CN115586327A - 一种免疫探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫探针、制备方法及其应用，属于兽医生物诊断制品领域，一种免疫探针，包括金纳米花颗粒，金纳米花颗粒通过静电吸附有能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白。一种免疫探针的制备方法，S1：以直径为15‑25nm的胶体金为晶核，对苯二酚为介导，制备金纳米花胶体，S2：取金纳米花胶体进行冰浴，调节pH值，滴加能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，按终浓度为0.8‑1.2wt％加入牛血清白蛋白，继续搅拌25‑35min，按终浓度为0.4‑0.6wt％加入聚乙二醇20000，静置于4℃过夜，S3：离心纯化，用重悬液复溶，得到免疫探针。本发明由金纳米花颗粒与能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白通过静吸附形成的免疫探针，应用于检测试纸具有更高的灵敏度。

Description

一种免疫探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于兽医生物诊断制品领域，尤其涉及一种免疫探针、制备方法及其应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒通过软蜱等虫媒传播和带毒野猪与家猪高度接触易感猪引起的烈性、尚未能防治的传染病。
非洲猪瘟是一种双链的核质大DNA病毒。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，其中由p72结构蛋白组成的核衣壳蛋白含量占到全部病毒蛋白的1/3，是结构蛋白中含量最多的。p72存在于病毒衣壳的表面，具有较好的免疫原性和抗原性，能够诱导机体产生中和抗体，因而是血清学检测的主要抗原区，也是用于ASFV诊断检测的主要蛋白，为建立无感染性的、快速、灵敏的血清学检测方法奠定了基础。
目前非洲猪瘟检测主要以PCR检测方法为主。仪器分析法在检测上比较灵敏，但是所用大多为大型仪器，需要在实验室由专人操作，存在样品前处理复杂，成本高且花费时间长，不适合现场大宗产品的快速筛查等问题。酶联免疫吸附反应和免疫层析技术等免疫分析方法以其快速、简便、灵敏及特异性强的特点近年来广泛的应用于检测方面。目前使用最广泛的是胶体金检测试纸条，同样利用抗原抗体反应原理，检测非洲猪瘟病毒抗原，其操作简便、反应时间短，但缺陷是灵敏度不够高，可能存在假阴性或者假阳性。
发明内容
本发明的目的在于提出一种免疫探针、制备方法及其应用，由金纳米花颗粒与能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白通过静吸附形成的免疫探针，可放大免疫检测的信号，应用于检测试纸具有更高的灵敏度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种免疫探针，包括金纳米花颗粒，金纳米花颗粒通过静电吸附有能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白。
优选地，能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白为p72单克隆抗体或p72单域抗体中任意一种。
优选地，金纳米花颗粒的粒径＞50nm。
本发明还提供一种免疫探针的制备方法，用于制备上述的免疫探针，包括以下步骤：S1：通过种子生长法，以直径为15-25nm的胶体金为晶核，对苯二酚为介导，制备金纳米花胶体，S2：取步骤S1制备的金纳米花胶体进行冰浴，持续搅拌，调节pH值，缓慢滴加能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，维持搅拌25-35min，按终浓度为0.8-1.2wt％加入牛血清白蛋白，继续搅拌25-35min，按终浓度为0.4-0.6wt％加入聚乙二醇20000，维持搅拌10-20min，静置于4℃平衡体系过夜，S3：将步骤S2得到的溶液进行离心纯化，用重悬液复溶，得到免疫探针。
优选地，步骤S1具体包括：取90-110mL的二次蒸馏水调pH值至7-8，依次加入15-25nm的胶体金450-550μL，0.8-1.2wt％柠檬酸钠280-320μL，0.8-1.2wt％四氯金酸700-800μL，混合均匀，在剧烈搅拌的情况下，一次性快速加入0.8-1.2mL的25-35mM的对苯二酚，持续剧烈搅拌18-22min，得金纳米花胶体，置4℃保存。
优选地，步骤S2之前，还包括：取步骤S1制备的金纳米花胶体用氯化钠滴定法分别确定最佳标记pH值和最佳标记抗体量。
优选地，氯化钠滴定法确定最佳标记pH值的步骤包括：分别取180-220μL步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，然后各加入0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5μL的0.08-0.12M碳酸钾，混匀，随后分别加入5-7μg的能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，孵育25-35min，分别加入8-12wt％的氯化钠各18-22μL，混匀8-12min后观测酶标条各孔中的颜色，取颜色稳定无沉淀、最低碳酸钾使用量对应的pH值即为最佳标记pH值。
