CN117723745A

CN117723745A - 用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN117723745A
Application number: CN202310351658.6A
Authority: CN
Inventors: 阮文科; 董虹; 刘晓晔; 何至远; 谷学佳; 樊雨
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2023-04-04
Filing date: 2023-04-04
Publication date: 2024-03-19

Abstract

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法。该胶体金试纸条包括PVC板，所述PVC板上设置有硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，硝酸纤维素膜上设有C检测线、T检测线；金标垫经胶体金标记抗体制备而成；胶体金试纸条的组装步骤如下：将硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，将吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封；硝酸纤维膜的C检测线上包被抗体，抗体为抗IgG抗体；硝酸纤维膜的T检测线上包被抗原；利用该用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条可以快速和特异性检测北京地区流行的PEDV变异株抗体。

Description

用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)病毒病是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起，主要的临床症状表现为：哺乳仔猪非常严重的呕吐和腹泻，最后脱水死亡，且发病急。流行性腹泻病毒病是猪的一种传染极强的肠道疾病。最早发现于1971年的英国，随后迅速扩散到世界各地。1976年开始，我国广东、上海等地报道了该病的发生。所有猪只无论品种和大小均易感，母猪、断奶猪、育肥猪、架子猪均有感染性，1周龄内哺乳仔猪感染死亡率达90％-100％。该病具有严重的危害性，给世界生猪市场造成了不可估量的损失。比利时病毒学家Pensaert于1977年通过试验发现并证实了，虽然该病与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在流行病学、临床症状乃至病理变化上都极其相似，但二者并无血清学交叉反应，而属于新的PEDV成员。

接种疫苗是预防流行性腹泻病毒病的重要手段，1995年起我国开始采用PEDV和TGEV的二联灭活苗和弱毒苗。在一段时间内有效控制了该病的发生。但从2006年起该病出现在了免疫猪群。2010年以来，该病以空前的态势开始暴发，先后在中国、美国、加拿大、日本和墨西哥等地发生，我国2010年-2014年猪场腹泻病的罪魁祸首是PEDV。PED除了致死率不断升高外，流行季节、持续时间和感染范围也与先前报道有所不同，并且猪群发病更加频繁，给世界养猪业带来严重威胁和巨大挑战。

PEDV的核酸长28Kb左右，正链RNA，线性不分段并具有侵染性。主要编码4种结构蛋白：核衣壳N、纤突S、小膜E和膜糖M，3种非结构的蛋白：Pol(1a/1b)和ORF3，5'-3'顺序为：5'-Pol(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'。专家根据S基因将猪流行性腹泻病毒分为G1和G2两个比较大的基因群，研究发现G1基因群均存在有不同程度的碱基插入或者缺失的现象(主要以基因插入多见)；而G2基因群主要存在有碱基缺失的点突变现象。通过建立S基因进化树，发现G2分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV的早起分离株，G1分支均为新的PEDV流行株，如韩国和美国流行的毒株。PEDV S基因是免疫优势基因，在以S基因为诊断技术研究和候选基因的疫苗中，表现出良好且特异性非常强的免疫原性。有研究表明，抗PEDV的S蛋白的抗体，不与TGEV S蛋白反应，PEDV S蛋白可以很好地作为胶体金检测的靶蛋白。

目前的PEDV流行毒株基因序列变异大，导致氨基酸的较大变异，致使疫苗临床效果不明显。因此，针对PEDV流行毒株的检测便十分重要。

目前，针对PEDV流行毒株的检测方法包括病原分离鉴定、中和实验。荧光定量PCR、免疫荧光(IF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法。但是上述方法在对PEDV流行毒株进行检测时均存在步骤繁琐、耗时长并且需要专用设备的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足以及目前北京地区PEDV变异株盛行，本发明提供了一种用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法。利用本发明的试纸条可以特异性检测北京地区流行的PEDV变异株抗体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条，包括PVC板，所述PVC板上设置有硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有C检测线、T检测线；

所述金标垫经胶体金标记抗体制备；

所述胶体金试纸条的组装步骤如下：

将硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，将吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封；

所述硝酸纤维膜的C检测线上包被抗体，所述抗体为抗IgG抗体；

所述硝酸纤维膜的T检测线上包被抗原，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，编码所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括样品垫和结合垫的处理、金标垫的制备、C检测线、T检测线的处理和胶体金试纸条的组装。

