JP2000230931A - 家畜インフルエンザウイルスに対する抗体の検出方法およびこれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便で精度の高い家畜インフルエンザウイル
スに対する抗体を検出するための検出方法および感染防
御が可能な家畜インフルエンザウイルス用ワクチンを提
供すること。 【解決手段】 家畜の生体内に産生される家畜インフル
エンザウイルスに対する抗体を検出する方法において、
抗原としてシアル酸アフィニティークロマトグラフィー
を用いて精製した組換え家畜インフルエンザウイルスヘ
マグルチニンを使用することを特徴とする方法並びに
（１）蛋白が実質的に変性されない状態で精製された組
換え家畜インフルエンザウイルスヘマグルチニンを固定
化した固相、および（２）測定対象となる家畜の抗体に
結合する標識処理を施した蛋白質を含有する家畜インフ
ルエンザウイルスに対する抗体検出用キット。また、抗
原としてシアル酸アフィニティークロマトグラフィーを
用いて精製した組換え家畜インフルエンザウイルスヘマ
グルチニンを使用した家畜のインフルエンザウイルスオ
イルワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、馬、豚、家禽等の
家畜のインフルエンザウイルスに対する抗体を検出する
ための方法およびこれに用いるキットに関する。より詳
細には、抗原として、精製した家畜インフルエンザウイ
ルスの外殻表面の糖蛋白質であるヘマグルチニン（以
下、「ＨＡ」という）またはその一部、好ましくはバキ
ュロウイルスとその宿主昆虫細胞あるいは宿主昆虫虫体
の系で発現させた組換えＨＡを用い、インフルエンザウ
イルス感染の診断や、ワクチン接種後の抗体価測定等に
有用な家畜のインフルエンザウイルスに対する抗体の検
出方法およびこれに用いるキット、更には蛋白質が実質
的に変性されない精製法で製造された家畜インフルエン
ザウイルス用ワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】家畜のインフルエンザウイルスのうち、
馬インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科
（Orthomyxoviridae）のインフルエンザウイルス（Infl
uenzavirus）属に分類され、Ａ亜型ウイルスに属するＡ
／ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｑｕｅ／１／５６（Ｈ７Ｎ７；
プラハ型）、Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｍｉａｍｉ／１／６３
（Ｈ３Ｎ８：マイアミ型）などが知られている。 これ
らのインフルエンザウイルスは馬に感染し、発熱、発
咳、鼻漏などを呈する呼吸器病の原因となるウイルス
で、主に冬期に流行し、伝染性が強い。

【０００３】馬のインフルエンザウイルスによる発症
は、１９５６年チェコスロバキアでの発生以後、世界各
地で発生しており、日本においても１９７１年にマイア
ミ型ウイルスによるインフルエンザが発生した。 そし
て、馬インフルエンザウイルスが発生すると、この病気
の発症が無くなるまで長期間に渡り、競馬開催が中止さ
れるので、同病の流行は競馬界に甚大な被害をもたら
す。

【０００４】従って、馬がインフルエンザウイルスに感
染しているかを早期に判断し、その感染の広がりを防ぐ
ことが重要であり、そのためには、ウイルスの感染をこ
れに対する抗原の存在から正確にかつ簡単に診断する技
術が必要とされている。また一方、インフルエンザウイ
ルス感染の予防のためのワクチン接種は必要不可欠で、
このワクチンによる免疫効果を、ウイルスに対する抗体
の存在から調べることもまた重要である。

【０００５】日本においては、ワクチン接種等の防疫体
制により、島国であることが幸いしてか、かなりの長い
期間において、同病の流行は見られていない。しかし、
国際交流が盛んに行われている今、馬インフルエンザウ
イルス感染が何時発生しても不思議ではない状況にあ
る。

【０００６】馬等の家畜についてのインフルエンザウイ
ルスの感染は、発病初期の鼻咽頭粘液などからのウイル
ス分離、または蛍光抗体法、赤血球凝集阻止反応（ＨＩ
抗体価）などの血清反応で診断することができる。 し
かし、従来の診断方法は、繁雑から測定に時間がかかる
うえ、測定感度が十分でない等の問題があった。

【０００７】従来のインフルエンザウイルス感染の診断
方法としては、発育鶏卵を用いたウイルスを分離する方
法が確立されているが、この方法は分離・同定に１〜２
週間の時間がかかる上、鶏卵に馴化していないウイルス
株の場合は分離が困難であることが多いという問題があ
った。

【０００８】また、従来のエライザ（ＥＬＩＳＡ）法に
よる方法は、抗原としてウイルス自体を用いているの
で、このウイルスの不活化のためにホルマリン処理が必
要であり、この処理により抗原性が低下し、検出感度が
低下する点に大きな問題がある。 例えば、ウイルス自
体を不活化したエライザ診断方法は、ＨＩ抗体価（血清
の希釈系列に対し一定量の抗原（ＨＩ）を加えて、反応
の生じる終末点の希釈倍数で示す；以下、同じ）３２倍
以下の測定領域において正確に応答しない難点があっ
た。 このＨＩ抗体価３２倍以下の測定領域は、免疫の
獲得を判断する上で重要な測定領域であるためその測定
は正確でなければならず、精度の高い測定感度が要求さ
れる。 これに対し、ＨＩ抗体価６４倍以上の領域にお
いてはワクチンの効果が明白であるため、精度の高い測
定応答は必ずしも必要ではないが、被検血清を希釈する
ことにより、ＨＩ抗体価６４倍以上でも本発明の抗体検
出用キットは正確な測定値が得られる。

