CN101253261A - 诊断检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测能识别猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一种或多种蛋白质和/或抗原的抗体的试剂盒、装置和方法。所述抗体可存在于被PRRSV感染或有被PRRSV感染的风险的对象的生物液内。本发明优选用于PRRSV感染的诊断和预防。

Description

诊断检测试剂盒
相关申请的交叉参考
本申请要求2005年7月5日提交的美国非临时专利申请No.11/175,605的优先权，该申请被完整纳入本文，这就如同完整列出该申请一样。
发明领域
本发明涉及用于检测能识别猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一种或多种蛋白质和/或抗原的抗体的试剂盒、装置和方法。所述抗体可存在于被PRRSV感染或有被PRRSV感染的风险的对象的生物液内。本发明优选用于PRRSV感染的诊断和预防。
发明背景
在美国，养猪业遭受经济损失的主要原因是猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒或PRRSV。PRRSV是猪无法繁殖和呼吸系统疾病的致病因子。与PRRS相关的经济损失主要是由于该病毒可引起怀孕母猪流产以及正在成长的猪患呼吸系统疾病综合症(PRDC)。现在已经实践了不同的控制方法，其中包括使用疫苗和改善管理。参见，例如，美国专利5,690,940。尽管养猪场都会进行常规的免疫，但是爆发PRRSV也并非罕见。
PRRSV爆发最常见的原因是生物安全措施失效。已被PRRSV感染的后备母猪未经检测就放入饲养群中是生物安全措施失效的一个常见原因。如果养猪场采取简单而经济的方法来检测PRRSV感染，这些问题都可以解决。这种方法还可用于检测母猪所生产的断奶猪仔是否是无病毒的以及断奶猪仔在环境适应过程中是否能够保持无病毒状态。
为了检测PRRSV抗体，兽医应采集血样并送到兽医诊断实验室。目前，ELISA、间接荧光抗体试验以及免疫过氧化物单层分析是常用的检测抗PRRSV抗体的实验室方法。然而，这些方法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员。利用这些方法至少需要3天才能得到结果，其中包括邮寄结果的时间。另外，养猪农民为了采集样品并将其送到诊断实验室也要付出经济成本。一种用于检测PRRSV抗体的以养殖场为基础的简单而快速的试验在兽医诊所或养猪合作组织的实验室中是十分有用的。利用PRRSV疫苗来根除疾病在农户水平上通常是不成功的。方法如扑杀全部种群并从新建立种群可以有效地根除养殖场的病毒。但是，这种方法不能用于所有养殖场，并且操作起来经济损失相当大。
另外，这种方法依赖于PRRSV的检测。某些PRRS病毒株的核酸序列及其编码的蛋白已有报道。利用组织样品，其中包括肺组织，检测PRRSV也有讨论(参见WO96/06619)，其结果与PRRSV优先在肺泡肺巨噬细胞内复制的结果一致。通过口鼻途径感染以后，PRRSV在肺巨噬细胞内复制，再进入肺淋巴结，然后通过血流进入其他器官内。
本文所文献的引用并不等于承认这些文献是相关的在先领域。有关日期的所有描述或有关文献内容的陈述的根据是申请人所提供的信息，并不等于承认日期或文献内容的正确性。
发明概述
本发明涉及用于检测对象被猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，即PRRSV感染的试剂盒、装置和方法。检测可通过利用包含一种或多种PRRSV编码蛋白和/或抗原的组合物来完成，其中蛋白和/或抗原可与抗所述蛋白的抗体结合。因此，本发明可被视为是基于“抗体捕获”随后检测抗体的原理而建立的。抗体是指被PRRSV感染的对象体内存在而未感染个体内不存在的那些抗体。
一种或多种PRRSV编码的蛋白包括核壳(N)蛋白和/或一种或多种病毒包膜(“E”)蛋白。蛋白可以是PRRSV感染细胞表面上的糖蛋白。蛋白也可被认为是用于检测对象体内抗体的PRRSV抗原，其中抗体可识别PRRSV蛋白，从而识别PRRSV。
PRRSV蛋白和/或抗原优选用于本发明的试剂盒、装置和方法中以便于在早期时间点根据对抗PRRSV抗体的检测来检测PRRSV感染。这种检测方法依赖于抗体的存在，其中抗体是感染后早期被感染对象体内存在的抗至少一种如本文所述的PRRSV蛋白和/或抗原的抗体。
在第一方面，本发明提供了使用包含一种或多种PRRSV表达的蛋白和/或抗原的组合物来制造或使用本文所述试剂盒或装置的方法。在某些实施方式中，所述装置是被本发明的组合物包被的平皿。这种平皿的非限制性例子包括各种尺寸的培养皿以及微量滴定板的孔。这种平皿可用于诊断试验以检测抗组合物中所含的一种或多种PRRSV蛋白和/或抗原的抗体。因此，这种装置可用于检测是否存在抗组合物中所含的一种或多种PRRSV蛋白和/抗原的抗体。被检测的抗体可以存在于生物液样品中，如果存在抗体，它可以作为用来采集样品的对象存在PRRSV感染的指示剂。因此，该装置可作为一种诊断PRRSV感染是否存在的快速方式。
