KR101541275B1 - Ｐｒｒｓ 바이러스 및 이의 단백질의 제조 방법 및 이들의검출을 위한 진단 검사 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)로부터의 하나 이상의 단백질 및/또는 항원을 인식하는 항체의 검출을 위한 키트, 장치 및 방법을 제공한다. 항체는 PRRSV에 감염되었거나 감염 위험에 있는 피험체의 생물학적 유체 중에 존재할 수 있다. 본 발명은 PRRSV 감염의 진단 및 예방에 유리하게 적용될 수 있다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, PRRSV 뉴클레오캡시드, PRRSV 외피 단백질, 수직적 면역확산 효소 검정, 수평적 면역확산 효소 검정

Description

ＰＲＲＳ 바이러스 및 이의 단백질의 제조 방법 및 이들의 검출을 위한 진단 검사 키트{Method for the preparation of PRRS virus and proteins of and diagnostic test kits for detecting them}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 전문이 제시된 것과 같이 본원에서 인용된, 2005년 7월 5일자 미국 정식 특허 출원 제11/175,605호로부터 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)로부터의 하나 이상의 단백질 및/또는 항원을 인식하는 항체의 검출을 위한 키트, 장치 및 방법에 관한 것이다. 항체는 PRRSV에 감염되었거나 감염 위험에 있는 피험체의 생물학적 유체 중에 존재할 수 있다. 본 발명은 PRRSV 감염의 진단 및 예방에 유리하게 적용될 수 있다.
미국 양돈 산업에서 경제적 손실의 주요 원인은 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 또는 PRRSV이다. PRRSV는 돼지에서 생식 장애 및 호흡 장애의 원인체이다. PRRS와 관련된 경제적 손실은 주로 임신한 암컷의 유산 및 육성돈의 호흡기 복합 질병(PRDC)에서 PRRS의 관련으로 인한 것이다. 백신의 사용 및 관리 변경을 포함하는 상이한 제어 대책이 실시되었다[참조: 미국 특허 제5,690,940호]. 일상적인 백신접종에도 불구하고, PRRSV 대유행은 양돈장에서 흔한 일이다.
상기 대유행은 가장 일반적으로 생물학적 안전 대책의 실패로 인한 것이다. PRRSV에 감염된 교체 미경산돈(replacement gilt)이 무리 중에서 낮게 검출되는 것은 생물학적 안전 실패의 일반적인 원인이었다. 이러한 문제는, 간단하고 저렴한 PRRSV 감염 검사 방법을 양돈장에서 사용할 수 있다면 예방될 수 있을 것이다. 이러한 방법은 또한 암퇘지가 음성 이유돈을 생산하고 순치(acclimatization) 과정 중에 있는지 검사하는데 적용될 수 있다.
PRRSV 항체를 검사하기 위하여, 수의사는 혈액 샘플을 채취하여 수의 진단 실험실로 발송해야 한다. 현재는, ELISA, 간접 형광 항체 검사 및 면역과산화효소 단층 검정이 항-PRRSV 항체를 검출하는 통상적인 실험 방법이다. 하지만, 이러한 방법은 고가의 장비 및 훈련된 실험 기술을 요구한다. 이러한 기술을 사용하여, 결과를 얻기 위해서는 우송 시간을 포함하여 3일 이상이 필요하다. 또한, 양돈업자는 샘플을 채취하여 진단 실험실로 운송하는데 드는 비용을 부담해야 한다. 현장에 기반을 둔 간단하고 신속한 PRRSV 항체 검출 검사는 수의 병원 실험실 또는 공동 양돈장에서 매우 유용할 것이다. PRRSV 백신을 사용한 질병 근절은 일반적으로 양돈장 수준에서 성공적이지 않았다. 완전히 양돈장을 비우고(depopulation) 다시 채우는 것(repopulation)과 같은 방법은 양돈장내 근절에 효과적인 것으로 밝 혀졌다. 하지만, 이러한 방법을 모든 양돈장에서 사용할 수는 없으며, 수행하기에는 상대적으로 비용이 많이 든다.
또한, 이러한 방법은 PRRSV의 검출에 의존적이다. 일부 PRRSV 주(strain)의 핵산 서열 및 암호화된 단백질이 기술되었다. 폐 조직을 포함하는 조직 샘플을 통한 PRRSV의 검출이 또한 논의되었고[참조: 국제공개공보 제WO 96/06619호], 이는 PRRSV가 우선적으로 폐포 폐 대식세포에서 복제한다는 관찰결과와 일관된다. 구비강(oronasal) 경로로 감염된 후, 폐 대식세포에서 복제된 PRRSV는 폐 림프절로 이동되고 나서 혈류를 통해 다른 기관으로 이동된다.
본원에서 문헌을 인용하는 것이 모든 문헌이 적절한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다. 일자에 관한 모든 진술 또는 문헌의 내용에 관한 설명은, 출원인이 입수가능한 정보에 근거한 것이며, 문헌의 일자 또는 내용의 정확성에 관하여 인정하는 것으로 여겨져서는 안된다.
발명의 요약
본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 PRRSV에 의한 피험체 감염의 검출을 위한 키트, 장치 및 방법에 관한 것이다. 검출은, 하나 이상의 PRRSV 암호화된 단백질 및/또는 상기 단백질에 대한 항체에 결합하는 항원을 함유하는 조성물의 사용에 의해 매개된다. 따라서 본 발명은 "항체 포획" 후 항체를 검출하는 원리를 따르는 것으로 생각할 수 있다. 항체는 PRRSV로 감염된 피험체에는 존재하지만 비감염 개체에는 존재하지 않는 것이다.
하나 이상의 PRRSV 암호화된 단백질에는 뉴클레오캡시드(N; Nucleocapsid) 단백질 및/또는 하나 이상의 바이러스 외피("E"; Envelope) 단백질이 포함될 수 있다. 단백질은 또한 PRRSV에 감염된 세포의 표면에서 발견되는 당단백질일 수 있다. 단백질은 또한 피험체에서 항체를 검출하는데 사용되는 PRRSV 항원으로 생각될 수 있고, 이때 항체는 PRRSV 단백질을 인식하므로 PRRSV가 인식된다.
PRRSV 단백질(들) 및/또는 항원은 본 발명의 키트, 장치 및 방법에서 유리하게 사용되어, 항-PRRSV 항체 검출을 기반으로, PRRSV 감염을 초기에 검출할 수 있다. 이러한 검출 방법은, 감염된 피험체에서 감염 후 초기에, 본원에서 기술되는 하나 이상의 PRRSV 단백질 및/또는 항원에 대한 항체의 존재에 의존한다.
