，其pH为7.0-8.5；pH进一步优选为8.0。本发明通过控制解吸附剂的pH在适当范围，有助于进一步保持疫苗活性。

在本发明的一个优选实施方式中，所述解吸附剂含有0.1～0.4(w/w)％吐温20。

在本发明的一个优选实施方式中，所述解吸附剂不含有其他外源蛋白成份，由此使得检测干扰因素少。

本发明另一方面还涉及上述解吸附液的应用，所述的应用是用于对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗中的抗原与铝佐剂进行解吸附处理。

另一方面，本发明涉及一种用于检测铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法，所述方法包括：采用本发明提供的上述解吸附液处理待检测疫苗。优选地，将待检测疫苗与所述解吸附剂充分混匀后孵育，该孵育条件为30-37℃；非水浴，为气浴加热的恒温培养箱。优选的，所述铝盐为氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的待测疫苗是带有氢氧化铝佐剂的包膜病毒抗原疫苗。

进一步的，所述带有氢氧化铝佐剂的包膜病毒抗原疫苗为森林脑炎和双价肾综合征出血热疫苗。优选的，所述待检测疫苗用pH7.2～8.0的0.01M磷酸盐缓冲液配制成抗原含量为1:16～1:128的疫苗溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还包括针对被解吸附的抗原通过酶联免疫吸附法或电泳方法对其含量进行测定。

本发明的解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂不但能够很好的解吸附，同时病毒抗原结构不受影响或者几乎不受影响，完整保持了其免疫原性。本发明的用于检测铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法具有重复性强、准确度及精密度高的特点，可以为氢氧化铝佐剂吸附型森林脑炎和肾综合征出血热疫苗中的质量控制提供参考。

具体实施例

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施案例中所用的吸附型森林脑炎、肾综合征出血热疫苗样品均为长春生物制品研究所有限责任公司生产；试剂均为市售；酶联免疫森林脑炎、肾综合征出血热病毒检测试剂盒与阳性对照品均为市售产品。

实施例1：

(1)将抗原含量为1﹕32的森林脑炎病毒或抗原含量为1﹕128出血热病毒与0.5mg/ml的氢氧化铝充分混合，最后加入终浓度为0.1％的人血白蛋白作为疫苗稳定剂；

(2)采用酶联免疫吸附法检测步骤(1)得到的混合液中的抗原含量，检测结果为阴性，证明所有抗原被氢氧化铝吸附完全(详见表1、2)。

表1：森林脑炎病毒吸附氢氧化铝佐剂前、后抗原检测结果

表2：肾综合征病毒吸附氢氧化铝佐剂前、后抗原检测结果

(3)配制解吸附剂：用柠檬酸钠配制8～16％的柠檬酸钠溶液，然后向该溶液中加入一定量的吐温-20，使其终浓度为0.2％，调溶液pH值为8.0。

(4)采用解吸附剂处理疫苗样品：将步骤(1)中待检样品与pH7.0～8.0的柠檬酸钠溶液等体积混合，充分混匀后在37℃恒温条件下孵育72小时。

(5)采用酶联免疫吸附法检测步骤(4)上清中抗原含量；

(5-1)上样：向已包被森林脑炎、肾综合征出血热病毒单克隆抗体的96孔微孔板中依次加入阴性对照品、阳性参考品、待测样品。阴性对照品，阳性参考品和待测样品均再做一个平行孔，37℃孵育1小时；

(5-2)用样品洗涤液洗净微孔板，每孔加入100μl酶标记森林脑炎、肾综合征出血热病毒抗体工作液，置于37℃水浴孵育45min；

(5-3)用洗涤液洗净微孔板3次，依次加入50μl TMA显色液，50μl TMB显色液，置于37℃水浴孵育15min；

(5-4)每孔加入50μl 2N硫酸终止反应；

(5-5)将微孔板震荡混匀，置于酶标仪上，进行450nm和630nm双波长检测，得到样品的吸光度。

本发明比较了不同浓度柠檬酸钠的解吸附效果，并以其中一种浓度为例说明了处理条件以及解吸附剂中一些关键组成成分的最优浓度范围。并且对该方法的重复性及精密度进行了分析：由同一实验人员对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗样品同时进行三次试验的抗原含量检测，结果无明显差异；由三名实验人员对森林脑炎、出血热疫苗样品进行抗原含量检测，结果无显著差异，表明本发明方法的重复性高，精密度高。不同浓度柠檬酸钠与相同浓度的Tween-20对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗的解吸附效果无显著差异(结果详见表3、4)。表3：不同浓度柠檬酸钠对森林脑炎疫苗解吸附效果的影响