优选的，样品垫和结合垫的处理步骤如下：

按照配方分别配制结合垫处理液和样品垫处理液，结合垫处理液涂布在一个玻璃纤维膜上，样品垫处理液涂布在另一个玻璃纤维膜上，干燥，分别得到结合垫和样品垫，备用。

优选的，所述结合垫处理液的配方为：1g PVP,5ml 10％Triton X-100，加95ml20mM Tris，调pH＝9；

所述样品垫的处理液的配方为：500μl Tween-20，0.2g BSA，加100ml 20mM Tris，调pH＝9。

优选的，所述金标垫的制备方法包括：制备胶体金标记抗体，用金标复溶液重悬胶体金标记抗体，然后用重悬液浸泡结合垫制备得到金标垫。

优选的，胶体金标记抗体按照如下步骤制备：

S1、取去离子水加热至沸腾后，加入的氯金酸溶液和柠檬酸三钠混匀，加入氯金酸溶液与柠檬酸三钠与去离子水的体积比为1：98-100：1.4-1.6，继续加热，待颜色由灰色变为黑色，再变为亮红色后且颜色保持不变，停止加热，避光冷却至室温，得到胶体金溶液；

S2、取胶体金溶液加入K₂CO₃调节pH至7.5～8，混匀后加入相对于胶体金溶液体积的1.3％的兔抗猪IgG后混匀，得到胶体金抗体混合溶液；

S3、于胶体金抗体混合溶液中加入200mg/mL的BSA和200mg/mL的PEG20000混匀后，得到胶体金标记抗体溶液；

S4、将胶体金标记抗体溶液离心，弃去上清液，用金标复溶液重悬沉淀，得到纯化好的胶体金标记抗体，将其于4℃保存备用。

优选的，胶体金溶液配制过程中使用的所有试剂均需要使用无菌滤器滤菌。

优选的，所述C检测线、T检测线的处理按照如下步骤：

T检测线上用0.1M的PB缓冲液稀释包被PEDV S1蛋白的浓度为0.5-2mg/mL，吸取于硝酸纤维素膜检测线位置上点膜，干燥；

C检测线上包被经0.1M的PB缓冲液稀释的浓度为0.8-1.2mg/mL的羊抗兔IgG抗体，吸取于硝酸纤维素膜质控线位置上点膜，干燥。

优选的，所述PB缓冲液中包含0.86g Na₂HPO₄·12H₂O和0.46gNaH₂PO₄·2H₂O。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提出的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条采用了胶体金。胶体金方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强等优点，并且适合大批量样本的检测。同时，该试纸条还具有如下优点：

(1)操作简便：应用胶体金法检测目前流行的猪流行性腹泻病毒的S蛋白抗体，操作步骤简单，普通实验人员即可掌握操作方法，易于推广。

(2)可用来诊断猪只是否感染PEDV或者检测猪只免疫疫苗后的针对S蛋白抗体水平，特异性高，检测效果准确。

2、本发明提出的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法步骤简单、耗时短、无需专用设备，制备的试纸条检测PEDV变异株抗体时，肉眼可观察结果、简单、可操作性性强，适用于大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的胶体金溶液。

图2为本发明实施例1制备的胶体金溶液吸光度值测定结果。

图3为本发明实施例1制备的胶体金溶液标记抗体最适pH值确定，图中1-6号分别是：0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl。

图4为本发明实施例1中兔抗猪IgG最佳标记量的确定兔抗猪IgG，A图中1-5号分别为：0μg、5μg、10μg、15μg、25μg；B图中6-10号分别为：8μg、10μg、13μg、15μg、18μg。

图5为本发明实施例1中制备的胶体金标记抗体溶液。

图6为本发明实施例1中结合垫处理液和样品垫处理液的检测结果，A图中1-4为：样本组；B图中5-8为：PBS组。

图7为本发明实施1中T线包被原料浓度选择结果，A图1-4中为：猪阳性血清组；B图中5-8为：猪阴性血清组。

图8为实施例1中胶体金免疫层析法检测临床样本结果，其中：图A中1-10、C中21-30、E中41-50分别为30份猪阴性样本检测；图B中11-20、D中31-40、F中51-60分别为30份猪阳性样本检测。

具体实施方式

除非另有说明，本文中所使用术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。

本发明中使用的术语“S蛋白抗体”是指动物在感染猪流行性腹泻病毒或者接种猪流行性腹泻病毒疫苗之后，体内产生的能识别S蛋白的抗体。

本发明中使用的术语“样品”是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿液、唾液、体液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。

