JP7232893B2 - インフルエンザ効力アッセイ - Google Patents

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Description

本出願は、欧州特許出願第１５１７５７６５．５号（出願日２０１５年７月７日）および欧州特許出願第１６１５２８２９．４号（出願日２０１６年１月２６日）の利益を主張しており、これら出願の全体の内容は、すべての目的のために参考として本明細書中に本明細書によって援用される。
発明の分野
本発明は一般に、ワクチン、より具体的には、インフルエンザワクチンについてのアッセイに関する。
発明の背景
インフルエンザの近年の大流行は、潜在的に致死性の合併症を有するこの疾患から、一般の公衆を防御するのに十分な量のインフルエンザワクチンを迅速に作製し、出荷する必要を浮き彫りにしている。
不活化インフルエンザワクチン中のヘマグルチニン（ＨＡ）含量についての標準的アッセイは、ＷＨＯにより、１９７８年に、赤血球の凝集に基づく試験を置き換えるように推奨された、一元放射免疫拡散（「ＳＲＩＤ」）（参考文献１および２）に基づく。
ＳＲＩＤアッセイは、十分に確立されているが、実施に時間がかかり、ダイナミックレンジが小さく、大幅なばらつきを受けやすく、要請される特異的な抗ＨＡ血清を調製および較正するのに長期間を要しうる。ワクチン中のインフルエンザ株は、毎シーズン変化するが、これらの基準試薬は、株が変化するたびに新たに調製および較正する必要があるため、これは、インフルエンザワクチンロットの出荷に対するボトルネックとなっている。これは、インフルエンザワクチンを、可能な限り迅速に調製する必要がある、インフルエンザ汎発（ｐａｎｄｅｍｉｃ）の場合に、特に問題である。
ＳＲＩＤアッセイでは、将来の免疫原性形態を優先的に認識するように、アッセイにおいて使用される抗血清を調整しうると一般に考えられている（参考文献１２５）が、このような抗血清は、完全に特異的ではありえず、いずれの形態とも反応しうるため、ＳＲＩＤアッセイの別の欠点は、それが、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）抗原の免疫原として活性の形態と、免疫原性として活性でない形態とを、信頼できる形で識別しえないことである。インフルエンザワクチンの免疫原性（よって、免疫防御）は、免疫原として活性のＨＡの量により決定されるので、アッセイが、免疫原として活性の形態のＨＡを特異的に測定することが可能であることが望ましい。
参考文献３は、限外濾過の後に逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）が続く、ＳＲＩＤアッセイに対する代替法を示唆しており、参考文献４および５は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ベースのアッセイについて教示している。参考文献６および７は、定量的質量分析ベースのアッセイを開発した。これらのアッセイは、総ＨＡを正確に定量することができ、株特異的抗血清に依存しなかったが、免疫学的に活性のＨＡを、不活性ＨＡから鑑別できなかった。ＥＬＩＳＡアッセイは、免疫学的に活性のＨＡを特異的に定量することが可能であったが、ワクチンを出荷しうる前に必要とされる時間を顕著に増大させる、株特異的な抗体の作出に依拠した（参考文献８）。
発明の要旨
本発明は、既存のインフルエンザ効力アッセイに関する問題の源泉の同定を包含する。したがって、本発明は、少なくとも部分的に、ワクチンを作製するためのインフルエンザウイルス抗原を定量するのに使用される従来型の方法が、ワクチン中に免疫原として含まれるインフルエンザウイルスタンパク質の量を正確に測定していないという認識に基づく。本明細書および他の箇所で提示される作業結果は、単離されたインフルエンザウイルスタンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏのイムノアッセイでは、抗原として作用しえるが、ｉｎ ｖｉｖｏでは、免疫応答を誘発する機能的免疫原として作用しえないことを示唆する。その中に含有される機能的な免疫原の正確な量を反映するインフルエンザワクチンを製造しうるように、これらの、機能的かつ構造的に顕著に異なる形態の、インフルエンザタンパク質を鑑別して測定することが火急に必要とされている。この目的のために、本開示の発明者らは、活性の免疫原性コンフォメーションと、不活性対応物との構造的差違を識別するように、生物物理的測定（免疫化学的測定と対比される）に基づくアッセイを開発しようと努めた。この手法の根拠は、ｉ）タンパク質／抗原自体についてのより直接的な評価；ｉｉ）このようなアッセイを実行しうる速度；ｉｉｉ）複数の抗原を伴う試料を同時に処理しうる簡便性；および／または、ｉｖ）対応する抗血清（典型的に、ヒツジ抗血清）の利用可能性への依拠が不要であることを含む。
したがって、本明細書で提供される方法は、ワクチン製造元が、生成物中に含まれるタンパク質の総量だけでなく、どのくらいの量の免疫原性抗原が、それらのそれぞれのワクチン中に含有されているのかを、正確に指し示すことを可能とする。どのくらいの量の免疫原性ＨＡが、ワクチン中に存在するのかを決定することは必要であり、また、どのくらいの量の非機能的なＨＡが、ワクチン中に存在するのかを知ることも望ましく、よりワクチンの純度および効能へと焦点をシフトさせることも一助となるため、これは、公衆衛生上の観点から重要である。