【０００９】また、従来法の一つであるＨＩ抗体価測定
法は、ＨＡアミノ酸配列の小さな変異があると抗体価の
変動が見られ、その変異を検出できる利点はあるが、逆
に、変異ウイルスに対し感度が低くなるという問題があ
り、また作業自体も繁雑である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、厳密な防疫体
制を維持して馬インフルエンザウイルス感染を早期に検
出し、これをワクチンを用いて有効に防除するために
は、上記の従来法の問題点を解消した、簡便で精度の高
い馬インフルエンザウイルスに対する抗体を検出するた
めの検出方法が要求されている。また、これは日本のみ
に限らず、世界の馬生産国においても共通に要求される
重要な課題である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウイルス
に代わる抗原として、ウイルスの外殻表面の糖蛋白質で
あるＨＡに着目し、その使用を検討していたが、家畜イ
ンフルエンザウイルスＨＡを純度高く得る方法がなく、
家畜インフルエンザウイルスに対する抗体を検出する方
法を開発する上での隘路となっていた。

【００１２】そこで、本発明者らは家畜インフルエンザ
ウイルスＨＡを効率的に高純度で得る方法について検討
していたところ、組換え家畜インフルエンザウイルスＨ
Ａ（以下、「組換えＨＡ」という）またはその一部をコ
ードする塩基配列を組込んだバキュロウイルスとその宿
主昆虫細胞あるいはその宿主昆虫虫体を用いて発現させ
た組換えＨＡあるいはその一部について実質的に蛋白変
性させることなく精製することにより、インフルエンザ
ウイルス感染の診断方法に用いられ、かつワクチンにも
用いられる抗原として十分に適した優れたものが得られ
ることを見出し、本発明を完成した。

【００１３】すなわち本発明は、家畜の生体内に産生さ
れる家畜インフルエンザウイルスに対する抗体を検出す
る方法において、抗原としてシアル酸アフィニティーク
ロマトグラフィーを用いて精製した組換えＨＡを使用す
ることを特徴とする方法を提供するものである。

【００１４】また、本発明は次の成分（１）および
（２）、（１）抗原として、蛋白質が実質的に変性され
ない状態の精製された組換えＨＡを固定化した固相、お
よび（２）測定対象となる家畜の抗体に結合する標識処
理を施した蛋白質を含有する家畜インフルエンザウイル
スに対する抗体検出用キットを提供するものである。

【００１５】更に、本発明は上記抗原を有効成分とする
家畜インフルエンザウイルス用ワクチンを提供するもの
である。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明において、家畜とは、馬、
豚等の動物の他、鶏、家鴨等の家禽を指称し、家畜イン
フルエンザウイルス中には、家禽インフルエンザウイル
スを含む。また、本発明で用いる組換えＨＡは、家畜イ
ンフルエンザウイルスの有するＨＡ遺伝子あるいはその
一部を公知のベクターに組み込んだ後、適当な宿主中で
複製発現することにより得られたものである。

【００１７】ここでいう、ＨＡ遺伝子の一部とは、ＨＡ
遺伝子のうち、家畜インフルエンザウイルスの抗原とし
て認識される部分（エピトープ）を意味し、具体的に
は、シアル酸ポッケト付近、ＨＡ１・ＨＡ２切断部位、
ＨＡ２膜融合活性必須部位などを例示することができ
る。

【００１８】また、特に好ましい組換えＨＡとしては、
家畜インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子またはその一
部をバキュロウイルスに組み込み、このバキュロウイル
スをカイコ科（カイコ）、ヤガ科（ハスモンヨトウガ、
イラクサキンウワバなど）等の昆虫の培養細胞あるいは
昆虫虫体中に感染させ、複製発現して得たものが挙げら
れる。

【００１９】この組換えＨＡの発現について、家畜イン
フルエンザウイルスとして、馬インフルエンザウイルス
・ラプラタ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｌａ Ｐｌａｔａ）
を用い、ベクターとしてバキュロウイルスおよび宿主と
してカイコ虫体を用いた場合について簡単に説明すれば
次の通りである。

【００２０】すなわち、まず、馬インフルエンザウイル
ス・ラプラタ株から常法によりＨＡのゲノムＲＮＡを採
取し、これを精製する。 次いで、ＰＣＲ法により目的
のＨＡ遺伝子を増幅した後、常法によりトランスファー
ベクターにクローニングする。 更に、これをバキュロ
ウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞にコ・トランスフェクシ
ョンした後、この昆虫細胞を培養し、組換えバキュロウ
イルスを選抜する（O'Reilly,D.et.al.,"Baculovirus e
xpression vectors",A laboratory mannual,(1992),W.
H.Freeman and Company）。

