JP2013135688A - 診断試験キット - Google Patents
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Abstract
【課題】診断試験キットに使用される、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法の提供。
【解決手段】本発明は、PRRSウイルス感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、a)PRRSウイルス感染細胞集団を準備し、ここで、前記細胞はPRRSVコードタンパク質及び抗原を産生して無細胞PRRSウイルスを培地中に産生する、b)当該PRRSウイルス感染細胞を、当該細胞周辺の培地中の無細胞PRRSウイルスから単離して、細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む単離した細胞を形成させ;そしてc)界面活性剤含有溶液を用いて、工程b)で単離した細胞を抽出又は溶出して細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原と細胞成分とを含む抽出物又は溶出物を形成させ、d)当該抽出物又は溶出物を免疫原性組成物として調製すること、を含んで成る方法、を提供する。
【選択図】図1
【解決手段】本発明は、PRRSウイルス感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、a)PRRSウイルス感染細胞集団を準備し、ここで、前記細胞はPRRSVコードタンパク質及び抗原を産生して無細胞PRRSウイルスを培地中に産生する、b)当該PRRSウイルス感染細胞を、当該細胞周辺の培地中の無細胞PRRSウイルスから単離して、細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む単離した細胞を形成させ;そしてc)界面活性剤含有溶液を用いて、工程b)で単離した細胞を抽出又は溶出して細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原と細胞成分とを含む抽出物又は溶出物を形成させ、d)当該抽出物又は溶出物を免疫原性組成物として調製すること、を含んで成る方法、を提供する。
【選択図】図1
Description
関連出願に対するクロスリファレンス
本願は、2005年7月5日に出願した米国仮出願番号第11/175,605号の利益を主張するものであり、当該出願は、引用によりその全体が完全に記載されているよう本明細書で援用される。
本願は、2005年7月5日に出願した米国仮出願番号第11/175,605号の利益を主張するものであり、当該出願は、引用によりその全体が完全に記載されているよう本明細書で援用される。
本発明は、1又は複数のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)由来の1又は複数のタンパク質及び/又は抗原を認識する抗体を検出するためのキット、装置、及び方法に関する。当該抗体は、PRRSVに感染した、又はその危険性のある被験者の体液中にあることもある。本発明は、有利にはPRRSVの診断及び予防の両方に適用されうる。
米国の養豚産業における経済的損失の主な原因は、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRSV)ウイルス、又はPRRSVにある。PRRSVは、ブタの生殖器疾患及び呼吸器障害の病原因子である。PRRSVに伴う経済的損失は、主に、それが妊娠中の雌ブタの流産及び育成ブタのブタ呼吸器病症候群(PRDC)に関与することに起因する。異なる抑制措置、例えばワクチンの使用及び管理の変更が実施されている。例えば、米国特許第5,690,940号を参照のこと。しかしながら、慣習的にワクチン接種が行われているにも拘らず、PRRSVの大流行が養豚場で発生することは珍しいことではない。
かかる大流行は、バイオセキュリティー対策の不備が最も一般的な原因である。PRRSVに感染した、代替のための(replacement)未経産のブタ(gilt)を群れの中で検出することが不十分であるのは、バイオセキュリティーの不備が原因であった。これらの問題は、PRRSV感染について単純且つ安価な試験方法が農場で利用可能であるならば回避可能なこともある。かかる方法は、また、雌ブタが順応段階で陰性な離乳ブタを生産するか否かを試験するのにも適用されうる。
PRRSV抗体を試験するために、獣医は血液試料を採取し、そしてそれらを獣医学的な診断研究所に送るべきである。現在、ELISA、間接的蛍光抗体試験及びイムノペルオキシダーゼ単層アッセイが、抗PRRSV抗体を検出するのに一般的な研究所での方法である。しかしながら、これらの方法は、高価な設備及び訓練された研究員の技術を必要とする。これらの技術を用いると、郵送の時間も含めて少なくとも3日は結果を得るのに必要とされる。更に、養豚家は、サンプルを採取し、そしてそれらを診断研究所に送る費用を負担しなければならない。現場ベースの、単純で迅速なPRRSV抗体の検出試験は、動物病院又は企業養豚家の研究所で非常に有用であろう。PRRSVワクチンを用いる疾患の根絶は、農家レベルでは定期的には成功していない。トータルデポピュレーション及びレポピュレーションのような方法は、農場での根絶に有効であることが示されている。しかしながら、かかる方法は全ての農場で使用することができず、実施するのに比較的費用がかかる。
更に、かかる方法は、PRRSVの検出に依存する。PRRSVの種によっては、核酸配列及びコードタンパク質が既述されている。組織試料、例えば肺組織を介してのPRRSVの検出も開示されており(WO96/06619を参照のこと)、これはPRRSVが優先的に肺胞マクロファージで複製するという観察と一致するものである。口鼻経路による感染の後、肺のマクロファージで複製したPRRSVは、肺リンパ節に進入し、続いて、血流を介して異なる器官に進む。
本明細書で引用する文書は、いずれかが関連の従来技術であることを認めるものと意図されていない。日付についての声明又は文書の内容についての説明は全て、出願人に利用可能な情報に基づくものであり、当該文書の日付又は内容の正確性についての承諾を何ら構成するものではない。
本発明の簡単な説明
本発明は、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、又はPRRSVによる被験者の感染を検出するためのキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、1又は複数のPRRSVコードタンパク質及び/又は当該タンパク質に対する抗体と結合する抗原を含む組成物の使用によって媒介される。従って、本発明は、「抗体捕捉」、続いて、当該抗体の検出、の原理に基づくものと考えられてもよい。当該抗体は、PRRSVに感染した被験者に存在するが、感染していない個体には存在しないものである。
本発明は、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRS)ウイルス、又はPRRSVによる被験者の感染を検出するためのキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、1又は複数のPRRSVコードタンパク質及び/又は当該タンパク質に対する抗体と結合する抗原を含む組成物の使用によって媒介される。従って、本発明は、「抗体捕捉」、続いて、当該抗体の検出、の原理に基づくものと考えられてもよい。当該抗体は、PRRSVに感染した被験者に存在するが、感染していない個体には存在しないものである。
