CN102650641B9 - 增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测血清中补体Clq浓度的试剂盒，解决了现有技术采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体C1q浓度步骤复杂，准确性不高、重复性差的技术问题。包括两种试剂，Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000、EDTA-NA₂和TX-100组成，Ⅱ试剂由兔抗人补体C1q抗血清或羊抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q单克隆抗体交联在胶乳颗粒上悬浊液组成。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测人血清中补体Clq浓度的方法，本发明的试剂盒和方法用于测定补体C1q浓度的步骤简单方便，准确度高、重复性好，用于自动化分析仪。

Description

增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种检测试剂盒，特别是一种采用增强纳米胶乳免疫比浊法检测人血清中和关节腔液中补体Clq浓度的试剂盒及其方法。

背景技术

补体Clq是补体系统Cl的第一组成成份，是一个巨分子量糖蛋白，一个Clq分子由18个多肽链成，化学组成为胶原性蛋白分子量：410KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体Clq浓度，但是其步骤复杂，准确性不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒及方法，所述的这种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒及方法要解决现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定补体Clq浓度过程复杂，准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒，包括两种试剂，其特征在于：I试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、EDTA-NA2和TX-100组成，在I试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量浓度为2.7g/L，所述的PEG6000的质量浓度为50g/L，所述的EDTA-NA2的质量浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，II试剂由兔抗人补体Clq抗血清或羊抗人补体Clq抗血清或鼠抗人补体Clq抗血清或鼠抗人补体Clq单克隆抗体交联在胶乳颗粒上悬浊液组成。

进一步的，所述的II试剂是通过碳二亚胺反应将兔抗补体Clq抗体、或羊抗补体Clq抗体、或鼠抗补体Clq抗体，或鼠抗人补体Clq单克隆抗体、IgG共价结合到胶乳颗粒上。

进一步的，所述的TX-100的纯度为100％。

进一步的，所述的兔抗人补体Clq抗血清的效价为1∶64。

本发明还提供了一种检测人血清中补体Clq浓度的方法，采用上述的试剂盒，包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样本加入I试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入II试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中，将校准加入I试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入II试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

结果计算：

上述测定的参数为：温度37℃，主波长546nm或600nm、副波长700nm，样本或校准品3-4μl，R₁：240μl，R₂：60μl，反应时间为10分钟。

本发明的兔抗人补体Clq抗血清或羊抗人补体Clq抗血清或鼠抗人补体Clq抗血清或鼠抗人补体Clq单克隆抗体可以在市场购买，也可以通过常规的免疫方法制备。

本发明的试剂盒和方法是采用增强纳米胶乳免疫比浊法的测定原理，即利用补体Clq抗原和交联在乳胶颗粒上的兔抗人补体Clq抗血清、羊抗人补体Clq抗血清、鼠抗人补体Clq抗血清、鼠抗人补体Clq单克隆抗体相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊，其浊度高低，即透光度减少、吸光度增加反映人血清样本中补体Clq的浓度，补体Clq的浓度可由校准品所作的剂量反应曲线算出。

采用本发明的试剂盒和方法测得的CLq的浓度可以作为科研和教学使用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的试剂盒和方法用于测定补体Clq浓度的过程简单方便，准确性高。

附图说明

图1是由校准品所作的补体Clq浓度和吸光度的剂量反应曲线图。

具体实施方式

实施例1

1.1适用仪器

半自动、全自动生化分析仪。

1.2分析方法

增强纳米乳胶免疫比浊法。

1.3性能要求

1.3.1试剂外观

R1：无色澄清透明液体；

R2：淡黄色澄清液体或胶乳悬液。

1.3.2试剂空白吸光度(A)

吸光度(A)：R₁+R₂≤0.04A(在温度37℃；主波长546nm、600nm(副波长700nm))。

1.3.3精密度

1.3.3.1批内精密度

CV≤10％。

1.3.4批间精密度

相对极差≤10％。

1.3.5准确度

不准确度：±10％的范围以内。

1.3.6分析灵敏度

吸光度(A)＞0.04A。

1.3.7线性

在50mg/L-400mg/L范围内，相关系数(γ)≥0.9900。

1.3.8稳定性

试剂在2℃-8℃避光贮存至有效期末前后两个月，进行检测，其质量符合上项的规定。

实验方法

实施例2

2.1检测条件

2.1.1生化分析仪(以下简称仪器)