【００２１】得られた組換えバキュウロウイルスをカイ
コ幼虫に接種し、組換えバキュウロウイルスが増殖後カ
イコから体液を回収し、体液中の成分としてＨＡ蛋白質
を得ることができる。 なお、カイコ体液中には各種プ
ロテアーゼが存在し、組換えＨＡを分解する働きがある
ので、カイコ体液の回収に当たってはこれらに対する適
当なインヒビターを加えた緩衝液中でカイコ虫体を磨砕
し、界面活性剤で可溶化することが好ましい。

【００２２】この様にして得られた組換えＨＡは、次い
でシアル酸アフィニティークロマトグラフィーを用いて
実質的に蛋白質変性させることなしに精製され、高純度
で組換えＨＡ液として得られる。 ここでいう実質的に
蛋白質変性させることなしにとは、抗原としての性質を
有し、それ単独でワクチンなどに使用できる十分な抗体
産生能を有するものである。このシアル酸アフィニティ
ークロマトグラフィーに用いられるカラムとしては、シ
アリルラクトース、α−フェトプロテイン、Ｌｅｕｉｓ
Ｘ等を結合した臭化シアン活性化多糖類ゲルおよびポリ
マー、エポキシ活性化多糖類ゲルおよびポリマー等を利
用することができる。 精製は、前記のようにして得ら
れた組換えＨＡまたはその一部の含有液を、上記シアル
酸アフィニティークロマトグラフィィーに通し、組換え
ＨＡまたはその一部を選択的に吸着させた後、適当な溶
離液で溶離させ回収する方法を用いることができる。

【００２３】カイコ体液中に含まれる組換えＨＡの精製
について、簡単に説明すれば次の通りである。 すなわ
ち、まずシアル酸アフィニティークロマトグラフィーカ
ラムをトリス−塩酸等適当な緩衝液（ｐＨ６〜１０）で
平衡化した後、同じくトリス−塩酸等適当な緩衝液（ｐ
Ｈ６〜１０）で希釈した組換えＨＡを含むカイコ体液を
１０ｃｍ／ｈ程度の速度で通液する。 このカラムを、
グリシン−ＮａＯＨ等の適当な洗浄液（ｐＨ８〜１１）
で洗浄した後、ホウ酸−ＮａＯＨ等の溶離液（ｐＨ８〜
１１）を用いて溶出し、組換えＨＡを含む画分を得る。
次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やエタノ
ール（ＥｔＯＨ）を加えることにより、界面活性剤を除
去し、最後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））を加え、高
純度の組換えＨＡ液を得る。

【００２４】かくして得られた組換えＨＡは、抗原とし
て家畜の生体内に産生される家畜インフルエンザウイル
スに対する抗体を検出する方法に使用される。ここでい
う家畜インフルエンザウイルスに対する抗体を検出する
方法の例としては、家畜のインフルエンザウイルス感染
の診断方法や、ワクチン接種（ワクチネーション）後の
免疫獲得の確認するための方法が挙げられる。

【００２５】上記組換えＨＡは、種々の免疫学的測定法
において、抗原として使用できるが、好ましくは、プラ
スチックプレートあるいはビーズ等の免疫学的測定法に
用いられる固相に公知の手段により固定化されて使用さ
れる。 この固相化された組換えＨＡ（抗原）は、免疫
学的測定法で家畜の血清等の被検体が加えられたとき
に、この中に含まれる抗体（家畜インフルエンザウイル
ス抗体）と結合する。

【００２６】そして、更に標識したこの抗体と結合する
蛋白質（以下、「標識結合蛋白質」という）を加えるこ
とにより、家畜被検体中の家畜インフルエンザウイルス
抗体の存在およびその量を知ることができるのである。
利用される抗原量は、特に限定されず実験的に定める
ことができるが、１ウエル当たり５〜１０ｎｇ程度用い
ればよい。

【００２７】また、本発明の家畜インフルエンザウイル
スに対する抗体検出用キットは、次の成分（１）および
（２）、（１）抗原として、蛋白質が実質的に変性され
ない状態の精製された組換えＨＡを固定化した固相、お
よび（２）測定対象となる家畜の抗体に結合する標識処
理を施した蛋白質を含有するものである。

【００２８】このキットにおいて、（１）の抗原を、蛋
白質が実質的に変性されない状態で精製するためには、
シアル酸アフィニティークロマトグラフィーを用いるこ
とが好ましく、また、固相としては、ポリスチレン、ア
ガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリフッ
化ビニリデン等を利用することができ、また、その形状
としては、プレート状、ビーズ状、メンブレン状（薄膜
状）等のものを利用することができる。

【００２９】また、（２）の標識結合蛋白質としては、
酵素、ラジオアイソトープ、化学発光物質、蛍光物質、
金属コロイド、ビオチン、ラテックスビーズ等で標識処
理された、検出対象となる家畜の抗体に対する抗体や、
プロテインＡ、プロテインＧ等が利用される。

【００３０】更に、本発明の家畜インフルエンザウイル
ス用ワクチンは、蛋白質が実質的に変性されない状態で
精製された組換えＨＡ（以下、「実質無変性組換えＨ
Ａ」という）を有効成分とするものである。このワクチ
ンは、実質無変性組換えＨＡを適当な医薬用担体に溶解
ないし懸濁させることにより調製されるが、好ましく
は、実質無変性組換えＨＡを例えばごま油等の適当な植
物油、特に２から６０Ｗ／Ｖ％のごま油−水エマルショ
ンに添加することにより得られる。このワクチンは、家
畜１頭当たり実質無変性組換えＨＡとして５から１００
μｇ（蛋白量として）程度投与すれば良い。