したがって、本発明の目的は、従来型のＳＲＩＤアッセイより迅速なインフルエンザ効力アッセイを提供し、インフルエンザワクチン中で、免疫原として活性であるＨＡの量についての信頼できる評価をさらに提供することである。
本発明はさらに、従来型のＳＲＩＤアッセイを、本明細書で記載される生物学的タンパク質分解の利益、すなわち、ＨＡの免疫原性形態と、ＨＡの低免疫原性形態とを鑑別する能力を利用するように改変した、改良型ＳＲＩＤアッセイも提供する。したがって、本発明の別の態様は、ＳＲＩＤの前に、生物学的タンパク質分解（例えば、トリプシン前処理）のステップを組み込み、これにより、試料中の、免疫学的に活性であるＨＡの量を決定することにおけるアッセイの精度を改善するＳＲＩＤアッセイを提供する。適切な試料は、本明細書で規定される試料でありうる。適切な試料は、例えば、抗原バルク調製物（モノバルクなど）、製造の間および／または最終的な製剤化の後における中間体調製物、出荷の前における最終的なワクチン製剤および／またはワクチン製品、保管の後におけるワクチン製品などから得ることができる。生物学的タンパク質分解による前処理を伴うＳＲＩＤは、本明細書で記載される通り、従来型のＳＲＩＤフォーマットにおいて見られる、免疫学的に活性であるＨＡについての過大評価を有利に回避する。
本明細書で記載される方法は、インフルエンザワクチンの製造の間において、インフルエンザウイルス抗原の量を測定することのほか、品質管理の目的、例えば、持続期間の後、例えば、保管の後における、試料（中間体調製物、バルク調製物、および最終的なワクチン製品を含む）の効力を査定することにも適する。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；
ｂ）前記試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、前記不活性ＨＡが消化され、前記免疫原性ＨＡが消化されないままであるステップと；
ｃ）前記試料中の、前記消化された不活性ＨＡを、前記消化されていない免疫原性ＨＡから分離するステップと；
ｄ）消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、前記消化されていない免疫原性ＨＡを、解析的タンパク質分解に供するステップと；
ｅ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、前記試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップと
を含む方法。
（項目２）
ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；
ｂ）前記試料を、１種または複数種のプロテアーゼにより、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、前記不活性ＨＡが、消化され、前記免疫原性ＨＡが、消化されないままであるステップと；
ｃ）前記不活性ＨＡ由来のペプチドと識別可能な、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、消化されていない免疫原性ＨＡと、消化された不活性ＨＡとの混合物を、１種または複数種のプロテアーゼを使用する解析的タンパク質分解に供するステップであって、前記解析的タンパク質分解が、生物学的タンパク質分解の間に、前記不活性ＨＡ内で切断されうる、１つまたは複数の切断部位において、前記免疫原性ＨＡを切断しえないステップと；
ｄ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、前記試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップと
を含む方法。
（項目３）
試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、
ａ）前記試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；
ｂ）前記試料中の前記免疫原性ＨＡを、他の成分から分離するステップと；
ｃ）前記試料中の前記免疫原性ＨＡを定量するステップと
を含む方法。
（項目４）
前記生物学的タンパク質分解が、プロテアーゼによるタンパク質分解を含む、項目１または３に記載の方法。
（項目５）
