CN104792985A - 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法 - Google Patents

定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104792985A
CN104792985A CN201510189168.6A CN201510189168A CN104792985A CN 104792985 A CN104792985 A CN 104792985A CN 201510189168 A CN201510189168 A CN 201510189168A CN 104792985 A CN104792985 A CN 104792985A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
sample
standard
agar plate
measuring samples
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510189168.6A
Other languages
English (en)
Inventor
杨小蓉
潘春刚
王贺民
李浩鹏
周蕾蕾
黄文强
陈秋阁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
QIANYUANHAO BIOLOGICAL CO Ltd
Original Assignee
QIANYUANHAO BIOLOGICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by QIANYUANHAO BIOLOGICAL CO Ltd filed Critical QIANYUANHAO BIOLOGICAL CO Ltd
Priority to CN201510189168.6A priority Critical patent/CN104792985A/zh
Publication of CN104792985A publication Critical patent/CN104792985A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制品检测领域，具体提供了一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法。所述方法通过在免疫琼脂板的制板成份中加入合适浓度的聚乙二醇(PEG-6000)，显著的提高了SRID反应速度且更稳定、准确，同时能很好的检测通过甲醛处理的抗原；通过对成品疫苗的前期特别处理，本方法能较好的检测成品疫苗，扩大了SRID检测范围。

Description

定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法
技术领域
本发明涉及生物制品检测领域，具体地说，涉及一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法。
背景技术
目前，我国禽用禽流感病毒灭活抗原的检测方法主要有免疫攻毒动物法、血凝和血凝抑制试验。以上方法人工成本高、效率低、检测步骤繁琐，准确度难以保证，主要表现在以下几个方面：(1)血清学方法，即血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，该试验必需新鲜鸡红细胞，而结果判读受细胞质量、操作者主观性影响较大；(2)免疫攻毒法，该试验人工成本高、耗时长，动物试验本身受干扰因素多。禽用禽流感病毒灭活疫苗质量控制对于我国动物禽流感的防控具有举足轻重的作用，采用单向免疫扩散(SRID)定性、定量检测禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份的方法，利用抗原抗体表位特异性反应的原理，只要存在免疫原性表位即可检测，不存在误检、漏检问题；该方法耗时短，批量检测样本多，疫苗的质量能得到批量控制。
单向免疫扩散(SRID)分析禽用禽流感病毒抗原有效成分是基于有活性的抗原成分血凝素(HA)含量，而不能检测已经失活的HA，因此，SRID检测抗原有效成分是经典而可靠的方法；而现有的SRID定性定量分析病毒抗原试验方法反应缓慢、具有易变性和有限检测范围、不能检测成品疫苗。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种改良SRID方法定性定量分析禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法，包括以下步骤：
(1)制备含PEG-6000的免疫琼脂板；
(2)样品的处理(成品疫苗特别处理)；
(3)加样扩散；
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
(5)测量，绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。
进一步地，所述免疫琼脂板中PEG-6000的浓度为2％-3％(百分号“％”是指100mL溶液中含有溶质的克数)。
进一步地，所述步骤(1)中的免疫琼脂板为25.4×76.2mm(1＂×3＂)，厚度为1mm-1.2mm；10mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，加入200μL标准抗体；3mm直径孔，孔间距5mm。
进一步地，步骤(2)中所述的样品包括标准抗原和待测样品；所述标准抗原为标准禽流感灭活病毒抗原，经稀释处理形成浓度梯度；所述待测样品为禽用禽流感成品疫苗或禽流感灭活病毒抗原。
当待测样品为禽用禽流感成品疫苗，须经特别处理：将苯酚按1/5比例加入成品疫苗中，充分震荡混匀后，10000rpm离心3分钟，取上清水相4℃保存备用待检。
当灭活病毒抗原浓度低于4.5μg/μL或者HA效价浓度log2低于7时需浓缩处理，具体浓缩方法如下：
(1)超滤法：将待检样品5000rpm离心10min；取上清，加入超滤离心管(100KD，再生纤维膜)中，4000rpm离心至中间套管内至合适体积为止。
或(2)超速离心法：将待检样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超速离心管内，4℃25000rpm(82700g)离心2h，然后加入适量PBS稀释，4℃溶解2h或过夜。
进一步地，所述步骤(3)具体为：将梯度稀释的标准抗原、待检样品和阴性对照在免疫琼脂板中加样；所述梯度稀释的标准抗原、待检样品须在同一个反应板上，每个加样孔加样10μL。扩散条件为：室温(20-25℃)反应12h-16h。
