CN102323427A - 一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法 - Google Patents
一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程领域,提供了一种免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒,解决了现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体C1q浓度步骤复杂,准确性不高、重复性差的技术问题,包括两种试剂,第一种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000、EDTA-NA2和TX-100组成,第二种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000、EDTA-NA2、TX-100和兔抗人补体C1q抗血清组成。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测人血清中补体Clq浓度的方法,本发明的试剂盒和方法用测定补体C1q浓度的步骤简单方便,准确性高、重复性好,用于自动化分析仪。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,尤其涉及一种检测试剂盒,特别是一种免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测人血清中和关节腔液中补体Clq浓度的试剂盒及其方法。
背景技术
补体Clq是补体系统Cl的第一组成成份,是一个巨分子量糖蛋白,一个Clq分子由18个多肽链成,化学组成为胶原性蛋白分子量:410KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体Clq浓度,但是其步骤复杂,准确性不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法,所述的这种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒及其方法要解决现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体Clq浓度过程复杂,准确性不高的技术问题。
本发明提供了一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒,包括两种试剂,第一种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、聚乙二醇6000(PEG6000)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-NA2)和曲拉通100(TX-100)组成,在所述的第一种试剂中,所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L,所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L,所述的聚乙二醇6000的质量百分比浓度为50g/L,所述的乙二胺四乙酸二钠的质量百分比浓度为1g/L,所述的曲拉通100的体积浓度为0.2ml/L,第二种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸二钠和曲拉通100和兔抗人补体Clq抗血清组成,在所述的第二种试剂中,所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L,所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L,所述的聚乙二醇6000的质量百分比浓度为50g/L,所述的乙二胺四乙酸二钠的质量百分比浓度为1g/L,所述的曲拉通100的体积浓度为0.2ml/L,所述的兔抗人补体Clq抗血清的体积浓度为300ml/L。
具体的,上述的曲拉通100的纯度为100%,上述兔抗人补体Clq抗血清的效价1∶64。
本发明还提供了一种检测人血清中补体Clq浓度的方法,采用上述的试剂盒,包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤,在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中,将样品加入第一种试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点样本A1,加入第二种试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点样本A2,样本A=样本A2-样本A1;还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤,在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中,将校准加入第一种试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点校准A1,加入第二种试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点校准A2,校准A=校准A2-校准A1;
结果计算:
上述测定的参数为:温度37℃;主波长340nm,副波长700nm,样本或校准品4μl;R1:240μl;R2:60μl,反应时间10分钟。
本发明的兔抗人补体Clq抗血清可以在市场购买,也可以通过常规的免疫方法制备。
本发明的试剂盒和方法是采用免疫透射比浊法和免疫散射比浊法的测定原理,即利用补体Clq抗原和特异性抗体(兔抗人补体Clq抗血清)相结合,形成不溶性免疫复合物,使反应液产生浑浊,其浊度高低,即透光度减少、吸光度增加反映人血清样本中补体Clq的浓度,补体Clq的浓度可由校准品所作的剂量反应曲线算出。