前記プロテアーゼが、トリプシンなどのセリンプロテアーゼである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記免疫原性ＨＡを、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）により定量する、項目３から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記免疫原性ＨＡを分離するステップが、タンパク質沈殿を含む、項目１および３から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記タンパク質沈殿が、有機溶媒を添加するステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記有機溶媒が、アセトン、エタノール、またはメタノールである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記沈殿したタンパク質を、アルコール、例えば、エタノールで洗浄するステップを含む、項目７から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記試料が、全ビリオンインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、サブユニットインフルエンザワクチン、および組換えインフルエンザワクチンからなる群から選択される、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記試料が、アジュバント、例えば、水中油エマルジョンアジュバントを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳが、同位体希釈質量分析（ＩＤＭＳ）である、項目１、２、または６から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記標識化基準ＨＡペプチドが、同位体標識を含み、例えば、同位体標識が、１５Ｎおよび１３Ｃからなるリストから選択される、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、
ａ）前記試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；
ｂ）（ａ）からの前記試料中の免疫原性ＨＡの量を、ＳＲＩＤアッセイにより定量するステップと
を含む方法。
（項目１６）
インフルエンザワクチンを製造するための方法であって、
ａ）インフルエンザＨＡを含むバルク調製物に由来する試料を提供するステップと、
ｂ）免疫原性ＨＡの量を、項目１から１５のいずれかに記載の方法に従い定量するステップと、
ｃ）単位剤形を、前記バルク調製物から、前記試料中の免疫原性ＨＡの量に従いパッケージングするステップと
を含む方法。
（項目１７）
インフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
ａ）項目１から１５のいずれか一項に記載の方法により、バルクワクチン中のＨＡの量を定量するステップと；
ｂ）ワクチンを前記バルクから調製するステップと
を含む方法。
図１は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）およびＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｂ）のいずれによっても示される通り、低ｐＨで誘導される融合後ＨＡ１が、トリプシン消化に対して感受性であるのに対し、対照の融合前ＨＡ１は、高プロテアーゼ濃度であってもなお、トリプシンに対して耐性であることを示す図である。
図２は、インフルエンザ効力アッセイについての流れ図を示す図である。
図３は、本発明のアッセイおよびＳＲＩＤにより調べられた、ｐＨ４ストレスを受けた四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）試料からの結果を示す図である。（Ａ）ことなって処理された試料についてのＲＰＬＣクロマトグラム（ピークについての注釈は、標準的なモノバルクの保持時間に基づく）を示す図であり；（Ｂ）本アッセイ（左パネル）およびＳＲＩＤ（右パネル）によるアッセイ結果を示す図である。－／－対照における各株の効力を、１００％として示す。
図４は、本発明のアッセイおよびＳＲＩＤにより調べられた、ｐＨ１１ストレスを受けた四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）試料からの結果を示す図である。（Ａ）異なって処理された試料についてのＲＰＬＣクロマトグラム（ピークについての注釈は、標準的なモノバルクの保持時間に基づく）を示す図であり；（Ｂ）本アッセイ（左パネル）およびＳＲＩＤ（右パネル）によるアッセイ結果を示す図である。－／－対照における各株の効力を、１００％として示す。
図５は、本アッセイおよびＳＲＩＤにより調べられた、熱（５６℃）ストレスを受けた四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）試料からの結果を示す図である。（Ａ）異なって処理された試料についてのＲＰＬＣクロマトグラム（ピークについての注釈は、標準的なモノバルクの保持時間に基づく）を示す図であり；（Ｂ）本アッセイ（左パネル）およびＳＲＩＤ（右パネル）によるアッセイ結果を示す図である。－／－対照における各株の効力を、１００％として示す。
図６は、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ株、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ株について、アセトン沈殿後において回収された免疫原性ＨＡの百分率を示す図である。