첫번째 양상에서, 본 발명은 본원에서 기술되는 키트 또는 장치의 제조 또는 사용에 있어서, 하나 이상의 PRRSV 발현된 단백질 및/또는 항원을 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 장치는 본 발명의 조성물로 코팅된 디쉬이다. 이러한 디쉬의 비제한적 예에는 다양한 크기의 페트리 디쉬 뿐만 아니라 미세역가 플레이트의 웰이 포함된다. 디쉬는 조성물 중에 함유된 하나 이상의 PRRSV 단백질 및/또는 항원에 대한 항체의 진단 검사용일 수 있다. 따라서, 이러한 장치를 사용하여 조성물 중의 하나 이상의 PRRSV 단백질 및/또는 항원에 대한 항체의 존재를 검출할 수 있다. 검출될 항체는 생물학적 유체의 샘플 중에 존재할 수 있고, 항체가 존재하는 경우, 이는 샘플을 채취한 피험체에서 PRRSV 감염의 지표로서 역할을 한다. 따라서 상기 장치는 PRRSV 감염의 존재를 진단하는 신속한 수단으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 장치의 중심에는, 조성물 중에 존재하는 고정된 형태의 하나 이상의 PRRSV 단백질 및/또는 항원이 존재한다. PRRSV 단백질 및/또는 항원은, 비제한적 예로서, 흡착(예: 코팅)에 의해 또는 장치 표면에의 접합에 의해서와 같이, 직접적으로 고정될 수 있다. 대안으로, 단백질 및/또는 항원은, 단백질 및/또는 항원에 결합하는 제제의 사용에 의해 또는 표면 및 단백질이나 항원에 둘다 결합하는 링커(linker)의 사용에 의해서와 같이, 간접적으로 고정될 수 있다. 따라서 고정된 PRRSV 단백질(들) 및/또는 항원(들)은, 단백질(들) 및/또는 항원(들)에 대한 항체와 결합하여 단백질(들) 및/또는 항원(들)을 함유하는 고정된 복합체를 형성하기 위한 "포획제"로서 볼 수 있다. 물론, 고정된 "포획제"는 제제에 결합하는 항체를 "포획"하는 제제로서 볼 수도 있다.
이어서, 복합체는 본원에서 기술되는, 복합체에 결합하는 표지된 시약과 같은 "검출제"를 사용하여 검출할 수 있다. 복합체에 결합하면, "검출제"는 샘플 중의 항-PRRSV 항체의 존재를 나타낸다. 일부 양태에서, "검출제"는 복합체의 일부분으로서 고정된 항체가 샘플 중에 존재하는 경우, 이와 결합하는 표지된 2차 항체이다. 항-PRRSV 항체의 존재는 샘플을 채취한 피험체에서 PRRSV 감염의 지표로서 사용될 수 있다. 항-PRRSV 항체의 부재는 감염의 부재를 나타낼 것이다. 샘플은 바람직하게는 PRRSV로 감염된 것으로 의심되는 돼지 피험체 또는 다른 피험체로부터 채취하지만, PRRSV에 의해 감염될 수 있는 임의의 피험체 또는 PRRSV 보균체가 본 발명의 장치에서 사용될 수 있다.
"검출제"는, 충분한 응집시 육안으로 볼 수 있는 미립자 표지에 접합되는 경 우와 같이, 직접적으로 검출되도록 표지될 수 있다. 대안으로, 검출제는, 검출가능한 기질에 대한 활성 또는 검출가능한 산물을 생성하는 활성에 의해 검출되는 효소에 접합되는 경우와 같이, 간접적 검출을 위하여 표지될 수 있다. 물론 "검출제"는, 본 발명의 복합체에 결합하는, 표지된 또는 비표지된 "1차" 결합제에 결합하는 "2차 결합제"일 수 있다.
본 발명의 장치는 또한, 장치에 적용되는 샘플 중에 PRRSV 항체가 존재하는지의 여부에 관계없이, 장치의 적절한 기능성을 확인하는 제어 부위 또는 제어 영역을 본 발명의 장치 내에 함유할 수 있다. 이러한 제어는 샘플 중에 존재하는 또다른 분자 또는 거대분자 구조체의 검출에 기반할 수 있다.
사용되는 장치의 형식에 구속되지 않으면서, 본 발명의 PRRSV 단백질(들) 및/또는 항원(들) 및 이를 포함하는 조성물은 또한, PRRSV 단백질(들) 및/또는 항원(들)에 대한 항체를 검출하는 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 방법을 설계하여, PRRSV로 감염된 것으로 의심되는 개체와 같은 피험체로부터의 생물학적 유체 중에서 이러한 항체를 검출할 수 있다. 상기 방법은, 샘플 또는 이의 희석된 형태를 PRRSV 암호화된 단백질(들) 및/또는 항원(들)과 접촉시키고, 단백질(들) 및/또는 항원(들)에 결합하는 항체가 샘플 중에 존재하는지를 측정함을 포함한다. 항체는 PRRSV 단백질 및/또는 항원에 결합하여 복합체를 형성하며, 이를 검출하여 항체의 존재를 나타낼 수 있고, 따라서 샘플을 채취한 피험체에서 PRRSV 감염의 존재를 나타낼 수 있다. 샘플은 바람직하게는 돼지 피험체로부터 채취하지만, PRRSV에 의해 감염될 수 있는 임의의 피험체 또는 PRRSV 보균체는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 생물학적 유체의 범위에는, PRRSV 단백질 및/또는 항원에 대한 항체가 검출가능하게 존재할 수 있는 임의의 유체가 포함된다. 비제한적 예에는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 눈물, 점액, 콧물 및 질 분비물과 같은 피험체의 신체 분비물이 포함된다. 이러한 유체의 희석액도 물론 본 발명의 실시에서 샘플로서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, EDTA 또는 다른 2가 양이온 킬레이터를 함유하는 희석제는 피험체로부터의 생물학적 유체 샘플과 1:1 비로 사용된다. 혈청 또는 혈장 샘플을 사용하는 양태에서, 희석을 생략할 수 있다.
샘플은 바람직하게는 감염을 나타내는 증상의 존재로 인해 PRRSV로 감염된 것으로 의심되는 개체로부터 채취한다. 대안으로, 본 발명의 방법은, 감염된 개체의 신속한 확인 및 분리를 위한 양돈장에서의 선별과 같은, 일상적인 동물 선별의 일부분으로서 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한, 동물을 한 장소에서 다른 장소로 수송 또는 이송하기 전에 감염을 확인하고 감염의 확산을 예방하는 것과 같은, 구체적인 사례에서 사용될 수 있다. 본 발명의 많은 양태에서, 피험체는 돼지이므로, 샘플은 돼지로부터의 체액 또는 분비물일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위하여 샘플을 채취할 수 있는 돼지의 비제한적 예에는 수퇘지, 미경산돈, 암퇘지, 비육돈, 자돈 및 젖먹이 돼지가 포함된다. 돼지는 출생에서 사망까지의 모든 나이 범위에 있을 수 있다. 비제한적 예에는 약 30 내지 약 40, 41 내지 약 50, 또는 51 내지 약 60일령 이상의 돼지가 포함되고 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 수직적 면역확산 효소 검정(VIDEA) 기반 방법이 다. 상기 방법은, 항-PRRSV 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터 투과성 장벽에 의해 분리된 고정된 PRRSV 단백질 및/또는 항원을 사용한다. 샘플은 다공성 물질을 통해 장벽에 제공되고, 샘플 중의 항-PRRSV 항체는 투과성 장벽을 통해 확산되어 PRRSV 단백질 및/또는 항원과 접촉하게 된다. 항체와 단백질/항원 간의 접촉으로 복합체가 형성된 후, 이를 검출하여 샘플 중의 항체의 존재를 나타낸다. 검출은 복합체가 존재하는 영역의 형태일 수 있다. 일부 양태에서, 투과성 장벽은 한천 또는 아가로스이다.