采用本发明的试剂盒和方法测得的CLq的浓度可以作为科研和教学使用。
本发明和已有技术相比,其技术进步是显著的。本发明的试剂盒和方法用于测定补体Clq浓度的过程简单方便,准确性高。
附图说明
图1是由校准品所作的补体Clq浓度和吸光度的剂量反应曲线图。
具体实施方式
实施例1
1.1试剂盒规格
1.2组份
R1:磷酸氢二钠 28.6g/L 磷酸二氢钾 2.7g/L
PEG6000 50g/L EDTA-NA2 1g/L
TX-100 0.2ml/L
R2:磷酸氢二钠 28.6g/L 磷酸二氢钾 2.7g/L
PEG6000 50g/L EDTA-NA2 1g/L
TX-100 0.2ml/L 兔抗人补体Clq抗血清 300ml/L
1.3适用仪器
半自动、全自动生化分析仪。
1.4分析方法
免疫透射比浊法。
1.5样本要求
使用人血清,2-8℃保存,24小时内检测,如不能在24小时之内检测,放于-20℃保存4月,溶血和严重脂血(如乳糜状)样品不能使用。
1.6性能要求
1.6.1试剂外观
R1:无色澄清透明液体;
R2:淡黄色澄清液体。
1.6.2试剂空白吸光度(A)
吸光度(A):R1+R2≤0.04A(在温度37℃;主波长340nm(副波长700nm))。
1.6.3精密度
1.6.3.1批内精密度
CV≤10%。
1.6.4批间精密度
相对极差≤10%。
1.6.5准确度
不准确度:±10%的范围以内。
1.6.6分析灵敏度
吸光度(A)>0.04A。
1.6.7线性
在50mg/L-400mg/L范围内,相关系数(γ)≥0.9900。
1.6.8稳定性
试剂在2℃-8℃避光贮存至有效期末前后两个月,进行检测,其质量符合上项的规定。
实施例2 实验方法
2.1检测条件
2.1.1生化分析仪(以下简称仪器)
日立7060自动生化分析仪。
2.1.2工作环境温度
室温15-32℃。
室内湿度45-85%RH。
2.1.3主要测定参数及操作步骤
温度37℃;主波长340nm(副波长700nm),样本或校准品4μl;R1:240μl;R2:60μl,反应时间10分钟。
方法类型:二点终点法。
样本或校准品加试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点(A1),加入试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点(A2),样本A=A2-A1。
结果计算:
2.1.4校准品
本标准中所用校准品为浙江省玉环县南方试剂厂生产的标准品。
2.2试剂外观
光下目测试剂盒,R1:无色澄清透明液体;R2:淡黄色澄清液体。
2.3试剂空白吸光度值
取R1240μl,加蒸馏水4μl,置37℃孵育5min后,加入R260μl,置37℃孵育5min后,在7060自动生化分析仪上,用340nm波长,测定其吸光度值应符合实施例1中1.6.2项的规定。
2.4精密度
2.4.1批内精密度试验方法
在仪器正常工作条件下,用同一批试剂,连续测试(约200mg/L)样本20次,计算其测量值的平均值和标准差(SD),再按以下公式计算变异系数(CV%)的值,其结果应符合实施例1中1.6.3.1项的规定。
n
SD={∑(Xi-X)2/(N-1)}1/2
I=1
式中:SD-标准偏差;
CV-变异系数;
Xi-第i次的测定值;
n-测量次数。
2.4.2批间精密度试验方法
在仪器正常工作条件下,取三个批号试剂,每个批号取一套。分别测定(约200mg/L)样本各3次。然后计算每批测定结果的均值和三批试剂测定结果的总均值按照下列公式求出三个批号试剂的测定均值的相对极差(%),其结果应符合实施例1中1.6.4项的规定。
2.5准确度
在仪器正常工作条件下,试剂用浙江玉环南方试剂厂生产的标准品经定标后,测定已知浓度的样本,重复测定10次,其测量结果的均值的相对偏差应符合实施例1中1.6.5项的规定。
RE%=绝对偏差/TV×100%
绝对偏差=检测结果均值-标准品靶值
式中:TV-测定标准品的靶值
2.6分析灵敏度
R1试剂240μl,加入50mg/L样本4μl,置37℃孵育5min后,加入R260μl,置37℃孵育5min后,在7060自动生化分析仪上,用340nm主波长(副波长700nm),测吸光度,其结果应符合实施例1中1.6.6项的规定。
2.7线性试验
样本或校准品:选用按实施例3配制的1#、2#、3#、4#、和5#各测试浓度样本或校准品。
测定步骤:在仪器正常工作条件下,经定标后,用试剂测定以上五个浓度样本或校准品,每一浓度样本或校准品分别测定3次,取均值为实测值Yi。
计算:按以下公式计算相关系数γ,其结果应符合实施例1中1.6.7项的规定。
式中:γ-相关系数
Xi-i#样本的理论值
Yi-i#样本的实测值
i-不同浓度测试样本的编号
5.8稳定性
取在规定贮存条件下保存至有效期末前后二个月内的试剂进行检测,其结果应符合实施例1中1.6.8项的规定。
实施例3 试剂的配制
取一含量约为200mg/L的样本,为样本4#,将样本4#按下表方法用生理盐水或纯水配制成5个测试样本。(此样本现用现配)
1# | 2# | 3# | 4# | 5# | |
校准品 | - | 4μl | 2μl | 4μl | 8μl |
生理盐水 | 4μl | 12μl | - | - | - |
稀释后取样量 | - | 4μl | - | - | - |
浓度(mg/L) | 0 | 50 | 100 | 200 | 400 |
样本或校准品加试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点(A1),加入试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点(A2),样本A=A2-A1。
结果仪器计算:
通过上述样品的测定,得到了图1所示的补体Clq浓度和吸光度的剂量反应曲线图。