在本发明的这种装置的核心是以固定形式存在于组合物中的一种或多种PRRSV蛋白和/或抗原。作为非限制性的例子，PRRSV蛋白和/或抗原可直接，例如通过吸附(例如，包被)或通过结合，固定到装置的表面。另外，蛋白和/或抗原还可以间接固定，例如通过使用与蛋白和/或抗原结合的试剂或通过使用既和表面结合又和蛋白或抗原结合的连接子。因此，固定的PRRSV蛋白和/或抗原可以被看作是“捕获剂”用于抗蛋白和/或抗原的抗体的结合以形成包含蛋白和/或抗原的固定复合物。当然，固定的“捕获剂”可被看作是能“捕获”与因子结合的抗体的因子。
然后，如本文所述，利用“检测剂”检测复合物，例如，与复合物结合的标记试剂。如果“检测剂”与复合物结合则说明样品中存在抗-PRRSV抗体。在某些实施方式中，“检测剂”上标记有第二抗体，样品中如果存在抗体，第二抗体则与抗体结合，其中第二抗体作为复合物的一部分被固定。抗-PRRSV抗体的存在可作为对象体内存在PRRSV感染的指示剂，其中样品取自该对象。如果没有抗-PRRSV抗体则说明没有感染。样品优选取自猪对象或怀疑被PRRSV感染的其他对象，但是可能被PRRSV或PRRSV载体感染的任何对象都可用于本发明的装置中。
“检测剂”可以被标记以便于直接检测，例如，通过连接一个特殊的标记物，一旦充分凝集就可以用肉眼观察到。另外，因子可以被标记以便于间接检测，例如，通过连接一个酶，该酶被检测的依据是其对可检测底物的活性，或者该酶可产生一个可被检测的产物。当然，“检测剂”可以是“第二因子”，第二因子可结合能与本发明的复合物结合的标记或未标记“初级”结合因子。
本发明的装置还可以包含控制位点或控制区，其中控制位点或控制区位于装置内，无论加载到装置上的样品内是否存在PRRSV抗体，控制位点或控制区都能确保装置正确行使功能。这种控制的基础在于对样品内存在的其他分子或大分子实体的检测。
如果不能被所使用的装置的组分结合，本发明的PRRSV蛋白和/或抗原以及包含PRRSV抗原和/或蛋白的组合物还可用于检测抗PRRSV蛋白和/或抗原的抗体的方法中。这种方法可被设计成用于检测来自于对象的生物液内的这种抗体，例如怀疑已被PRRSV感染的个体。该方法包括使样品或其稀释形式与PRRSV编码蛋白和/或抗原接触以确定样品中是否存在与蛋白和/或抗原结合的抗体。抗体与PRRSV蛋白和/或抗原结合形成复合物，检测到这种复合物则说明存在抗体，因而说明对象体内存在PRRSV感染，其中样品取自该对象。样品优选来自猪对象，但是被PRRSV或PRRSV载体感染的任何对象都可用于本发明。
可用于实现本发明的生物液的范围包括其中存在可检测水平的抗PRRSV蛋白和/或抗原的抗体的任何液体。非限制性的例子包括对象的体液，如血液、血清、血浆、唾液、眼泪、粘液、鼻涕和阴道分泌物。当然，这种液体的稀释液也可作为样品用于实现本发明。在某些实施方式中，包含EDTA或其他二价阳离子螯合剂的稀释剂与来自于对象的生物液样品以1∶1的比例混合来使用。在使用血清或血浆的实施方式中，可以省略稀释步骤。
样品优选来自于怀疑已被PRRSV感染的个体，所以被怀疑是因为存在显示感染的症状。另外，本发明的方法可作为动物常规筛选的一部分来使用，例如养殖场所使用的用于快速鉴定和分离被感染个体的那些方法。方法还可在特殊的情况下使用，例如，在将动物从一个地方运输或转移到另一个地方前用于鉴定感染和防止感染扩散。在本发明的许多实施方式中，对象是猪，因此样品可以是猪的体液或分泌物。可从中获取样品以用于本发明的猪的非限制性例子包括公猪、后备母猪、母猪、育肥猪、猪仔和未断奶小猪。猪可以是从出生到死亡之间的任何猪龄的猪。非限制性的例子包括约30到约40、41到约50、或51到约60天或更大的猪，都可用于实现本发明。
在某些实施方式中，所述方法是以垂直免疫扩散酶分析(VIDEA)为基础的方法。该方法利用固定的PRRSV蛋白和/或抗原，其中蛋白和/或抗原是利用可通透屏障从包含或怀疑包含抗PRRSV抗体的样品中分离的。样品通过多孔材料透过屏障，样品中的抗PRRSV抗体扩散通过屏障与PRRSV蛋白和/或抗原接触。抗体与蛋白和/或抗原的接触导致复合物的形成，然后检测复合物，如果有复合物形成则说明样品中存在抗体。检测可以是采取一个区域的形式，其中含有复合物。在某些实施方式中，可通透屏障是琼脂或琼脂糖。
在其他实施方式中，方法是以水平免疫扩散酶分析(HIDEA)为基础的方法。该方法与上述VIDEA相似，二者都利用固定的PRRSV蛋白和/或抗原。HIDEA方法包括通过可通透屏障从包含或怀疑包含抗PRRSV抗体的样品中分离固定的蛋白/抗原。样品直接提呈给屏障，这样抗PRRSV抗体扩散通过可通透屏障与PRRSV蛋白和/或抗原接触。扩散还可以是从样品点向外呈放射状扩散，然后与屏障接触。抗体与蛋白和/或抗原的接触导致复合物的形成，然后检测复合物，如果有复合物形成则说明样品中存在抗体。检测可以是采取圈或环的形式，其中含有复合物。在某些实施方式中，可通透屏障是琼脂或琼脂糖。
本发明的各个方面都可用于与北美株抗原性相关的所有PRRSV株。因此，本发明的基础通常被视为任何PRRSV病毒的蛋白。
另外，提供了与制造这种装置有关的方法。本发明的这种附加方面与本文所述的试剂盒、装置和方法的组分的制备方法有关。本发明包括从感染PRRSV的细胞中制备PRRSV蛋白的方法。在某些实施方式中，在感染后的早期时间点收获蛋白，这时蛋白的大部分或全部还依然保持着与被感染细胞联系。或者换一个说法，大部分或全部PRRSV编码蛋白或者存在于被感染细胞内，或者与被感染细胞的细胞膜相连。在这种条件下，细胞外环境中存在的PRRSV颗粒相对很少，即使存在的话。
另一方面提供了将第一结合因子固定在上述装置的至少一个表面上的方法，例如但不限于PRRSV的N蛋白和/或一种或多种包膜蛋白。