1又は複数のPRRSVコードタンパク質は、ヌクレオキャプシド(N)タンパク質及び/又は1又は複数のウイルスエンベロープ(「E」)タンパク質を含むこともある。当該タンパク質はまた、PRRSV感染細胞の表面に見られる糖タンパク質であってもよい。当該タンパク質はまた、被験者において検出される抗体であって、PRRSVタンパク質、すなわちPRRSVを認識する抗体に対し使用されるPRRSV抗原であるとみなされてもよい。
PRRSVタンパク質及び/又は抗原は、有利には、抗PRRSV抗体の検出に基づいて、早い時点でPRRSV感染を検出するために、本発明のキット、装置、及び方法で使用してもよい。かかる検出法は、上述のような少なくとも1つのPRRSVタンパク質及び/又は抗原に対して早い時点で感染した被験者の抗体の存在に依拠する。
第一の観点において、本発明は、本明細書に記載のキット又は装置の調製又は使用における1又は複数のPRRSV発現タンパク質及び/又は抗原を含む組成物の使用方法を提供する。態様によっては、前記装置は、本発明の組成物でコートされているディッシュである。かかるディッシュの非限定的な例としては、種々のサイズのペトリ皿並びにマイクロタイタープレートのウェルがある。当該ディッシュは、前記組成物に含まれる1又は複数のPRRSVタンパク質及び/又は抗原に対する抗体について診断試験する際に使用するためのものであってもよい。従って、前記装置は、前記組成物中の1又は複数のPRRSVタンパク質及び/又は抗原に対する抗体の存在を検出するために使用されうる。検出されるべき抗体は、体液のサンプル中にあってもよく、そして抗体が存在する場合には、サンプルが採取された被験者中のPRRSV感染の指標としての役割を果たす。従って、前記装置は、PRRSV感染の存在を診断する迅速な手段として使用されうる。
本発明のかかる装置の中心部は、前記組成物中に存在する1又は複数のPRRSVタンパク質及び/又は抗原の固定型の存在である。PRRSVタンパク質及び/又は抗原は、直接、例えば、非限定的な例として、吸着(例えばコーティング)により又は装置表面への接合により、固定されうる。あるいは、当該タンパク質及び/又は抗原は、間接的に、例えば前記タンパク質及び/又は抗原と結合する物質の使用により、あるいは前記表面及び前記タンパク質又は抗原の両方と結合するリンカーの使用により固定されうる。従って、固定されたPRRSVタンパク質及び/又は抗原は、前記タンパク質及び/又は抗原に対する抗体により結合して、前記タンパク質及び/又は抗原を含む固定型複合体を形成するための「捕捉物質」と考えられてもよい。固定された「捕捉物質」は、当然ながら、当該物質と結合する抗体を「捕捉」する物質として考えられうる。
前記複合体は、続いて、「検出物質」、例えば、本明細書に記載のように、前記複合体と結合する標識試薬の使用により検出されうる。複合体に結合した場合、「検出試薬」は、サンプル中の抗PRRSV抗体の存在を示唆する。態様によっては、前記「検出試薬」は、前記抗体と結合する標識二次抗体であって、サンプル中に存在する場合には、前記複合体の一部として固定されているもの、である。抗PRRSV抗体の存在は、サンプルを得た被験者のPRRSV感染を示すものとして使用されうる。抗PRRSV抗体の不在は、感染していないことを示すであろう。当該サンプルは、好ましくは被験ブタ、又はPRRSVに感染していると疑われている他の被験者であるが、PRRSV又はPRRSV担体に感染しているとかもしれないあらゆる被験者が本発明の装置に使用されうる。
「検出物質」とは、例えば十分な凝集により目に見える粒子標識との接合により、直接的な検出を、可能にするよう標識されうる。あるいは、当該物質は、例えば検出可能な物質上の活性に基づいて検出される酵素に対する接合により、あるいは検出可能な生成物を生成するように、間接的な検出のために標識されうる。当然のことながら、「検出物質」は、本発明の複合体と結合する、標識又は未標識の「一次」結合物質と結合する「二次物質」であってもよい。
本発明の装置は、本発明の装置内にコントロールの部位又はコントロールの領域を含んでもよく、これは、PRRSV抗体が、装置にかけられたサンプル中に存在していたか否かに関係なく、当該装置が適切に機能していることを確認するものである。かかるコントロールは、サンプル中に存在する別の分子又は高分子部分の検出に基づいてもよい。
使用する装置のフォーマットに拘束されることなく、PRRSVタンパク質及び/又は抗原、並びにそれらを含んで成る本発明の組成物はまた、PRRSVタンパク質及び/又は抗原に対する抗体を検出する方法において使用してもよい。かかる方法は、被験者、例えばPRRSVに感染していることが疑われている個体由来の体液中のかかる抗体を検出するために設計してもよい。当該方法は、サンプル、又はその希釈物を、PRRSVコードタンパク質及び/又は抗原と接触させ、そして当該サンプル中に、前記タンパク質及び/又は抗原と結合する任意の抗体があるか否かを決定すること、を含んで成る。PRRSVタンパク質及び/又は抗原に対する抗体の結合は複合体を形成し、これは検出されて当該抗体の存在を示唆することがあり、その結果、前記サンプルを得た被験者のPRRSV感染の存在が示唆されうる。当該サンプルは、好ましくは被験ブタ由来であるが、PRRSV又はPRRSV担体に感染していると思われるあらゆる被験者が本発明に関して使用されうる。
本発明の実施に使用されうる体液の範囲は、PRRSVタンパク質及び/又は抗原に対する抗体が検出可能に存在しうる任意の液体を含む。限定しないが、例えば、被験者の身体から分泌されるもの、例えば血液、血清、血漿、唾液、涙液、粘液、鼻汁、及び膣分泌物がある。かかる液体の希釈物は、当然ながら、本発明の実施におけるサンプルとして使用されうる。態様によっては、EDTA又は他の二価陽イオンキレート剤を含む希釈剤が、被験者由来の体液サンプルと1:1の比率で使用される。血清又は血漿のサンプルを用いる態様においては、希釈は省略してもよい。
前記サンプルは、好ましくは、感染を示す症候の存在に起因して、PRRSVに感染していることが疑われる個体に由来する。あるいは、本発明の方法は、動物、例えば、農場の動物のルーチンなスクリーニングの一部として、感染した個体の迅速な同定及び単離を可能にするために使用してもよい。当該方法はまた、具体的な事例において、例えば、ある場所から別の場所への動物の運搬又は輸送の前に、感染の同定を可能にし、そして感染の拡大を防ぐために使用してもよい。本発明の多くの態様において、被験体はブタであり、そのため、サンプルはブタの体液又は分泌物のものであってもよい。本発明による使用のためにサンプルを得ることができるブタの非限定的な例には、雄ブタ、未経産ブタ、経産ブタ(sow)、肥育ブタ(fattener)、幼ブタ(nusery)及び哺乳子ブタ(suckling pig)が含まれる。ブタは、生まれてから死ぬまでのあらゆる年齢に及んでいてもよい。限定しないが、例えば、約30〜約40、41〜約50、又は51〜60日齢以上のブタが本発明の実施に使用されうる。
態様によっては、前記方法は、垂直免疫拡散酵素アッセイ (vertical immunodiffusion enzyme assay) (VIDEA)ベースのフォーマットである。当該フォーマットは、固定化PRRSVタンパク質及び/又は酵素を利用するものであり、これは、抗PRRSV抗体を含む、又は含むことが疑われるサンプルから透水性バリアによって分離される。当該サンプルは、多孔性材料を介して前記バリアに提示され、そして当該サンプル中の抗PRRSV抗体は、前記透水性バリアを通過して拡散し、PRRSVタンパク質及び/又は抗原と接触する。抗体とタンパク質/抗原との接触は、複合体の形成をもたらし、これはその後検出されてサンプル中の抗体の存在を示す。当該検出は、複合体が存在する領域の形態でなされてもよい。態様によって、透水性バリアは寒天又はアガロースである。