(图1是根据波长340nm的OD值所做的曲线,波长700nm的仅供参考用。)
通过图1,测定了500例正常人的血清,结果如下表描述,根据卫生部医政司“全国临床检验规程”中介绍的补体Clq在血清中正常参考值:157-237mg/L,说明采用本发明的试剂盒和方法测定的Clq的浓度还是准确的和可靠的。
500例健康人人血清中补体Clq浓度(mg/L)
人数 | 数值 | 人数 | 数值 | 人数 | 数值 | 人数 | 数值 | 人数 | 数值 | 人数 | 数值 |
1 | 179 | 9 | 196 | 17 | 196 | 25 | 221 | 33 | 206 | 41 | 195 |
2 | 174 | 10 | 199 | 18 | 178 | 26 | 205 | 34 | 195 | 42 | 205 |
3 | 166 | 11 | 201 | 19 | 221 | 27 | 192 | 35 | 206 | 43 | 200 |
4 | 198 | 12 | 193 | 20 | 207 | 28 | 196 | 36 | 182 | 44 | 198 |
5 | 206 | 13 | 194 | 21 | 197 | 29 | 213 | 37 | 198 | 45 | 215 |
6 | 195 | 14 | 203 | 22 | 194 | 30 | 206 | 38 | 196 | 46 | 161 |
7 | 216 | 15 | 221 | 23 | 184 | 31 | 191 | 39 | 194 | 47 | 180 |
8 | 194 | 16 | 196 | 24 | 207 | 32 | 192 | 40 | 226 | 48 | 196 |
49 | 205 | 78 | 195 | 107 | 196 | 136 | 206 | 165 | 196 | 194 | 193 |
50 | 200 | 79 | 194 | 108 | 194 | 137 | 200 | 166 | 192 | 195 | 203 |
51 | 160 | 80 | 206 | 109 | 196 | 138 | 192 | 167 | 194 | 196 | 191 |
52 | 194 | 81 | 187 | 110 | 199 | 139 | 196 | 168 | 195 | 197 | 200 |
53 | 206 | 82 | 198 | 111 | 199 | 140 | 197 | 169 | 217 | 198 | 198 |
54 | 184 | 83 | 225 | 112 | 200 | 141 | 195 | 170 | 198 | 199 | 183 |
55 | 163 | 84 | 217 | 113 | 196 | 142 | 196 | 171 | 196 | 200 | 226 |
56 | 206 | 85 | 193 | 114 | 195 | 143 | 198 | 172 | 193 | 201 | 195 |
57 | 207 | 86 | 195 | 115 | 196 | 144 | 199 | 173 | 188 | 202 | 198 |
58 | 205 | 87 | 204 | 116 | 194 | 145 | 232 | 174 | 198 | 203 | 194 |
59 | 198 | 88 | 196 | 117 | 196 | 146 | 193 | 175 | 195 | 204 | 206 |
60 | 195 | 89 | 198 | 118 | 201 | 147 | 194 | 176 | 194 | 205 | 198 |
61 | 230 | 90 | 196 | 119 | 195 | 148 | 196 | 177 | 229 | 206 | 198 |
62 | 197 | 91 | 195 | 120 | 191 | 149 | 163 | 178 | 195 | 207 | 191 |
63 | 194 | 92 | 182 | 121 | 193 | 150 | 195 | 179 | 204 | 208 | 195 |
64 | 195 | 93 | 207 | 122 | 195 | 151 | 196 | 180 | 199 | 209 | 193 |
65 | 195 | 94 | 198 | 123 | 179 | 152 | 172 | 181 | 198 | 210 | 195 |
66 | 198 | 95 | 217 | 124 | 197 | 153 | 192 | 182 | 183 | 211 | 161 |
67 | 205 | 96 | 203 | 125 | 197 | 154 | 203 | 183 | 195 | 212 | 199 |
68 | 204 | 97 | 192 | 126 | 166 | 155 | 229 | 184 | 196 | 213 | 219 |
69 | 187 | 98 | 196 | 127 | 195 | 156 | 197 | 185 | 198 | 214 | 195 |
70 | 228 | 99 | 229 | 128 | 194 | 157 | 226 | 186 | 205 | 215 | 192 |
71 | 199 | 100 | 197 | 129 | 196 | 158 | 198 | 187 | 206 | 216 | 187 |
72 | 196 | 101 | 192 | 130 | 196 | 159 | 196 | 188 | 196 | 217 | 196 |
73 | 198 | 102 | 195 | 131 | 195 | 160 | 200 | 189 | 201 | 218 | 193 |
74 | 196 | 103 | 181 | 132 | 193 | 161 | 192 | 190 | 233 | 219 | 206 |
75 | 184 | 104 | 186 | 133 | 201 | 162 | 184 | 191 | 226 | 220 | 197 |