表4：不同浓度柠檬酸钠对肾综合征出血热疫苗解吸附效果的影响

本发明比较了有、无Tween-20条件下的解吸附效果。该研究以其中浓度优化后的柠檬酸钠与含有和不含有Tween-20，在一定的温度条件下确定Tween-20在解吸附中作用。检测结果显示，在单纯的柠檬酸钠不能够有效的解离森林脑炎和出血热疫苗中的氢氧化铝佐剂，而加入一定量的Tween-20的混合液解离疫苗后，能够完全检测到其抗原成份。结果表明Tween-20在解吸附剂中起到比较关键的作用(结果详见表5、6)。

表5：有、无Tween-20的解吸附剂对森林脑炎疫苗解吸附作用结果

表6：有、无Tween-20的解吸附剂对出血热疫苗解吸附作用结果

本发明比较了不同浓度Tween-20条件下的解吸附效果。并以其中浓度优化后的柠檬酸钠与不同浓度的Tween-20配制而成的解吸附剂，对森林脑炎和出血热疫苗中的氢氧化铝佐剂进行解离。并且对该方法的重复性及精密度进行了分析。不同浓度的Tween-20的解吸附剂所解离的病毒抗原量有差异，从而优化了Tween-20的使用浓度(结果详见表7、8)。

表7：不同浓度Tween-20的解吸附对森林脑炎疫苗解吸附作用结果

表8：不同浓度Tween-20的解吸附对出血热疫苗解吸附作用结果

本发明还比较了不同温度条件下解吸附效果。主要说明对样品进行不同温度条件下，使待检测样品中的森林脑炎、肾综合征出血热抗原解吸达到最佳条件下的最佳温度。(结果详见表9、10)。

表9：不同温度条件下对森林脑炎疫苗解吸附效果的影响

表10：不同温度条件下对肾综合征出血热疫苗解吸附效果的影响

结果分析：在不同温度条件下，本发明所述解吸附剂对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗的解吸附效果，通过对解吸附后上清中抗原含量和OD值的分析，37℃效果最佳。

本发明还比较了气浴和水浴条件下解吸附效果的区别。主要说明对样品进行气浴或水浴加热时，使待检测样品中的森林脑炎、肾综合征出血热抗原解吸附的最佳时间和最佳温度条件下的处理方式。(结果详见表11、12)。

表11：相同条件下气浴和水浴对森林脑炎疫苗解吸附效果的影响

表12：相同条件下气浴和水浴对肾综合征出血热疫苗解吸附效果的影响

结果分析：本发明中涉及到解离环境的确认，通过实验研究发现，分别在气浴和水浴条件下对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗解吸附，结果发现，在37℃水浴条件下，森林脑炎、肾综合征出血热病毒受到传导温度过快，包膜蛋白结构被破坏，导致其检测抗原量下降，持续到72h时，甚至无法检测到抗原。与之相反的是，在37℃气浴环境中，能够较好的进行解吸附，在72h时，森林脑炎、肾综合征出血热病毒不但能够很好的解吸附，同时病毒抗原结构不受温度影响，完整保持了其免疫原性。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种用于解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的解吸附剂，所述解吸附剂为柠檬酸钠溶液，并包含一种稳定蛋白构象并增加检测特异性的非离子型表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的解吸附剂，所述的非离子型表面活性剂为吐温，优选为吐温20。

3.根据权利要求1或2所述的解吸附剂，所述解吸附剂的柠檬酸盐溶液的浓度为8-16％(w/v)，其pH为7.0-8.5；pH进一步优选为8.0。

4.根据权利要求1或2所述的解吸附剂，所述解吸附剂不含有其他外源蛋白成份。

5.权利要求1～4任意一项所述解吸附液的应用，所述的应用是用于对森林脑炎、肾综合征出血热疫苗中的抗原与铝佐剂进行解吸附处理。

6.一种用于检测铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法，所述方法包括：采用权利要求1～4任意一项所述的解吸附液处理待检测疫苗。

7.根据权利要求6所述的方法，所述的待测疫苗是带有氢氧化铝佐剂的包膜病毒抗原疫苗。

8.根据权利要求7所述的方法，所述带有氢氧化铝佐剂的包膜病毒抗原疫苗为森林脑炎和双价肾综合征出血热疫苗。

9.根据权利要求6～8任意一项所述的方法，所述方法还包括针对被解吸附的抗原通过酶联免疫吸附法或电泳方法对其含量进行测定。