【００３１】

【発明の効果】本発明の方法では、抗原として用いるＨ
Ａ蛋白質の不活化処理を必要とせず、また、精製度の高
い組換えＨＡを用いるため、感度の高い測定が可能であ
る。たとえば、馬インフルエンザウイルスの感染診断に
用いた場合は、ＨＩ抗体価３２倍以下の測定領域におい
て、精度の高い測定値が得られる優れたものである。

【００３２】また、本発明の方法は、交差性が高いた
め、実際に必要なウイルス中和抗体価に近い測定値が得
られる。 具体的には、馬インフルエンザウイルス・ラ
プラタ株を用いた後記実施例の記載の方法では、ラプラ
タ株と同じＨ３セロタイプのケンタッキー／９２株（A/
equine/Kentucky/92）やローマ／９１株（A/equine/Rom
e/91）との交差性を確認している。

【００３３】なお本発明者らは、馬インフルエンザウイ
ルス・ラプラタ株のＨＡ部分について、これをコードす
る塩基配列をシークエンシングを行った結果、馬インフ
ルエンザウイルス・アルゼンチナ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ
／Ａｒｇｅｎｔｉｎａ／９３）のＨＡ部分をコードする
塩基配列（ J. General Virology, 77: 661-671, 1996
）と同一の配列を有することを見出した。

【００３４】更に、後記試験例１で述べる方法により、
４０％オイルワクチンとして実施例で、ワクチンとして
の使用およびワクチネーションの成立を確認した。

【００３５】

【実施例】次に実施例および試験例を挙げ、本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等によりな
んら制約されるものではない。

【００３６】実 施 例 １ 馬インフルエンザウイルスＨＡｃＤＮＡのクローニング
と組換えウイルスの作製：馬インフルエンザウイルスＨ
Ａ・ｃＤＮＡの合成は、タカラ ＬＡ ＲＮＡ ＰＣＲキ
ット（Ｖｅｒ.１.１）；宝酒造社製）を用いて行った。
鋳型となるＲＮＡは、馬インフルエンザウイルス・ラ
プラタ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｌａ Ｐｌａｔａ／９
３）から抽出したものを用いた。１本鎖ｃＤＮＡの合成
のためのプライマーは、公知の馬インフルエンザウイル
ス、ラプラタ株ＨＡ蛋白遺伝子配列から開始コドンを含
むコーディング領域配列１４塩基とノンコーティング領
域配列７塩基に制限酵素ＢａｍＨｌ認識配列を付加した
２７塩基のものを用い、ＲＮＡ量は１μｇを使用した。
１本鎖ｃＤＮＡの伸長反応は４８℃で３時間行った。

【００３７】合成した１本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法によってｃ
ＤＮＡの増幅を行った。 プライマーは、公知の馬イン
フルエンザウイルス、ラプラタ株ＨＡ蛋白遺伝子配列か
ら終止コドンより下流の２８塩基配列に制限酵素Ｎｃｏ
ｌ認識配列を導入したものと１本鎖ｃＤＮＡの伸長反応
に用いたものを使用した。 ＰＣＲ反応に必要な各種構
成成分を混合して、反応液１００μｌを調製した。反応
は、９４℃／１分、５５℃／３０秒および７２℃／９０
秒のサイクルを５０回くり返すことにより行った。な
お、使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。

【００３８】 フォワードプライマー： ５'−ＡＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴ−３' リバースプライマー： ５'−ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＴＣ−３'

【００３９】増幅された遺伝子はＱＩＡクイック・スピ
ン・カラム（QIA quick spin column；キアゲン社製）
により精製した。 精製されたＤＮＡ断片は制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ、Ｎｃｏｌにより末端を修飾した。 クローニ
ングベクターとして、組換えウイルス作製に用いるトラ
ンスファープラスミドｐＢＭＯ５０（Maeda,S."InsectC
ell Biochemistry",p.1-31）を用い、これを制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ 、ＮｃｏＩで消化した。 末端を修飾した上記
ＤＮＡ断片１００ｎｇおよびＢｇｌＩＩ 、Ｎｃｏｌで
消化した前記ｐＢＭＯ５０ １００ｎｇを混合し、タカ
ラライゲーションキット（宝酒造社製）により１６℃で
１時間ライゲーション反応を行った。 得られた混合物
を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルを形
質転換し、形質転換体を得た。

【００４０】これらの形質転換体から８個を選抜し、常
法に従いプラスミドＤＮＡの抽出を行った。 得られた
組換え体プラスミドをゲル電気泳動で分離し、移動度の
違いにより馬インフルエンザウイルス・ラプラタ株ＨＡ
蛋白ｃＤＮＡを含む組換え体プラスミドを選抜した。
この組換え体プラスミドの塩基配列の決定はダイターミ
ネーターシーケンシングキット（アプライドバイオシス
テム社製）を用いて行った。 得られたサンプルを調整
し、自動シーケンサー３１０ジェネティック・アナライ
ザー（310 genetic analyzer；アプライドバイオシステ
ム社製）により行った。 その結果、馬インフルエンザ
ウイルス・ラプラタ株ＨＡ蛋白ｃＤＮＡをクローニング
した組換えウイルス作製用のトランスファープラスミド
を得ることが出来た。