다른 양태에서, 상기 방법은 수평적 면역확산 효소 검정(HIDEA) 기반 방법이다. 상기 방법은, 둘다 고정된 PRRSV 단백질 및/또는 항원을 사용한다는 점에서, 상기한 VIDEA의 형식과 유사하다. HIDEA 방법은, 항-PRRSV 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플로부터, 투과성 장벽에 의한, 고정된 단백질/항원의 분리를 포함한다. 샘플은 직접 장벽에 제공되고, 항-PRRSV 항체가 투과성 장벽을 통해 확산되어 PRRSV 단백질 및/또는 항원과 접촉하게 된다. 확산은 장벽에 접촉된 샘플 지점으로부터 바깥쪽으로 방사될 수도 있다. 항체와 단백질/항원 간의 접촉으로 복합체가 형성되고, 이를 검출하여 샘플 중의 항체의 존재를 나타낼 수 있다. 검출은 복합체가 존재하는 원 또는 고리의 형태일 수 있다. 일부 양태에서, 투과성 장벽은 한천 또는 아가로스이다.
본 발명의 다양한 양상은, 항원적으로 북아메리카 주(strain)와 관련된 모든 PRRSV 주에 관해 사용하기 위하여 고려된다. 그러므로, 본 발명은 보다 일반적으로 임의의 PRRSV 바이러스의 단백질(들)에 기반하는 것으로서 볼 수 있다.
또한, 이러한 장치의 제조에 관한 방법이 제공된다. 따라서 본 발명의 추가적인 양상은 본원에서 기술된 키트, 장치 및 방법의 구성요소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에는 PRRSV로 감염된 세포로부터 PRRSV 단백질을 제조하는 방법이 포함된다. 일부 양태에서, 대부분 또는 전체 단백질이 감염된 세포와 관련되어 남아있는 경우 감염 후 초기에 단백질을 회수한다. 달리 언급하면, 대부분 또는 전체 PRRSV 암호화된 단백질이 감염된 세포 내에 있거나 감염된 세포의 세포막과 결합되어 있다. 이러한 조건 하에서, 존재하는 경우, 상대적으로 적은 PRRSV 입자가 세포 바깥쪽의 세포외 환경에 존재한다.
또다른 양상은, PRRSV의 N 단백질 및/또는 하나 이상의 외피 단백질과 같은 비제한적인 첫번째 결합제를, 본원에서 기술되는 장치의 하나 이상의 표면 상에 고정화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 장치를 포함하는 키트 또는 본원에서 기술된 방법의 실시를 위한 키트가 제공된다. 추가적인 양상에는 본 발명에서 제공된 하나 이상의 방법의 실시에서 사용하기 위한 조성물 및 물품이 포함된다. 이러한 조성물의 비제한적 예에는 본 발명의 키트 또는 장치의 제조에서 사용하기 위한 것이 포함된다. 키트의 비제한적 예에는, 본원에서 기술된 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 하나 이상의 조성물 또는 제제, 또는 본 발명의 하나 이상의 장치를 포함하는 것이 포함된다.
본 발명의 하나 이상의 양태의 상세한 설명은 아래의 첨부된 도면 및 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 도면 및 상세한 설명으로부 터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 두가지 면역확산 효소 검정(IDEA)의 도식적인 표현이다. 수직적(VIDEA) 및 수평적(HIDEA) 양태가 제시되어 있고, 1, 2 및 3번 위치가 어떻게 각각 양성, 음성 및 양성 결과를 보이는지를 나타낸다.
정의
본원에서 사용되는 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스 또는 PRRSV라는 용어는, 예전에는 "청이 증후군(blue-eared syndrome)", 돼지 전염성 유산 및 호흡기 증후군(PEARS), 와바쉬(Wabash) 증후군, 돼지 괴질(MPD; Mystery Pig Disease), 돼지 역병, 영국에서는 청색 유산 질병(blue abortion disease) 또는 청이병(blue ear disease), 네덜란드에서는 abortus blau, 독일에서는 seuchenhafter spatabort der schweine, 및 Heko-Heko병으로 알려졌었던, PRRS, 돼지 괴질(MSD; Mystery Swine Disease), 돼지 불임 호흡기 증후군(SIRS)을 일으키는 바이러스를 말한다.
PRRSV 단백질은 PRRSV 게놈에 의해 암호화되고/되거나 PRRSV 감염 또는 PRRSV 생활사의 결과로서만 생산되는 임의의 폴리펩티드 산물을 말한다. 따라서 PRRSV 특이적이고, 따라서 PRRSV에 감염된 세포에 의해 암호화되거나 발현되지 않는 폴리펩티드는 상기 용어의 범위 내에 있다. PRRSV에 감염된 세포에 의해 암호화되지만, PRRSV 감염 및/또는 생활사의 부재 하에서는 발현되지 않는 내인성(endogenous) 폴리펩티드는 의도되지 않는다. 하지만, PRRSV 감염 및/또는 생활사의 결과로서만 발현되는 내인성 폴리펩티드는 상기 용어의 범위 내에 있다. 상기 용어에는 또한, 비제한적 예로서 부분적 또는 실질적 단백질 변성으로 인한 것과 같은, 2차 및/또는 3차 구조의 변화로 인한 폴리펩티드의 대안적 형태가 포함된다. 따라서 폴리펩티드의 변성된 형태는 상기 용어의 범위 내에 있다.
PRRSV 항원은 항-PRRSV 항체에 의해 인식되는 PRRSV 폴리펩티드의 임의의 부분 또는 단편을 말한다. 일부 경우에, 부분 또는 단편은 당 잔기, 포스페이트 잔기 또는 지질 잔기와 같은 비제한적인, 부착된 잔기를 갖는 펩티드일 수 있다. 대안으로, 부분 또는 단편은 부착된 비-펩티드 잔기가 없는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 실시 방법에 관한 상세한 설명
본 발명은 항-PRRSV 항체를 검출하기 위한 키트, 장치 및 방법에 관한 것이다. 검출은, 하나 이상의 PRRSV 암호화된 단백질 및/또는 상기 단백질에 대한 항체에 결합하는 항원의 사용을 기반으로 한다. 항체는 PRRSV에 감염된 피험체에는 존재하지만 비감염 개체에는 부재하는 것이다. 본 발명은 포획된 항체를 검출하는 "항체 포획" 검정으로서 볼 수 있다. 본 발명은 항-PRRSV 항체의 검출을 위한 면역확산 기반 방법을 제공하는 것으로 생각될 수도 있다.
본 발명은 부분적으로, 뉴클레오캡시드(N), 막(M) 결합된 및 4개 이상의 외피(E) 단백질을 포함하는, PRRSV의 구조 단백질을 사용하여 PRRSV에 감염된 피험체에서 항체를 검출할 수 있다는 인식을 토대로 한다. 달리 언급하면, 본 발명은 부분적으로, 이러한 단백질 및/또는 이의 항원성 부분에 대한 항체가 PRRSV에 감염된 피험체에 존재하여, 항체의 검출이 피험체가 PRRSV로 감염되었다는 것을 나타내는 유리한 수단을 제공한다는 발견을 토대로 한다.