在本发明的其他方面，提供了包含本发明的装置或用于实现本文所述的方法的试剂盒。其他方面包括用于实现本发明所提供的一种或多种方法的组合物和制造条款。这种组合物的非限制性例子包括用于制备本发明的试剂盒或装置的那些组合物。试剂盒的非限制性例子包括那些包含用于本文所公开的方法中的，本发明的一种或多种组合物或因子或者本发明的一种或多种装置的那些试剂盒。
本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和下面的说明中有描述。通过阅读附图、详细描述和权利要求可以清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。
附图简述
图1是代表两个免疫扩散酶分析(IDEA)的示意图。图中显示的是垂直(VIDEA)和水平(HIDEA)实施方式，而图中位置1、2和3是如何分别显示阳性、阴性和阳性结果的。
定义
在本文中，术语猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，或PRRSV，是指可引起PRRS、神秘猪病(MSD)、猪不孕及呼吸综合征(SIRS)(以前被称为“蓝耳综合征”)、猪流行性流产及呼吸综合征(PEARS)、瓦伯希综合征(Wabash syndrome)、神秘猪病(MPD)、猪瘟、英国的蓝色流产病毒或蓝耳病、荷兰的蓝耳病(abortus blau)、德国的猪蓝耳病(seuchenhafter spatabort der schweine)以及Heko-Heko病的病毒。
PRRSV蛋白是指由PRRSV基因组编码的和/或仅仅作为PRRSV感染或PRRSV生命周期的结果而产生的任何多肽。因此，PRRSV特异性的以及非PRRSV感染细胞编码的或表达的多肽都包含在这个术语的范围内。PRRSV感染细胞编码的，但是在没有PRRSV感染和/或生命周期时不表达的内源性多肽不属于这个术语的范畴。然而，仅仅是作为PRRSV感染和/或生命周期的结果而表达的内源性多肽处于这个术语的范围之内。该术语还包括因次级和/或三级结构的改变而导致的其他形式的多肽，例如，非限制性的例子有部分或全部蛋白变性而产生的那些多肽。因此，多肽的变性形式也包括在该术语的范围之内。
PRRSV抗原是指可被抗PRRSV抗体识别的PRRSV多肽的任何部分或片段。在某些情况下，部分或片段可以是带有连接基序的肽，例如而不限于糖基序、磷酸根基序或脂质基序。另外，部分或片段可以是不带任何粘附非肽基序的肽。
发明详述及实施模式
本发明涉及用于检测抗PRRSV抗体的试剂盒、装置和方法。检测的基础在于使用一种或多种可与抗所述蛋白的抗体结合的PRRSV编码蛋白和/或抗原。抗体是指那些存在于PRRSV感染对象体内而不存在于未感染个体内的抗体。本发明可被视为检测捕获抗体的“抗体捕获”分析。本发明还可被视为用于检测抗PRRSV抗体的以免疫扩散为基础的方法。
本发明的基础部分在于人们认识到PRRSV的结构蛋白，其中包括相关的核壳蛋白(N)、膜相关蛋白(M)以及至少4个包膜蛋白(E)，可用于检测PRRSV对象体内的抗体。换一种说法，本发明的基础部分在于发现了PRRSV感染对象体内存在抗这些蛋白和/或其抗原性片段的抗体，因此，抗体的检测提供了一种指示对象被PRRSV感染的良好方式。
本发明还部分基于发现了某些条件和方法可用于获得包含高浓度的与其他PRRSV蛋白和/或抗原相关的E蛋白的PRRSV蛋白和/或抗原组合物。因此，本发明包括从感染PRRSV的细胞中制备PRRSV蛋白和/或抗原的方法。在感染后的早期时间点收获蛋白，这时蛋白的大部分或全部还依然保持着与被感染细胞联系，或者是本发明的细胞相关性病毒组分(CAVC)的一部分。或者换一个说法，大部分或全部PRRSV蛋白和/或抗原或者存在于被感染细胞内，或者与被感染细胞的细胞膜相连。在这种条件下，细胞外环境中存在的PRRSV颗粒相对很少，即使存在的话。本发明的基础部分在于意外地发现，在细胞被感染后的一段相对较短的时期内，细胞可产生足量的PRRSV编码蛋白，这些蛋白适用于本发明的检测方法。在较早的时间点制备CAVC，例如在PRRSV颗粒产生和/或释放到细胞外环境之前，还有提高安全性的好处，这样所得到的CAVC就不会被非感染性的病毒颗粒污染。
感染的细胞可以是能被PRRSV有效感染的任何细胞。非限制性的例子包括体外或体内的猪细胞。体外细胞的一个非限制性例子是来源于被PRRSV感染的猪对象的原代细胞。体内细胞的一个非限制性例子是PRRSV通过口鼻途径感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，这种细胞随后可被收获用于制备PRRSV蛋白和/或抗原。另一个非限制性例子是使用猿细胞系MARC-145。根据本发明的方法制备的PRRSV蛋白和/或抗原包括至少一种PRRSV N、M和E蛋白。这些蛋白的组合物也可从本发明的细胞中制备。在某些实施方式中，制备出的蛋白/抗原中E蛋白的比例相较N和M蛋白高。
因此，本发明提供了从PRRS病毒感染细胞中制备PRRS病毒蛋白和抗原的方法，该方法包括：a)提供一个被PRRS病毒感染的细胞群；b)将无细胞PRRS病毒与感染细胞分离以形成包含细胞相关PRRS病毒蛋白和抗原的细胞；以及c)从步骤b)分离的细胞中提取或洗脱PRRS病毒蛋白和抗原。在没有无细胞病毒存在的例子中，步骤b)可以修改为只是简单从可能干扰本方法的其他材料中分离细胞，例如用于培养细胞的培养基。步骤b)可以通过本领域熟知的任何方法完成，例如，通过离心产生细胞团和上清，然后去除或丢弃上清，或者利用膜过滤去除上清，保留细胞。步骤c)可任选通过将细胞重悬在缓冲液中来完成。在某些实施方式中，提取或洗脱是用包含去污剂的溶液完成的，因此，用于重悬细胞的缓冲液可能包含去污剂。