【００４１】組換えウイルスの作製はカチオン性脂質試
薬を用いて行った。 すなわち、カイコ核多核体ウイル
ス・ＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ・ＤＮＡ） １００ｎｇ、上で
得たトランスファープラスミド（馬インフルエンザウイ
ルス・ラプラタ株ＨＡ蛋白ｃＤＮＡを含む） ５００ｎ
ｇおよびリポフェクチン（ギブコ社製）１０μｌを、牛
胎児血清を含まないＴＣ−１００培地 ２００μｌに懸
濁し、室温で１５分間放置した。 次いで８００μｌの
ＴＣ−１００を加え、カイコ由来培養細胞ＢｍＮに滴下
した。 ２５℃で４時間静置した後に培地を牛胎児血清
を１０％含むＴＣ−１００に交換して５日間培養した。

【００４２】培養上清からの組換え体ウイルスの選抜は
限界希釈法により行った。 すなわち、９６ウェルプレ
ートに播種したウイルスから多角体を形成しないクロー
ンを選抜し、これを組換え体ウイルス（Ａ／Ｅｑ／Ｌａ
Ｐｌａｔａ／９３株ＨＡ蛋白質組換えバキュロウイル
ス）とした。

【００４３】実 施 例 ２ ＨＡ組換えバキュロウイルス感染蚕からのＨＡ精製；実
施例１で得られたＨＡ組換えバキュロウイルスを注射に
より５齢のカイコに接種した。 ウイルス感染５日後に
カイコを回収し、これにプロテアーゼインヒビター（１
０ｍＭベンズアミジン塩酸塩）を含むトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８.０）を加えてホモジェナイズし、更に２％ Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）
オクチルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン
（９）オクチルフェニルエーテルの混合物）を加え、室
温で３０分間攪拌した。 攪拌後、０.１％硫酸プロタミ
ンを加え、１０,０００×ｇで１５分間の遠心処理を行
い、上清を回収した。

【００４４】得られた上清を、常法に従いシアロ糖蛋白
質をカップリングさせた臭化シアン活性化セファロース
４Ｂ（ファルマシア社製）にアプライした。 １０ｍＭ
硫酸バッファー（ｐＨ１０）で洗浄した後、１００ｍＭ
硼酸バッファー（ｐＨ１０）でＨＡ蛋白質を溶出した。

【００４５】この溶出液に１５％ ポリエチレングリコ
ール６０００（和光純薬）を加え、ＨＡ蛋白質を沈澱さ
せた後、リン酸緩衝生理食塩水に溶解し、０.２２μｍ
メンブレンフィルターで濾過した。 この濾液に４５％
濃度となるまでエタノールを加え、沈澱させ、得られた
沈殿をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、精製ＨＡ抗原液
とした。

【００４６】試 験 例 １ 馬インフルエンザウイルス感染診断：２頭の馬につい
て、馬インフルエンザワクチンを接種し、その免疫の変
化が正確に判定できるかについて、日本中央競馬会（Ｊ
ＲＡ）の術式（ＨＩ抗体価測定法）でもとめたＨＩ抗体
価と、本発明方法により求めた吸光度および従来のエラ
イザ法による吸光度の関係を比較した。 試験に用いた
馬の種類は中半種で、いずれもワクチン未接種の抗体陰
性の１歳馬であった。 この結果を表１に示す。

【００４７】（１）馬インフルエンザワクチン接種：試
験に用いた馬インフルエンザワクチンとしては、インフ
ルエンザウイルスラプラタ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｌａ
Ｐｌａｔａ／９３）ＨＡ蛋白ｃＤＮＡをコードした組
換えバキュロウイルスをカイコで発現させ、これを実施
例２の方法により精製して得た精製ＨＡ蛋白質を用い
た。 実際の投与は、下に示す組成および製法の４０％
オイルワクチンを使用した。 ワクチンの接種は、馬の
頸部筋肉に２回行い、２回目の接種は１回目の接種から
２８日目に行なった。１回のワクチン接種量は１頭当た
り１ｍｌを投与した。 また、被検血清の採取は、１回
目のワクチン接種直前、接種後１４日目およびその後１
週間目毎に行なった。

【００４８】 ＜４０％オイルワクチン＞ （ 組 成 ） １.精製ＨＡ蛋白質溶液（１ｍｇ／ｍｌ） １ｍｌ ２.ゴマ油 ４０ｇ ３.セスキオレイン酸ソルビタン ６.５ｇ ４.ポリソルベート８０ １ｇ ５.生理食塩水 ４９ｍｌ

【００４９】（ 製 法 ） Ａ.４および５を３０℃の水浴にて加温、混合したもの
に１を分散させた。 Ｂ.２および３を３０℃の水浴にて加温、混合させた。 Ｃ.スターラーによりＡを撹拌しながら、Ｂを添加す
る。 Ｄ.乳化機（ミニミクサー；特殊機化工業（株）製）を
用いてＣを乳化混合し（５,０００ｒｐｍ、１０分）、
Ｏ／Ｗ型エマルションタイプのワクチンを得る。