본 발명은 또한 부분적으로, 특정 조건 및 프로토콜을 사용하여, 다른 PRRSV 단백질 및/또는 항원에 비해 고농도의 E 단백질을 함유하는 PRRSV 단백질 및/또는 항원의 조성물을 수득할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 따라서 본 발명에는 PRRSV로 감염된 세포로부터 PRRSV 단백질 및/또는 항원을 제조하는 방법이 포함된다. 상기 단백질 및/또는 항원은, 단백질의 대부분 또는 전부가 감염된 세포와 결합되어 잔존하거나 또는 본 발명의 세포 결합된 바이러스 구성요소(CAVC)의 일부인 경우에, 감염 후 조기에 회수한다. 달리 언급하면, PRRSV 단백질 및/또는 항원의 대부분 또는 전부는 감염된 세포 내에 있거나 감염된 세포의 세포막과 결합되어 있다. 이러한 조건 하에서, 존재하더라도, 비교적 소수의 PRRSV 입자가 세포 바깥쪽의 세포외 환경에 존재한다. 본 발명은, 비교적 단기간 동안 감염된 세포가, 본 발명의 검출 방법에서 사용하기에 적당한 충분한 양의 PRRSV 암호화된 단백질을 생산할 수 있다는 예상외의 발견을 일부 토대로 한다. PRRSV 입자가 생산되고/되거나 세포외 환경으로 방출되기 전인 초기에 CAVC를 제조하는 것은 또한, 감염성 바이러스 입자가 오염원으로서 존재하지 않는다는 점에서 안전성을 증가시키는 이점이 있다.
감염시키는 세포는 PRRSV에 의해 생산적으로 감염될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 비제한적 예에는 시험관내 또는 생체내의 돼지 세포가 포함된다. 시험관내 세포의 한가지 비제한적 예로 PRRSV로 감염된 돼지 피험체로부터의 1차 세포가 있다. 생체내 세포의 비제한적 예로, 구비강(oronasal) 경로를 통해 PRRSV로 감염되고 나서, 그 후 PRRSV 단백질 및/또는 항원의 제조를 위하여 회수된, 돼지 폐포 대식세포(PAM)가 있다. 또다른 비제한적 예는 원숭이 세포주 MARC-145를 사용하는 것이다. 상기 방법으로 생산된 PRRSV 단백질 및/또는 항원에는 하나 이상의 PRRSV N, M 및 E 단백질이 포함된다. 이러한 단백질의 조합물은 또한 본 발명의 세포로부터 제조할 수 있다. 일부 양태에서, 제조된 단백질/항원은 N 및 M 단백질에 비해 높은 비의 E 단백질을 갖는다.
따라서 본 발명은, a) PRRS 바이러스로 감염된 세포의 집단을 제공하고; b) 감염된 세포를 세포-부존재 PRRS 바이러스로부터 분리하여 세포 결합된 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 함유하는 세포를 형성시키고; c) 상기 b) 단계에서 분리된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 추출하거나 용출시킴을 포함하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 세포-부존재 바이러스가 존재하지 않는 경우에는, 상기 b) 단계는 세포와 함께 사용된 배양 배지와 같이 상기 방법을 방해할 수 있는 다른 물질로부터 세포를 분리하는 단계로 단순하게 변형될 수 있다. 상기 b) 단계는, 원심분리로 세포 펠릿 및 상청액을 생성하여 이를 제거하거나 폐기하는 방법 또는 막 여과를 사용하여 상청액을 제거하고 세포를 유지시키는 방법과 같이, 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 c) 단계는 세포를 완충액 중에 재현탁시켜 임의로 수행된다. 일부 양태에서, 추출 또는 용출은 세제 함유 용액을 사용하므로, 세포를 재현탁시키는데 사용된 완충액은 세제를 함유할 수 있다.
다른 양태에서, 상기 방법은, 세포와 함께 사용한 배양 배지와 같은, 상청액 1ml 당 거의 없거나 내지는 검출불가능한 양의 감염성 단위를 생산하는데 충분한 시간 동안 PRRS 바이러스로 감염시킨 세포의 집단을 사용함을 포함한다. 비제한적 예에는 101.5 조직 배양 감염 용량(TCID)50/ml 미만이 포함된다. 상기 방법에서 사용된 세포의 집단은 세포변성효과(CPE)를 관찰하는데 충분한 시간 동안 PRRS 바이러스로 임의로 감염시킬 수 있다. 물론 CPE 또는 CPE의 초기 단계가 관찰될 만큼 충분히 오래 감염시키지 않은 세포 역시 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 PRRS 바이러스에 감염된 돼지 폐포 대식세포(PAM)로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 PRRS 바이러스를 구비강으로 접종시킨 돼지의 폐 세척으로 수득한 PAM 세포의 집단으로부터 상기 단백질 및 항원을 제조함을 포함할 수 있다. PRRS 바이러스 단백질 및 항원은 상기한 세포로부터 추출하거나 용출시킬 수 있다. 따라서 세포를 추출 완충액 중에 재현탁시킬 수 있다. 일부 양태에서, 추출 또는 용출은 세제 함유 용액을 사용하므로, 세포를 재현탁시키는데 사용된 완충액은 세제를 함유할 수 있다.
세제 함유 용액은 PRRSV 단백질 및/또는 항체를 추출하거나 용출시키는데 적당한 임의의 것일 수 있다. 한가지 비제한적 예는 폴리(에틸렌 글리콜) p-이소옥틸-페닐 에테르, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Nonidet P-40) 또는 Triton X-100과 같은 비이온성 세제를 사용한 것이다. 본 발명의 일부 양태에서, 세제는, 약 0.5% Triton X-100의 용액과 같은 용액 중에 약 0.5%의 농도로 존재한다
본 발명은 또한 PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시험관내 및 생체내 방법으로 제조한 세포의 집단으로부터 상기 단백질 및 항원을 제조함을 포함한다. 시험관내 방법의 경우, 돼지 폐포 대식세포(PAM) 또는 MARC-145 세포주를 배양하여, PRRSV로 감염시킨 후 세포를 회수한다. 세포 배양 시스템을 사용하지 않는 생체내 방법의 경우, PRRS 바이러스를 구비강으로 접종시킨 후 돼지의 폐 세척으로 PAM 세포를 수득한다. 항원 수율을 상이한 PRRSV 분리주를 사용하여 바이러스 접종 후 상이한 일수 후에 비교하였고, 가장 높은 항원 수율을 위한 최적의 조건을 비교 검사로 미리 결정하였다.
본 발명에는 물론, 본원에 공개된 임의의 방법으로 제조된 분리된 PRRSV 단백질 및/또는 항원을 함유하는 조성물이 포함된다. 당해 조성물은 PRRSV 단백질 및/또는 항원이 사용되는 모든 목적을 위하여 사용될 수 있다. 비제한적 예에는 단백질/항원에 대한 항체를 제조하기 위한 용도; PRRSV 단백질에 대한 참조 마커로서의 용도; 및 백신 제형의 경우에서와 같이, 임의로 적당한 애쥬번트와 함께 동물에게 투여하여 면역 반응을 일으키는 면역원성 조성물로서의 용도가 포함된다. 상기 조성물의 추가적인 비제한적 예에는 단백질(들)/항원(들)이 가용성 또는 동결건조된(냉동건조된) 형태인 것이 포함된다.