他の態様において、当該方法は水平免疫拡散酵素アッセイ (horizontal immunodiffusion enzyme assa)(HIDEA)ベースのフォーマットである。当該フォーマットは、固定化PRRSVタンパク質及び/又は抗原を利用する点で上述のVIDEAのものと類似している。HIDEAフォーマットは、抗PRRSV抗体を含む、又は含むことが疑われるサンプルから、透水性バリアにより固定化タンパク質/抗原を分離することを含む。当該サンプルは、抗PRRSV抗体が透水性バリアを通過してPRRSVタンパク質及び/又は抗原と接触するように、直接バリアに提示される。拡散は、サンプルの接触点から当該バリアへと、外側に広がる。抗体とタンパク質/抗原との接触は、複合体の形成をもたらし、これは、検出されることでサンプル中の抗体の存在を示唆することもある。当該検出は、複合体が存在する円又は環の形態でなされてもよい。態様によっては、透水性バリアは寒天又はアガロースである。
本発明の種々の観点は、北アメリカ株と抗原的に関連している全てのPRRSV株との関連での使用が考慮される。従って、本発明は、より一般的には、任意のPRRSVウイルスのタンパク質に基づくと考えることができる。
更に、かかる装置の製造に関連する方法が提供される。従って、本発明の追加の観点は、本明細書に記載のキット、装置及び方法の構成要素を調製する方法に関連する。本発明は、感染細胞からPRRSVタンパク質を調製する方法を含む。態様によっては、前記タンパク質は、タンパク質の大部分、又は全部が感染細胞と会合したままである場合に、感染後の早い時点で収集される。別の言い方をすれば、PRRSVコードタンパク質の大部分又は全部が、感染細胞内にあるか、あるいは感染細胞の細胞膜と会合している。かかる状態のもとでは、もしあるとしたら比較的少ない数の、PRRSV粒子が細胞の外側の細胞外環境に存在する。
別の観点は、第一の結合物質、例えば、限定しないが、PRRSVのNタンパク質及び/又は1又は複数のエンベロープタンパク質を、上述の装置の少なくとも一面に固定化する方法を提供する。
本発明の他の観点において、本発明の装置を含んで成るキット又は本明細書に記載の方法を実施するためのキットが提供される。追加の観点には、本発明により提供される1又は複数の方法の実施における使用のための組成物及び製品がある。かかる組成物の非限定的な齢には、本発明のキット又は装置の調製における使用ためのものが含まれる。限定しないが、キットには、本明細書に開示した方法の使用のための、本発明の1又は複数の組成物又は物質、あるいは本発明の1又は複数の装置を含んで成るものが含まれる。
本発明の1又は複数の態様の詳細は、添付図及び以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び詳細な説明、並びに特許請求の範囲から自明であろう。
定義
本明細書で使用する場合、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRSV)ウイルス、又はPRRSVという用語は、PRRS、ミステリーブタ病 (Mystery Swine Disease) (MSD)、以前「青耳症候群」として知られていたブタの不妊・呼吸症候群(SIRS)、ブタの伝染性流産・呼吸器症候群(PEARS)、ワバッシュ(Wabashu)症候群、ミステリーブタ病 (Mystery Pig Disease) (MPD)、ブタペスト、英国における青色流産病 (blue abortion disease)又は青耳病、オランダにおける青い流産 (abortus blau)、ドイツでのSeuchenhafte Spaetabort der Schweine、及びヘコヘコ病を指す。
本明細書で使用する場合、ブタ生殖器呼吸器症候群(PRRSV)ウイルス、又はPRRSVという用語は、PRRS、ミステリーブタ病 (Mystery Swine Disease) (MSD)、以前「青耳症候群」として知られていたブタの不妊・呼吸症候群(SIRS)、ブタの伝染性流産・呼吸器症候群(PEARS)、ワバッシュ(Wabashu)症候群、ミステリーブタ病 (Mystery Pig Disease) (MPD)、ブタペスト、英国における青色流産病 (blue abortion disease)又は青耳病、オランダにおける青い流産 (abortus blau)、ドイツでのSeuchenhafte Spaetabort der Schweine、及びヘコヘコ病を指す。
PRRSVタンパク質は、PRRSVゲノムがコードする、そして/あるいはPRRSV感染又はPRRSVライフサイクルの結果としてのみ生成されるあらゆるポリペプチドを指す。従って、PRRSV特異的で、且つ、その結果、PRRSV感染細胞によってコードされておらず、又は発現されていないポリペプチドは、この用語の範囲内にある。PRRSV感染細胞によってコードされているが、PRRSV感染及び/又はライフサイクルの不在下で発現しない内因性ポリペプチドは意図していない。しかしながら、PRRSV感染及び/又はライフサイクルの結果としてのみ発現した内因性ポリペプチドはかかる用語の範囲内にある。当該用語はまた、二次及び/又は三次構造の変化に起因するポリペプチドの別の形態、例えば、非限定的な例として、部分的又は実質的なタンパク質変性から生じるもの、を含む。従って、前記ポリペプチドの変性形態はかかる用語の範囲内にある。
PRRSV抗原は、抗PRRSV抗体によって認識されているPRRSVポリペプチドの任意の部分又はフラグメントを指す。態様によっては、当該部分又はフラグメントは、会合部分、例えば、限定しないが、糖部分、リン酸塩部分、又は脂質部分を有するペプチドであってもよい。あるいは、当該部分又はフラグメントは、非ペプチド部分と何ら会合していないペプチドであってもよい。
本発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、検出抗PRRSV抗体を対象とするキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、1又は複数のPRRSVコードタンパク質及び/又は前記タンパク質に対する抗体に結合する抗原の使用に基づく。かかる抗体は、PRRSVに感染した被験者には存在するが、感染していない個体には存在しないものである。本発明は、捕捉した抗体が検出される、「抗体捕捉」アッセイとして考えられてもよい。本発明はまた、抗PRRSV抗体の検出に基づく免疫拡散を提供するものと考えることもできる。
本発明は、検出抗PRRSV抗体を対象とするキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、1又は複数のPRRSVコードタンパク質及び/又は前記タンパク質に対する抗体に結合する抗原の使用に基づく。かかる抗体は、PRRSVに感染した被験者には存在するが、感染していない個体には存在しないものである。本発明は、捕捉した抗体が検出される、「抗体捕捉」アッセイとして考えられてもよい。本発明はまた、抗PRRSV抗体の検出に基づく免疫拡散を提供するものと考えることもできる。
本発明は、PRRSVの構造タンパク質、例えばヌクレオキャプシド(N)タンパク質、膜(M)結合タンパク質、そして少なくとも4個のエンベロープ(E)タンパク質を使用してPRRSVに感染した被験者における抗体を検出することが可能であるという認識に一部基づくものである。別の言い方をすれば、本発明は、これらのタンパク質、及び/又はそれらの抗原性部分に対する抗体が、PRRSVに感染した被験者に存在し、その結果、その抗体の検出が被験者がPRRSVに感染しているということを示唆するのに有利な手段をもたらすという発見に一部基づいている。