进一步地，步骤(4)中的所述漂洗为：将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，期间换PBS缓冲液3-5次。
步骤(4)中的所述干燥为：从PBS中取出拨片上的免疫琼脂板，用粗滤纸吸取免疫琼脂板水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。
步骤(4)中的所述染色为：用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的免疫琼脂板4-6min(5min左右)；脱色方法为用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
步骤(4)中的所述脱色为：用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
进一步地，所述步骤(5)具体为：用数显游标卡尺测量沉淀圈；以标准抗原形成的沉淀环的直径对其相应的抗原浓度作回归曲线，得到直线回归方程y＝ax+b，代入待检样品孔的沉淀环平均直径，即得到待检样品抗原的含量；其中，y为标准品或样品的沉淀环直径，x为标准品或样品的抗原含量，R2>0.85。
本发明的有益效果在于：
发明人通过探索，在制板成份中加入合适浓度的聚乙二醇(PEG-6000)，显著的提高了SRID反应速度且更稳定、准确，同时能很好的检测通过甲醛处理的抗原；通过对成品疫苗的前期特别处理，本方法能较好的检测成品疫苗，扩大了SRID检测范围。因此，本发明所采用的检测禽用禽流感病毒抗原有效成分的SRID方法，称为改良SRID方法。本发明采用改良SRID方法定性、定量检测禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份，极大的提高了其反应速度、结果更加稳定，提高了疫苗质量控制的准确度，而且能够检测成品疫苗和经甲醛处理的抗原，扩大了其检测范围，提高了生产检测工艺效率。
本发明所采用的标准抗原和特异性抗血清购自世界卫生组织WHO国际标准品供应中心(NIBSC)，解决了特异性抗血清校准时间长的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中SRID重复性检验结果。
图2为本发明实施例2中SRID检测样品结果。
图3为本发明实施例3中SRID检测样品结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。
实施例1 SRID检测禽用禽流感疫苗抗原方法的重复性检验
包括以下步骤：
(1)免疫琼脂板制备、打孔；
量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2PBS缓冲液。称量琼脂糖0.1g，氯化钠0.8g，PEG-60000.2g加入10mL pH 7.2PBS缓冲液中，高压105KPa 15min至完全溶解。
待10mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入200μL标准抗体(成份为标准的抗血清，商品名称Influenza Reagent InfluenzaAntiserum A/turkey/Turkey/1/2005(H5N1)，商品来源(厂家)为National Institute for Biological Standards and Control–Assuring thequality of biological medicines)，混匀后铺板，4.5mL/板，免疫琼脂板凝固后为平整透明状，约3mm厚度。用3mm直径孔，孔间距5mm，打完孔后，用针头将孔中琼脂挑出。然后封底，将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。
(2)标准抗原和待检样品的处理；
将未开封的国际标准品供应中心实验室标准抗原，降入1mL纯水溶解(静置5min)，溶解后浓度为80μg/μL；然后再加入10％(w/v)Zwittergent detergent，然后室温(25℃)静置30min，此时该标准抗原浓度为72μg/μL。
用PBS(稀释抗原用)将标准抗原稀释如下，并标明标记：
标准品1浓度：72μg/μL；
标准品2浓度：36μg/μL；
标准品3浓度：9μg/μL；
标准品4浓度：4.5μg/μL。
将经过前期处理的待检样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超滤离心管(100KD，再生纤维膜)中，4000rpm离心至中间套管内至原体积的1/50为止，离心30min。
(3)加样扩散；
每个反应板每孔依次加样10μL：标准品1(72μg/μL)、标准品2(36μg/μL)、待检样品x、标准品3(9μg/μL)、标准品4(4.5μg/μL)、阴性对照。每板加完样品，应该马上盖上盖子。待全部板加完样品并盖上盖子，平放在带有湿度的盒子中，置于室温(23℃)扩散16小时。
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，其间换PBS缓冲液5次。从PBS中取出扩散板上的琼脂，用粗滤纸吸取琼脂糖水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的琼脂5min左右。用脱色液脱色15min直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间换脱色液5次。
(5)测量；
用数显游标卡尺测量沉淀圈，测量时卡尺一定要与扩散板边缘接触平行。阴性对照无沉淀线出现，本试验成立。将测量的3次待检样品孔直径取平均值，如图1所示。
(6)绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。
以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应的抗原浓度作回归曲线，得到直线回归方程(y＝ax+b，y为标准品或样品的沉淀环直径，x为标准品或样品的血凝素含量，R2>0.85)，代入待检样品孔的的沉淀环平均直径，即得到待检样品的血凝素含量(μg/μL)。如表1所示。
表1 SRID重复性检验数据分析
实施例2 SRID定量检测禽流感病毒灭活抗原的方法
包括以下步骤：
(1)免疫琼脂板制备、打孔；
量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.1g，氯化钠0.8g，PEG-60000.2g加入10mL pH 7.2 PBS缓冲液中，高压105KPa 15min至完全溶解。