일부 양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 장치의 표면과 같은 표면을 코팅하는데 적당한 용액 중에 있다. 이러한 용액은 단백질이 페트리 디쉬의 바닥에 코팅되게 한다. 비제한적 예에는 pH 9.6인 0.06M 탄산염 완충 용액 중의 묽은 PRRSV 단백질/항원의 용액이 포함된다. 용액을 사용하여, 예를 들면, 각각 폴리스티렌 또는 유리 페트리 디쉬 또는 멀티-웰 플레이트의, 디쉬 또는 웰의 표면을 코팅할 수 있다. 비흡착 물질을 붓고 나서, 임의로 단백질/항원이 없는 완충된 용액 중에서 1회 이상 세척할 수 있다. 코팅은 25℃ 이하를 포함하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 수행할 수 있다. 일부 양태에서, 코팅은 (약) 4℃에서 약 72시간 동안 수행할 수 있다.
따라서 본 발명은 또한, a) 본원에서 기술된 바와 같이 제조된 하나 이상의 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 함유하는 용액을 제조하고; b) 상기 용액을 상기 단백질과 항원이 상기 디쉬의 표면에 흡착되게 하는 시간 동안 표면과 접촉시킴을 포함하여, 바이러스 단백질(들) 및/또는 항원(들)으로 표면을 코팅하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 단백질(들) 및/또는 항원(들)을 PRRSV에 감염된 세포로부터 본원에서 기술된 세제 함유 용액을 사용하여 추출하거나 용출시켰다. 추가적인 양태에서, 코팅될 표면은 폴리스티렌 또는 유리 또는 유사한 물질로 만들어진 것이다. 표면은 바람직하게는 에탄올로 세척하고 나서 건조시킨다.
PRRSV 단백질/항원의 용액을 깨끗한 표면에 가하고, 약 2 내지 약 4 시간 내지 하룻밤 동안 흡착되게 한다. 단백질/항원을 약 0.01 내지 0.001%의 최적 농도로 희석시킬 수 있고, 바람직하게는 중탄산나트륨-탄산나트륨 코팅 완충액 중에 희석시켜 단백질/항원이 표면에 부착되는 것을 촉진시킨다. 코팅 완충액은 바람직하게는 NaHCO3 1L 당 약 0.84 내지 8.4g 및 Na2CO3 1L 당 0.11 내지 10.6g을 함유하는 약 0.01M 내지 0.1M (pH 9 내지 10)이어야 한다. 코팅 기간 후, 과량의 용액을 붓거나 또는 제거한다. 코팅된 표면은 증류수 또는 단백질/항원이 없는 완충액으로 세척할 수 있다. PRRSV 단백질(들) 및/또는 항원(들)으로 코팅하고 나서, 임의로 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.2) 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 비제한적인, 차단제로 코팅할 수 있다. 코팅은 약 37℃를 포함하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 수행할 수 있다. 일부 양태에서, 코팅은 (약) 37℃에서 약 1시간 동안 수행할 수 있다. 차단제를 가한 후, 용액을 제거하고 나서, 임의로 1회 이상 물로 세척하거나 차단제가 없는 완충 용액을 포함시켜 세척할 수 있다.
코팅 후, 투과성 장벽을 코팅된 표면에 가한다. 장벽은, 건조 후 나중에 투과성 장벽을 형성하는 용액으로서 가할 수 있다. 비제한적 예에는, 건조된 형태인 경우 투과성 장벽이 겔 유사 물질로 구성되는 한천 및/또는 아가로스의 용액이 포함된다. 따라서 용융된 한천 또는 아가로스 층을 가하여 고체화되게 할 수 있다. 한천 층의 깊이는 임계적이지 않으며, 최소 약 1.5mm부터 바람직하게는 2mm이고 최대 약 10mm까지 달라질 수 있다. 층은 약 0.75 내지 1.5% 그리고 바람직하게는 약 1%의 용액으로부터 가해진다.
직경이 60mm인 폴리스티렌 페트리 디쉬를 사용한 비제한적 예로서, PBS 중의 4ml의 0.6% 아가로스를 본원에서 기술된 VIDEA 기반 방법의 경우에 사용한다. 6ml의 동일한 용액을 HIDEA 기반 방법의 경우에 사용한다. 용액은, 예를 들어 4℃에서 하룻밤 동안 고체화되게 한다. 이렇게 코팅된 장치는, 예를 들어 4℃에서 습기 챔버 내에서 최대 4개월 동안 보관할 수 있다.
본원에서 기술된 코팅된 표면이 있는 장치는 항-PRRSV 항체의 검출을 위한 진단 키트의 전체 또는 일부분으로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한, a) 피험체로부터 혈액 또는 혈청 샘플을 채취하고; b) 상기 샘플을 본원에서 기술된 코팅된 장치의 투과성 장벽과 접촉시키고; c) 상기 샘플을 항온처리하여 항체와 같은 분자가 투과성 장벽을 통해 확산되게 하고, 장치를 코팅하는데 사용된 단백질(들)/항원(들)과 결합하게 하고; d) 투과성 장벽을 제거하고 임의로 장치를 세척하여 비결합 항체를 제거하고; e) 항체가 단백질(들)/항원(들)에 결합하여 형성된 복합체를 검출함을 포함하여, PRRS 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 b) 단계의 장치에 관하여, 한가지 비제한적 예로는 장치가 (1) 편평한 지지 표면을 갖는 디쉬; (2) 상기 PRRSV 단백질(들)/항원(들)의 표면 상에 흡착된 코팅; 및 (3) 상기 코팅을 덮는 한천 층을 포함하는 디쉬 검정 플레이트인 경우가 있다.
상기 e) 단계에 관하여, 상기 방법은 형성된 복합체에 결합하는 검출제를 사용하여 실시할 수 있다. 한가지 비제한적 예로는 샘플 중에 존재할 수 있는 항체에 결합하는 2차 항체를 사용하는 것이다. 이러한 2차 항체의 비제한적 예에는 검사하는 샘플 중의 항체의 Fc 부분을 인식하는 특정 동물 (예: 마우스, 래트, 염소, 래빗 등)로부터의 것이 포함된다.
2차 항체를 표지(label)에 접합시켜 검출을 편리하게 할 수 있다. 접합은 또다른 잔기를 항체에 부착하여 항체를 변형시키는 것이다. 잔기는 바람직하게는 검출가능한 표지이고, 방사성 동위원소, 형광 표지 (비제한적 예로서 Cy3 및 Cy5) 또는 미립자 표지와 같이 직접적으로 검출가능한 표지가 포함된다. 미립자 표지의 비제한적 예에는 라텍스(latex) 입자, 금속 졸(metal sol) 및 콜로이드상 금 입자가 포함된다. 대안으로, 표지는 간접 검출용일 수 있다. 비제한적 예에는 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase)와 같은 비제한적인 효소가 포함된다. 다른 비제한적 예에는 비오틴, 친화성 펩티드 또는 정제 태그와 같은 비제한적인, 또다른 분자에 결합된 분자가 포함된다. 바람직하게는, 표지는 공유적으로 부착된다.