本発明はまた、ある条件及びプロトコールを使用することで、他のPRRSVタンパク質及び/又は抗原と比較して高濃度のEタンパク質を含む、PRRSVタンパク質及び/又は抗原の組成物を得ることが可能であるという発見に一部基づくものである。従って、本発明は、PRRSVタンパク質及び/又は抗原を、それらに感染した細胞から調製する方法を含む。当該タンパク質及び/又は抗原は、タンパク質の大部分、又は全部が感染細胞と結合したままである場合に、あるいは、他の方法で本発明の細胞結合ウイルス成分(CAVC)の一部となっている場合に、感染後の早い時点で収集される。別の言い方をすれば、PRRSVタンパク質及び/又は抗原の大部分、又は全部が、感染細胞内にあるか、あるいは感染細胞の細胞膜と結合している。かかる状態のもとでは、もしあるとしたら比較的少ない数の、PRRSV粒子が細胞の外側の細胞外環境に存在する。本発明は、比較的短期間に感染した細胞が、本発明の検出方法に使用するのに適したPRRSVコードタンパク質を十分量産生することができるという予測できない発見に一部基づいている。PRRSV粒子の産生及び/又は細胞外環境へのそれらの放出、の前の早い時点からのCAVCの調製も、感染ウイルス粒子が夾雑物として存在しない点で高い安全性という利点を有する。
感染細胞は、PRRSVに増殖的に感染することができるあらゆるものであってもよい。限定しないが、例としては、in vitro又はin vivoのいずれかのブタ細胞がある。in vitro細胞の非限定的な例には、PRRSVに感染しているブタ被験者由来の初代細胞がある。in vivoの非限定的な例には、口鼻経路を介してPRRSVに感染し、続いて、PRRSVタンパク質及び/又は抗原の調製のために収集されるブタ肺胞マクロファージ(PAM)である。別の非限定的な例には、サル細胞系MARC−145を用いるものである。当該方法によって産生されるPRRSVタンパク質及び/又は抗原には、PRRSV N、M及びEタンパク質のうちの少なくとも1つが挙げられる。これらのタンパク質の組み合わせは、本発明の細胞から調製することも可能である。態様によっては、調製されたタンパク質/抗原は、N及びMタンパク質と比較して高い比率のEタンパク質を有する。
従って、本発明は、PRRSウイルス感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、a)PRRSウイルス感染細胞集団を準備し;b)当該感染細胞を、無細胞PRRSウイルスから単離して、細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む細胞を形成させ;そしてc)項目b)で単離した細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を抽出又は溶出すること、を含んで成る方法、を提供する。無細胞ウイルスが全く存在しない場合、項目b)は、単に、前記方法に干渉しうる他の材料、例えば細胞に使用する培地から細胞を単離する役割へと修飾することも可能である。項目b)は、当業界で知られている任意の手段によって、例えば、遠心を用いることで、除去又は廃棄される細胞のペレット及び上清を生成させることにより、あるいは膜濾過を用いることで、上清を除去し、そして細胞を維持することで実施してもよい。項目c)は、任意に、緩衝液中での細胞の再懸濁によって実施される。態様によっては、抽出又は溶出は、界面活性剤を含む溶液を用いることで行われ、そのため、細胞を再懸濁するために使用される緩衝液は界面活性剤を含んでもよい。
他の態様においては、上清1ml当たり僅かな量乃至検出不可能な量の感染単位を生成するのに十分な時間、PRRSウイルスに感染した細胞集団を使用することを含んで成る。限定しないが、例としては、101.5組織培養感染量(TCID)50/ml未満である。前記方法で使用する細胞集団は、任意に、CPEを観察するために、十分な時間PRRSウイルスに感染していてもよい。当然のことながら、CPE、又はCPEの初期段階が観察されるのに十分長時間感染している細胞も本発明の実施に使用されうる。
追加の態様において、本発明は、PRRSウイルスタンパク質及び抗原を、PRRSウイルスに感染したブタの肺胞マクロファージ(PAM)細胞から調製する方法を提供する。当該方法は、PRRSウイルスを口鼻から接種したブタの肺胞で得られたPAM細胞集団から、前記タンパク質及び抗原を調製することを含んで成ることもある。PRRSウイルスタンパク質及び抗原は、上述のように、細胞から抽出又は溶出してもよい。従って、当該細胞は、抽出緩衝液中で再懸濁されうる。態様によっては、抽出又は溶出は、界面活性剤含有溶液を用いて行われ、そのため、細胞を再懸濁するために使用されうる緩衝液は、界面活性剤を含むことがある。
界面活性剤含有溶液は、PRRSVタンパク質及び/又は抗原を抽出又は溶出するのに適しているものであればいずれのものでもよい。非限定的な例の1つとして、非イオン性界面活性剤、例えばポリ(エチレングリコール)p−イソオクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Nonidet P−40)、又はTriton X−100の使用がある。本発明の態様によっては、界面活性剤は、溶液中約0.5%の濃度であり、例えば約0.5%のTriton X−100溶液である。
本発明はまた、PRRSウイルス感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法を提供する。かかる方法は、前記タンパク質及び抗原を、in vitro及びin vivoの方法により調製した細胞集団から調製することを含んで成る。in vitroの方法の場合、ブタ肺胞マクロファージ(PAM)細胞又はMARC−145系の細胞が培養され、そして当該細胞がPRRSVの感染後に収集される。細胞培養系を用いないin vivoの方法の場合、PAM細胞は、PRRSウイルスを口鼻的に接種した後、ブタの肺胞から得られる。抗原の収率は、異なるPRRSV単離物を用い、ウイルス接種後異なる日数で比較され、そして最高の抗原の収率のための最適な条件を比較試験で予め決定した。
本発明は、当然のことながら、本明細書で開示された方法のいずれかによって調製された、単離されたPRRSVタンパク質及び/又は抗原を含む組成物を含む。当該組成物は、PRRSVタンパク質及び/又は抗原が使用されるあらゆる目的のために使用してもよい。非限定的な例としては、前記タンパク質/抗原に対する抗体を調製するための使用;PRRSVタンパク質の参照マーカーとしての使用;及び免疫原性組成物としての使用、例えばワクチン製剤の場合、任意に、免疫反応を生成するために動物に投与される適当なアジュバントと併用される。前記組成物の追加の非限定的な例には、前記タンパク質/抗原が可溶性/凍結乾燥(フリーズドライ)の形態にある組成物が含まれる。
態様によっては、前記組成物は、表面、例えば本発明の装置の表面をコーティングするのに適した溶液状態にある。かかる溶液は、前記タンパク質をペトリ皿の底の上にコーティングするのを可能にする。限定しないが、例として、pH9.6の0.06M炭酸緩衝溶液で希釈したPRRSVタンパク質/抗原溶液がある。前記溶液を使用して、ディッシュ又はウェルの表面、例えば、それぞれポリスチレン又はガラス製のペトリ皿又はマルチウェルプレートの表面にコーティングすることもできる。非吸着性の材料は、任意に、タンパク質/抗原を含まない緩衝溶液中での1又は複数の洗浄の後、廃棄することもできる。当該コーティングは、種々の温度で、例えば25℃未満で、種々の時点で実施されうる。態様によっては、コーティングは、4℃又はおよそ4℃で約72時間行ってもよい。