【００５０】（２）本発明方法による免疫の測定：本発
明方法によるエライザは以下のように実施した。すなわ
ち、精製ＨＡ抗原液を０.００５Ｍ炭酸緩衝液で希釈
し、エライザプレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに５０
μｌずつ分注し、４℃で一晩静置することにより抗原を
各ウェルに吸着させたプレート（抗原吸着ウェル）を得
た。

【００５１】このプレートを０.０５％のＴｗｅｅｎ２
０を含むリン酸緩衝生理食塩水（プレート洗浄液）で２
回洗浄した後、ウェル当り２００μｌの１／４ブロック
エース（大日本製薬）を分注し、３７℃で１時間震盪す
ることによりブロッキング操作を行った。 このプレー
トをプレート洗浄液で３回洗浄した後、１／１０ブロッ
キングエースで１：８００に希釈した被検血清５０μｌ
を抗原吸着ウェルに分注し、３７℃で１時間震盪した。
このプレートをプレート洗浄液で３回洗浄した後、１
／１０ブロックエースで１：５０００に希釈したペルオ
キシダーゼ標識抗ウマＩｇＧヤギＩｇＧを各ウェルに５
０μｌずつ分注し、３７℃で１時間震盪した。 このプ
レートをプレート洗浄液で３回洗浄した後、１００μｌ
のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに分注
し、室温で２０分間静置した。１Ｎ硫酸溶液を１００μ
ｌ添加して酵素反応を停止させた後、マイクロプレート
リーダーにより吸光度ＯＤ_４５０−ＯＤ_５８５を測定し
た。

【００５２】（３）ＨＩ（血球凝集抑制）試験による免
疫の測定：ＨＩ（血球凝集抑制）試験は、日本中央競馬
会の既報（Ｊｐｎ. Ｊ. Ｅｑｕｉｎｅ Ｓｃｉ. ４；３
１−３８,１９９３）に準じて下記のとおり実施した。

【００５３】 馬の血清中の非特異的血球凝集抑制物
質除去のための前処理 まず、被検血清０.２ｍｌと０.８％トリプシン生理食塩
液０.１ｍｌを混合し１０分間放置後、５６℃で３０分
間非働化する。 ０.２３％過ヨウ素酸カリウム生理食塩
液０.６ｍｌを加えて６０分間室温に放置後、１％グリ
セリン生理食塩液０.６ｍｌを加えて、過ヨウ素酸カリ
ウムを中和する。

【００５４】次に、アルサーバー液（グルコース・クエ
ン酸ナトリウム・食塩液ｐＨ７.０）を用いてニワトリ
血液を採取し、生理食塩水を用いて２０００ｒｐｍの遠
心洗浄等により調製したパックドセル０.１ｍｌを加え
て、室温に１時間（その間２回の攪拌を加え）放置後、
２５００ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を試験に用い
た。

【００５５】 使用するウイルス抗原の希釈倍率の調
製 ウイルス抗原として精製ＨＡ抗原液を用いた。 ２ｍｌ
の生理食塩水の中に２００倍希釈の精製ＨＡ抗原の所定
液量を混ぜて、１：３００から１：２０００までの抗原
希釈列を小試験管で作り、各希釈列について、４穴づつ
０.０２５ｍｌを滴下し、それぞれに生理食塩水を０.０
２５ｍｌ加えた後、０.５％のニワトリ血球０.０５ｍｌ
を滴下し、１時間後に血球の凝集像を調べた。４穴のす
べての血球を完全に凝集した最高抗原希釈の数値を抗原
力価とし、その数値を８で割った数値を、８単位の使用
抗原とした。

【００５６】次に、８単位に調製した抗原について、生
理食塩水を用いて調製した２〜１５倍希釈抗原液を作
り、前試験と同様の手順でニワトリ血球による凝集反応
を調べ、調製抗原液が８単位であることを確認した。

【００５７】 ＨＩ価の測定 ９６穴の丸底マイクロトレイを用い、Ａ列に被検血清を
０.０５ｍｌ、またＨ列に被検処理血清を０.０２５ｍｌ
滴下した。Ｂ〜Ｇの穴には生理食塩水を０.０２５ｍｌ
づつ滴下しておき、Ａ列からＧ列までマイクロピペット
等を用いて、順次、倍数希釈を行なった。

【００５８】次に、８単位に調製した抗原を０.０２５
ｍｌづつＡ〜Ｇに滴下した。Ｈ列には、生理食塩水を
０.０２５ｍｌ滴下して対照区とした。攪拌後、３０分
室温に放置した後、０.５％ニワトリ血球を０.０５ｍｌ
滴下して、１時間放置後判定し、完全に血球凝集を抑制
した最高血清希釈倍数をＨＩ抗体価とした。

【００５９】（４）ウイルスを抗原とした酵素抗体法
（従来法） 馬インフルエンザウイルス・ラプラタ株を発育鶏卵に接
種し増殖させ、漿尿膜腔液を回収して、密度勾配遠心に
よりウイルスを精製した、この精製ウイルスを０.１％
ホルマリンで不活化し、従来法である酵素抗体法の抗原
に用いた。以下、試験例１（２）の組換え精製ＨＡを抗
原とした方法（本発明方法）と同様に測定した。