待10mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入200μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，免疫琼脂板凝固后为平整透明状，约3mm厚度。用3mm直径孔，孔间距5mm。每个板打9孔，打完孔后，用针头将孔中琼脂挑出。然后封底，将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。
(2)标准抗原和待检样品的处理；
将未开封的国际标准品供应中心实验室标准抗原，降入1mL纯水溶解(静置5min)，溶解后浓度为80μg/μL；然后再加入10％(w/v)Zwittergent detergent，然后室温(20-25℃)静置30min，此时该标准抗原浓度为72μg/μL。
用PBS(稀释抗原用)将标准抗原稀释如下，并标明标记：
标准品1浓度：72μg/μL；
标准品2浓度：36μg/μL；
标准品3浓度：18μg/μL；
标准品4浓度：9μg/μL；
标准品5浓度：4.5μg/μL。
将经过前期处理的待检样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超滤离心管(100KD，再生纤维膜)中，4000rpm离心至中间套管内至原体积的1/50为止，离心30min。
(3)加样扩散；
每个反应板每孔依次加样10μL：标准抗原72μg/μL、36μg/μL、18μg/μL、9μg/μL、4.5μg/μL，待检样品1、待检样品2、待检样品3、待检样品4、阴性对照。
每板加完样品，应该马上盖上盖子。待全部板加完样品并盖上盖子，平放在带有湿度的盒子中，置于室温(23℃)扩散16h。
(5)漂洗、干燥、染色、脱色；
待扩散完成后，将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，其间换PBS缓冲液5次。
从PBS中取出扩散板上的琼脂，用粗滤纸吸取琼脂糖水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。
用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的琼脂5min左右。
用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间换脱色液5次。
(5)测量；
用数显游标卡尺测量沉淀圈，测量时卡尺一定要与扩散板边缘接触平行。阴性对照无沉淀线出现，本试验成立。将测量的3次待检样品孔直径取平均值，如图2所示。
(6)绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。
以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应的抗原浓度作回归曲线，得到直线回归方程(y＝ax+b，y为标准品或样品的沉淀环直径，x为标准品或样品的血凝素含量，R2>0.85)，代入待检样品孔的的沉淀环平均直径，即得到待检样品的血凝素含量(μg/μL)。如表2所示。
表2 SRID检测样品分析结果
实施例3 SRID定性检测禽流感病毒灭活抗原的方法
包括以下步骤：
(1)免疫琼脂板制备、打孔；
量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g，PEG-60000.4g加入20mL pH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。
待免疫琼脂板完全凝固(一般置于室温20min)后打孔，用3mm直径孔，孔间距5mm。每个板打10孔，打完孔后，用针头将孔中琼脂挑出。然后封底，将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。将备好的免疫琼脂板置于带盖子的搪瓷盒中，4℃中保存备用。
(2)标准抗原和待检样品的处理；
将未开封的标准抗原，降入1mL纯水溶解(静置5min)，溶解后浓度为80μg/μL；然后再加入10％(w/v)Zwittergent detergent，然后室温(20-25℃)静置30min，此时该标准抗原浓度为72μg/μL。
用PBS(稀释抗原用)将标准抗原稀释如下，并标明标记：
标准品1浓度：72μg/μL；
标准品2浓度：36μg/μL；
标准品3浓度：18μg/μL；
将经过前期处理的待检样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超速离心管内，4℃25000rpm(82700g)离心2h，然后加入PBS(稀释抗原用，用量为原体积的1/50)4℃溶解2h，每20min轻轻震荡。
(3)加样扩散；
每个反应板每孔依次加样10μL：标准抗原72μg/μL、36μg/μL、18μg/μL、待检样品a、待检样品b、待检样品c、待检样品d、待检样品e、阴性对照1、阴性对照2。
每板加完样品，应该马上盖上盖子。待全部板加完样品并盖上盖子，平放在带有湿度的盒子中，置于室温(20-25℃)扩散12h。
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
待扩散完成后，将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，其间换PBS缓冲液4次。
从PBS中取出扩散板上的琼脂，用粗滤纸吸取琼脂糖水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。
用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的琼脂5min左右。用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
(5)试验观察
试验结果，阴性对照1、阴性对照2无沉淀线出现，本试验成立。如图3、表3所示。
表3 SRID检测样品分析结果
待检样品名称 定性检测结果
待检样品a 阳性+
待检样品b 阳性+
待检样品c 阴性—
待检样品d 阴性—
待检样品e 阴性—
对比例1 SRID定性检测禽流感病毒灭活抗原的方法
(1)免疫琼脂板制备、打孔；
含PEG配方：量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g，PEG-60000.4g加入20mLpH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。