図７は、異なる洗浄プロトコール後においても残存する、消化された不活性ＨＡペプチドの百分率について詳述する表を示す図である。試料は、ｉ）アセトンで３回；ｉｉ）アセトンで２回に続く、１回のエタノール洗浄で；またはｉｉｉ）エタノールで３回洗浄した。エタノールで３回にわたる洗浄は、最大量の消化された不活性ＨＡペプチドを除去することにより、最良の結果をもたらした。
図８は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、１μｇの、卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡの、２回にわたる注射による、マウスにおけるトリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の免疫原性を示すグラフを示す図である。（Ａ）Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスおよびシチメンチョウ血液細胞を使用するＨＩ力価を示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じ血清セット内における、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを使用して、ＭＤＣＫ細胞に感染させるマイクロ中和力価を示す図である。
図９は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、ＲＰ－ＨＰＬＣ解析、ＥＬＩＳＡ解析、およびＳＲＩＤ解析を示す図である。（Ａ）非還元試料（左）および還元試料（右）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じ試料セットについての、解析的ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＨＡでプレートをコーティングして実施され、ＳＲＩＤで使用したヒツジポリクローナル抗血清により検出されるＥＬＩＳＡを示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＳＲＩＤゲル画像を示す図である。（Ｅ）ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤによるＨＡ定量についての概要を、マウスにおける免疫原性研究によるＨＩ力価と共に示す図である。 図９は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、ＲＰ－ＨＰＬＣ解析、ＥＬＩＳＡ解析、およびＳＲＩＤ解析を示す図である。（Ａ）非還元試料（左）および還元試料（右）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じ試料セットについての、解析的ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＨＡでプレートをコーティングして実施され、ＳＲＩＤで使用したヒツジポリクローナル抗血清により検出されるＥＬＩＳＡを示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＳＲＩＤゲル画像を示す図である。（Ｅ）ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤによるＨＡ定量についての概要を、マウスにおける免疫原性研究によるＨＩ力価と共に示す図である。 図９は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、ＲＰ－ＨＰＬＣ解析、ＥＬＩＳＡ解析、およびＳＲＩＤ解析を示す図である。（Ａ）非還元試料（左）および還元試料（右）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じ試料セットについての、解析的ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＨＡでプレートをコーティングして実施され、ＳＲＩＤで使用したヒツジポリクローナル抗血清により検出されるＥＬＩＳＡを示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＳＲＩＤゲル画像を示す図である。（Ｅ）ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤによるＨＡ定量についての概要を、マウスにおける免疫原性研究によるＨＩ力価と共に示す図である。 図９は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析、ＲＰ－ＨＰＬＣ解析、ＥＬＩＳＡ解析、およびＳＲＩＤ解析を示す図である。（Ａ）非還元試料（左）および還元試料（右）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じ試料セットについての、解析的ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＨＡでプレートをコーティングして実施され、ＳＲＩＤで使用したヒツジポリクローナル抗血清により検出されるＥＬＩＳＡを示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じ試料セットについての、ＳＲＩＤゲル画像を示す図である。（Ｅ）ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤによるＨＡ定量についての概要を、マウスにおける免疫原性研究によるＨＩ力価と共に示す図である。