76 | 202 | 105 | 194 | 134 | 193 | 163 | 188 | 192 | 188 | 221 | 194 |
77 | 196 | 106 | 198 | 135 | 228 | 164 | 204 | 193 | 194 | 222 | 195 |
223 | 207 | 252 | 204 | 281 | 193 | 310 | 182 | 339 | 165 | 368 | 198 |
224 | 228 | 253 | 216 | 282 | 207 | 311 | 196 | 340 | 196 | 369 | 219 |
225 | 199 | 254 | 196 | 283 | 205 | 312 | 189 | 341 | 202 | 370 | 192 |
226 | 200 | 255 | 207 | 284 | 191 | 313 | 206 | 342 | 216 | 371 | 221 |
227 | 196 | 256 | 199 | 285 | 196 | 314 | 198 | 343 | 184 | 372 | 196 |
228 | 198 | 257 | 192 | 286 | 221 | 315 | 200 | 344 | 195 | 373 | 206 |
229 | 197 | 258 | 222 | 287 | 195 | 316 | 229 | 345 | 194 | 374 | 196 |
230 | 196 | 259 | 201 | 288 | 173 | 317 | 194 | 346 | 183 | 375 | 192 |
231 | 197 | 260 | 194 | 289 | 198 | 318 | 186 | 347 | 196 | 376 | 189 |
232 | 196 | 261 | 206 | 290 | 191 | 319 | 191 | 348 | 203 | 377 | 203 |
233 | 195 | 262 | 171 | 291 | 184 | 320 | 163 | 349 | 196 | 378 | 196 |
234 | 197 | 263 | 192 | 292 | 217 | 321 | 197 | 350 | 201 | 379 | 197 |
235 | 219 | 264 | 199 | 293 | 182 | 322 | 231 | 351 | 192 | 380 | 196 |
236 | 194 | 265 | 206 | 294 | 183 | 323 | 190 | 352 | 201 | 381 | 190 |
237 | 199 | 266 | 194 | 295 | 186 | 324 | 189 | 353 | 199 | 382 | 179 |
238 | 193 | 267 | 207 | 296 | 200 | 325 | 187 | 354 | 198 | 383 | 192 |
239 | 196 | 268 | 196 | 297 | 199 | 326 | 192 | 355 | 194 | 384 | 190 |
240 | 201 | 269 | 198 | 298 | 182 | 327 | 196 | 356 | 197 | 385 | 196 |
241 | 198 | 270 | 193 | 299 | 233 | 328 | 196 | 357 | 195 | 386 | 195 |
242 | 200 | 271 | 171 | 300 | 189 | 329 | 191 | 358 | 162 | 387 | 183 |
243 | 196 | 272 | 203 | 301 | 159 | 330 | 160 | 359 | 209 | 388 | 208 |
244 | 163 | 273 | 189 | 302 | 194 | 331 | 196 | 360 | 219 | 389 | 198 |
245 | 196 | 274 | 195 | 303 | 201 | 332 | 188 | 361 | 233 | 390 | 194 |
246 | 227 | 275 | 206 | 304 | 182 | 333 | 194 | 362 | 221 | 391 | 203 |
247 | 159 | 276 | 219 | 305 | 166 | 334 | 198 | 363 | 190 | 392 | 220 |
248 | 191 | 277 | 207 | 306 | 184 | 335 | 201 | 364 | 213 | 393 | 195 |
249 | 195 | 278 | 196 | 307 | 196 | 336 | 196 | 365 | 196 | 394 | 180 |
250 | 209 | 279 | 206 | 308 | 201 | 337 | 195 | 366 | 184 | 395 | 159 |
251 | 226 | 280 | 194 | 309 | 184 | 338 | 205 | 367 | 229 | 396 | 204 |
397 | 192 | 421 | 199 | 445 | 197 | 469 | 199 | 493 | 203 | 397 | 192 |
398 | 195 | 422 | 197 | 446 | 196 | 470 | 184 | 494 | 233 | 398 | 195 |
399 | 197 | 423 | 182 | 447 | 196 | 471 | 191 | 495 | 172 | 399 | 197 |
400 | 195 | 424 | 205 | 448 | 201 | 472 | 197 | 496 | 224 | 400 | 195 |
401 | 193 | 425 | 197 | 449 | 178 | 473 | 196 | 497 | 160 | ||