従って、本発明はまた、表面をウイルスタンパク質及び/又は抗原でコーティングする方法であって、a)本明細書に記載のとおり調製した1又は複数のPRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備し;そしてb)前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記タンパク質及び/又は抗原は、本明細書に記載のとおり、界面活性剤含有溶液の使用によりPRRSV感染細胞から抽出又は溶出した。追加の態様において、コーティングされるべき表面は、ポリスチレン又はガラスあるいは類似の材料から作られる。当該表面は、好ましくはエタノールで洗浄され、これは続いて蒸発される。
PRRSVタンパク質/抗原の溶液は、きれいな表面に適用され、そして約2時間〜約4時間乃至一晩吸着させられる。タンパク質/抗原は、タンパク質/抗原を表面に吸着させるのを促進するために、約0.01〜0.001%の至適濃度に、好ましくは炭酸水素−炭酸ナトリウムコーティング緩衝液中で希釈されうる。コーティング緩衝液は、好ましくは約0.01M〜0.1M(pH9〜10)の間で、1リットル当たり約0.84〜8.4gのNaHCO3及び1リットル当たり0.11〜10.6gのNa2CO3を含むはずである。コーティング期間の後、過剰な溶液は廃棄され、又は他の方法により除去される。コーティングされた表面は、蒸留水又はタンパク質/抗原を含まない緩衝液で洗浄してもよい。PRRSVタンパク質及び/又は抗原によるコーティングに続いて、任意に、ブロッキング剤、例えば、限定しないが、1%ウシ血清アルブミン(BSA)/pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いたコーティングを行ってもよい。当該コーティングは、種々の温度、例えば約37℃で、種々の時点で行ってもよい。態様によっては、コーティングは、37℃又は約37℃で約1時間でもよい。ブロッキング剤の適用後、溶液は除去され、そして、任意に1又は複数の水又はブロッキング剤を含まない緩衝液を含んで成る洗浄液で洗浄される。
コーティング後、透水性バリア層がコート表面に適用される。当該バリアは、乾燥後に透水性バリアを遅れて形成する溶液として適用することができる。非限定的な例としては、寒天及び/又はアガロースの溶液であって、乾燥すると、ゲル様材料から構成される透水性バリアを形成するもの、がある。従って、融解した寒天又はアガロース層を適用し、固化させてもよい。寒天層の深さは必須ではなく、少なくとも約1.5mm、好ましくは約2mm〜約10mmに変化してもよい。当該層は、約0.75〜1.5%、好ましくは約1%の溶液に適用される。
直径60mmのポリスチレン製のペトリ皿を用いる非限定的な例として、4mlの0.6%アガロース/PBSが本明細書に記載のVIDEAベースの方法に使用される。6mlの同溶液はHIDEAベースの方法に使用される。当該溶液は、例えば4℃で、一晩固化される。そのようにコーティングされる装置は、抗PRRSV抗体の検出のための診断キットの全部又は一部として使用することもできる。例えば4℃で、加湿器内で、最大4ヶ月保存してもよい。
本明細書に記載のコート表面を有する装置は、抗PRRSV抗体の検出のための診断キットの全部又は一部として使用されうる。従って、本発明はまた、PRRSウイルスに対する抗体を検出する方法であって、a)血液又は血清試料を被験者から回収し;b)前記試料と、本明細書に記載のようにコーティングされた装置の透水性バリアとを接触させ;c)前記試料をインキュベートして、抗体のような分子が透水性バリアを通過して拡散し、そして前記装置をコーティングするのに使用したタンパク質/抗原と結合するようにし;d)透水性バリアを除去し、そして任意に、前記装置を洗浄して未結合抗体を除去し;e)抗体が前記タンパク質/抗原に結合することによって形成した複合体を検出すること、を含んで成る方法、を提供する。工程b)の装置に関して、非限定的な1つの例として、(1)水平な支持表面を有するディッシュ;(2)PRRSVタンパク質/抗原の前記表面上に吸着されたコーティング;及び(3)前記コーティングに重層されている寒天層を含んで成る、ディッシュ試験プレートである装置がある。
項目e)に関し、前記方法は、形成した複合体と結合する検出物質の適用により実施されることもある。限定しないが、一例として、サンプル中に存在しうる抗体と結合する二次抗体との併用がある。限定しないが、かかる二次抗体の例には、特定の動物、例えばマウス、ラット、ヤギ、ウサギ等に由来するものであって、試験されるサンプル中の抗体のFc部分を認識するもの、がある。
二次抗体は、その検出を容易にするための標識とコンジュゲートされることもある。このコンジュゲーションは、抗体に別の部分を接合させることで当該抗体を修飾する。当該部分は、好ましくは検出可能な標識、例えば直接検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光標識(非限定的な例として、Cy3及びCy5)又は粒子標識、である。粒子標識の非限定的な例として、ラテックス粒子、金属ゾル、及びコロイド状の金属粒子がある。あるいは、前記標識は、間接的な検出のためのものでもよい。非限定的な例としては、酵素があり、例えば、限定しないが、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼがある。他の非限定的な例として、別の分子と結合した分子、例えば限定しないが、ビオチン、親和性ペプチド、又は精製タグがある。好ましくは、前記標識は共有結合している。
態様によっては、二次抗体は、抗ブタ免疫グロブリンとコンジュゲートした酵素であって、約30〜約60分間当該複合体中の抗体と結合させられるもの、である。結合後、未結合の二次抗体は、1又は複数の任意の洗浄によって除去されうる。酵素は、任意の適当な酵素、例えば酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)で使用される酵素、例えばペルオキシダーゼであってもよい。ペルオキシダーゼは、アミノサリチル酸と過酸化水素、又はp−フェニレンジアミンと過酸化水素が反応した場合に、紫色を生成する。アルカリホスファターゼは、ジニトロフェニルホスフェートと反応した場合、黄色を生成する。ベータ−ガラクトシダーゼは、O−ニトロフェニル−ベータ−D−ガラクトピラノシドと反応して紫色を呈する。
酵素結合型の二次抗体の非限定的な例に続いて、結合型の二次抗体の検出による複合体の検出は、前記酵素により、反応時に検出可能なシグナルを生成する、限定しないが、例えば色を産生する基質を含む寒天溶液を重層することで媒介されうる。態様によっては、検出可能なシグナルは、目視で、例えば肉眼で観察可能なものである。前記シグナルは、ポジティブコントロール(既知の抗PRRSV抗体であって、コート表面と結合するものを含む)及び/又はそのような抗PRRSV抗体を含まないネガティブコントロールの使用により観察される呈色反応と比較してもよい。
本発明の態様によっては、特に本明細書に記載のVIDEAにおいては、サンプルは収集され、そして多孔性材料、例えば、限定しないが、ろ紙又はろ紙ディスクに適用される(又はそれらによって収集される)。非限定的な例としてのろ紙ディスクの使用により、当該ディスクは透水性バリア上に水平に置かれ、分子がディスクからバリアを通過してコート表面に拡散するのが可能となる。当該表面では、本発明のPRRSVタンパク質/抗原と結合する分子(例えば抗体)は、タンパク質/抗原と複合体を形成する。従って、サンプル由来の分子は、コート表面に固定化され始める。態様によっては、拡散及び複合体形成の機関は、室温(25℃)又は約37℃のいずれかで約2〜約3時間である。