普通配方：量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g加入20mL pH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。待免疫琼脂板完全凝固(一般置于室温20min)后打孔，用3mm直径孔，孔间距5mm。每个板打10孔，打完孔后，用针头将孔中琼脂挑出。然后封底，将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。将备好的免疫琼脂板置于带盖子的搪瓷盒中，4℃中保存备用。
(2)标准抗原和待检样品的处理；
将未开封的标准抗原，降入1mL纯水溶解(静置5min)，溶解后浓度为80μg/μL；然后再加入10％(w/v)Zwittergent detergent，然后室温(20-25℃)静置30min，将该标准抗原置于4℃备用。
将未经甲醛处理的待检样品标记为a，经过甲醛处理的待检样品b。上述样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超速离心管内，4℃25000rpm(82700g)离心2h，然后加入PBS(稀释抗原用，用量为原体积的1/50)4℃溶解2h，每20min轻轻震荡。
将待检成品疫苗样品c，加入20％的苯酚，震荡5分钟，12000rpm离心3分钟后，取上清样品备用，经过该处理的成品疫苗样品标记为样品d。
(3)加样扩散；
含PEG配方制备的反应板依次加样：每孔依次加样10μL，标准抗原、样品a、样品b、样品c、样品d、阴性对照1。普通配方制备的反应板依次加样：每孔依次加样10μL，标准抗原、样品a、样品b、样品c、样品d、阴性对照2。
待全部板加完样品并盖上盖子，平放在带有湿度的盒子中，置于室温(20-25℃)扩散12h。
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
待扩散完成后，将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，其间换PBS缓冲液4次。
从PBS中取出扩散板上的琼脂，用粗滤纸吸取琼脂糖水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。
用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的琼脂5min左右。用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
(5)试验观察
试验结果，阴性对照1、阴性对照2无沉淀线出现，本试验成立。结果分析表明，用普通配方制备的免疫琼脂不能检测到经甲醛处理的样品，通过琼脂配方中加入合适比例的PEG后则能够检测经甲醛处理的待检样品。通过对成品疫苗的苯酚处理后，能实现SRID方法对疫苗的检测。
表4 含PEG配方的SRID检测样品分析结果
待检样品名称 定性检测结果
标准抗原 阳性+
未经甲醛处理样品a 阳性+
经甲醛处理样品b 阳性+
待检成品疫苗c 阴性—
经苯酚处理成品疫苗d 阳性+
阴性对照1 阴性—
表5 普通配方的SRID检测样品分析结果
待检样品名称 定性检测结果
标准抗原 阳性+
未经甲醛处理样品a 阳性+
经甲醛处理样品b 阴性—
待检成品疫苗c 阴性—
经苯酚处理成品疫苗d 阳性+
阴性对照2 阴性—
对比例2
(1)免疫琼脂板制备、打孔；
含PEG-6000配方：量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g，PEG-60000.4g加入20mL pH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。
含PEG-8000配方：量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g，PEG-80000.4g加入20mL pH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。待免疫琼脂板完全凝固(一般置于室温20min)后打孔，用3mm直径孔，孔间距5mm。每个板打10孔，打完孔后，用针头将孔中琼脂挑出。然后封底，将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。将备好的免疫琼脂板置于带盖子的搪瓷盒中，4℃中保存备用。
普通配方：量取甲液2.8mL，乙液7.2mL混合得10mL pH 7.2 PBS缓冲液。称量琼脂糖0.2g，氯化钠1.6g加入20mL pH 7.2 PBS缓冲液中，100℃水浴煮沸至完全溶解。待20mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，立即加入400μL标准抗体，混匀后铺板，4.5mL/板，约3mm厚度。置于4℃保存备用。
(2)标准抗原和待检样品的处理；
将未开封的标准抗原，降入1mL纯水溶解(静置5min)，溶解后浓度为80μg/μL；然后再加入10％(w/v)Zwittergent detergent，然后室温(20-25℃)静置30min，将该标准抗原置于4℃备用。
将未经甲醛处理的待检样品标记为a，经过甲醛处理的待检样品b。上述样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超速离心管内，4℃25000rpm(82700g)离心2h，然后加入PBS(稀释抗原用，用量为原体积的1/50)4℃溶解2h，每20min轻轻震荡。
(3)加样扩散；
含PEG-6000配方制备的反应板依次加样：每孔依次加样10μL，标准抗原、样品a、样品b、阴性对照1。
含PEG-8000配方制备的反应板依次加样：每孔依次加样10μL，标准抗原、样品a、样品b、阴性对照2。
普通配方制备的反应板依次加样：每孔依次加样10μL，标准抗原、样品a、样品b、阴性对照3。
待全部板加完样品并盖上盖子，平放在带有湿度的盒子中，置于室温(20-25℃)扩散12h。
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
待扩散完成后，将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，其间换PBS缓冲液4次。
从PBS中取出扩散板上的琼脂，用粗滤纸吸取琼脂糖水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。
用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的琼脂5min左右。用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
(5)试验观察
试验结果，阴性对照1、阴性对照2、阴性对照3无沉淀线出现，本试验成立。本研究表明，经过在配方中PEG-6000能扩大抗原检测范围，同时能显著缩短反应检测时间。