本发明中使用的术语“纯化”是指从天然环境或重组生产来源中分离的多肽。纯化的多肽可以是通过层析技术获得的纯化多肽。

本发明中所述的“包含”、“含有”意指包含但不限于，或基本上由……组成，或者由……组成。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

实施例中所用到的材料和试剂包括：PVC板、硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫、氯金酸、柠檬酸钠、结合垫处理液和样品垫处理液材料和试剂。

用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条包括包括PVC板，所述PVC板上设置有硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有C检测线、T检测线；

所述金标垫经胶体金标记抗体制备；

所述硝酸纤维膜的T检测线上包被抗原，所述抗原的氨基酸序列如下：

PQDVTRCSANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFVSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPTANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYmLNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYSANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQ；

编码上述抗原的核苷酸序列如下：

CCACAAGATGTCACTAGGTGCTCAGCTAACACTAATTTTAGGCGGTT

CTTTTCAAAATTTAATGTTCAGGCGCCTGCAGTTGTTGTACTGGGCGGTTA

TCTACCTATTGGTGAAAACCAGGGTGTCAATTCAACTTGGTACTGTGCTG

GCCAACATCCAACTGCTAGTGGCGTTCATGGTATCTTTGTTAGCCATATTA

GAGGTGGTCATGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCTTTTGACCCT

AGTGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCTACTAACGGTAACACTAATGCT

ACTGCGCGACTGCGCATTTGCCAGTTTCCTAGCATTAAAACATTGGGCCC

CACTGCTAATAATGATGTTACAACAGGTCGTAATTGCCTATTTAACAAAGC

CATCCCAGCTCATATGAGTGAACATAGTGTTGTCGGCATAACATGGGATAA

TGATCGTGTCACTGTCTTCTCTGACAAGATCTATTATTTTTATTTTAAAAAT

GATTGGTCCCGTGTTGCGACAAAGTGTTACAACAGTGGAGGTTGTGCTAT

GCAATATGTTTATGAACCCACCTATTACATGCTTAATGTTACTAGTGCTGGT

GAGGATGGTATTTCTTATCAACCCTGTACAGCTAATTGCATTGGTTATTCTG

CCAATGTATTTGCTACTGAGCCCAATGGCCACATACCAGAAGGTTTTAGTT

TTAATAATTGGTTTCTTTTGTCCAATGATTCCACTTTGGTGCATGGTAAAGT

GGTTTCCAACCAA。

该用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法如下：

(1)胶体金溶液配制

胶体金溶液配制过程中所需的所有试剂均需要使用0.22μm无菌滤器过滤。

胶体金溶胶制备采用柠檬酸三钠还原法，具体操作如下：

量取99mL去离子水于烧杯中，将其放置于微波炉中，加热至沸腾后，吸取1％(浓度为10mg/mL)的氯金酸溶液1mL加入其中，高火继续加热3min，取出置于磁力搅拌器上充分震荡混匀，并一次性快速加入1％(浓度为10mg/mL)的柠檬酸三钠1.5mL，在磁力搅拌器上持续搅拌20秒，微波炉中继续加热3min，观察溶液颜色，发现溶液颜色变化由灰色变为黑色，再变为亮红色后保持不变，立即停止加热，并避光自然冷却至室温，再往烧杯中加入去离子水添加至100mL，得到胶体金溶液(见图1)，利用可见分光光度计测其吸光度值。

优质胶体金溶液的评价标准：优质的胶体金溶液颜色应为酒红色，透明无沉淀颗粒；粒径大小均一，形状一致，无多角形或椭圆形颗粒存在，分散性比较好没有颗粒聚集现象。

(2)胶体金标记抗体最佳pH值的确定

取6支EP管依次编号1～6，并做好标记，于各EP管中均加入1mL的胶体金溶液，往1～6号EP管中分别依次加入0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的0.2M K₂CO₃后，于涡旋器上振荡混匀后，向上述各EP管中均加入200μl兔抗猪抗体，涡旋器上震荡混匀后静止10min，向各EP管中依次加入100μL的10％NaCl溶液，混匀后室温下放置2h后，观察1～6号EP管(不同EP管内胶体金溶液的PH值不同)内胶体金溶液的颜色变化，溶液颜色保持红色的EP管内胶体金溶液的最低PH值为胶体金标记抗体的最佳pH值，实验结果见图3。