複合体の形成後、透水性バリアが取り除かれる。寒天又はアガロースのバリアを含んで成る態様によっては、寒天又はアガロースの層は、任意の洗浄により剥がされてもよい。
本発明の方法は、本明細書に記載のような、サンプルの抗PRRSV抗体と結合したPRRSVタンパク質/抗原を含んで成る複合体の形成に基づく。抗PRRSV抗体は、当該複合体の検出し易さを改善するために検出されうる。サンプルからのPRRSVタンパク質/抗原と抗PRRSV抗体の複合体の検出は、サンプルを得た被験者におけるPRRSV感染の存在を示唆する。
本発明は更に、垂直免疫拡散酵素アッセイ(VIDEA)法であって、a)本明細書に記載のような1又は複数のPRRSVタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、本明細書に記載のように透水性バリアで重層されている表面を含んで成る診断装置を準備し;b)前記バリアの表面と、被験者由来の抗体含有サンプルを含んで成る多孔性材料とを接触させ;c)材料が前記サンプルから前記1又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間であって、前記多孔性材料の除去の後任意に生じる期間前記装置をインキュベートし;そしてd)透水性バリアの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、を含んで成る方法を提供する。態様によって、前記多孔性材料はろ紙ディスクである。
本発明は更に、水平免疫拡散酵素アッセイ(HIDEA)法であって、a)本明細書に記載のような1又は複数のPRRSVタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、本明細書に記載のように透水性バリアで重層されているが、サンプルを受け取るために、表面上に1又は複数のくぼみ(indentation)を含んで成る表面を含んで成る診断装置を準備し;b)1又は複数のくぼみと、被験者由来の抗体含有サンプルとを接触させ;c)材料が前記サンプルから前記1又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間前記装置をインキュベートし;そしてd)透水性バリアの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、を含んで成る方法を提供する。態様によって、1乃至多数の小さい直径の穴が透水性バリアから打ち抜かれ、試験サンプルのウェルとして機能するくぼみが形成される。当該ウェルは、直径約1〜4mmであってもよく、例えば、寒天コーティングを貫通する。7個の3mmの円形のウェルを有する鋳型を、HIDEAのための各試験ディッシュの寒天上にパンチされた穴に対して使用することは、非限定的な例である。
VIDEAとHIDEAの両態様において、サンプルは血清サンプルであるか全血サンプルである。当該方法は、PRRSVに感染していると思われる、あるいはPRRSウイルスに感染していることが疑われる種々の動物及び/又は被験者由来のサンプルに適用されうる。前記診断装置は、ディッシュ、プレート、又はプレートのウェルであってもよい。ポジティブ及びネガティブコントロールの両方は、試験サンプルのそれぞれと一緒に実行されうる。同量のコントロール血清が、試験装置上の他のウェル内に据えられる。
プレートのインキュベーション後、寒天ゲル層は剥がされ、そしてプレートは洗浄され、これは、例えば洗浄緩衝液、例えば、限定しないが、Tween 20/リン酸緩衝生理食塩水を用いて行われる。プレートは、洗浄緩衝液よりもむしろ、蒸留水又は水道水を用いて洗浄されうる。洗浄により、未結合(非特異的)抗体並びに他の夾雑物が除去される。
VIDEA及びHIDEAフォーマットの両方に、抗原−抗体反応の使用による複合体の形成が含まれ、これは検出物質、例えば二次抗体を用いて当該複合体と結合させることにより、例えば当該複合体の抗体部分と結合させることにより検出されうる。前記検出物質は、約30分〜約2時間室温で複合体と接触状態で保持されうる。当該プレートは、例えば、非限定的な例として、緩衝洗浄溶液を用いて洗浄することで、未結合コンジュゲートが除去される。洗浄液は、シリンジ又はピペットを用いて試験プレートの縁からゆっくりと添加し、そして廃棄することもできる。これは任意に最大3回以上繰り返される。
検出物質をインキュベートしている間、寒天又はアガロースコーティングが調製される。非限定的な例として、寒天の1%溶液、好ましくは1%寒天/リン酸緩衝生理食塩水が融解され、そしてコンジュゲートの酵素のための基質が取り込まれる。態様によっては、触媒が必要に応じて取り込まれる。非限定的な例として、酵素がペルオキシダーゼである場合、1%寒天溶液は、約0.05〜0.10%の5−アミノサリチル酸を基質として、そして約0.002〜約0.01%の過酸化水素を触媒として含んでもよい。役0.08%の基質及び約0.005%の触媒の使用も使用されうる。寒天は、洗浄した表面に注ぎ入れられ、そして固化させられる。
二次抗体の酵素との呈色反応は、寒天支持層内で生じる。当該反応は、酵素−基質反応による可視化に役立つ。濃い紫色の円形の領域の直径は、HIDEAについて測定され、そしてその存在又は不在あるいは色濃度がVIDEAの場合記録され、抗体量が決定された。
HIDEAの場合、円形の領域又は環の形態で発色する。当該環は、基質反応を約5〜約30分以内に測定するのに十分なほど濃い。より長期間存続している場合、当該環はより濃くなるが、拡大しない。生成される環の直径は、血中に存在する特定の抗体の量(すなわち、ウイルス中和価)に関連する。濃い色をした円形の領域の直径が測定され、そしてこれを使用して標準ウイルス中和試験抗体価と関連付けられる。決定した値は、試験プレートのサンプルウェルのサイズ及び使用するサンプルのサイズに関連している。代表的な環の値及び/又は描写の表は、本発明の各装置と一緒に、又は本発明の各キットと一緒に含めてもよい。
VIDEA及びHIDEAフォーマットの両方の表面にある抗体の存在の検出は、当該表面上のPRRSVタンパク質/抗原と結合した抗体を検出することを意図されている。当該検出は、本明細書に記載の任意の手段、例えば、標識二次抗体の使用によって実施されうる。他の非限定的な手段には、酵素−基質反応を介した抗原−抗体反応の可視化が含まれるが、当該反応由来の呈色反応の存在又は濃さを使用して、抗PRRSV抗体の量((定量的又は半定量的)あるいは存在(定性的)が示される。
PRRSVタンパク質/抗原並びに当該タンパク質/抗原を含んで成る組成物、方法、及び装置は、周知の手順に従い製造されるキットの調製に適している。本発明は、そのため、本明細書に記載のPRRSVタンパク質/抗原を含んで成るキット、あるいはそれらを含んで成る組成物又は装置であって、本明細書で開示した1又は複数の方法において使用するためのもの、を提供する。かかるキットは、任意に、本発明の方法においてそれらの使用に関する識別的記載又は標識又は指示を更に含んで成る。かかるキットは容器を含んで成ることもあり、これらはそれぞれ、前記方法で利用される1又は複数の種々の試薬(典型的には濃縮形態のもの)又は装置を一緒に含まれていてもよい。
本発明の装置を含んで成るキットは、本発明の方法における装置に使用するために1又は複数の追加の試薬又は機器の一部を更に含んで成ることもある。封入体のための追加の材料の非限定的な例は、サンプルの希釈溶液、希釈剤のバイアル、及びサンプルの輸送のための点滴器、である。他の非限定的な例には、VIDEAフォーマットに使用するための多孔性材料及び二次抗体がある。