일부 양태에서, 2차 항체는 효소 접합된 항-돼지 면역글로불린이고, 이를 약 30 내지 약 60분 동안 복합체 중 항체와 결합하게 한다. 결합 후, 비결합 2차 항체는 1회 이상의 임의의 세척으로 제거할 수 있다. 효소는 퍼옥시다제를 포함하여, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)에서 사용되는 효소와 같은 임의의 적당한 효소일 수 있다. 퍼옥시다제는 아미노살리실산과 과산화수소, 또는 p-페닐렌 디아민과 과산화수소와 반응하는 경우 자주색을 낸다. 알칼리성 포스파타제는 디니트로페닐포스페이트와 반응하는 경우 황색을 낸다. 베타-갈락토시다제는 O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드와 반응하여 자주색을 낸다.
효소 연결된 2차 항체의 비제한적 예에 이어, 결합된 2차 항체의 검출에 의한 복합체의 검출은, 효소와 반응하여 검출가능한 시그날, 비제한적 예로서 색 형성을 내는 기질을 함유하는 한천 용액으로 덮는 방법으로 매개될 수 있다. 일부 양태에서, 검출가능한 시그날은, 예를 들어 육안에 의해서, 시각적으로 관찰가능하다. 시그날은, 양성 대조군 (코팅된 표면에 결합하는 공지된 항-PRRSV 항체를 함유함) 및/또는 이러한 항-PRRSV 항체를 함유하지 않는 음성 대조군을 사용하여 관찰된 색 반응과 비교될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 특히 본원에서 기술된 VIDEA에서, 샘플을 채취하여 필터 종이 또는 필터 종이 디스크와 같은 비제한적인 다공성 물질에 가한다 (또는 샘플을 다공성 물질로 채취한다). 비제한적 예로서 종이 디스크를 사용하는 경우, 디스크를 편평하게 투과성 장벽 상에 위치시켜 분자가 디스크로부터, 장벽을 통해, 코팅된 표면으로 확산되게 한다. 표면에서, 본 발명의 PRRSV 단백질/항체에 결합하는 샘플로부터의 분자(예: 항체)는 단백질/항체와 복합체를 형성한다. 따라서 샘플로부터의 분자는 코팅된 표면에 고정된다. 일부 양태에서, 확산 및 복합체 형성을 위한 시간은, 약 실온(25℃) 또는 약 37℃에서 약 2 내지 약 3시간이다.
복합체 형성 후, 투과성 장벽을 제거한다. 한천 또는 아가로스 장벽을 포함하는 일부 양태에서, 한천 또는 아가로스의 층을 벗겨내고 나서 임의로 세척할 수 있다.
본 발명의 방법은, 본원에서 기술된 샘플의 항-PRRSV 항체에 결합한 PRRSV 단백질/항원을 포함하는 복합체의 형성을 토대로 한다. 항-PRRSV 항체를 검출하여 복합체 검출의 용이함을 향상시킬 수 있다. PRRSV 단백질/항체와 샘플로부터의 항-PRRSV 항체와의 복합체의 검출은, 샘플을 채취한 피험체에서 PRRSV 감염의 존재를 나타낸다.
본 발명은, a) 본원에서 기술된 하나 이상의 PRRSV 단백질 및 항원으로 코팅되고, 본원에서 기술된 투과성 장벽으로 덮여있는 하나 이상의 표면을 포함하는 진단 장치를 제공하고; b) 장벽의 표면을 피험체로부터 유래된 샘플을 함유하는 항체를 포함하는 다공성 물질과 접촉시키고; c) 임의로 다공성 물질을 제거한 후, 상기 장치를 상기 샘플로부터 상기 하나 이상의 표면으로 물질이 확산되는데 충분한 기간 동안 항온처리하고; d) 투과성 장벽의 제거 후 디쉬의 표면에서 항체의 존재를 검출함을 포함하는, 수직적 면역확산 효소 검정(VIDEA) 방법을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 다공성 물질은 종이 디스크이다.
본 발명은, a) 본원에서 기술된 하나 이상의 PRRSV 단백질 및 항원으로 코팅되고, 본원에서 기술된 투과성 장벽으로 덮여있지만 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 함입부(indentation)를 포함하는 하나 이상의 표면을 포함하는 진단 장치를 제조하고; b) 하나 이상의 함입부를 피험체로부터 유래된 샘플을 함유하는 항체와 접촉시키고; c) 상기 장치를, 상기 샘플로부터 상기 하나 이상의 표면으로 물질이 확산되는데 충분한 기간 동안 항온처리하고; d) 투과성 장벽의 제거 후 디쉬의 표면에서 항체의 존재를 검출함을 포함하는, 수평적 면역확산 효소 검정(HIDEA) 방법을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 직경이 작은 하나 내지 다수의 구멍을 투과성 장벽에 뚫어서, 검사 샘플 웰의 역할을 하는 함입부를 만든다. 웰의 직경은, 예를 들면 약 1 내지 4mm일 수 있고 한천 코팅을 관통할 수 있다. 7개의 3mm 원형 웰이 있는 주형을 HIDEA를 위한 각각의 검사 디쉬의 한천 상에 뚫린 구멍에 사용하는 것은 한가지 비제한적 예이다.
VIDEA 및 HIDEA 두 양태에서, 샘플은 혈청 샘플 또는 전혈 샘플이다. 상기 방법은 PRRSV로 감염되었을 수 있거나 PRRS 바이러스로 감염된 것으로 의심되는 다양한 동물 및/또는 피험체로부터의 샘플에 적용될 수 있다. 진단 장치는 디쉬, 플레이트 또는 플레이트의 웰일 수 있다. 양성 및 음성 대조군 둘 모두를 각각의 검사 샘플 세트와 함께 사용할 수 있다. 동량의 대조군 혈청을 검사 장치의 다른 웰에 위치시킨다.
플레이트의 항온처리 후, 한천 겔 층을 벗겨내고, 플레이트를 비제한적 예로서 인산염 완충 식염수 중의 Tween 20과 같은 세척 완충액으로 세척한다. 플레이트를 세척 완충액 보다는 증류수 또는 수돗물로 세척할 수 있다. 세척하여 비결합(비특이적) 항체 뿐만 아니라 다른 오염물질도 제거한다.
VIDEA 및 HIDEA 두 방법 모두에는 항원-항체 반응을 사용하여 복합체를 형성하는 것이 포함되고, 이는 예를 들어 복합체의 항체 부분에 결합함으로써 복합체에 결합하는 검출제(예: 2차 항체)를 사용하여 검출할 수 있다. 검출제는 실온에서 약 30분 내지 약 2시간 동안 복합체와 접촉을 유지할 수 있다. 이어서, 플레이트를 비제한적 예로서 완충된 세척 용액으로 세척하여 비결합 접합체를 제거한다. 세척액을 검사 플레이트의 가장자리로부터 주사기 또는 피펫을 사용하여 서서히 첨가하고 부을 수 있다. 이를 임의로 최대 3회 또는 그 이상 반복한다.