日立7060自动生化分析仪。

2.1.2工作环境温度

室温15-32℃。

室内湿度45-85％RH。

2.1.3主要测定参数及操作步骤

温度37℃；主波长546nm、600nm(副波长700nm)，样本或校准品3-4μl；R₁：240μl；R₂：60μl，反应时间10分钟。

方法类型：二点终点法。

样本或校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A＝A2-A1。

结果计算：

2.1.4校准品

本标准中所用校准品为浙江省玉环县南方试剂厂生产的标准品。

2.2试剂外观

光下目测试剂盒，R1：无色澄清透明液体；R2：淡黄色澄清液体。

2.3试剂空白吸光度值

取R₁240μl，加蒸馏水4μl，置37℃孵育5min后，加入R₂60μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用546nm、600nm波长，测定其吸光度值应符合实施例1中1.3.2项的规定。

2.4精密度

2.4.1批内精密度试验方法

在仪器正常工作条件下，用同一批试剂，连续测试(约200mg/L)样本20次，计算其测量值的平均值 和标准差(SD)，再按以下公式计算变异系数(CV％)的值，其结果应符合实施例1中1.3.3.1项的规定。

n

SD＝{∑(Xi-X)²/(N-1)}^1/2

I＝1

$\mathrm{CV}=\mathrm{SD}/\stackrel{\‾}{X}\×100\%$

式中：SD-标准偏差；

CV-变异系数；

-n次测定值的均值；

Xi-第i次的测定值；

n-测量次数。

2.4.2批间精密度试验方法

在仪器正常工作条件下，取三个批号试剂，每个批号取一套。分别测定(约200mg/L)样本各3次。然后计算每批测定结果的均值 和三批试剂测定结果的总均值 按照下列公式求出三个批号试剂的测定均值的相对极差(％)，其结果应符合实施例1中1.3.4项的规定。

式中： 为 中最大值， 为 中最小值。

2.5准确度

在仪器正常工作条件下，试剂用浙江玉环南方试剂厂生产的标准品经定标后，测定已知浓度的样本，重复测定10次，其测量结果的均值的相对偏差应符合实施例1中1.3.5项的规定。

RE％＝绝对偏差/TV×100％

绝对偏差＝检测结果均值-标准品靶值

式中：TV-测定标准品的靶值

2.6分析灵敏度

R₁试剂240μl，加入50mg/L样本4μl，置37℃孵育5min后，加入R₂60μl，置37℃孵育5min后，在7060自动生化分析仪上，用546nm、600nm，主波长(副波长700nm)，测吸光度，其结果应符合实施例1中1.3.6项的规定。

2.7线性试验

样本或校准品：选用按实施例3配制的1^#、2^#、3^#、4^#、和5^#各测试浓度样本或校准品。

测定步骤：在仪器正常工作条件下，经定标后，用试剂测定以上五个浓度样本或校准品，每一浓度样本或校准品分别测定3次，取均值为实测值Yi。

计算：按以下公式计算相关系数γ，其结果应符合实施例1中1.3.7项的规定。

$\mathrm{\γ}=(\mathrm{n\Σ}{X}_i{Y}_i-\mathrm{\Σ}{X}_i\·\mathrm{\Σ}{Y}_i)/\√\stackrel{\‾}{[\mathrm{n\Σ}{X_i}^2-{\left(\mathrm{\Σ}{X}_i\right)}^2][\mathrm{n\Σ}{Y_i}^2-{\left(\mathrm{\Σ}{Y}_i\right)}^2]}$