ここに本発明を広く説明してきたが、以下の実施例の参照を通じてより容易に理解されるであろう。当該実施例は、本発明は例示目的で示すものであり、特に断りのない限り、本発明を限定するものとして意図されていない。
実施例1:PRRSVタンパク質及びディッシュの調製
PRRSVタンパク質は、PRRSV株を使用してin vitro又はin vivoで感受性細胞に接種し、そして感染細胞を、細胞結合ウイルス成分を調製するのに最適な時間で収集することで調製されうる。in vitroでの方法の場合、抗原は、細胞培養系により、あるいは組換え技術の使用により調製されうる。あるいは、PRRSV感染ブタ肺胞マクロファージ(PAM)細胞は、PRRSVによる口鼻からの接種に従い、そして肺(肺胞)を洗浄することでブタから得ることができる。
PRRSVタンパク質は、PRRSV株を使用してin vitro又はin vivoで感受性細胞に接種し、そして感染細胞を、細胞結合ウイルス成分を調製するのに最適な時間で収集することで調製されうる。in vitroでの方法の場合、抗原は、細胞培養系により、あるいは組換え技術の使用により調製されうる。あるいは、PRRSV感染ブタ肺胞マクロファージ(PAM)細胞は、PRRSVによる口鼻からの接種に従い、そして肺(肺胞)を洗浄することでブタから得ることができる。
細胞は、遠心によってペレット化され、そして上清は除去又は廃棄した。ペレットは任意に洗浄してもよい。細胞ペレットは、0.05Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、0.025M のEDTA緩衝液であって、0.5%のTriton X−100を含むもの、において、ひとまとまりの細胞の5〜10倍の容積で懸濁した。混合物は4℃で2〜15時間攪拌し、そして10,000gで1時間遠心した。上清はPRRSV抗原として使用した。当該抗原は非感染性であるため、ウイルスの拡散の危険性なしに広範に使用することが可能である。
PRRSVタンパク質/抗原の約pH9.6の0.06M炭酸緩衝液中での希釈は、比較試験により予め決定した。抗原は、ポリスチレン製のペトリ皿(直径60mm)上に、4℃で72時間吸着させることでコーティングした。吸着されなかった抗原は廃棄し、そしてディッシュはブロッキング剤(例えば、1%ウシ血清アルブミン、BSA)/リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.2)とともに1時間37℃でインキュベートした。BSAの除去後、HIDEAの場合は6ml、VIDEAの場合は4mlの0.6%アガロース/PBSをペトリ皿に重層した。寒天は、4℃で一晩固化された。HIDEAの場合、鋳型を用いて、7個の3mmの円形のウェルが各試験の寒天上に打ち抜かれた。VIDEAの場合、ウェルのないディッシュが使用された。試験ディッシュの全てを4℃の加湿器内に最大4ヶ月保存した。
実施例2:VIDEA
試験プレートは、ペトリ皿の底にウイルス抗原をコーティングし、続いて、上述のとおり通常の方法で寒天ゲルを重層することで調製した。使用においては、ろ紙ディスクをブタ由来の試験血清に浸し、そして試験プレートの寒天上に据えた。当該ディスクの平面性は、試験血清のようなサンプルの中身が概して一方向に寒天を通過してコート表面に移動するように、ほぼ二次元の出発領域を示す。
試験プレートは、ペトリ皿の底にウイルス抗原をコーティングし、続いて、上述のとおり通常の方法で寒天ゲルを重層することで調製した。使用においては、ろ紙ディスクをブタ由来の試験血清に浸し、そして試験プレートの寒天上に据えた。当該ディスクの平面性は、試験血清のようなサンプルの中身が概して一方向に寒天を通過してコート表面に移動するように、ほぼ二次元の出発領域を示す。
ゲルは、インキュベーション期間後に剥がされ、そしてディッシュは3回5〜8mlの洗浄溶液(0.05%Tween−20を含むPBS)で洗浄された。PBSで希釈した3mlの市販のペルオキシダーゼコンジュゲート型のウサギ抗ブタIgG(1〜2μg/ml)を45分間25℃で適用した。ディッシュを再び3回洗浄溶液で洗浄した後、5mlの1%寒天/基質及(5−アミノサリチル酸)及びH2O2をそれぞれ0.08%及び0.005%の濃度で含有するPBSをディッシュ上に重層した。その存在又は不在あるいは色濃度は、VIDEAの場合記録された。
1つの実験において、インキュベーションは、寒天が剥がされてから約2〜3時間25又は37℃で実施された。ペルオキシダーゼ反応の結果は、呈色反応を示す陽性サンプルに基づき、約5〜10分後に決定された。既知のELISA S/P比又はPRRSウイルス感染の病歴を有する種々の血清サンプルは、未処理の動物由来のサンプルと一緒に試験した。VIDEAの感度及び特異性は、ELISAに関して評価した。以下の表1は、種々のブタ血清についてのVIDEAの結果及び想到のELISA S/P比を要約する。アッセイ結果間の一致率を括弧内に示す。VIDEAは、ブタ血清について100%の特異性を示し、ELISAにおいて陰性であることが明らかとなった。25℃で約3時間のインキュベーションは、ELISAと比較した場合、全てのサンプルについて100%の一致率を示した。
抗原−抗体反応は、わずかに2時間程度で生じたが、抗体価が低い場合には、短いインキュベーション期間では偽陰性として観察されることがあり、より長期間かけることが有益なようである。VIDEAとELISA S/P比の高い相関関係は、抗PRRSウイルス抗体を検出するためのアッセイとしてVIDEAの能力を示すものである。標準的なカットオフ値である0.4未満のELISA S/P比との相関関係は、VIDEAがELISAと同等の感度を有しうることを示唆している。
実施例3:HIDEA
コート表面及び透水性バリアを有する本発明の装置を使用する。ここで、当該バリアの材料は、それが1又は複数のくぼみを当該バリアの表面において規定するように修飾される。アガロースを非限定的な例として用い、1又は複数のウェルをアガロース内に作ってもよい。
コート表面及び透水性バリアを有する本発明の装置を使用する。ここで、当該バリアの材料は、それが1又は複数のくぼみを当該バリアの表面において規定するように修飾される。アガロースを非限定的な例として用い、1又は複数のウェルをアガロース内に作ってもよい。
各ウェルは、0.015mlの試験血清で充填した。装置は約12〜約24時間室温(25℃)でインキュベートすることで抗体を拡散させ、そして抗原−抗体反応を起こさせた。前記装置の更なる使用は、24時間のインキュベーション時間実施された。
ゲルは、インキュベーション期間後に剥がされ、そしてディッシュは3回5〜8mlの洗浄溶液(0.05%Tween−20を含むPBS)で洗浄された。PBSで希釈した3mlの市販のペルオキシダーゼコンジュゲート型のウサギ抗ブタIgG(1〜2μg/ml)を45分間25℃で適用した。ディッシュを再び3回洗浄溶液で洗浄した後、5mlの1%寒天/基質及(5−アミノサリチル酸)及びH2O2をそれぞれ0.08%及び0.005%の濃度で含有するPBSをディッシュ上に重層した。濃い紫色の円形の領域の直径は、HIDEAの場合、反応の5〜30分後に測定された(mm)。表2及び3は、異なる条件下で試験した14の血清の異なる直径を示す。7mm未満の直径は、HIDEAにおいて陰性であるとみなされる。ELISA陰性血清の幾つかは陽性な結果を示し、これはHIDEAについてより良い感度を示唆している。表3の結果は、HIDEAの高い再現性を示唆している。
