CN102511387A

CN102511387A - 一种适用于多倍体黄芩优良品种规模化生产的技术流程

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Publication number: CN102511387A
Application number: CN2011103408907A
Authority: CN
Inventors: 刘敬梅; 谢莹; 周骅; 高春春
Original assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明提供一种规模化生产四倍体黄芩的技术流程，它以黄芩为育种材料，借助植物多倍体育种技术、组培快繁技术、茎段扦插技术，快速获得性状优良一致的四倍体黄芩种苗，本发明获得的四倍体黄芩株系KT优选，株高是对照的1.84倍，叶片长度是对照的1.50倍，叶片宽度是对照的2.14倍，单株产量高，根单株产量为二倍体对照的1.70倍，黄芩苷含量比对照高1.86个百分点，育性表现为不育，全生长期比对照长25-30天，对其应用组培扩繁技术繁殖获得原种苗，再将原种苗经茎段扦插技术进行制种获得种苗，移栽到大田种植，每亩地种植5000株左右，当年收获叶片和根，每亩可生产黄芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黄芩苷含量达13.50-16.56％，远高于药典不少于8.0％的要求，黄芩品质优良。

Description

一种适用于多倍体黄芩优良品种规模化生产的技术流程

技术领域

本发明涉及四倍体黄芩优良品种的创制、试管苗快速繁殖、原种苗扦插及种苗大田种植等技术环节构成的特有规模化生产流程，属于生物技术育种领域。

背景技术

黄芩(Scutellariae baicalensis，Georgi)是我国特有的中药材大品种之一，主产于我国华北地区，河北省承德地区为黄芩地道产区，质量最好。黄芩根可入药，主要有效成分为黄芩甙，具有抗菌、抗病毒、抗真菌、解热、降压和抗癌作用。70％的中成药都含有黄芩；黄芩根提取物黄芩素、黄芩甙作为制药原料，黄芩酊剂可治疗动脉硬化性高血压及神经性机能障碍，也可消除高血压引起的头痛、失眠、胸闷等症；近年，黄芩叶片被开发成具有医疗保健功能的茶叶，具有较高的经济开发价值。因此，目前黄芩的应用和开发越来越受到国内外的关注，需求量也随之急剧增加。黄芩是我国三级濒危保护中药材品种。目前黄芩的繁殖以种子繁殖为主，但药农引种时存在着盲目性，有的种子从药材市场采购，有的自产自用，有的直接采自野生黄芩的种子，种源混乱，药材质量、化学成分含量不稳定，导致黄芩的产量和质量差异较大。因此，迫切需要筛选出有效成分含量高、产量高的优良品种。

植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力。多倍体植物在品质和生物量上都较二倍体优越。因此，植物多倍体在生产上有着重要意义，通过人工诱导多倍体是现代育种工作的一个重要手段。但其带来的育性降低的不利影响又成为制约多倍体育种成功的巨大障碍，因此，在确定一项多倍体生产计划时，需充分考虑规模化繁育生产的制种问题及生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于四倍体黄芩规模化生产的成套技术流程，解决四倍体黄芩规模化生产的制种难、生产成本高等问题，以获得品质优良的黄芩中药材。

本发明的技术方案如下：一种适用于四倍体黄芩优良品种规模化生产的技术流程，其特征在于经过下列步骤：

1.待黄芩愈伤组织表面分化出绿色芽点时，在超净工作台内将愈伤组织切成直径0.5cm的小块，将愈伤组织块用含有2％二甲基亚砜(DMSO)的0.2％秋水仙素水溶液浸泡处理 12-16小时，处理后用无菌水冲洗3次，接种到培养基中培养，使其分化成苗。

2.切取秋水仙素诱导30-40天左右的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析，并对试管苗根尖进行染色体显微鉴定，对3次以上均鉴定为四倍体的株系进行繁殖。

3.选取长势茁壮的四倍体黄芩小苗转入生根培养基中生根，培养15-20天后取出炼苗3-4天，栽入苗床，保湿，约一个半月后苗床小苗的根系均发育良好，带土移出，移栽于试验田中，生长二年，观察四倍体及二倍体黄芩地上部分的农艺性状，于第二年6月黄芩生长稳定期测定植株高度、叶片大小；花期结束后定时检查各株系育性并作记录，黄芩成熟期收获后测定根长、宽、鲜重、干重及黄芩苷含量，筛选出综合性状优良的株系KT优选。