【００６０】（５）結果

【表１】

【００６１】上記表１より明らかなように、ＨＩ抗体価
と本発明方法による吸光度値は高い相関を示し、本発明
方法により馬インフルエンザウイルスによる感染が正確
に診断できることが明らかになった。

【００６２】また、上記試験例１の精製ＨＡ蛋白質を用
いた４０％オイルワクチンを２回接種することにより、
感染防御が可能な６４倍もしくはそれ以上のＨＩ抗体価
が得られ、ワクチンとしての有効性が明らかとなった。

【００６３】試 験 例 ２ 馬インフルエンザウイルスワクチネーション後抗体価の
測定：日本中央競馬会（ＪＲＡ）の美浦・栗東トレーニ
ングセンターにおいて、市販の馬インフルエンザウイル
スワクチンが接種されている２５０頭の馬について、こ
れらの馬の血清を採取し、本発明方法およびＨＩ抗体価
測定法を実施した。

【００６４】本発明方法は、プレートの固相化抗原とし
て、４０ｎｇ／ｍｌの精製ＨＡ抗原を用い、標識蛋白と
してペルオキシダーゼ標識抗ウマＩｇＧヤギＩｇＧに代
えて２μｇ／ｍｌのホースラデッシュ標識プロテインＧ
を用いる以外は、試験例１と同様にして行った。また、
ＨＩ抗体価測定法も実施例１と同様に行った。

【００６５】この結果、本発明方法の測定値（ＯＤ４５
０ｎｍ）とＨＩ抗体価測定法による抗体価の間の関係を
調べた。この結果を図１に示す。

【００６６】上記試験結果から求めた、本発明方法（Ｏ
Ｄ４５０ｎｍ）とＨＩ抗体価の相関係数は、０.８３１
であったが、ＨＩ抗体価測定法自体がその方法の性質
上、抗体価は必ず２の倍数となり、その間の数値は取り
得ないことを勘案すれば、０.８以上の相関を得ること
のできる本発明方法は精度が高いものであるということ
ができる。

【００６７】 製 剤 例 １ ４％オイルワクチン： （ 組 成 ） １.精製ＨＡ蛋白質溶液（１ｍｇ／ｍｌ） １ｍｌ ２.ゴマ油 ４ｇ ３.セスキオレイン酸ソルビタン ０.５ｇ ４.ポリソルベート８０ ２ｇ ５.生理食塩水 ９２.５ｍｌ

【００６８】（ 製 法 ） Ａ.４および５を３０℃の水浴にて加温、混合したもの
に１を分散させた。 Ｂ.２および３を３０℃の水浴にて加温、混合させた。 Ｃ.スターラーによりＡを撹拌しながら、Ｂを添加す
る。 Ｄ.乳化機（ミニミクサー；特殊機化工業（株）製）を
用いてＣを乳化混合し（８,０００ｒｐｍ、２０分）、
Ｏ／Ｗ型エマルションタイプのワクチンを得る。

【００６９】 製 剤 例 ２ ０.４％オイルワクチン： （ 組 成 ） １.精製ＨＡ蛋白質溶液（１ｍｇ／ｍｌ） １ｍｌ ２.ゴマ油 ０.４ｇ ３.セスキオレイン酸ソルビタン ０.２５ｇ ４.ポリソルベート８０ １ｇ ５.生理食塩水 ９７.５ｍｌ