在其他实施方式中，该方法包括利用PRRS病毒感染细胞群足够的时间以使每毫升上清如用于培养细胞的培养基中的感染单位降低到不可检测的水平。非限制性的例子包括低于101.5的组织培养感染量(TCID50/ml)。用于本方法的细胞群可任选用PRRS病毒感染足够的时间以观察CPE。当然，细胞被感染的时间未达到可以观察到CPE或CPE早期阶段的长度时的细胞也可用于实现本发明。
在另一个实施方式中，本发明提供了从PRRS病毒感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)中制备PRRS病毒蛋白和抗原的方法。该方法包括从PAM细胞群中制备所述的蛋白和抗原，其中PAM细胞是通过灌洗口鼻接种PRRS病毒的猪的肺而获得的。PRRS病毒蛋白和抗原可从上述细胞中提取或洗脱。因此，细胞可重悬到提取缓冲液中。在某些实施方式中，提取或洗脱是用包含去污剂的溶液完成的，因此，用于重悬细胞的缓冲液可能包含去污剂。
包含去污剂的溶液可以是适于提取或洗脱PRRSV蛋白和/或抗原的任何溶液。一个非限制性的例子是使用非离子型去污剂，如聚(乙烯甘油)对-异辛基-苯基醚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(诺乃P-40(Nonidet P-40))或曲通X-100(Triton X-100)。在本发明的某些实施方式中，溶液中去污剂的浓度约为0.5％，例如，约0.5％曲通X-100溶液。
本发明还提供了从PRRS病毒感染细胞中制备PRRS病毒蛋白和抗原的方法。这种方法包括从体外或体内方法制备的细胞群中制备所述的蛋白和抗原。对于体外方法来说，培养猪肺泡巨噬细胞(PAM)或MARC-145细胞系，感染PRRSV后收获细胞。对于不使用细胞培养系统的体内方法来说，口鼻接种PRRS病毒后通过灌洗猪的肺来获得PAM细胞。比较使用不同PRRSV分离株以及病毒接种后不同天数所产生的抗原，通过比较试验可以预先确定达到最高抗原产量所需要的最佳条件。
当然，本发明包括含有游离PRRSV蛋白和/或抗原的组合物，其中的游离PRRSV蛋白和/或抗原是利用本文公开的任何方法制备的。组合物可用于使用PRRSV蛋白和/或抗原的任何目的。非限制性的例子包括用于制备抗蛋白/抗原的抗体；用作PRRSV蛋白的参照标记；以及用作免疫原性组合物，例如疫苗制剂，可任选加入合适的佐剂，这种疫苗给予动物后可产生免疫反应。组合物的其他非限制性例子包括其中的蛋白/抗原是可溶或冻干(冷冻干燥)形式的那些组合物。
在某些实施方式中，组合物溶解在适于包被表面的溶液中，例如本发明的装置的表面。这种溶液可以使蛋白包被在培养皿的底部。非限制性的例子包括用pH9.6的0.06M碳酸盐缓冲液稀释的PRRSV蛋白/抗原溶液。溶液可用于包被平皿或孔的表面，例如聚苯乙烯或玻璃培养皿或多孔培养板的孔。倒掉未吸附的材料，然后任选用不含蛋白/抗原的缓冲液洗涤一次或多次。包被可在各种温度下进行，其中包括25℃以下，包被时间也可以各不相同。在某些实施方式中，包被可在4℃或约4℃进行约72小时。
因此，本发明还提供了用病毒蛋白和/或抗原包被表面的方法，所述方法包括a)提供一种包含如本文所述的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原的溶液；以及b)使所述的溶液与表面接触一段时间以使所述的蛋白和抗原吸附到所述平皿的表面。在某些实施方式中，通过利用如本文所述的包含去污剂的溶液从PRRSV感染细胞中提取或洗脱蛋白和/或抗原。在其他实施方式中，被包被的表面是用聚苯乙烯或玻璃或类似材料制备的。优选用乙醇洗涤表面，然后将其吸干。
PRRSV蛋白/抗原溶液可用于清洁表面，使其吸附约2-4小时到过夜。蛋白/抗原可被稀释到最佳浓度，约0.01到0.001％之间，优选用碳酸钠-碳酸氢钠包被缓冲液稀释以促使蛋白/抗原粘附到表面上。包被缓冲液的浓度优选在约0.01M到0.1M之间(pH9到10)，其中每升溶液包含约0.84到8.4g NaHCO3和0.11到10.6g Na2CO3。包被期过后，倒掉或用其他方式去掉多余的溶液。被包被的表面用蒸馏水或不含蛋白/抗原的缓冲液洗涤。用PRRSV蛋白和/抗原包被以后可以选择再用封闭剂，例如而不限于，溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中的1％牛血清白蛋白(BSA)包被。包被可在各种温度下进行，其中包括约37℃包被不同的时间。在某些实施方式中，包被可以在37℃或约37℃进行约1小时。使用封闭剂以后，去掉溶液，任选再用水或不含试剂的缓冲液洗涤一次或多次。
包被以后，将可通透屏障层加到包被表面。屏障可以溶液的形式使用，在变干后形成可通透屏障。非限制性的例子包括琼脂和/琼脂糖溶液，这种溶液变干后形成由凝胶样材料组成的可通透屏障。因此，可使用融化的琼脂或琼脂糖层，然后使其固定。琼脂层的厚度并不是关键的，可以从至少约1.5mm，优选从约2mm，到约10mm。制备琼脂层的溶液浓度为约0.75到1.5％之间，优选约1％。