表6 含PEG-6000配方的SRID检测样品分析结果
表7 含PEG-8000配方的SRID检测样品分析结果
表8 普通配方的SRID检测样品分析结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备含PEG-6000的免疫琼脂板；
(2)样品处理；
(3)加样扩散；
(4)漂洗、干燥、染色、脱色；
(5)测量，绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫琼脂板中PEG-6000的浓度为2％-3％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫琼脂板中含标准抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的样品包括标准抗原和待测样品；所述标准抗原为标准禽流感灭活病毒抗原，经稀释处理形成浓度梯度；所述待测样品为禽用禽流感成品疫苗或禽流感灭活病毒抗原。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品为禽用禽流感成品疫苗时，处理方法如下：
将苯酚按1/5比例加入禽用禽流感成品疫苗中，充分震荡混匀后，10000rpm离心3分钟，取上清水相4℃保存备用待检。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将梯度稀释的标准抗原、待检样品和阴性对照在免疫琼脂板中加样；扩散条件为：20-25℃反应12h-16h。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的所述漂洗为：将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，期间换PBS缓冲液3-5次。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的所述干燥为：从PBS中取出免疫琼脂板，用粗滤纸吸取免疫琼脂板水分30min以上，放入56℃干燥至滤纸完全干燥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的所述染色为：用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的免疫琼脂板4-6min；所述脱色为：用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为：用数显游标卡尺测量沉淀圈；以标准抗原形成的沉淀环的直径对其相应的抗原浓度作回归曲线，得到直线回归方程y＝ax+b，代入待检样品孔的沉淀环平均直径，即得到待检样品抗原的含量；
其中，y为标准品或样品的沉淀环直径，x为标准品或样品的抗原含量，R2>0.85。
CN201510189168.6A 2015-04-21 2015-04-21 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法 Pending CN104792985A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510189168.6A CN104792985A (zh) 2015-04-21 2015-04-21 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510189168.6A CN104792985A (zh) 2015-04-21 2015-04-21 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104792985A true CN104792985A (zh) 2015-07-22

Family

ID=53557962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510189168.6A Pending CN104792985A (zh) 2015-04-21 2015-04-21 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104792985A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105467138A (zh) * 2015-12-04 2016-04-06 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033695A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-14 Chiron Srl Digital imaging of single radial immunodiffusion assays
CN1768267A (zh) * 2003-03-28 2006-05-03 安尼生物科技公司 多通道测试装置、其生产方法及其用途
CN101253261A (zh) * 2005-07-05 2008-08-27 明尼苏达大学董事会 诊断检测试剂盒
WO2009040343A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Nobilon International B.V. Inactivated influenza vaccine
CN101971030A (zh) * 2007-12-24 2011-02-09 诺华有限公司 流感吸附疫苗的试验
WO2011036220A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunodiffusion assay for influenza virus
CN102323427A (zh) * 2011-08-09 2012-01-18 上海北加生化试剂有限公司 一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768267A (zh) * 2003-03-28 2006-05-03 安尼生物科技公司 多通道测试装置、其生产方法及其用途
WO2005033695A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-14 Chiron Srl Digital imaging of single radial immunodiffusion assays
CN101253261A (zh) * 2005-07-05 2008-08-27 明尼苏达大学董事会 诊断检测试剂盒