由图3可知，胶体金溶液标记抗体最适PH值为加入10μl的0.2M K₂CO₃时的值(PH＝8.5)。

(3)胶体金标记抗体最佳浓度的筛选

取10支EP管依次编号1～10，并做好标记，向各EP管中均加入1mL的胶体金溶液，加入0.2M K₂CO₃使其各自的PH值达到8.5后，于涡旋器上震荡混匀，再分别加入0μg、5μg、10μg、15μg、25μg和₈μg_、10μg_、13μg_、15μg_、18μg的兔抗猪抗体，涡旋器上震荡混匀静止10min后，向上述各EP管中依次加入100μL的10％NaCl溶液，混匀后室温静止2h后，观察1～5号EP管(不同EP管内胶体金溶液的抗体用量不同)内胶体金溶液的颜色变化，溶液颜色保持红色的EP管内胶体金溶液的抗体用量即为抗体的饱和标记量，实际标记过程中多加30％即为稳定胶体金的蛋白用量，实验结果见图4。

由图4可知，兔抗猪IgG最佳标记量为13μg。

(4)胶体金标记抗体的制备及其纯化

S1、向已处理好的玻璃小瓶和转子中，加入2mL的胶体金溶液润洗2遍后，吸净溶液；

S2、将玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，吸取10mL胶体金溶液加入其中，调好搅拌速度为40转/min；

S3、加入10μl的0.2M K₂CO₃调节胶体金溶液的PH值后混匀30min；

S4、缓慢滴加130μg的兔抗猪IgG，混匀2h以上；

S5、加入100μl的20％的BSA，混匀30min；

S6、加入100μl的20％的PEG20000，混匀2h，得到胶体金标记抗体溶液(见图5)；

S7、将S6所得胶体金标记抗体溶液分装置于EP管中，于4℃12000r/min离心15min；

S8、离心结束后立即将上清吸出弃去，吸出残液，用1mL的金标复溶液重悬沉淀，得到纯化好的胶体金标记抗体，将其置于4℃保存备用。

金标复溶液的制备方法为：2mL 50％海藻糖，1mL 50％蔗糖，1mL 10％BSA，加6mL0.2MTris-HCl至10ml。

(5)结合垫处理液、样品垫处理液的选择

按照配方分别配制结合垫处理液和样品垫处理液，配液后将结合垫处理液涂布在一个玻璃纤维膜上，将样品垫处理液涂布在另一个玻璃纤维膜上，两个玻璃纤维膜尺寸规格相同，分别置于烘箱内，于37℃下干燥后，得到结合垫和样品垫，结合垫处理液和样品垫处理液的检测结果见图6。

通过检测样本，观察样本流速(1分钟内流到质控线以上)、背景颜色(与白色底部对比明显)、液体吸收速度(20秒内吸收较为完全)，确定最适宜的处理液配方，“()”为判断标准，筛选结果详见表1。

表1处理液配方

种类名称	配方
		结合垫处理液A	20mMTris、1％PVP、0.5％Trionx-100
结合垫处理液B	20mMTris、5％蔗糖、0.5％酪蛋白、0.8％TritonX-100
		样品垫处理液C	20mMTris、0.5％PVP、2％蔗糖、1％NACL、1％酪蛋白
样品垫处理液D	20mMTris、0.5％Tween-20、0.2％BSA

将上步筛选出来的最适处理液配方分别处理结合垫和样品垫，置于培养箱中浸泡处理30min，然后摆放在自制的架托上37℃烘干；组装前将结合垫垫放入稀释好的胶体金标记抗体溶液中浸泡30min，架托上37℃干燥，得到金标垫，备用。

(6)C检测线、T线包被浓度的确定及点膜

T检测线上包被用PB缓冲液稀释浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的PEDV S1蛋白，吸取0.7μl于硝酸纤维素膜检测线位置上点膜；

C检测线上包被用PB缓冲液稀释的浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG抗体，吸取0.7μl于硝酸纤维素膜质控线位置上点膜，室温晾干或用吹风机吹干；

PB缓冲液的配制方法为：称取0.86g Na₂HPO₄·12H₂O和0.46g NaH₂PO₄·2H₂O，加10mL水溶解，调节PH值至7.0。

利用猪流行性腹泻阳性、阴性参照血清检测，以确定最佳包被浓度，T线包被原料浓度选择结果见图7。

经阴、阳性血清平行比对的结果显示，当其浓度为0.5mg/mL时质控线与检测线颜色均较均匀、红色鲜明。当其浓度升至1.0mg/mL时，由于C、T线包被原料竞争金标原料的缘故，T线包被原料浓度越高，拦截金标原料越多，导致C线的颜色越浅。故选择浓度为0.5mg/mL的PEDV S1蛋白为T线最佳抗体包被浓度。