优选地，氯化钠滴定法确定最佳标记抗体量的步骤包括：分别取180-220μL步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，往各孔统一加入最佳碳酸钾量调节pH，然后各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg的能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，混匀后孵育25-35min，分别加入8-12wt％的氯化钠各18-22μL，混匀8-12min后观测酶标条各孔中的颜色变化是否趋于稳定，在颜色变化稳定的孔中选取最低抗体量即为最佳标记抗体量。
优选地，步骤S2中，取8-12mL的步骤S1制备的金纳米花胶体进行冰浴，采用0.08-0.12M碳酸钾调节pH值至最佳标记pH值，按最佳标记抗体量缓慢滴加能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，如p72单克隆抗体或p72单域抗体中任意一种。
优选地，将步骤S2过夜后的溶液置于离心机中，以4℃、1400-1600r/min离心15-25min，弃沉淀，取上清再继续以4℃、12000-14000r/min离心4-6min，保留沉淀，按1/5体积重悬，重悬液包括：0.008-0.012M的pH为8-9的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、0.8-1.2wt％牛血清白蛋白、8-12wt％蔗糖。
本发明还提供上述的免疫探针或上述的免疫探针的制备方法所制备的免疫探针，在制备检测试剂、试纸、检测卡、试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测试纸，包括底板，及设置于底板上方依次排列的样品垫、金垫、层析膜及吸水垫，层析膜为由一条检测线和一条质控线组成的固相硝酸纤维素膜，金垫上包被有上述的免疫探针或上述的免疫探针的制备方法所制备的免疫探针，免疫探针中能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白为p72单克隆抗体A，检测线上包被有P72单克隆抗体B，质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
本发明还提供一种用于制备上述的检测试纸的方法，包括以下步骤：分别对样品垫和金垫通过预处理液进行预处理，处理后置37℃干燥过夜备用；将硝酸纤维素膜固定到底板；分别对P72单克隆抗体B和羊抗鼠IgG抗体进行稀释，稀释后吸入划膜仪，分别在硝酸纤维膜上按照0.8-1.2μL/cm进行划线，分别作为检测线和质控线，然后置37℃干燥烘干3.8-4.2h得层析膜；将免疫探针用重悬液稀释1.8-2.2倍，取440-460μL铺平到1.25×5cm金垫上，置37℃干燥过夜，然后将裁剪后的吸水垫、层析膜、金垫、样品垫依次粘贴于PVC底板上得到检测试纸。
优选地，样品垫的预处理液的pH为7.2-9.0，样品垫的预处理液包括以下质量分数组分：0.1-1份8-12mg/mL的表面活性剂S9，0.2-1份0.6-0.8wt％的PVP-40，0.22-1份0.3-0.5wt％酪蛋白钠，余量50mM-200mM的pH为8-9的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
优选地，金垫的预处理液的pH为7.2-9.0，金垫的预处理液包括以下质量分数组分：1-5份1.5-2.5wt％海藻糖，0.5-3份0.8-1.2wt％牛血清白蛋白，余量50mM-200mM的pH为8-9的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
优选地，将P72单克隆抗体B稀释至0.5-2.5mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.25-0.75mg/mL。
本发明的有益效果为：
1、通过金纳米花颗粒与能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白结合，特别是与p72单克隆抗体A结合，制备的免疫探针，由于金纳米花颗粒的比表面积大，分散性好，再结合大于50nm的粒径，使得能更好吸附更多能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白,可放大免疫检测的信号，体现在检测试纸上的灵敏度相对于胶体金检测试纸也更高；且金纳米花为蓝色胶体，制备出来的检测试纸区别于传统胶体金试纸条，更易于肉眼补捉观察，为新型免疫检测试纸条。
2、本发明提供的试纸适用于检测病猪血清或全血中非洲猪瘟病毒P72蛋白，可在短时间内诊断出ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。
附图说明
图1是本发明制得的金纳米花胶体。
图2是本发明的金纳米花胶体紫外可见光全波长扫描图。
图3是本发明的免疫探针制备过程的紫外可见光谱分析图。