검출제를 항온처리하는 동안, 한천 또는 아가로스 코팅을 제조한다. 비제한적 예로서, 바람직하게는 인산염 완충 식염수 중의, 1% 한천 용액을 용융시키고 접합체의 효소에 대한 기질을 혼입한다. 일부 양태에서, 촉매를 필요에 따라 혼입한다. 비제한적 예로서, 효소가 퍼옥시다제인 경우, 1% 한천 용액은 기질로서 약 0.05 내지 0.10%의 5-아미노살리실산 및 촉매로서 약 0.002 내지 0.01%의 과산화수소를 함유할 수 있다. 약 0.08% 기질 및 약 0.005%의 촉매를 사용할 수도 있다. 한천을 세척한 표면 위에 붓고 고체화되게 한다.
2차 항체의 효소 간의 색 반응은 한천 지지 층 내에서 일어난다. 상기 반응은 효소-기질 반응에 의해 시각화를 돕는다. 진한 자주색 원형 구역의 직경을 HIDEA의 경우 측정하고, 존재 또는 부재 또는 색 밀도를 VIDEA의 경우 기록하여 항체 양을 측정하였다.
HIDEA의 경우에, 색은 원형 구역 또는 고리의 형태로 형성된다. 고리는 기질 반응의 약 5 내지 약 30분 내에 측정될 만큼 진하다. 오랜 기간 동안 유지시, 고리는 보다 진해지지만 확대되지는 않을 것이다. 형성된 고리의 직경은 혈액 중에 존재하는 특이적 항체의 양(즉, 바이러스 중화 역가)과 관계가 있다. 진한 색의 원형 구역의 직경을 측정하고 이를 사용하여 표준 바이러스 중화 검사 항체 값과 상호관련시킨다. 측정된 값은 검사 플레이트의 샘플 웰의 크기 및 사용된 샘플의 크기와 관계가 있다. 값의 표 및/또는 대표적인 고리의 묘사는, 본 발명의 각각의 장치 또는 본 발명의 각각의 키트와 함께 포함될 수 있다.
VIDEA 및 HIDEA 방법에 있어서, 표면에서 항체의 존재를 검출하는 것은, 표면 상의 PRRSV 단백질(들)/항원(들)에 결합한 항체를 검출하는 것을 의미한다. 검출은, 표지된 2차 항체의 사용을 포함하는 본원에서 기술된 임의의 수단으로 수행할 수 있다. 다른 비제한적 수단에는 효소-기질 반응을 통한 항원-항체 반응의 시각화가 포함되고, 반응으로부터의 색 반응 또는 색 밀도의 존재를 사용하여 항-PRRSV 항체의 양(정량적 또는 반정량적) 또는 존재(정성적)를 나타낸다.
PRRSV 단백질/항원 뿐만 아니라 단백질/항원을 포함하는 조성물, 방법 및 장치는 익히 공지된 방법에 따라 생산되는 키트의 제조에 적당하다. 따라서 본 발명은 본원에서 공개된 하나 이상의 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 기술된 PRRSV 단백질/항원을 포함하는 키트, 또는 이들을 포함하는 조성물 또는 장치를 제공한다. 이러한 키트는 본 발명의 방법에서의 이들의 용도에 관한 확인설명서 또는 라벨 또는 지침서를 임의로 추가적으로 포함한다. 이러한 키트는 상기 방법에서 사용되는 하나 이상의 다양한 시약(통상적으로 농축된 형태로) 또는 장치가 각각 있는 용기를 포함할 수 있다. 지침서 세트도 통상적으로 포함될 것이다.
본 발명의 장치를 포함하는 키트에는, 본 발명의 방법에서 상기 장치와 함께 사용하기 위한 하나 이상의 추가적인 시약 또는 장비의 부품이 추가로 포함될 수 있다. 포함될 수 있는 추가적인 물질의 비제한적 예로 샘플 희석 용액, 희석액 바이알, 및 샘플의 이동을 위한 점적기(dropper)가 있다. 다른 비제한적 예에는 VIDEA 방법과 함께 사용하기 위한 다공성 물질 및 2차 항체가 포함된다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였고, 이는 다음의 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 달리 명시하지 않는 경우, 실시예는 설명을 위하여 제시되어 있고, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: PRRSV 단백질 및 디쉬의 제조
PRRSV 주를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 감수성(susceptible) 세포에 접종하고, 감염된 세포를 세포 결합된 바이러스 구성요소를 제조하는데 최적인 시간에 회수하여, PRRSV 단백질을 제조할 수 있다. 시험관내 방법의 경우, 세포 배양 시스템에 의해 또는 재조합 기술을 사용하여 항원을 제조할 수 있다. 대안으로, 돼지를 PRRSV로 구비강 접종하고 폐를 세척(폐 세척)한 후 돼지로부터 PRRSV에 감염된 돼지 폐포 대식세포(PAM)를 수득할 수 있다.
세포를 원심분리로 펠릿화하고, 상청액을 제거하거나 폐기하였다. 펠릿을 임의로 세척할 수 있다. 세포 펠릿을, 0.5% Triton X-100을 함유하는 0.05M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 0.025M EDTA 완충액 중에, 압축된 세포 용적의 5 내지 10배의 용적으로 현탁시켰다. 혼합물을 2 내지 15시간 동안 4℃에서 교반하고 10,000g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 PRRSV 항원으로서 사용하였다. 항원은 비-감염성으로서 바이러스 확산의 위험 없이 광범위하게 사용할 수 있다.
pH 약 9.6의 0.06M 탄산염 완충 용액 중의 PRRSV 단백질/항원의 희석액을 비교 검사로 예비측정하였다. 항원을 폴리스티렌 페트리 디쉬(직경 60mm) 상에 4℃에서 72시간 동안 흡착시켜 코팅하였다. 비흡착 항원을 붓고, 디쉬를 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2) 중의 차단제(예: 1% 소 혈청 알부민, BSA)와 함께 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. BSA를 제거한 후, PBS 중의 0.6% 아가로스를, HIDEA의 경우 6ml 그리고 VIDEA의 경우 4ml로, 페트리 디쉬에 덮었다. 한천을 4℃에서 하룻밤 동안 고체화되게 하였다. 주형을 사용하여, HIDEA의 경우 각각의 검사 디쉬의 한천 상에 7개의 3mm 원형 웰을 뚫었다. VIDEA의 경우, 웰이 없는 디쉬를 사용하였다. 모든 검사 디쉬를 4℃에서 습기 챔버 내에서 최대 4개월 동안 보관하였다.
실시예 2: VIDEA
페트리 디쉬의 바닥에 바이러스 항원을 코팅하고 나서, 상기한 바와 같이 일반적으로 한천 겔을 덮어, 검사 플레이트를 제조하였다. 사용 중, 필터 종이 디스크를 돼지로부터의 검사 혈청으로 적시고 검사 플레이트의 한천 상에 위치시킨다. 편평한 디스크로 거의 2차원의 출발 영역을 제공하여, 검사 혈청과 같은 샘플의 내용물이 일반적으로 한천을 통과하여 코팅된 표면을 향해 한 방향으로 이동할 수 있게 한다.
겔을 항온처리 기간 후 벗겨내고, 디쉬를 5 내지 8ml의 세척 용액(0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하였다. 이어서, PBS 중에 희석된 3ml의 시판되는 퍼옥시다제-접합된 래빗 항-돼지 IgG (1 내지 2㎍/ml)를 45분 동안 25℃에서 가하였다. 디쉬를 다시 세척 용액으로 3회 세척한 후, 기질(5-아미노살리실산) 및 H2O2를 각각 0.08% 및 0.005%의 농도로 함유하는 PBS 중의 5ml의 1% 한천을 디쉬 상에 덮었다. 존재 또는 부재 또는 색 밀도를 VIDEA의 경우 기록하였다.