4.对筛选得到的综合性状优良的株系KT优选进行快速组培扩繁，繁殖系数为4(扩繁系数是指经过20天培养，每株组培苗可以扩繁成4株克隆苗)，每代时间为20天左右，选取长势茁壮的黄芩小苗转入生根培养基中生根，培养15-20天后取出炼苗3～4天，栽入苗床，保湿，移栽成活后获得原种苗，原种苗成活率90％以上。

5.原种苗生长3个月后，利用茎段扦插技术进行制种，选取半木质化的枝条按照7-8厘米剪断，扦插于扦插床上，繁殖系数为15-20，扦插成活率90％以上，成活后获得种苗。

6.第二年5月中下旬将种苗从扦插床移栽到大田种植，每亩地种植5000株左右，当年收获叶片和根，每亩可生产黄芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黄芩苷含量达13.50-16.56％，远高于药典不少于8.0％的要求，黄芩品质优良。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明采用多倍体育种技术，对黄芩愈伤组织采用秋水仙碱处理诱导，不仅诱导率高，而且诱导得到的四倍体黄芩粗壮；对诱导后的黄芩进行多倍体鉴定，采用细胞流式分析与显微镜检相结合，且重复三次以上，鉴定结果稳定可信；对黄芩四倍体的筛选不仅考察农艺性状，还考察黄芩的质量、产量，筛选出综合性状优良的黄芩品种，该品种生长茂盛，体型巨大，产量高，且有效成分黄芩苷含量非常高；对筛选得到的综合性状优良的四倍体黄芩采用组培扩繁技术，在短时间内稳定并扩繁了四倍体黄芩植株，获得了高质量的原种苗；本发明还采用茎段扦插技术，扦插成活率90％以上，繁殖系数为10-15，降低了来源于组织培养克隆的试管苗四倍体种植生产成本，使筛选得到的综合性状优良的黄芩四倍体KT优选适合推广和应用；按本发明方法每亩可生产优质黄芩茶40-50公斤，黄芩根250-300公斤，黄芩苷含量高达13.50-16.56％。本发明筛选获得的优良四倍体黄芩品种的示范推广和规范化种植必将大幅度地提高我国中药材的质量和产量，而且通过该品种的成功种植，可带动一系列中药材多倍体优良品种的培育和标准化种植，实现中药材良性可持续发展。

附图说明

图1为二倍体黄芩和四倍体黄芩的细胞染色体镜检对比图。

图2为二倍体黄芩与四倍体黄芩的细胞流式分析结果对比图。

图3为四倍体黄芩KT优选的试管苗。

图4为在苗床生长3个月后的四倍体黄芩KT优选。

图5为二倍体黄芩与四倍体黄芩中黄芩苷高效液相色谱结果比较图。

具体实施方式

实施例1四倍体黄芩的诱导

待黄芩愈伤组织表面分化出绿色芽点时，在超净工作台内将愈伤组织切成直径0.5cm的小块，将愈伤组织块用含有2％二甲基亚砜(DMSO)的0.2％秋水仙素水溶液浸泡处理12-16小时，处理后用无菌水冲洗3次，接种到培养基中培养，使其分化成苗，诱导率可达40.0％，培养基配方如下：

MS基本培养液，蔗糖30g/L，琼脂3.2g/L，6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L，矮壮素(PP₃₃₃)0.5mg/L。

实施例2四倍体黄芩的鉴定-染色体显微镜检

将实施例1处理得到的各株系在培养基上诱导生根，切取刚萌发的试管苗根0.5cm左右，在蒸馏水中漂洗干净，放入0.1％秋水仙素溶液中20℃下处理30min，取出后用蒸馏水洗3次，再放入卡诺氏液中冰箱固定2h，然后依次用95％乙醇、70％乙醇、蒸馏水各洗3次，用1M盐酸于60℃下离析5min，蒸馏水洗3次并在蒸馏水中低渗30min。镜检时小心切取根尖，置载玻片中央，加改良苯酚品红染液1滴，30min后盖上盖玻片并轻敲轻压至根尖压成一薄层，用显微镜进行观察，二倍体与四倍体黄芩结果见附图1，其中培养基配方为：