式中：γ-相关系数

Xi-i^#样本的理论值

Yi-i^#样本的实测值

i-不同浓度测试样本的编号

5.8稳定性

取在规定贮存条件下保存至有效期末前后二个月内的试剂进行检测，其结果应符合实施例1中1.3.8项的规定。

实施例3

试剂的配制

取一含量约为200mg/L的样本，为样本4^#，将样本4^#按下表方法用生理盐水或纯水配制成5个测试样本。(此样本现用现配)

	1#	2#	3#	4#	5#
						校准品	-	4μl	2μl	4μl	8μl
生理盐水	4μl	12μl	-	-	-
						稀释后取样量	-	4μl	-	-	-
浓度(mg/L)	0	50	100	200	400

样本或校准品加试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点(A1)，加入试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点(A2)，样本A＝A2-A1。

结果仪器计算：

通过上述样品的测定，得到了图1所示的补体Clq浓度和吸光度的剂量反应曲线图。

(图1是根据波长600nm的OD值所做的曲线，副波长700nm的仅供参考用。)

通过图1，测定了500例正常人的血清，结果如下表描述，根据卫生部医政司“全国临床检验规程”中介绍的补体Clq在血清中正常参考值：157-237mg/L，说明采用本发明的试剂盒和方法测定的Clq的浓度还是准确的和可靠的。

500例健康人人血清中补体Clq浓度(mg/L)

人数	数值	人数	数值	人数	数值	人数	数值	人数	数值	人数	数值
												1	179	9	196	17	196	25	221	33	206	41	195
2	174	10	199	18	178	26	205	34	195	42	205
												3	166	11	201	19	221	27	192	35	206	43	200
4	198	12	193	20	207	28	196	36	182	44	198
												5	206	13	194	21	197	29	213	37	198	45	215
6	195	14	203	22	194	30	206	38	196	46	161
												7	216	15	221	23	184	31	191	39	194	47	180
8	194	16	196	24	207	32	192	40	226	48	196

49	205	78	195	107	196	136	206	165	196	194	193
												50	200	79	194	108	194	137	200	166	192	195	203
51	160	80	206	109	196	138	192	167	194	196	191
												52	194	81	187	110	199	139	196	168	195	197	200
53	206	82	198	111	199	140	197	169	217	198	198
												54	184	83	225	112	200	141	195	170	198	199	183
55	163	84	217	113	196	142	196	171	196	200	226
												56	206	85	193	114	195	143	198	172	193	201	195
57	207	86	195	115	196	144	199	173	188	202	198
												58	205	87	204	116	194	145	232	174	198	203	194
59	198	88	196	117	196	146	193	175	195	204	206
												60	195	89	198	118	201	147	194	176	194	205	198
61	230	90	196	119	195	148	196	177	229	206	198
												62	197	91	195	120	191	149	163	178	195	207	191
63	194	92	182	121	193	150	195	179	204	208	195
												64	195	93	207	122	195	151	196	180	199	209	193
65	195	94	198	123	179	152	172	181	198	210	195
												66	198	95	217	124	197	153	192	182	183	211	161
67	205	96	203	125	197	154	203	183	195	212	199
												68	204	97	192	126	166	155	229	184	196	213	219
69	187	98	196	127	195	156	197	185	198	214	195
												70	228	99	229	128	194	157	226	186	205	215	192
71	199	100	197	129	196	158	198	187	206	216	187
												72	196	101	192	130	196	159	196	188	196	217	196
73	198	102	195	131	195	160	200	189	201	218	193
												74	196	103	181	132	193	161	192	190	233	219	206
75	184	104	186	133	201	162	184	191	226	220	197
												76	202	105	194	134	193	163	188	192	188	221	194
77	196	106	198	135	228	164	204	193	194	222	195

