JP2011508198A - 吸着されたインフルエンザワクチンのためのアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原を拡散の前に脱離する工程を含むことによって、吸着した抗原のためのインフルエンザSRIDアッセイプロトコールを修飾する。従って本発明は、以下の工程を含む、SRIDアッセイを行うための方法を提供する:
(a)目的の抗原を含む開始組成物を得る工程であって、ここでその抗原はアジュバントに吸着している、工程;
(b)アジュバントから抗原を脱離するために開始組成物を処理する工程;および
(c)脱離した組成物、またはそのサンプルを、目的の抗原に特異的な抗体を含むゲル中へ拡散させる工程。
(a)インフルエンザ抗原を含む開始組成物を得る工程であって、ここでその抗原はアジュバントに吸着している、工程;
(b)アジュバントから抗原を脱離するために開始組成物を処理する工程;および
(c)脱離した組成物、またはそのサンプルに、アッセイ技術を適用する工程。
本発明のSRIDアッセイは、上記で記載したように、3つの工程(a)から(c)を含む。
SRIDによって分析する開始組成物は、アジュバントに吸着した抗原を含み、そしてこの抗原は典型的にはインフルエンザウイルス抗原である。
分析されるべきサンプル中の抗原を、アジュバントに吸着させる。微粒子および不溶性の金属塩、例えばアルミニウムまたはカルシウム塩を含む、様々なアジュバントが抗原を吸着し得る。吸着は部分的または完全であり得る。例えば、組成物中少なくとも50%(例えば≧60%、≧70%、≧80%、≧90%、≧95%、≧99%等)の抗原を吸着し得る。吸着の程度を、単純に、例えば組成物を遠心し、そしてどれだけの物質が溶液中に残るか(すなわち吸着されなかった)を決定することによって決定し得る。例えば、参考文献36において、リン酸カルシウムアジュバントの吸着能力を、この方法によって測定した。
抗原を吸着するための適当なアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントを含む。これらの名前は従来のものであるが、どちらも存在する実際の化合物の正確な説明ではないので、簡便さのためにのみ使用する[例えば参考文献37の第9章を参照のこと]。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれも使用し得る。
様々なカルシウム塩のうち、一般的にリン酸カルシウムのみをアジュバントとして使用する。リン酸カルシウムの様々なアジュバント形態が報告され、そしてこれらのいずれも本発明の方法によって分析し得る。
本発明の方法は、吸着抗原の脱離を含む。脱離のために、様々な方法を使用し得る。インフルエンザウイルス抗原に関して、本発明者らは、表面糖タンパク質およびアルミニウム塩(特に水酸化アルミニウムアジュバント)の間の相互作用の性質が、多くの利用可能な脱離方法がおだやか過ぎる(それは、タンパク質の一部分は結合したままであり、抗原含有量の過小評価を引き起こすことを意味する)または厳し過ぎる(HA抗原が変性または切断され、再び抗原含有量の過小評価を引き起こすことを意味する)ことを意味することを見出した。従って、本発明者らは、SRIDによってアッセイ可能であることを保証しながらも、インフルエンザタンパク質の実質的に完全な脱離を可能にする脱離処理を考案した。
本発明は、以下の工程を含む、ワクチンを産生するための方法を提供する:
(i)目的のバルク抗原を調製する工程:
(ii)本発明の方法を用いて、バルク抗原のサンプルを分析する工程;
(iii)工程(ii)の結果に基づいて、バルク抗原を望ましい最終濃度へ希釈する工程;
(iv)任意で、希釈したバルク抗原を、1つまたはそれ以上の薬剤学的に許容可能な成分と組み合わせる工程;そして
(v)流通のために希釈したバルク抗原を包装する工程。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」および「から成る」を含む、例えばXを「含む」組成物は、独占的にXから成り得る、またはさらに何かを、例えばX+Yを含み得る。
様々な塩の評価
バルクの一価表面糖タンパク質を、卵増殖A/New York(H3N2)インフルエンザウイルスから調製した。抗原(50μg/ml)を、水酸化アルミニウムアジュバントに完全に吸着し(1mg/ml AlhydrogelTM)、その後それはもはやSRIDによって確実には分析できなかった。従って、様々な脱離試薬を試験した(最終的な濃度を下記の表で示す):
緩衝塩:リン酸アンモニウム
リン酸カリウム(三塩基性)
オルトリン酸水素二カリウム
リン酸二水素ナトリウム
オルトリン酸水素二ナトリウム
界面活性剤 Zwittergent3−14TM 。
一価表面糖タンパク質を、卵増殖A/Vietnam/1203/2004(H5N1)リアソータントから調製した。表面抗原(HA濃度90μg/ml)は、水酸化アルミニウム1mgあたり60μgの赤血球凝集素の比で、水酸化アルミニウムに完全に吸着した。その処方物を完全にボルテックスし、そして使用するまで4℃で保存した。
(1)300mMのリン酸水素二カリウムプラス0.5%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(2)350mMのリン酸水素二カリウムプラス0.5%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(3)400mMのリン酸水素二カリウムプラス0.5%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(4)300mMのリン酸水素二カリウムプラス1.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(5)350mMのリン酸水素二カリウムプラス1.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(6)400mMのリン酸水素二カリウムプラス1.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(7)300mMのリン酸水素二カリウムプラス2.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(8)350mMのリン酸水素二カリウムプラス2.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM
(9)400mMのリン酸水素二カリウムプラス2.0%(w/v)のZwittergent 3−14TM 。
A/New York(H3N2)の結果に基づいて、汎流行性株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)由来の抗原を調製し、そして上記で記載したように水酸化アルミニウムに吸着した。90、60、30、15、および7.5μg/mlのHA濃度を用いた。HA対水酸化アルミニウムの比を、1mgの水酸化アルミニウムに対して30μgのHAに維持した。K2PO4・3H2O(350、500および750mM)およびZwittergent3−14TM(0.5%、2%、または4%)の混合物を、脱離のために使用した。Zwittergent追加後の最終的な緩衝剤濃度は以下のようであった:
汎流行性株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)由来の抗原を調製し、そして上記で記載したように水酸化アルミニウムに吸着した。90、60、30、15、および7.5μg/mlのHA濃度を用いた。HA対水酸化アルミニウムの比を、1mgの水酸化アルミニウムに対して30μgのHAに維持した。K2HPO4.3H2O(350mM)およびZwittergent3−14TM(0.5%、2%、または4%)の混合物を、脱離のために使用した。Zwittergent追加後の最終的な緩衝剤濃度は:0.5%Zwittergent=332.5mM、2%Zwittergent=280mM、および4%Zwittergent=210mMであった。脱離工程のインキュベーション温度が2−8℃であった以外は、上記で記載した条件によって脱離を行った。
アッセイの頑健性を評価するために、同等のサンプルを用いて並行して行うために第二の操作者を用いた。
Claims (32)
- 免疫拡散アッセイを実行するための方法であって、該方法は、(a)目的の抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該抗原はアジュバントに吸着されている、工程;(b)該開始組成物を処理して、該抗原を該アジュバントから脱離させる工程;ならびに(c)該脱離させた組成物またはそのサンプルを、該目的の抗原に特異的な抗体を含むゲルに拡散させる工程を包含する、方法。
- 前記目的の抗原は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)である、請求項1に記載の方法。
- 前記開始組成物またはそのサンプルと塩を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程(b)で脱離させる、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩がリン酸塩である、請求項3に記載の方法。
- 前記塩が、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムである、請求項4に記載の方法。
- 前記塩がオルトリン酸水素二カリウムである、請求項5に記載の方法。
- 前記開始組成物またはそのサンプルと界面活性剤を含む脱離試薬とを混合することによって、抗原を工程(b)で脱離させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱離試薬が双性イオン性界面活性剤を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記界面活性剤がn−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートである、請求項8に記載の方法。
- オルトリン酸水素二カリウムおよびn−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートを含む脱離試薬を使用して、抗原を工程(b)で脱離させる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱離試薬が、300〜350mM オルトリン酸水素二カリウムおよび0.5% n−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートを有する、請求項10に記載の方法。
- 工程(c)が、ゲル中のウェルからの拡散を含み、そして、工程(b)と(c)との間に、前記方法が、脱離させた組成物またはそのサンプルを該ウェルに導入する工程を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)で使用されるゲルが、寒天ゲルまたはアガロースゲルである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲル中の沈殿ハローの寸法を決定する、さらなる工程(d)を包含する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)で測定された寸法を標準的な寸法と比較し、その比較の結果を使用して、工程(c)で添加された材料中の前記抗原の濃度を計算する、さらなる工程(e)を包含する、請求項14に記載の方法。
- 前記開始組成物が不活性化されたインフルエンザワクチンである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンがウイルス粒子全体を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ワクチンが分割ウイルス粒子を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ワクチンがビロソームを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ワクチンが精製された表面抗原を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記アジュバントが不溶性の金属塩を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントがカルシウム塩を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記アジュバントがリン酸カルシウムを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記アジュバントがリン酸アルミニウムを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記アジュバントが水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物を含む、請求項24に記載の方法。
- インフルエンザ抗原に対してアッセイを実行するための方法であって、該方法は、(a)インフルエンザ抗原を含む開始組成物を取得する工程であって、該抗原は、アジュバントに吸着されている、工程;(b)該開始組成物を処理して、該抗原を該アジュバントから脱離させる工程;および(c)アッセイ技術を該脱離させた組成物またはそのサンプルに適用する工程、を包含する、方法。
- ワクチンを産生するための方法であって、該方法は:(i)バルクの目的の抗原を調製する工程;(ii)請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法を使用して該バルクの抗原のサンプルを分析する工程;および、工程(ii)の結果に基づいて、(iii)該バルクの抗原を所望の最終濃度に希釈する工程;必要に応じて(iv)該希釈されたバルクの抗原と1つ以上の薬学的に受容可能な成分とを合わせる工程;および(v)流通のために該希釈されたバルクの抗原を包装する工程、を包含する、方法。
- アジュバントに吸着した抗原のためのSRIDアッセイにおける、抗原の放射状拡散が生じる前の、該抗原を脱離させることからなる改善。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法によってアッセイされた、抗原組成物。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法によってアッセイされた、抗原を含むワクチン。
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