1/2MS基本培养液，蔗糖30g/L，琼脂3.2g/L，萘乙酸(NAA)0.1mg/L，矮壮素(PP₃₃₃)0.5mg/L

实施例3四倍体鉴定-细胞流式分析

切取黄芩嫩芽叶片1-2片，加入1ml冰冷缓冲液I于培养皿，用锋利的刀片切碎，40μm细胞过滤器过滤，收集滤液，放置冰上，500rpm离心5min，用PI染液对细胞核DNA进行荧光标记，放置冰上，避光，用流体细胞仪进行植株倍性鉴定，上样后流式细胞仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量分布图。二倍体黄芩与四倍体黄芩细胞流式分析结果见附图2

缓冲液I：45mmol/LMgCl₂，30mmol/L柠檬酸三钠，20mmol/LMOPS，0.1％TritonX-100，PH7.0。

PI染液：50μg/ml PI，50μg/mlRnase的缓冲液I。

实施例4四倍体黄芩的筛选

根据实施例2、实施例3鉴定结果，选取长势茁壮的四倍体黄芩小苗转入生根培养基中生根，培养15-20天后取出炼苗3～4天，栽入苗床，每天定时喷水2小时，保湿，约一个半月后苗床小苗的根系均发育良好，带土移出，按20cm×30cm行距移栽于试验田中，生长二年，观察四倍体及二倍体黄芩地上部分的农艺性状，于第二年6月黄芩生长稳定期测定植株高度、叶片大小；花期结束后定时检查各株系育性并作记录，黄芩成熟期收获后测定根长、宽、鲜重、干重及黄芩苷含量，筛选出综合性状优良的株系KT优选。KT优选、对照CK综合性状比较详见表1、表2，生根培养基配方如下：

MS基本培养液，蔗糖30g/L，琼脂3.2g/L，萘乙酸NAA0.2mg/L

表1：二年生黄芩KT优选株系、对照CK地上部分农艺性状的对比(n＝5)

株系	长势	株高(cm)	叶长(cm)	叶宽(cm)	育性
						对照(CK)	中等	26.5±0.82	3.20±0.029	0.701±0.015	正常
KT优选	茂盛	48.7±1.59	4.81±0.046	1.503±0.026	不育

表2：二年生黄芩KT优选株系、对照CK根部性状的比较(n＝5)

株系	主根长(cm)	主根直径(cm)	鲜重(g)	干重(g)	黄芩苷平均含量(％)
						对照(CK)	15.1±3.0	1.3±0.16	52.7±8.1	22.26±3.2	11.61
KT优选	18.7±2.3	2.0±0.21	89.8±14.3	38.61±4.7	13.50

实施例5四倍体黄芩KT优选扩繁

对筛选得到的综合性状优良的株系KT优选(附图3)进行快速组培扩繁，繁殖系数为4，每代时间为20天左右，选取长势茁壮的黄芩小苗转入生根培养基中生根，培养15-20天后取出炼苗3～4天，栽入苗床，保湿，移栽成活后获得原种苗，原种苗成活率90％以上。

生根培养基配方：MS基本培养液，蔗糖30g/L，琼脂3.2g/L，萘乙酸NAA0.2mg/L。

扩繁培养基配方：MS基本培养液，蔗糖30g/L，琼脂3.2g/L，6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L。

实施例6四倍体黄芩KT优选扦插

四倍体黄芩KT优选原种苗生长3个月后(附图4)，选取半木质化的枝条按照7-8厘米剪断，扦插于扦插床上，繁殖系数为10-15，扦插成活率90％以上，成活后获得种苗。

实施例7四倍体黄芩KT优选田间实验

于第二年5月中下旬，将种苗从扦插床移栽到大田种植，每亩地种植5000株左右，于黄芩生长稳定期测定植株高度、叶片大小；花期结束后定时检查各株系育性并作记录，黄芩成熟期收获后测定根长、宽、鲜重、干重及黄芩苷含量，不同生长大田结果见表3，表4。四倍体黄芩KT优选当年收获叶片和根(附图4)，每亩可生产黄芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黄芩苷含量为13.50-16.20％，远高于药典不少于8.0％的要求，黄芩品质优良。

表3不同生长地区四倍体黄芩KT优选与二倍体黄芩农艺性状表(n＝5)

表4不同生长地区四倍体黄芩KT优选与二倍体黄芩根部比较结果表(n＝5)