한가지 양태에서, 25 또는 37℃에서 약 2 내지 3시간 동안 항온처리한 후 한천을 벗겨냈다. 퍼옥시다제 반응 결과를, 색 반응을 보이는 양성 샘플에 따라 약 5 내지 10분 후 측정하였다. ELISA S/P 비 또는 PRRS 바이러스 감염력이 공지된 다양한 혈청 샘플을, 비감염(naive) 동물로부터의 샘플과 함께 검사하였다. VIDEA의 민감성 및 특이성을 ELISA에 대해 평가하였다. 아래의 표 1에, 다양한 돼지 혈청에 대한 VIDEA의 결과 및 상응하는 ELISA S/P 비를 요약한다. 검정 간의 일치 %를 괄호 안에 제시한다. VIDEA는 ELISA에서 음성인 것으로 밝혀진 돼지 혈청에 대해 100% 특이성을 보였다. 25℃에서 약 3시간 동안 항온처리한 경우, ELISA와 비교하여 모든 샘플에 대해 100% 일치를 보였다.
Figure 112008009580510-pct00001
항원-항체 반응은 2시간 처럼 적은 시간 내에 일어났지만, 항체 역가가 낮은 경우에는 보다 긴 시간이 유리하다고 생각되며, 항온처리 시간이 짧은 경우에는 거짓 음성으로서 관찰될 수 있다. VIDEA와 ELISA S/P 비 사이의 높은 상관관계는 항-PRRS 바이러스 항체 검출을 위한 검정으로서의 VIDEA의 능력을 나타낸다. 표준 컷오프(cut-off)인 ELISA S/P 비 < 0.4 인 경우의 상관관계는, VIDEA가 ELISA와 동등한 민감성을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2: HIDEA
코팅된 표면 및 투과성 장벽을 갖는 본 발명의 장치를 사용하고, 이때 장벽 물질을 장벽의 표면에 하나 이상의 함입부를 명확히 할 수 있도록 변형시킨다. 비제한적 예로서 아가로스를 사용하여, 하나 이상의 웰을 아가로스에 만들 수 있다.
각각의 웰을 0.015ml의 검사 혈청으로 채웠다. 장치를 약 12 내지 약 24시간 동안 실온(25℃)에서 항온처리하여 항체 확산 및 항원-항체 반응이 일어나게 하였다. 24시간 항온처리의 경우 장치의 추가적인 사용을 실시하였다.
겔을 항온처리 후 벗겨내고 디쉬를 5 내지 8ml의 세척 용액(0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하였다. 이어서, PBS 중에 희석된 3ml의 시판되는 퍼옥시다제-접합된 래빗 항-돼지 IgG (1 내지 2㎍/ml)를 45분 동안 25℃에서 가하였다. 디쉬를 다시 세척 용액으로 3회 세척한 후, 기질(5-아미노살리실산) 및 H2O2를 각각 0.08% 및 0.005%의 농도로 함유하는 PBS 중의 5ml의 1% 한천을 디쉬 상에 덮었다. 진한 자주색의 원형 구역의 직경을, HIDEA의 경우 5 내지 30분의 반응 후 mm 단위로 측정하였다. 표 2 및 3은, 상이한 조건 하에서 검사한 14개 혈청의 상이한 직경을 보여준다. 7mm 미만의 직경은 HIDEA에서 음성인 것으로 간주된다. ELISA 음성 혈청 중 일부는 양성 결과를 보여 HIDEA에 대해 보다 우수한 민감성을 나타냈다. 표 3의 결과는 HIDEA의 높은 반복성을 나타낸다.
Figure 112008009580510-pct00002
Figure 112008009580510-pct00003
본원에서 인용된 모든 참조문헌은, 이전에 구체적으로 인용되었는지의 여부에 관계없이, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 본원에서 사용되는 "하나의" 및 "임의의"라는 용어는 각각 단수 및 복수 형태를 모두 포함하는 것이다.
지금까지 본 발명을 충분히 기술하였고, 당업자는 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이 광범위한 동등한 변수, 농도 및 조건 내에서 본 발명을 수행할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명을 이의 구체적인 양태와 관련하여 기술하였지만, 추가적인 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 출원에는, 일반적으로 본 발명의 원리를 따르면서, 본 발명이 속하는 당업계 내에 공지되어 있거나 통상적인 관행에 속하고 본원에서 앞서 제시한 필수적인 특징에 적용될 수 있는 본 특허원에 개시되지 않은 것을 포함하는, 본 발명의 임의의 변화, 용도 또는 변형이 포함되는 것으로 이해된다.

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  22. a) PRRS 바이러스로 감염된 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 이때 상기 세포가 PRRS 바이러스에 의해 암호화된 바이러스 단백질 및 항원을 생성하여, PRRS 바이러스에 의해 암호화된 바이러스 단백질 및 항원의 대부분이 상기 감염된 세포 내에 존재하거나 상기 감염된 세포의 세포막과 결합되어 있는 단계 ;
    b) 상기 PRRS 바이러스 감염된 세포를, 감염 후 PRRS 바이러스에 의해 암호화된 바이러스 단백질 및 항원의 대부분 또는 전부가 상기 감염된 세포 내에 잔존하거나 상기 감염된 세포의 세포막과 결합한 시점에, 세포 주변의 배양 배지 중의 세포-부존재 PRRS 바이러스로부터 분리하여, 세포 결합된 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 함유하는 분리된 세포를 형성시키는 단계; 및
    c) 세제 함유 용액을 사용하여, b) 단계에서 분리된 세포를 추출 또는 용출시켜, 세포 성분을 함유하는 세포-결합된 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 포함하는 추출물 또는 용출물을 형성하는 단계
    를 포함하여, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세제 함유 용액이 비이온성 세제를 함유함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 추출 또는 용출을 2 내지 15시간 동안 4℃에서 실시함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 단백질 및 항원이 PRRS 바이러스 외피 단백질 또는 뉴클레오캡시드(N; Nucleocapsid) 단백질을 포함함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 단백질 및 항원이 PRRS 바이러스 암호화된 당단백질을 포함함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 따라 PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 단계 및
    상기 단백질 및 항원을 백신 조성물로서 제형화하는 단계
    를 포함하여, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터의 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 백신 조성물이 애쥬번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 백신 조성물의 제조 방법.
  29. 제27항의 방법에 의해 제조된 백신 조성물.
  30. 제28항의 방법에 의해 제조된 백신 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 형태임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 형태임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  33. 제22항 또는 제23항에 따른 방법으로 제조한 PRRS 바이러스 단백질 및 항원.
  34. 제22항에 있어서, 상기 세포 집단을 PRRS 바이러스로 감염시켜 상청액 1ml 당 101.5 조직 배양 감염 용량(TCID)50 미만을 생산함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
  35. 제22항 또는 제34항에 있어서, 상기 세제 함유 용액이 0.5% Triton X-100을 함유함을 특징으로 하는, PRRS 바이러스에 감염된 세포로부터 PRRS 바이러스 단백질 및 항원을 제조하는 방법.
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