402 | 187 | 426 | 203 | 450 | 207 | 474 | 204 | 498 | 164 | ||
403 | 191 | 427 | 190 | 451 | 213 | 475 | 205 | 499 | 184 | ||
404 | 181 | 428 | 195 | 452 | 164 | 476 | 196 | 500 | 159 | ||
405 | 197 | 429 | 161 | 453 | 229 | 477 | 180 | ||||
406 | 232 | 430 | 181 | 454 | 192 | 478 | 194 | ||||
407 | 210 | 431 | 198 | 455 | 172 | 479 | 196 | ||||
408 | 182 | 432 | 191 | 456 | 200 | 480 | 193 | ||||
409 | 179 | 433 | 170 | 457 | 194 | 481 | 196 | ||||
410 | 188 | 434 | 233 | 458 | 181 | 482 | 177 | ||||
411 | 209 | 435 | 193 | 459 | 178 | 483 | 196 | ||||
412 | 196 | 436 | 232 | 460 | 171 | 484 | 229 | ||||
413 | 180 | 437 | 204 | 461 | 189 | 485 | 198 | ||||
414 | 173 | 438 | 230 | 462 | 202 | 486 | 196 | ||||
415 | 194 | 439 | 159 | 463 | 166 | 487 | 163 | ||||
416 | 164 | 440 | 174 | 464 | 208 | 488 | 160 | ||||
417 | 200 | 441 | 184 | 465 | 211 | 489 | 233 | ||||
418 | 189 | 442 | 164 | 466 | 195 | 490 | 160 | ||||
419 | 173 | 443 | 189 | 467 | 196 | 491 | 191 | ||||
420 | 181 | 444 | 193 | 468 | 199 | 492 | 161 |
Claims (4)
1.一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒,包括两种试剂,其特征在于:第一种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000 、EDTA-NA2 和TX-100组成,在所述的第一种试剂中,所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L,所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L,所述的PEG6000的质量百分比浓度为50g/L ,所述的EDTA-NA2的质量百分比浓度为1g/L,所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L,第二种试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000 、EDTA-NA2 、TX-100和兔抗人补体C1q抗血清组成,在所述的第二种试剂中,所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L,所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L,所述的PEG6000的质量百分比浓度为50g/L ,所述的EDTA-NA2的质量百分比浓度为1g/L,所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L,所述的兔抗人补体C1q抗血清的体积浓度为300ml/L。
2.如权利要求1所述的一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒,其特征在于:所述的曲拉通100的纯度为100%。
3.如权利要求1所述的一种检测人血清中补体Clq浓度的试剂盒,其特征在于:所述的兔抗人补体C1q抗血清的效价为1:64。
4.一种检测人血清中补体Clq浓度的方法, 其特征在于采用权利要求1所述的试剂盒,包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤,在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中,将样品加入第一种试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点样本A1,加入第二种试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点样本A2,样本A=样本A2-样本A1;还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤,在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中,将校准加入第一种试剂R1后,37℃孵育5min,读测第1点校准A1,加入第二种试剂R2,37℃孵育5min,读测第2点校准A2,校准A=校准A2-校准A1;
样本A2-样本A1
补体Clq浓度(mg/L)= ×校准品浓度(mg/L)
校准A2-校准A1
上述测定的参数为:温度37℃,主波长340nm,副波长700nm,样本或校准品4μl,R1:240μl,R2:60μl,反应时间为10分钟。
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