作为非限制性的例子，本文所述的以VIDEA为基础的方法可使用直径为60mm的聚苯乙烯培养皿和4ml溶于PBS中的0.6％琼脂糖。以HIDEA为基础的方法可使用6ml相同的溶液。溶液固定过夜，例如在4℃。如此包被的装置可储存，例如在4℃潮湿的容器内，最多达4个月。
具有如本文所述的包被表面的装置可作为诊断试剂盒的全部或部分用于检测抗PRRSV抗体。因此，本发明还提供了检测抗PRRS病毒的抗体的方法，该方法包括a)采集对象的血样或血清样品；b)使所述样品与本文所述的包被装置的可通透屏障接触；c)孵育所述样品使分子如抗体扩散通过可通透屏障与包被装置的蛋白/抗原结合；d)去掉可通透屏障并任选洗涤装置以去除未结合的抗体；e)检测抗体与蛋白/抗原结合而形成的复合物。关于步骤b)中的装置，一个非限制性的例子是装置为平皿试验板(dish test plate)，其中包括(1)具有平坦支持表面的平皿；(2)PRRSV蛋白/抗原包被吸附到所述表面上；以及(3)琼脂层覆盖所述的包被。
关于步骤e)，方法可通过使用能与形成的复合物结合的检测剂来实现。一个非限制性的例子是使用第二抗体，其中第二抗体可与样品中存在的抗体结合。这种第二抗体的非限制性例子包括来自于特殊动物，例如，小鼠、大鼠、山羊、兔等，的那些抗体，第二抗体可识别被测样品中的抗体的Fc部分。
第二抗体可以连接标记物以便于其检测。连接通过将另一个基序连接到抗体上来修饰抗体。基序优选可检测标记，其中包括可直接检测的标记，如放射性同位素、荧光标记(非限制性的例子有Cy3和Cy5)或颗粒标记。颗粒标记的非限制性例子包括乳胶颗粒、金属液胶以及胶体金颗粒。另外，标记也可用于间接检测。非限制性的例子包括酶，例如而不限于，过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶以及辣根过氧化物酶。其他非限制性的例子包括可被另一种分子结合的分子，例如而不限于生物素、亲和肽或纯化标记。标记优选共价连接。
在某些实施方式中，第二抗体是酶偶联的猪免疫球蛋白，它可以在约30到约60分钟内结合复合物内的抗体。结合以后，通过一次或多次可选的洗涤去除未结合的第二抗体。酶可以是任何合适的酶，例如用于酶联免疫吸附分析(ELISA)中的酶，其中包括过氧化物酶。过氧化物酶与氨基水杨酸和过氧化氢，或者对苯二胺和过氧化氢反应时可产生紫色。碱性磷酸酶与二硝基磷酸苯酯反应时可产生黄色。β半乳糖苷酶与O-硝基苯基-β-D-半乳糖基吡喃糖苷反应可产生紫色。
作为酶联二抗的另一个非限制性例子，通过检测结合的二抗来检测复合物可通过覆盖包含底物的琼脂溶液来介导，其中底物与酶反应后可产生可检测信号，例如，生成颜色就是一个非限制性的例子。在某些实施方式中，可检测信号是可见的，例如通过肉眼观察。信号可以和使用阳性对照(包含可与包被表面结合的已知抗PRRSV抗体)所观察到的和/或使用不包含这种抗PRRSV抗体的阴性对照所观察到的生色反应比较。
在本发明的某些实施方式中，特别是本文所述的VIDEA中，收集样品并用于多孔材料(或者通过多孔材料收集)，例如而不限于滤纸或滤纸盘。作为非限制性的例子，在使用滤纸盘的情况下，滤纸盘平放到可通透屏障上，以使分子从滤纸盘扩散，通过屏障到达包被表面。在表面上，样品中可结合本发明的PRRSV蛋白/抗原的分子(如抗体)与蛋白/抗原形成复合物。因此，样品中的分子被固定到包被的表面上。在某些实施方式中，扩散和复合物形成所需的时间为约2到3小时，在室温(25℃)或约37℃下进行。
复合物形成以后，去掉可通透屏障。在某些包含琼脂或琼脂糖屏障的实施方式中，可剥离掉琼脂或琼脂糖层，然后任选洗涤。
本发明方法的根据是复合物的形成，其中复合物包含与本文所述的样品中的抗PRRSV抗体结合的PRRSV蛋白/抗原。可以检测抗PRRSV抗体以降低检测复合物的难度。在样品中检测到PRRSV蛋白/抗原与抗PRRSV抗体形成的复合物说明对象体内存在PRRSV感染，其中样品取自该对象。
本发明还提供了垂直免疫扩散酶分析(VIDEA)方法，所述方法包括a)提供一个至少一个表面被本文所述的一种或多种PRRSV蛋白和抗原包被的诊断装置，所述表面被本文所述的可通透屏障覆盖；b)使屏障的表面与包含抗体的多孔材料接触，其中抗体包含在对象来源的样品中；c)孵育所述装置足够的时间以使材料从所述样品扩散到所述一个或多个表面，所述的孵育期任选在去除多孔材料之后进行；以及d)在去除可通透屏障后检测平皿表面是否存在抗体。在某些实施方式中，多孔材料是纸盘。
本发明还提供了水平免疫扩散酶分析(HIDEA)方法，所述方法包括a)提供一个至少一个表面被本文所述的一种或多种PRRSV蛋白和抗原包被的诊断装置，所述表面被本文所述的可通透屏障覆盖，其中所述表面上有一个或多个缺口用于接纳样品；b)使一个或多个缺口与包含抗体的来源于对象的样品接触；c)孵育所述装置足够的时间以使材料从所述样品扩散到所述一个或多个表面；以及d)在去除可通透屏障后检测平皿的表面是否存在抗体。在某些实施方式中，在可通透屏障上打出一个到一组小孔，形成缺口，用作试验样品孔。孔的直径约为1到4mm，穿透琼脂包被。使用带7个3 mm园孔的模板在每一个HIDEA试验平皿的琼脂上打孔是一个非限制性的例子。
在VIDEA和HIDEA实施方式中，样品是血清样品或全血样品。方法可用于被PRRSV感染或怀疑被PRRS病毒感染的各种动物和/或对象来源的样品。诊断装置可以是培养皿、培养板或培养板的孔。每一组试验样品都要设阳性对照和阴性对照。相同量的对照血清加到试验装置的其他孔内。