图4是本发明的自制金纳米花检测标准色卡。
图5是本发明的检测试纸的灵敏度测试图。
图6是国内非洲猪瘟抗原检测试剂的灵敏度测试图。
图7是本发明的检测试纸的特异性鉴定图。
图8是本发明的检测试纸的实际样品检测图。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
本实施例中提供的一种免疫探针(AuNFs-mAb)，包括金纳米花颗粒，金纳米花颗粒通过静电吸附有能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白。本实施例中，能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白为p72单克隆抗体A,P72单克隆抗体A采购于洛阳佰盛生物技术有限公司，生产日期2020/06/13。金纳米花颗粒的粒径为52nm。通过金纳米花颗粒与p72单克隆抗体A结合，由于金纳米花颗粒的比表面积大，分散性好，再结合大于50nm的粒径，使得能更好吸附更多p72单克隆抗体A,可放大免疫检测的信号，体现在检测试纸上的灵敏度相对于胶体金检测试纸也更高。
本实施例还提供一种免疫探针的制备方法，用于制备上述的免疫探针，包括以下步骤：
S1：通过种子生长法，以直径为20nm的胶体金为晶核，对苯二酚为介导，制备具有花瓣状金纳米花(AuNF)颗粒的金纳米花胶体。
具体的，取100mL的二次蒸馏水(ddH2O)调pH值至7.5，依次加入20nm的胶体金500μL，1wt％柠檬酸钠300μL，1wt％四氯金酸(HAuCl4)750μL，混合均匀，在剧烈搅拌的情况下，一次性快速加入1mL的30mM的对苯二酚，持续剧烈搅拌20min，得金纳米花胶体，置4℃保存。如图1所示，所制金纳米花胶体为深蓝色，未见浑浊，底部无沉淀，分散性良好；取100uL金纳米花胶体用紫外可见光谱扫描，如图2所示，金纳米花胶体最大吸收峰约为590nm，峰形较宽。
取步骤S1制备的金纳米花胶体用氯化钠滴定法分别确定最佳标记抗体量和最佳标记pH值。
氯化钠滴定法确定最佳标记pH的步骤包括：
分别取200μL步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，然后各加入0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5μL的0.1M碳酸钾(K2CO3)，混匀，随后分别加入6μg的P72单克隆抗体A，孵育30min，分别加入10wt％的氯化钠各20μL，混匀10min后观测酶标条各孔中的颜色，取颜色稳定无沉淀、最低碳酸钾使用量对应的pH值即为最佳标记pH值。本实施例加入7.5μL的0.1M碳酸钾颜色最为正常且无沉淀。
氯化钠滴定法确定最佳标记抗体量的步骤包括：
分别取200μL步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，然后各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg的p72单克隆抗体A，混匀后孵育30min，分别加入10wt％的氯化钠(NaCl)各20μL，混匀5min后观测酶标条各孔中的颜色变化是否趋于稳定，在颜色变化稳定的孔中选取最低抗体量即为最佳标记抗体量。本实施例加入6μg的P72单克隆抗体A为最佳标记抗体量。
S2：取10mL步骤S1制备的金纳米花胶体进行冰浴，持续低速搅拌，采用0.1M碳酸钾调节pH值至最佳标记pH值，按最佳标记抗体量缓慢滴加p72单克隆抗体A，维持冰浴低速搅拌30min，取1mL进行紫外可见光谱扫描分析p72单克隆抗体A吸附情况，结果如图3所示，说明吸附良好。按终浓度为1wt％加入牛血清白蛋白(BSA)，继续冰浴，低速搅拌30min，按终浓度为0.5wt％加入聚乙二醇20000(PEG20000)，维持搅拌15min，静置于4℃平衡体系过夜。
S3：将步骤S2过夜后的溶液进行离心纯化，用重悬液复溶，得到免疫探针(AuNFs-mAb)。
具体的，将步骤S2过夜后的溶液置于离心机中，以4℃、1500r/min离心20min，弃沉淀，取上清再继续以4℃、13000r/min离心5min，保留沉淀，按1/5体积重悬，重悬液包括：0.01M的pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)、1wt％牛血清白蛋白、10wt％蔗糖。
本实施例还提供一种上述的免疫探针在制备检测试纸、检测卡、试剂盒中的应用。
本实施例还提供一种检测试纸，包括PVC底板，及设置于PVC底板上方依次排列的样品垫、金垫、层析膜及吸水垫，层析膜为由一条检测线和一条质控线组成的固相硝酸纤维素膜，金垫上包被有如上述的免疫探针，检测线上包被有P72单克隆抗体B，P72单克隆抗体A和P72单克隆抗体B是配对抗体，两个抗体结合在p72不同的位点，P72单克隆抗体B也采购于洛阳佰盛生物技术有限公司，生产日期2020/06/13。质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
本实施例还提供一种用于制备上述的检测试纸的方法，包括以下步骤：