(7)胶体金试纸条的组装

将其上设置有C检测线和T检测线的硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上。使吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面距离其边缘2mm，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面距离其边缘2mm，样品垫边缘附着在金标垫上，彼此衔接紧密。最终裁剪成4.0mm*6.0cm的试纸条，密封备用。

下面结合实施例1制备的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条对该试纸条的使用方法进行说明。

滴加70μl待测样本于试纸条的样品垫端，待测样本透过样品垫与金标垫接触，释放胶体金标记抗体。由于硝酸纤维素膜的毛细血管作用，液体渐渐向吸水垫端渗移，分别与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线反应。利用抗原抗体的免疫学特性以及胶体金聚集后可呈现颜色反应的特点，肉眼即可通过颜色变化判断待检样本中抗原/抗体的存在与否，试纸条的判定标准如表2所示。

需要说明的是，此处的待测样本为随机选取自于北京某猪场送检的60份血清样品。

表2试纸条的判定标准

现象	结果
		检测线、质控线均出现红色圆点	试纸条呈阳性
质控线出现红色圆点；检测线无圆点出现	试纸条呈阴性
		质控线没有圆点出现	试纸条无效

利用上述待测样品对利用本发明用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法制备的试纸条进行使用，结果显示本发明所制备的试纸条具有灵敏度高、重复性好、特异性强的特点。

下面结合实施例1来说明本发明制备的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条在制备检测样品中猪流行性腹泻病毒变异株抗体的试剂中的应用。

临床样本检测

(1)实验方法

对来自于北京某猪场送检的60份血清样品进行检测，与ELISA检测背景进行复核。

运用间接ELISA方法检测30份阳性样本、30份阴性样本，S1蛋白为包被原料，山羊抗猪酶标二抗反应，450nm处读取OD值。以此为背景对比胶体金结果准确度。

共对本实验室2014年保存的来自于北京某地区猪场送检的60份血清样品进行检测，5min判定结果，与ELISA检测背景进行复核。结果检测30份阳性样本，符合率30/30、30份阴性样本，符合率30/30，与ELISA背景总符合率为100％。

(2)结果

实验结果见表3和图8。

表3间接ELISA法检测临床样本结果

上述实验结果表明，本发明所制备的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条，可用于诊断猪只是否感染变异型PEDV或者检测猪只免疫疫苗后的抗体水平。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims

1.用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条，包括PVC板，所述PVC板上设置有硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有C检测线、T检测线，其特征在于，所述金标垫经胶体金标记抗体制备而成；

所述胶体金试纸条的组装步骤如下：

2.根据权利要求1所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条，其特征在于，编码所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括样品垫和结合垫的处理、金标垫的制备、C检测线、T检测线的处理和胶体金试纸条的组装。

4.根据权利要求3所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，样品垫和结合垫的处理步骤如下：

5.根据权利要4所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述结合垫处理液的配方为：1g PVP,5ml 10％Triton X-100，加95ml 20mM Tris，调pH＝9；

6.根据权利要求3所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述金标垫的制备方法包括：制备胶体金标记抗体，用金标复溶液重悬胶体金标记抗体，然后用重悬液浸泡结合垫制备得到金标。

7.根据权利要求6所述的用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，胶体金标记抗体按照如下步骤制备：

S1、取去离子水加热至沸腾后，加入氯金酸溶液和柠檬酸三钠混匀，加入氯金酸溶液与柠檬酸三钠与去离子水的体积比为1：98-100：1.4-1.6，继续加热，待颜色由灰色变为黑色，再变为亮红色后且颜色保持不变，停止加热，避光冷却至室温，得到胶体金溶液；

8.根据权利要求7所述的一种用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，胶体金溶液配制过程中使用的所有试剂均需要使用无菌滤器虑菌。

9.根据权利要求3所述的一种用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述C检测线、T检测线的处理按照如下步骤：

T检测线上用0.1M的PB缓冲液稀释包被PEDVS1蛋白的浓度为0.5--2mg/mL，吸取于硝酸纤维素膜检测线位置上点膜，干燥；

C检测线上包被经0.1M的PB缓冲液稀释的浓度为0.8-1.2mg/mL的羊抗兔IgG抗体，于硝酸纤维素膜质控线位置上点膜，干燥。

10.根据权利要求9所述的一种用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述PB缓冲液中包含0.86gNa₂HPO₄·12H₂O和0.46gNaH₂PO₄·2H₂O。