培养板孵育以后，剥去琼脂凝胶层，洗涤培养板，例如用洗涤缓冲液洗涤，溶于磷酸盐缓冲液中的吐温20是洗涤缓冲液的一个非限制性例子。培养板可以用蒸馏水或自来水而非洗涤缓冲液洗涤。洗涤可去除未结合的抗体(非特异性的)以及其他污染物。
VIDEA和HIDEA方法包括利用抗原-抗体反应形成复合物，利用可与复合物结合的检测剂，例如，第二抗体，检测复合物，例如通过结合复合物的抗体部分。检测剂在室温下与复合物保持接触约30分钟到约2小时。然后洗涤培养板以去除未结合的连接物，例如，用缓冲液洗涤就是一个非限制性例子。洗涤液可用注射器或移液管从试验培养板的边上缓慢加入和移出。这个过程可任选重复3次或多次。
在孵育检测剂的同时制备琼脂或琼脂糖包被。作为非限制性的例子，优选溶于磷酸盐缓冲液中的1％琼脂溶液，琼脂融化后加入结合酶的底物。在某些实施方式中，需要加入催化剂。作为非限制性的例子，如果酶是过氧化物酶，1％琼脂溶液可以包含约0.05％到1.0％的5-氨基水杨酸作为底物，以及约0.002％到0.01％的过氧化氢作为催化剂。也可以使用约0.08％的底物和约0.005％的催化剂。琼脂倾注到经洗涤的表面上，使其固定。
第二抗体的酶之间的生色反应可在琼脂支持层内发生。通过酶-底物反应可使反应产生可视化的结果。通过测定HIDEA中的深紫色圆形带的直径以及VIDEA中是否存在颜色或颜色的密度可以确定抗体的量。
在HIDEA中，产生的颜色形成圆形带或环的形式。在底物反应的约5到30分钟内，环的颜色就深到足以测定的程度。随着反应时间的延长，环的颜色变得更深，但是不会扩大。所形成的环的直径与血液中存在的特异性抗体的量有关(即，病毒中和滴度)。测量深色圆形带的直径，并与标准病毒中和试验抗体值相关联。所确定的值与试验培养板上样品孔的直径以及所使用的样品的大小有关。本发明的每一个装置或本发明的每一个试剂盒都带有一个数值表和/或代表性环的说明书。
检测VIDEA和HIDEA装置内的表面上存在的抗体意味着检测与表面上PRRSV蛋白/抗原结合的抗体。检测可利用本文描述的任何方法完成，其中包括利用标记的第二抗体。其他非限制性的方法包括通过酶-底物反应显示抗原-抗体反应，如果存在生色反应则说明存在抗PRRSV抗体(定性的)，或者通过测定反应所产生的颜色密度来确定抗-PRRSV抗体的量(定量或半定量的)。
PRRSV蛋白/抗原以及包含蛋白/抗原的组合物、方法和装置适用于按照大家熟知的方法制备试剂盒。因此，本发明提供了包含如本文所述的PRRSV蛋白/抗原的试剂盒，或者包含PRRSV蛋白/抗原的组合物或装置，这些都可用于本文所述的一种或多种方法中。这种试剂盒还可任选包含鉴定说明书或标记物或与其如何用于本发明的方法中有关的说明书。这种试剂盒可包含容器，每一个容器都包含方法所使用的一种或多种试剂(一般是浓缩的形式)或装置。
包含本发明的装置的试剂盒还可以包含装置所使用的一种或多种其他试剂或设备配件，其中的装置是本发明的方法所使用的。试剂盒所包含的其他材料的非限制性例子有样品稀释溶液、稀释剂瓶和用于转移样品的滴管。其他非限制性的例子包括用于VIDEA装置的多孔材料和第二抗体。
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考下面的实施例可以更容易地理解本发明，下面的实施例是通过说明的方式提供的，并不意味着对本发明的限制，除非特别说明。
实施例
实施例1：PRRSV蛋白和平皿的制备
PRRSV蛋白可通过如下过程制备：利用PRRSV株接种体外或体内的易感细胞，在最佳的时间收获被感染的细胞用于制备与细胞相关联的病毒组分。在体外方法中，通过细胞培养系统或通过使用重组技术制备抗原。另外，在用PRRSV口鼻接种并洗涤肺(肺灌洗)后可以获得PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)。
通过离心使细胞成团，去掉或弃去上清。细胞团还可以经过洗涤。将细胞团重悬到0.05M三(羟甲基)氨基甲烷0.025M EDTA缓冲液中，其中包含0.5％曲通X-100，缓冲液的体积为浓集细胞的5-10倍。混合物在4℃搅拌2-15小时，10,000g离心1小时。上清用作PRRSV抗原。抗原是非感染性的，用途广泛而没有导致病毒传播的风险。
通过比较试验预先确定用约pH9.6的0.06M碳酸盐缓冲液稀释PRRSV蛋白/抗原。通过在4℃吸附72小时将抗原包被到聚苯乙烯培养皿(直径60mm)上。倒掉未吸附的抗原，培养皿与溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)中的封闭剂(例如，1％牛血清白蛋白，BSA)在37℃共孵育1小时。去掉BSA以后将6ml(对于HIDEA来说)和4ml(对于VIDEA来说)用PBS溶解的0.6％琼脂糖覆盖到培养皿上。琼脂在4℃固定过夜。在HIDEA中，用包含7个3mm圆形孔的模具在每个试验培养皿的琼脂上打孔。在VIDEA中，使用不带孔的培养皿。所有试验皿在4℃的潮湿容器内最多都可储存4个月。
实施例2：VIDEA
试验板通过如下过程制备：将病毒抗原包被到培养皿的底部，然后再用上述琼脂凝胶覆盖。在使用过程中，滤纸盘用猪的试验血清浸湿，然后放到试验板的琼脂上。平坦的滤纸盘提供了一个近乎二维的起始区，这样样品如血清内的物质一般以一个方向移动通过琼脂并到达包被表面。