図１０は、ｐＨ７．２で維持されるか、または一過性にｐＨ４．０へと曝露された、卵により作製されたＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）ＨＡの均質な試料と、２つの試料の混合物とについての、ＳＲＩＤおよびトリプシン／ＲＰ－ＨＰＬＣ解析を示す図である。（Ａ）ストレスを受けていないＨＡ、低ｐＨストレスを受けたＨＡ、および２倍、１．５倍、１倍、および０．５倍の、低ｐＨストレスを受けたＨＡとスパイクされた、ストレスを受けていないＨＡについてアッセイする、ＳＲＩＤゲルについての画像を示す図である。（Ｂ）（Ａ）におけるＳＲＩＤゲルからのＨＡならびにストレス試料およびこれらの混合物のトリプシン／ＲＰ－ＨＰＬＣアッセイからのＨＡについての相対的定量を示す図である。
図１１は、ｐＨ７．２で維持されるか、もしくは一過性にｐＨ４．０へと曝露されたＨＡ、または２つのＨＡ試料の混合物についての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＲＩＤ解析およびＲＰ－ＨＰＬＣ解析を示す図である。（Ａ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８試料についてのＳＲＩＤ画像を示す図である。（Ｂ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ＨＡ；（Ｃ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ；（Ｄ）Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ；および（Ｅ）Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２ ＨＡについての、ＳＲＩＤおよびＲＰ－ＨＰＬＣによるＨＡ定量を示す図である。 図１１は、ｐＨ７．２で維持されるか、もしくは一過性にｐＨ４．０へと曝露されたＨＡ、または２つのＨＡ試料の混合物についての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＲＩＤ解析およびＲＰ－ＨＰＬＣ解析を示す図である。（Ａ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８試料についてのＳＲＩＤ画像を示す図である。（Ｂ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ＨＡ；（Ｃ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ；（Ｄ）Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ；および（Ｅ）Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２ ＨＡについての、ＳＲＩＤおよびＲＰ－ＨＰＬＣによるＨＡ定量を示す図である。 図１１は、ｐＨ７．２で維持されるか、もしくは一過性にｐＨ４．０へと曝露されたＨＡ、または２つのＨＡ試料の混合物についての、トリプシン消化を伴う場合および伴わない場合の、ＳＲＩＤ解析およびＲＰ－ＨＰＬＣ解析を示す図である。（Ａ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８試料についてのＳＲＩＤ画像を示す図である。（Ｂ）これらの処理に供される、卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ＨＡ；（Ｃ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ；（Ｄ）Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ；および（Ｅ）Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２ ＨＡについての、ＳＲＩＤおよびＲＰ－ＨＰＬＣによるＨＡ定量を示す図である。
図１２は、ＩＲＤｙｅ標識化Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについてのＳＲＩＤ解析の画像を示す図である。（Ａ）各々がＩＲＤｙｅ８００で標識化された、ストレスを受けていないＨＡおよび低ｐＨストレスを受けたＨＡについて、ＳＲＩＤにより解析したことを示す図である。標識化タンパク質は、ＳＲＩＤゲル内で、遠赤外線蛍光イメージングにより追跡した。また、抗Ｈ３抗体による、ＳＲＩＤゲルをブロットするのに使用されるニトロセルロース膜上のウェスタンブロット法により、非標識化ＨＡも検出した。（Ｂ）ストレスを受けていないＨＡを、ＩＲＤｙｅ８００で標識化し、低ｐＨストレスを受けたＨＡを、ＩＲＤｙｅ６８０で標識化したことを示す図である。