分别对样品垫和金垫通过预处理液进行预处理，处理后置37℃干燥过夜备用。具体的，样品垫的预处理液的pH为7.2-9.0，样品垫的预处理液包括以下质量分数组分：0.5份10mg/mL的表面活性剂S9，0.6份0.7wt％的PVP-40，0.25份0.4wt％酪蛋白钠，余量100mM的pH为8.3的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。金垫的预处理液的pH为7.2-9.0，金垫的预处理液包括以下质量分数组分：3份2wt％海藻糖，1.5份1wt％牛血清白蛋白，余量100mM的pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
将硝酸纤维素膜固定到PVC底板。
分别对P72单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体进行稀释，具有份，将P72单克隆抗体B稀释至2mg/mL，将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.5mg/mL。稀释后吸入划膜仪，分别在硝酸纤维膜上按照1μL/cm进行划线，分别作为检测线和质控线，然后置37℃恒温箱干燥烘干4h得层析膜；将免疫探针用重悬液稀释2倍，取450μL铺平到1.25cm×7.5cm金垫上，置37℃恒温箱干燥过夜，使用时裁剪成0.5cm宽，然后将吸水垫、层析膜、金垫、样品垫依次粘贴于PVC底板上得到检测试纸。
本实施例还提供一种检测卡，包括塑料外壳及包装在外壳内的上述检测试纸，外壳上设有加样孔和观察窗，加样孔位于样品垫上方，观察窗用于观察检测线和质控线。
样品检测：
将检测卡平放于平面上，取10μL待测血清，与70μL样品稀释液成分混匀后点样，静置10-15min后观察检测结果。
结果判读：
C线正常显色，T线消失，为阴性，说明待测液中不含靶标或含量极低；C线正常显色，T线显色，T线对照自制色卡(如图4)数值在3及以上，为阳性，说明待测液中含有靶标，且浓度高于检测阈值；C线不显色，T线无论显色或者不显色，判定为试纸条失效。
检测试纸的测试：
1)灵敏度测试：取P72重组蛋白用PBS缓冲液进行稀释至不同浓度：2μg/mL、200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、1ng/mL，分别取10uL进行检测，结果如图5所示，图中，1：2μg/mL；2：200ng/mL；3：20ng/mL；4：2ng/mL；5：1ng/mL；6：阴性。检测试纸在为2ng/mL时仍可观察到T线条带，对比色卡信号强度值为3，在1ng/mL时T线条带消失，因此，检测限(vLOD)为2ng/mL。
2)灵敏度对比：采购市售的非洲猪瘟抗原胶体金快速检测试剂盒进行比对，如图6所示，图中，1：1μg/mL；2：250ng/mL；3：62.5ng/mL；4：15ng/mL；5：3.90625ng/mL；6：阴性。其最低检测限(vLOD)约为15ng/mL，因此，本发明的检测试纸与市售的胶体金快速检测试纸相比，具有更高的灵敏度。
3)特异性测试：取不同灭活病毒或重组蛋白(H1N1、H3N2、H3N2-BJ、H5N1-HA、H5N6-AH、H5N6-GZ、H7N9、腺病毒Ad5)稀释到50ng/mL，以非洲猪瘟病毒阳性血清作为阳性对照，SARS-CoV-2RBD为阴性对照，各取10μL进行测试，如图7所示，图中，1：非瘟阳性血清；2：感病毒H1N1；3：流感H3N2；4：流感H3N2-BJ；5：流感重组蛋白H5N1-HA；6：流感H5N6-AH；7：流感H5N6-GZ；8：流感H7N9；9：腺病毒Ad5；10：SARS-CoV-2RBD。仅非洲猪瘟病毒阳性血清检测线呈现阳性条带，其余检测线均无明显条带。
检测试纸的应用：
1)实际样品前处理：将PCR或ELISA确诊的非洲猪瘟阳性血清或全血，置于65℃水浴锅中灭活30min。
2)检测试纸的检测：取10μL阳性血清+70μL样品稀释液混匀后点样。以本发明的检测试纸进行检测。如图8所示，图中，1：阳性样本编号11；2：阳性样本编号12；3：阳性样本编号13；4：阳性样本编号14；5：阳性样本编号15；6：阳性样本编号16；7：阴性血清。
样品1：阳性样本编号11 信号强度03。
样品2：阳性样本编号12 信号强度01。
样品3：阳性样本编号13 信号强度03。
样品4：阳性样本编号14 信号强度03。
样品5：阳性样本编号15 信号强度05。
样品6：阳性样本编号16 信号强度07。
对照组：阴性血清，信号强度C01。
本发明提供的试纸适用于检测病猪血清或全血中非洲猪瘟病毒P72蛋白，可在短时间内诊断出ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种免疫探针，其特征在于：包括金纳米花颗粒，所述金纳米花颗粒通过静电吸附有能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白。
2.根据权利要求1所述的免疫探针，其特征在于：所述能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白为p72单克隆抗体或p72单域抗体中任意一种。
3.根据权利要求1所述的免疫探针，其特征在于：所述金纳米花颗粒的粒径＞50nm。
4.一种免疫探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：通过种子生长法，以直径为15-25nm的胶体金为晶核，对苯二酚为介导，制备金纳米花胶体；