223	207	252	204	281	193	310	182	339	165	368	198
												224	228	253	216	282	207	311	196	340	196	369	219
225	199	254	196	283	205	312	189	341	202	370	192
												226	200	255	207	284	191	313	206	342	216	371	221
227	196	256	199	285	196	314	198	343	184	372	196
												228	198	257	192	286	221	315	200	344	195	373	206
229	197	258	222	287	195	316	229	345	194	374	196
												230	196	259	201	288	173	317	194	346	183	375	192
231	197	260	194	289	198	318	186	347	196	376	189
												232	196	261	206	290	191	319	191	348	203	377	203
233	195	262	171	291	184	320	163	349	196	378	196
												234	197	263	192	292	217	321	197	350	201	379	197
235	219	264	199	293	182	322	231	351	192	380	196
												236	194	265	206	294	183	323	190	352	201	381	190
237	199	266	194	295	186	324	189	353	199	382	179
												238	193	267	207	296	200	325	187	354	198	383	192
239	196	268	196	297	199	326	192	355	194	384	190
												240	201	269	198	298	182	327	196	356	197	385	196
241	198	270	193	299	233	328	196	357	195	386	195
												242	200	271	171	300	189	329	191	358	162	387	183
243	196	272	203	301	159	330	160	359	209	388	208
												244	163	273	189	302	194	331	196	360	219	389	198
245	196	274	195	303	201	332	188	361	233	390	194
												246	227	275	206	304	182	333	194	362	221	391	203
247	159	276	219	305	166	334	198	363	190	392	220
												248	191	277	207	306	184	335	201	364	213	393	195
249	195	278	196	307	196	336	196	365	196	394	180
												250	209	279	206	308	201	337	195	366	184	395	159
251	226	280	194	309	184	338	205	367	229	396	204

397	192	421	199	445	197	469	199	493	203	397	192
												398	195	422	197	446	196	470	184	494	233	398	195
399	197	423	182	447	196	471	191	495	172	399	197
												400	195	424	205	448	201	472	197	496	224	400	195
401	193	425	197	449	178	473	196	497	160
												402	187	426	203	450	207	474	204	498	164
403	191	427	190	451	213	475	205	499	184
												404	181	428	195	452	164	476	196	500	159
405	197	429	161	453	229	477	180
												406	232	430	181	454	192	478	194
407	210	431	198	455	172	479	196
												408	182	432	191	456	200	480	193
409	179	433	170	457	194	481	196
												410	188	434	233	458	181	482	177
411	209	435	193	459	178	483	196
												412	196	436	232	460	171	484	229
413	180	437	204	461	189	485	198
												414	173	438	230	462	202	486	196
415	194	439	159	463	166	487	163
												416	164	440	174	464	208	488	160
417	200	441	184	465	211	489	233
												418	189	442	164	466	195	490	160
419	173	443	189	467	196	491	191
												420	181	444	193	468	199	492	161

Claims (2)

1.一种增强纳米胶乳免疫比浊法检测补体Clq浓度的试剂盒，包括两种试剂，其特征在于：Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000 、EDTA-NA2 和TX-100组成，在Ⅰ试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量浓度为2.7g/L，所述的PEG6000的质量浓度为50g/L ，所述的EDTA-NA₂的质量浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，Ⅱ试剂由兔抗人补体C1q抗血清或羊抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q抗血清或鼠抗人补体C1q单克隆抗体交联在胶乳颗粒上悬浊液组成，所述的Ⅱ试剂是通过碳二亚胺反应将兔抗补体C1q抗体、或羊抗补体C1q抗体、或鼠抗补体C1q抗体，或鼠抗人补体C1q单克隆抗体、IgG共价结合到胶乳颗粒上，所述的TX-100的纯度为100％，所述的兔抗人补体C1q抗血清的效价为1:64。

2.一种检测人血清中补体Clq浓度的方法, 其特征在于采用权利要求1所述的试剂盒，包括一个将样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样本加入Ⅰ试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入Ⅱ试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准采用生化分析仪测定的步骤中，将校准加入Ⅰ试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入Ⅱ试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A=校准A2-校准A1；

样本A2-样本A1

补体Clq浓度(mg/L)= ×校准品浓度(mg/L)

校准A2-校准A1

上述测定的参数为：温度37℃,主波长546nm或600nm、副波长700nm，样本或校准品3-4μl,R₁：240μl,R₂：60μl，反应时间为10分钟。