トリプシン処理を伴う、ならびに伴わない、ストレスを受けていないＨＡ、ストレスを受けたＨＡ、およびストレスを受けていないＨＡとストレスを受けたＨＡとの混合物を、ＳＲＩＤゲル内で、イメージャーの緑色チャネルおよび赤色チャネルを介して検出した。 図１２は、ＩＲＤｙｅ標識化Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについてのＳＲＩＤ解析の画像を示す図である。（Ａ）各々がＩＲＤｙｅ８００で標識化された、ストレスを受けていないＨＡおよび低ｐＨストレスを受けたＨＡについて、ＳＲＩＤにより解析したことを示す図である。標識化タンパク質は、ＳＲＩＤゲル内で、遠赤外線蛍光イメージングにより追跡した。また、抗Ｈ３抗体による、ＳＲＩＤゲルをブロットするのに使用されるニトロセルロース膜上のウェスタンブロット法により、非標識化ＨＡも検出した。（Ｂ）ストレスを受けていないＨＡを、ＩＲＤｙｅ８００で標識化し、低ｐＨストレスを受けたＨＡを、ＩＲＤｙｅ６８０で標識化したことを示す図である。トリプシン処理を伴う、ならびに伴わない、ストレスを受けていないＨＡ、ストレスを受けたＨＡ、およびストレスを受けていないＨＡとストレスを受けたＨＡとの混合物を、ＳＲＩＤゲル内で、イメージャーの緑色チャネルおよび赤色チャネルを介して検出した。
本発明は、迅速であり、より正確であり、抗血清の使用を要請しない、試料中の免疫原性ＨＡを定量するための方法を提供する。本発明に従い、免疫原性ＨＡおよび不活性ＨＡは、タンパク質分解に対するそれらの異なる感受性に反映される、それらの異なるコンフォメーションにより分離することができる。これらの方法は、抗血清に依存せず、生物物理的前処理を利用して、免疫学的に不活性のＨＡ（例えば、低免疫原性コンフォメーション、ストレスを受けたコンフォメーション、または融合後コンフォメーション）を選択的に除去した後で、免疫原性ＨＡの分離および定量が続く。したがって、これらの方法は、標準的なＳＲＩＤアッセイより顕著に迅速であり、さらに、免疫原性ＨＡの量だけを測定するため、より正確でもある。
本発明は、
ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；
ｂ）試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、不活性ＨＡが消化され、免疫原性ＨＡが消化されないままであるステップと；
ｃ）試料中の、消化された不活性ＨＡを、消化されていない免疫原性ＨＡから分離するステップと；
ｄ）消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、消化されていない免疫原性ＨＡを、解析的タンパク質分解に供するステップと；
ｅ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップと
を含む方法を提供する。
さらに、試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、
ａ）試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；
ｂ）試料中の免疫原性ＨＡを、他の成分から分離するステップと；
ｃ）試料中の免疫原性ＨＡを定量するステップと
を含む方法も提供される。
特に好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）を、質量分析、特に、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して実行する。
免疫原性ＨＡの定量は、原理的に、当技術分野で公知である、タンパク質定量のための任意の方法を使用して実施することができる。上記で記載したある特定の実施形態はまた、ＳＲＩＤによる定量とも適合性であろう。
また、本明細書で記載される方法であって、試料中の免疫原性ＨＡを、他の成分から分離するステップ（例えば、試料中の、消化された不活性ＨＡを、消化されていない免疫原性ＨＡから分離するステップ）をなしで済ませる方法も提供される。このような方法は、本明細書で記載される、分離ステップを伴う方法、特に、定量が質量分析を介する方法に対する代替法でありうる。このような方法は、処理ステップまたは操作ステップの数を低減し（例えば、タンパク質沈殿による分離ステップを廃することにより）、試料の喪失を最小化する利点を有する。本発明者らは、異なるプロテアーゼ、または異なる基質特異性を有するプロテアーゼの異なる選択（または基質特異性の選択）を、生物学的タンパク質分解ステップおよび解析的タンパク質分解ステップの各々において使用すれば、試料中の、免疫原性ＨＡの数量を、不活性ＨＡの数量からさらに鑑別しうることを見出した。このような方法では、不活性ＨＡを、生物学的タンパク質分解ステップにおける、１種または複数種のプロテアーゼにより消化して、消化された不活性ＨＡを作製するが、免疫原性ＨＡ（または免疫原性ＨＡの実質的に全て）は、消化されないままである。次いで、消化されていない免疫原性ＨＡと、消化された不活性ＨＡとの混合物を、１種または複数種のプロテアーゼによる解析的タンパク質分解に供する。