表2.室温(25℃)での種々のインキュベーション時間を用いた場合の、異なるELISA S/P比を有するブタ血清
* HIDEAの直径(mm);7mm超は陽性
** 0.4超のELISA S/P比は陽性である。
** 0.4超のELISA S/P比は陽性である。
表3.室温(25℃)での種々のインキュベーション時間を用いた場合の、異なるELISA S/P比を有する7つのブタ血清についてのHIDEA直径の再現性
a&b.各血清サンプルは、再現性のために2回HIDEAによって試験される。
* HIDEAの直径(mm);7mm超は陽性
** 0.4超のELISA S/P比は陽性である。
* HIDEAの直径(mm);7mm超は陽性
** 0.4超のELISA S/P比は陽性である。
本明細書で引用する全ての引用文献は、既に具体的に援用されているか否かに関係なく、それらの全てが本明細書に援用される。本明細書で使用する場合、単数形で表されている用語は、それぞれ単数形及び複数形を含むことが意図される。
本発明はここに十分に説明されたが、当業者にとって、本発明が、パラメーター、濃度、及び条件について広範な均等の範囲内で、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験無しに実施することができることは自明であろう。本発明はその具体的な態様に関連して説明されているが、更に修飾することができることも理解されよう。本願は、通常、本発明の原理に従い、且つ本発明が属する分野の技術において既知の又は慣習的な方法となっているような、そしてこれまでに説明された本質的な特徴に適用されうるような、本発明の開示から逸脱するようなものを含むあらゆる本発明の変更、使用、又は適応を網羅することが意図される。
Claims (21)
- PRRSウイルス感染細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、
a)PRRSウイルス感染細胞集団を準備し;
b)当該感染細胞を、無細胞PRRSウイルスから単離して、細胞結合PRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む細胞を形成させ;そして
c)界面活性剤含有溶液を用いて、工程b)で単離した細胞からPRRSウイルスタンパク質及び抗原を抽出又は溶出すること、を含んで成る方法。 - 前記細胞集団が、101.5組織培養感染量(TCID)50/ml上清を生成するのに十分な時間PRRSウイルスに感染している、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞集団が、初期段階のCPEを観察するのに十分な時間PRRSウイルスに感染している、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤含有溶液が0.5%Triton X−100を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記抽出又は溶出が4℃で約2時間〜約15時間である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質及び抗原が、PRRSウイルスエンベロープタンパク質又はNタンパク質を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法によって調製されるPRRSウイルスタンパク質及び抗原。
- 1又は複数の請求項7に記載のPRRSウイルスタンパク質及び抗原でコートされている少なくとも1つの表面を含んで成る診断装置。
- 界面活性剤含有溶液を用いてPRRSウイルス感染細胞から抽出又は溶出された1又は複数のPRRSウイルスタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも1つの表面を含んで成る診断装置。
- 前記1又は複数のPRRSVタンパク質及び抗原が、PRRSウイルスコードヌクレオキャプシドタンパク質及び/又はエンベロープタンパク質を含んで成る、請求項8又は9に記載の装置。
- 前記1又は複数のPRRSVタンパク質及び抗原がPRRSウイルスコード糖タンパク質を含んで成る、請求項8又は9に記載の装置。
- 前記溶液が0.5%Triton X−100を含む、請求項9に記載の装置。
- 垂直免疫拡散酵素アッセイ(VIDEA)法であって、
a)1又は複数の請求項7に記載のPRRSVタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、寒天又はアガロースの層で重層されている当該少なくとも1つの表面、を含んで成る診断装置を準備し;
b)前記寒天又はアガロースの表面と、被験者由来の抗体含有サンプルを含んで成る多孔性材料とを接触させ;
c)材料が前記サンプルから前記1又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間であって、前記多孔性材料の除去の後任意に生じる期間前記装置をインキュベートし;そして
d)前記寒天又はアガロースの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、
を含んで成る方法。 - 前記サンプルが血清サンプル又は全血サンプルである、請求項13に記載の方法。
- 前記多孔性材料がろ紙ディスクである、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記被験者が、PRRSウイルスに感染していることが疑われている、請求項13、14又は15に記載の方法。
- 水平免疫拡散酵素アッセイ(HIDEA)法であって、
a)1又は複数の請求項7に記載のPRRSVタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、、寒天又はアガロースの層で重層されており、表面上に1又は複数のくぼみ(indentation)を含んで成る、当該少なくとも1つの表面、を含んで成る診断装置を準備し;
b)1又は複数のくぼみと、被験者由来の抗体含有サンプルとを接触させ;
c)材料が前記サンプルから前記1又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間前記装置をインキュベートし;そして
d)前記寒天又はアガロースの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、
を含んで成る方法。 - 前記装置がディッシュである、請求項13又は17に記載の方法。
- 表面をウイルスタンパク質及び/又は抗原でコーティングする方法であって、
a)1又は複数の請求項7に記載のPRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備し;そして
b)前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、を含んで成る方法。 - 表面をウイルスタンパク質及び/又は抗原でコーティングする方法であって、
a)PRRSウイルス感染細胞から1又は複数のPRRSウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備すること、ここで、前記タンパク質及び抗原は界面活性剤溶液の使用によって前記細胞から抽出又は溶出されている;そして
b)前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、
を含んで成る方法。 - 前記ディッシュがポリスチレン製である、請求項19又は20に記載の方法。
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