WO2009040343A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Nobilon International B.V. Inactivated influenza vaccine
CN101971030A (zh) * 2007-12-24 2011-02-09 诺华有限公司 流感吸附疫苗的试验
WO2011036220A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunodiffusion assay for influenza virus
CN102323427A (zh) * 2011-08-09 2012-01-18 上海北加生化试剂有限公司 一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. JOHANNSEN ET AL: "Quantification of haemagglutinin of influenza Tween-ether split vaccines by immunodiffusion", 《VACCINE》 *
S.S. GANDHI: "The effect of formaldehyde treatment of influenza virus on the assay of its haemagglutinin antigen content by the single-radial-immunodiffusion (SRD) technique", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL STANDARDIZATION》 *
娄华等: "应用琼脂免疫扩散试验检测番鸭细小病毒抗体", 《中国兽医科技》 *
尹少甫: "免疫单扩散法(SRID)测定纯化灭活流感病毒疫苗血凝素含量及其方法学的研究", 《兰州医学学院学报》 *
常维山等: "苯酚在兽医生物制品检测中的应用", 《中国兽药杂志》 *
李维义等: "应用琼脂扩散试验检测新城疫抗原", 《中国畜禽传染病》 *
费东亮等: "禽流感检测方法研究进展", 《畜牧兽医杂志》 *
赵增连等: "一种敏感的禽流感病毒快速定型双扩散法", 《中国兽医学报》 *
陈传桂等: "PEG-6000在单向免疫扩散法中的应用", 《上海医学检验杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105467138A (zh) * 2015-12-04 2016-04-06 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法
CN105467138B (zh) * 2015-12-04 2018-01-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Van Deusen et al. Micro neuraminidase-inhibition assay for classification of influenza A virus neuraminidases
CN103901208B (zh) 能够更好地在医疗制品中检测非内毒素致热污染物的改进的单核细胞活化测试
Spackman et al. Hemagglutination inhibition assay
Russell et al. A single radial haemolysis technique for the measurement of influenza antibody
CN103837674A (zh) 特异性IgE抗体的检测方法、该方法所使用的试剂盒以及该试剂盒的制备和使用方法
CN107748252A (zh) 基于荧光微球的检测山羊传染性胸膜肺炎抗体的免疫试纸卡、制备及检测方法
CN105259354A (zh) 结核T细胞释放γ-干扰素检测试剂盒及其使用方法
CN105203477A (zh) 一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的检测方法
CN102426258B (zh) 鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清国家标准品及制备方法
CN106290868A (zh) 荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体免疫层析试剂盒
CN102662063A (zh) 口蹄疫病毒多种非结构蛋白抗体斑点印迹检测试剂盒及方法
CN102268488A (zh) 检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN104792985A (zh) 定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法
CN110672850A (zh) 甲型肝炎病毒抗体IgM检测试剂盒及其制备方法
CN101825635A (zh) 梅毒特异性IgG抗体与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法
CN103954772B (zh) 一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条
CN113624972A (zh) 一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒
Chambers et al. Equine influenza serological methods
JP4969245B2 (ja) 免疫測定方法およびそれに用いる免疫測定用キット
CN102050876A (zh) 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法
CN106771121A (zh) 一种口蹄疫病毒胶体金试纸条、病原快速检测试剂盒及其制备方法
CN105891469B (zh) 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒检测试纸条及其制备方法
CN102619131B (zh) 胶体金免疫配套吸水材料及其制备方法
CN102778568B (zh) 一种检测发热伴血小板减少综合征病毒总抗体elisa试剂盒的制备和应用
CN102435732A (zh) 弓形虫IgM抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150722