S2：取所述步骤S1制备的金纳米花胶体进行冰浴，持续搅拌，调节pH值，缓慢滴加能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，维持搅拌25-35min，按终浓度为0.8-1.2wt％加入牛血清白蛋白，继续搅拌25-35min，按终浓度为0.4-0.6wt％加入聚乙二醇，维持搅拌10-20min，静置于平衡体系中一段时间；
S3：将所述步骤S2得到的溶液进行离心纯化，用重悬液复溶，得到免疫探针。
5.根据权利要求4所述的免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：取90-110mL的二次蒸馏水调pH值至7-8，依次加入15-25nm的胶体金450-550μL，0.8-1.2wt％柠檬酸钠280-320μL，0.8-1.2wt％四氯金酸700-800μL，混合均匀，在搅拌的情况下，一次性加入0.8-1.2mL的25-35mM的对苯二酚，持续搅拌18-22min，得金纳米花胶体。
6.根据权利要求4所述的免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2之前，还包括：取所述步骤S1制备的金纳米花胶体用氯化钠滴定法分别确定最佳标记抗体量和最佳标记pH值；
氯化钠滴定法确定最佳标记pH值的步骤包括：分别取180-220μL所述步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，然后各加入0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5μL的0.08-0.12M碳酸钾，混匀，随后分别加入5-7μg的能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，孵育25-35min，分别加入8-12wt％的氯化钠各18-22μL，混匀8-12min后观测酶标条各孔中的颜色变化是否趋于稳定，取颜色稳定无沉淀、最低碳酸钾使用量对应的pH值即为最佳标记pH值；
氯化钠滴定法确定最佳标记抗体量的步骤包括：分别取180-220μL所述步骤S1制备的金纳米花胶体加入酶标条的各个孔中，往各孔统一加入最佳碳酸钾量调节pH，然后各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg的能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白，混匀后孵育25-35min，分别加入8-12wt％的氯化钠各18-22μL，混匀8-12min后观测酶标条各孔中的颜色变化是否趋于稳定，在颜色变化稳定的孔中选取最低抗体量即为最佳标记抗体量；
所述步骤S2中，取8-12mL的步骤S1制备的金纳米花胶体进行冰浴，采用0.08-0.12M碳酸钾调节pH值至所述最佳标记pH值，按所述最佳标记抗体量缓慢滴加能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白。
7.根据权利要求4所述的免疫探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将所述步骤S2过夜后的溶液置于离心机中，以4℃、1400-1600r/min离心15-25min，弃沉淀，取上清再继续以4℃、12000-14000r/min离心4-6min，保留沉淀，按1/5体积重悬，重悬液包括：0.008-0.012M的pH为8-9的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、0.8-1.2wt％牛血清白蛋白、8-12wt％蔗糖。
8.权利要求1-3任一权利要求所述的免疫探针或权利要求4-7任一权利要求所述的免疫探针的制备方法所制备的免疫探针，在制备检测试剂、检测试纸、检测卡、试剂盒中的应用。
9.一种检测试纸，其特征在于：
包括底板，及设置于底板上方依次排列的样品垫、金垫、层析膜及吸水垫；
所述层析膜为由一条检测线和一条质控线组成的固相硝酸纤维素膜；
所述金垫上包被有如权利要求1-3任一权利要求所述的免疫探针或权利要求4-7任一权利要求所述的免疫探针的制备方法所制备的免疫探针，所述免疫探针中能够与非洲猪瘟的p72蛋白特异性结合的蛋白为p72单克隆抗体A；
所述检测线上包被有P72单克隆抗体B；
所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
10.一种用于制备如权利要求9所述的检测试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：分别对样品垫和金垫通过预处理液进行预处理，处理后干燥过夜备用；将硝酸纤维素膜固定到底板；分别对P72单克隆抗体B和羊抗鼠IgG抗体进行稀释，稀释后吸入划膜仪，分别在硝酸纤维膜上按照0.8-1.2μL/cm进行划线，分别作为检测线和质控线，然后干燥3.8-4.2h得层析膜；将免疫探针用重悬液稀释1.8-2.2倍，取440-460μL铺平1.25×5cm金垫上，干燥过夜，然后将裁剪后的吸水垫、层析膜、金垫、样品垫依次粘贴于底板上得到检测试纸。
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