孵育一段时间之后剥去凝胶，培养皿用5-8ml洗涤溶液(包含0.05％吐温-20(Tween-20)的PBS)洗涤3次。然后加入3ml用PBS稀释的商品化的过氧化物酶连接的兔抗猪IgG(1-2μg/ml)，在25℃孵育45分钟。培养皿再用洗涤溶液洗涤3次，然后用5ml溶于PBS中的1％琼脂覆盖培养皿，其中分别包含0.08％的底物(5-氨基水杨酸)和0.005％的H2O2。记录VIDEA试验是否产生颜色以及颜色的密度。
在一个试验中，剥去琼脂后在25或37℃孵育2到3小时。约5到10分钟后根据发生颜色反应的阳性样品来确定过氧化物酶反应的结果。具有已知ELISA S/P比例或PRRS病毒感染历史的各种血清样品与天然动物来源的样品一起检测。比较VIDEA与ELISA的敏感性和特异性。下面的表1总结了各种猪血清的VIDEA结果和相应的ELISA S/P比例的结果。分析结果之间的百分一致性显示在括号内。对于ELISA试验中表现为阴性的猪血清来说，VIDEA也表现出了100％的特异性。在25℃孵育约3小时后，与ELISA比较时所有样品都表现出了100％的一致性。
表1
  VIDEA  VIDEA  VIDEA   VIDEA
  37℃，2小时  37℃，2小时  25℃，3小时   25℃，3小时
  ELISA OD   血清编号   阳性  阴性  阳性   阴性
  空白   40   0  40(100％)  0   40(100％)
  ＜0.4   30   20(66.6％)  10(33.3％)  30(100％)   0
  0.4-0.9   32   31(96.9％)  1(3.1％)  32(100％)   0
  1.0-1.9   17   17(100％)  0  17(100％)   0
  ＞2.0   10   10(100％)  0  10(100％)   0
抗原-抗体反应持续2小时以内，但是，在抗体滴度较低的情况下更长的时间似乎是有益的，这可从短时间孵育时出现的假阴性结果中看出。VIDEA与ELISA S/Prations的高度相关性说明VIDEA作为一个分析方法能够用于检测抗PRRS病毒抗体。与＜0.4的ELISA S/P比例的相关性说明VIDEA的敏感性与ELISA相似，＜0.4这个数值是标准阈值。
实施例2：HIDEA
可使用具有包被表面和可通透屏障的本发明的装置，其中屏障材料可加以改造，在屏障表面上形成一个或多个缺口。以琼脂糖作为非限制性的例子，可在琼脂糖上钻出一个或多个孔。
每一个孔内加入0.015ml试验血清。装置在室温(25℃)下孵育约12到约24小时使抗体扩散，抗原抗体发生反应。该装置用于其他试验时可孵育24小时。
孵育后剥去凝胶，培养皿用5到8ml洗涤溶液(包含0.05％吐温-20的PBS)洗涤3次。然后加入3ml用PBS稀释的商品化的过氧化物酶连接的兔抗猪IgG(1-2μg/ml)，在25℃孵育45分钟。培养皿再用洗涤溶液洗涤3次，然后用5ml溶于PBS中的1％琼脂覆盖培养皿，其中分别包含0.08％的底物(5-氨基水杨酸)和0.005％的H2O2。对于HIDEA来说，反应进行5到30分钟后测定深紫色圆形带的直径，单位为mm。表2和表3列出了不同条件下的14个被测血清的不同直径。在HIDEA中，＜7mm的直径被认为是阴性的。某些ELISA阴性血清在HIDEA中表现为阳性结果说明HIDEA的敏感性更高。表3的结果说明HIDEA有较高的重复性。
表2.在室温(25℃)下孵育不同时间时具有不同ELISA S/P比例的猪血清的HIDEA直径
  被测血清   孵育时间
  15小时   18小时   20小时   24小时
  1234567   无PRRS无PRRSELISA S/P比例**0.06ELISA S/P比例0.21ELISA S/P比例0.73ELISA S/P比例1.96ELISA S/P比例2.83   3*47881112   66810111314   44910111415   55910111415
*HIDEA中的直径；大于7mm为阳性
**ELISA S/P比例大于0.4为阳性
表3.在室温(25℃)下孵育不同时间时具有不同ELISA S/P比例的7份猪血清的HIDEA直径的重复性
  被测血清  3小时   6小时   12小时   15小时   21小时   24小时
  1234567   a.无PRRSb.无PRRSa.无PRRSb.无PRRSa.ELISA阴性b.ELISA阴性a.ELISA阴性b.ELISA阴性a.ELISA S/P比例0.54b.ELISA S/P比例0.54a.ELISA S/P比例1.80b.ELISA S/P比例1.80a.ELISA S/P比例2.59b.ELISA S/P比例2.59   3*3333333555555   33333333777777   33333344787778   33333344887888   444444449910101011   444444449910101012
a和b.每个血清样品通过HIDEA测定两次用于确定重复性
*HIDEA中的直径；大于7mm为阳性
**ELISA S/P比例大于0.4为阳性
文中引用的所有参考文献都通过引用全文纳入本文，无论是否特地纳入本文。在本文中，术语“一个”、“一种”和“任何”都包含单数或复数形式。