【００７０】（ 製 法 ） Ａ.４および５を３０℃の水浴にて加温、混合したもの
に１を分散させた。 Ｂ.２および３を３０℃の水浴にて加温、混合させた。 Ｃ.スターラーによりＡを撹拌しながら、Ｂを添加す
る。 Ｄ.乳化機（ミニミクサー；特殊機化工業（株）製）を
用いてＣを乳化混合し（８,０００ｒｐｍ、３０分）、
Ｏ／Ｗ型エマルションタイプのワクチンを得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 試験例２における本発明方法の測定値とＨＩ
抗体価測定法による抗体価の間の関係を示す図面であ
る。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/531 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 7/00 15/00 Ａ (72)発明者 石山 誠司 埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548番地 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者 金谷 利道 埼玉県狭山市大字下奥富字宮後1548番地 片倉工業株式会社中央蚕研事業所内 (72)発明者 今川 浩 栃木県下都賀郡国分寺町駅東６−10−21 (72)発明者 杉浦 健夫 栃木県河内郡南河内町祇園２−６−９ (72)発明者 杉田 繁夫 茨城県古河市古河141−６ フレッシュコ ーポ301号 (72)発明者 桑野 昭 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内 (72)発明者 佐伯 欣之 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 家畜の生体内に産生される家畜インフル
   エンザウイルスに対する抗体を検出する方法において、
   抗原としてシアル酸アフィニティークロマトグラフィー
   を用いて精製した組換え家畜インフルエンザウイルスヘ
   マグルチニンを使用することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 抗原が、家畜インフルエンザウイルスの
   ヘマグルチニン遺伝子あるいはその一部を組み込んだ組
   換えバキュロウイルスの発現した組換えヘマグルチニン
   である請求項第１項記載の方法。
3. 【請求項３】 組換えヘマグルチニンが、宿主としてカ
   イコ科またはヤガ科の昆虫の細胞あるいは昆虫虫体を利
   用して得られたものである請求項第２項記載の方法。
4. 【請求項４】 家畜が馬であり、抗原を得るために使用
   される家畜インフルエンザウイルスが馬２型インフルエ
   ンザウイルスである請求項第１項ないし第３項の何れか
   の項記載の方法。
5. 【請求項５】 家畜が馬であり、抗原を得るために使用
   される家畜インフルエンザウイルスが馬インフルエンザ
   ウイルス・ラプラタ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｌａ Ｐｌ
   ａｔａ）または馬インフルエンザウイルス・アルゼンチ
   ナ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）である
   請求項第１項ないし第４項の何れかの項記載の方法。
6. 【請求項６】 家畜のインフルエンザウイルス感染を診
   断するものである請求項第１項ないし第５項の何れかの
   項記載の方法。
7. 【請求項７】 ワクチネーション後のワクチン抗体価を
   測定するものである請求項第１項ないし第５項の何れか
   の項記載の方法。
8. 【請求項８】 次の成分（１）および（２）、（１）抗
   原として、蛋白質が実質的に変性されない状態の精製さ
   れた組換え家畜インフルエンザウイルスヘマグルチニン
   を固定化した固相、および（２）測定対象となる家畜の
   抗体に結合する標識処理を施した蛋白質を含有する家畜
   インフルエンザウイルスに対する抗体検出用キット。
9. 【請求項９】 蛋白質が実質的に変性されない状態での
   抗原の精製を、シアル酸アフィニティークロマトグラフ
   ィーを用いて行う請求項第８項記載の家畜インフルエン
   ザウイルスに対する抗体検出用キット。
10. 【請求項１０】 測定対象となる家畜の抗体に結合する
    標識処理を施された蛋白質が、標識抗体、標識プロテイ
    ンＡまたは標識プロテインＧである請求項第８項または
    第９項記載の家畜インフルエンザウイルスに対する抗体
    検出用キット。
11. 【請求項１１】 組換え家畜インフルエンザウイルスヘ
    マグルチニンが、家畜インフルエンザウイルスのヘマグ
    ルチニン遺伝子あるいはその一部を組み込んだバキュロ
    ウイルスの発現したものである請求項第８項ないし第１
    ０項の何れかの項記載の家畜インフルエンザウイルスに
    対する抗体検出用キット。
12. 【請求項１２】 固相がプラスチックプレート、ビー
    ズ、メンブレン、寒天粒子またはゲル状高分子である請
    求項第８項ないし第１１項の何れかの項記載の家畜イン
    フルエンザウイルスに対する抗体検出用キット。
13. 【請求項１３】 標識処理が酵素、ラジオアイソトー
    プ、化学発光物質、蛍光物質、金属コロイド、ビオチン
    またはラテックスを用いる標識処理である請求項第８項
    ないし第１２項のいずれかの項記載の家畜インフルエン
    ザウイルスに対する抗体検出用キット。
14. 【請求項１４】 家畜が馬であり、家畜インフルエンザ
    ウイルスが馬２型インフルエンザウイルスである請求項
    第８項ないし第１３項の何れかの項記載の家畜インフル
    エンザウイルスに対する抗体検出用キット。
15. 【請求項１５】 家畜が馬であり、家畜インフルエンザ
    ウイルスが馬インフルエンザウイルス・ラプラタ株（Ａ
    ／ｅｑｕｉｎｅ／Ｌａ Ｐｌａｔａ）または馬インフル
    エンザウイルス・アルゼンチナ株（Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／
    Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）である請求項第８項ないし第１４
    項の何れかの項記載の家畜インフルエンザウイルスに対
    する抗体検出用キット。
16. 【請求項１６】 家畜のインフルエンザウイルス感染を
    診断するものである請求項第８項ないし第１５項の何れ
    かの項記載の家畜インフルエンザウイルスに対する抗体
    検出用キット。
17. 【請求項１７】 ワクチネーション後のワクチン抗体価
    を測定するものである請求項第８項ないし第１５項の何
    れかの項記載の家畜インフルエンザウイルスに対する抗
    体検出用キット。
18. 【請求項１８】 請求項第８項ないし第１７項の何れか
    の項記載の家畜インフルエンザウイルスに対する抗体検
    出用キットを用いる家畜のインフルエンザウイルス感染
    の診断方法。
19. 【請求項１９】 請求項第８項ないし第１７項の何れか
    の項記載の家畜インフルエンザウイルスに対する抗体検
    出用キットを用いるワクチネーション後のワクチン抗体
    価の測定方法。
20. 【請求項２０】 蛋白質が実質的に変性されない状態の
    精製された組換え家畜インフルエンザウイルスヘマグル
    チニンを有効成分とする家畜インフルエンザウイルス用
    ワクチン。
21. 【請求項２１】 蛋白質が実質的に変性されない状態の
    精製を、シアル酸アフィニティークロマトグラフィーを
    用いて行なう請求項第２０項記載の家畜インフルエンザ
    ウイルス用ワクチン。