实施例8黄芩中黄芩苷含量测定

样品溶液制备：取同株系同种植地黄芩5棵，剪取整个根，置烘箱中60℃干燥；取干燥后的同株系同种植地黄芩根各5.0g，混合粉碎，过60目筛；分别称取各样品0.3g.，精密称定，加入70％乙醇40ml，加热回流3h，放冷，滤过，滤液置100ml容量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一容量瓶中，加入70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取黄芩根样品溶液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

标准溶液制备：取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，即得。

色谱条件：Kromasil C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇水磷酸(47∶53∶0.2)；检测波长为280nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。

测定方法：

分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积对黄芩苷(μg)作图，求得标准曲线方程。

精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，根据标准曲线方程计算黄芩苷含量，三个产地的二倍体黄芩与四倍体黄芩中黄芩苷含量结果见实施例7中的表4。

二倍体黄芩与四倍体黄芩中黄芩苷高效液相色谱结果比较图见图5。

Claims

1.一种规模化生产多倍体中药材的方法，其特征是：先用秋水仙素进行多倍体的诱导，通过流式细胞仪和染色体显微镜分析挑选出多倍体进行繁殖，繁殖获得的小苗通过组培扩繁获得原种苗，将原种苗经茎段扦插技术进行制种获得种苗，再移至大田进行规模化生产。

2.权利要求1所述的方法，包括其在多倍体黄芩的规模化生产中的应用，其具体技术流程如下：

（a）多倍体黄芩的诱导：将表面分化出绿色芽点的黄芩愈伤组织用秋水仙素水溶液进行处理，处理后用无菌水冲洗，接种到培养基中培养，使其分化成苗；

(b) 流式细胞仪分析和染色体显微镜检核：切取秋水仙素诱导的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析，并对试管苗根尖进行染色体显微鉴定，挑取多倍体株系进行繁殖；

(c) 多倍体黄芩的筛选：选取多倍体黄芩小苗转入生根培养基中生根，培养15-20天后取出炼苗3-4天，栽入苗床，保湿，约一个半月后苗床小苗的根系均发育良好，带土移出，移栽于试验田中，生长二年，筛选综合性状优良的多倍体黄芩株系；

(d) 组培、扦插和大田繁殖：将性状优良的黄芩株系通过快速组培扩繁获得原种苗，原种苗经茎段扦插技术进行制种，获得种苗，将种苗移栽至大田，进行规模化生产。

3.权利要求2所述的方法，其中所述的秋水仙素水溶液浓度为0.2%，其中含有2%的二甲基亚砜，秋水仙素的诱导率为40%。

4.权利要求2所述的方法，其中所述的快速组培是以四倍体黄芩采用组织培养克隆技术进行试管苗快速繁殖，其繁殖系数为4，每代时间为20天左右，试管苗移栽成活后获得原种苗。

5.权利要求2所述的方法，其中所述的茎段扦插是将原种苗以茎段扦插方式进行繁殖，每株原种苗枝条按照7-8厘米剪断，扦插于扦插床上，扦插成活率90%以上，繁殖系数为10-15，成活后获得种苗。

6.权利要求2所述的方法，其中所述的大田繁殖是将种苗从扦插床移栽至大田种植，每亩地种植5000株左右，收获叶片和根，每亩可生产黄芩茶40-50公斤，根350-450公斤，黄芩苷含量为13.5%以上。

7.权利要求2所述的方法，其中所述的多倍体黄芩为四倍体黄芩。

8.权利要求2或7所述的方法，其中所述的四倍体黄芩的特征是：四倍体株高是对照的1.84倍，叶片长度是对照的1.50倍，叶片宽度是对照的2.14倍，根单株产量为二倍体对照的1.70倍，黄芩苷含量比对照高1.86个百分点，大田种植能够正常开花，全生长期比对照长25-30天，育性表现为不育。

9. 一种多倍体黄芩产品，由权利要求2-7所述的方法获得。

10.权利要求9所述的黄芩产品，其特征是黄芩苷含量为13.5%以上。

11.权利要求9或10所述的黄芩产品，其特征是其黄芩叶片在开发成有医疗保健功能的茶叶中的应用。

12.权利要求9或10所述的黄芩产品，其特征是从其黄芩根中提取的黄芩素、黄芩甙、黄芩酊剂等在制药中的应用。