现在已经全面描述了本发明，本领域的技术人员应当清楚的是，只要不偏离本发明的精神和范围，无需过多的试验就可以在一个较宽范围的等价参数、浓度和条件下得到相同的结果。虽然通过联系本发明的特殊实施方式对本发明做了描述，但是，应当理解，本发明可作进一步修改。根据本发明的总体原则，本申请有意涵盖本发明的所有变化、用途或应用，其中包括进入本发明所述领域已知的或惯常的实践中的本公开的这种偏差，这些也适用于上文所描述的基本特征。

Claims (21)

1.一种从PRRS病毒感染细胞中制备PRRS病毒蛋白和抗原的方法，该方法包括
a)提供一群被PRRS病毒感染的细胞；
b)将无细胞PRRS病毒与所述感染细胞分离以形成包含与细胞相关联的PRRS病毒蛋白和抗原的细胞；以及
c)利用含去污剂的溶液从步骤b)分离的细胞中提取或洗脱PRRS病毒蛋白和抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞群已用PRRS病毒感染足够时间以使上清中产生的病毒量达到低于101.5组织培养感染量(TCID)50/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞群已用PRRS病毒感染足够时间以观察早期CPE。
4.如权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于，所述包含去污剂的溶液含有0.5％曲通X-100。
5.如权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于，所述提取或洗脱在4℃进行约2到15小时。
6.如权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其特征在于，所述蛋白和抗原包括PRRS病毒包膜蛋白或N蛋白。
7.通过权利要求1、2、3、4、5或6所述方法制备的PRRS病毒蛋白和抗原。
8.一种诊断装置，其包含至少一个被权利要求7所述的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原包被的表面。
9.一种诊断装置，其包含至少一个被一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原包被的表面，所述蛋白和抗原用包含去污剂的溶液从PRRS病毒感染的细胞中提取或洗脱。
10.如权利要求8或9所述的装置，其特征在于，所述一种或多种PRRSV蛋白和抗原包含PRRS病毒编码的核壳蛋白和/或包膜蛋白。
11.如权利要求8或9所述的装置，其特征在于，所述一种或多种PRRSV蛋白和抗原包含PRRS病毒编码的糖蛋白。
12.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述溶液含有0.5％曲通X-100。
13.一种垂直免疫扩散酶分析(VIDEA)方法，所述方法包括
a)提供一个至少一个表面被权利要求7所述的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原包被的诊断装置，在所述至少一个表面上所述表面已被一层琼脂或琼脂糖覆盖；
b)使琼脂或琼脂糖表面与包含抗体的多孔材料接触，其中所述抗体包含在对象来源的样品中；
c)孵育所述装置足够时间以使材料从所述样品扩散到所述一个或多个表面，所述孵育期任选在去除多孔材料之后进行；以及
d)在去除琼脂或琼脂糖后检测培养皿表面是否存在抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述样品是血清样品或全血样品。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述多孔材料是纸盘。
16.如权利要求13、14或15所述的方法，其特征在于，所述对象被怀疑感染了PRRS病毒。
17.一种水平免疫扩散酶分析(HIDEA)方法，所述方法包括
a)提供一个至少一个表面被权利要求7所述的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原包被的诊断装置，在所述至少一个表面上所述表面已被一层包括一个或多个容纳样品的缺口的琼脂或琼脂糖覆盖；
b)使一个或多个缺口与对象来源的包含抗体的样品接触；
c)孵育所述装置足够时间以使材料从所述样品扩散到所述一个或多个表面；以及
d)在去除琼脂或琼脂糖后检测培养皿表面是否存在抗体。
18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述装置是培养皿。
19.一种用病毒蛋白和抗原包被表面的方法，所述方法包括
a)提供包含权利要求7所述的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原的溶液；以及
b)使所述溶液与表面接触一段时间以使所述蛋白和抗原吸附到所述培养皿的表面上。
20.一种用病毒蛋白和抗原包被表面的方法，所述方法包括
a)提供包含PRRS病毒感染细胞来源的一种或多种PRRS病毒蛋白和抗原的溶液，所述蛋白和抗原是利用包含去污剂的溶液从所述细胞中提取或洗脱的；以及
b)使所述溶液与表面接触一段时间以使所述蛋白和抗原吸附到所述培养皿的表面上。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述培养皿是用聚苯乙烯制成的。
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