重要なことは、生物学的タンパク質分解の間に、不活性ＨＡ内で切断されうる、１つまたは複数の切断部位において、免疫原性ＨＡを切断しえないプロテアーゼまたはプロテアーゼの選択を使用して、解析的タンパク質分解を実行することである。このようにして、解析的タンパク質分解は、不活性ＨＡ由来のペプチドと識別可能な、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片をもたらしうる。例えば、消化された免疫原性ＨＡの断片は、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用されたが、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用されなかった、少なくとも１つのプロテアーゼにより切断されうる、少なくとも１つの切断部位を含有する、１つまたは複数の免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む。
したがって、本発明はまた、
ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；
ｂ）試料を、１種または複数種のプロテアーゼにより生物学的タンパク質分解に供するステップであって、不活性ＨＡが消化され、免疫原性ＨＡが消化されないままであるステップと；
ｃ）不活性ＨＡ由来のペプチドと識別可能な、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、消化されていない免疫原性ＨＡと、消化された不活性ＨＡとの混合物を、１種または複数種のプロテアーゼを使用する解析的タンパク質分解に供するステップであって、解析的タンパク質分解が、生物学的タンパク質分解の間に、不活性ＨＡ内で切断されうる、１つまたは複数の切断部位において、免疫原性ＨＡを切断しえないステップと；
ｄ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップと
を含む方法も提供する。
これらの方法についての好ましい実施形態では、１種のプロテアーゼ（例えば、キモトリプシン様プロテアーゼ）を、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用し、異なる基質特異性を有する、異なるプロテアーゼ（例えば、トリプシン様プロテアーゼ）を、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用する。代替的に、１種を超える（例えば、２種の）異なるプロテアーゼを、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用することができ、単一のプロテアーゼを、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用することができる。２種を超える異なるプロテアーゼ（例えば、３種、４種、またはこれを超える）のセットを、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用する場合、より少数の異なるプロテアーゼのセットを、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用することができる。
このような方法は、例えば、第１のプロテアーゼおよび第２のプロテアーゼにより、試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップを伴う場合があり、この場合、第２のプロテアーゼの基質特異性は、第１のプロテアーゼの基質特異性と異なる。次いで、方法は、消化されていない免疫原性ＨＡと、消化された不活性ＨＡとの混合物を、第１のプロテアーゼだけによる解析的タンパク質分解に供するステップを伴いうる。代替的に、第１のプロテアーゼおよび第２のプロテアーゼのいずれの基質特異性とも異なる基質特異性を有する、第３のプロテアーゼを、解析的タンパク質分解において使用することもできる。一部の実施形態では、第１のプロテアーゼおよび第２のプロテアーゼを、生物学的タンパク質分解のために使用するが、この場合、第１のプロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼ（例えば、トリプシン）であり、第２のプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼ（例えば、キモトリプシン）である。
解析的タンパク質分解は、単一のプロテアーゼを使用することができる。特に好ましい実施形態では、解析的タンパク質分解のために使用される単一のプロテアーゼは、トリプシン様プロテアーゼ（例えば、トリプシン）である。
適切なプロテアーゼのさらなる例を下記に示すが、当業者には公知であろう。当業者は、パイロット実験において、本発明における使用のためのプロテアーゼの適切な組合せを、容易に決定することができる。また、免疫原性ＨＡの定量のために使用される、基準／サロゲートＨＡペプチドは、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用されるが、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用されない、少なくとも１つのプロテアーゼにより切断されうる、少なくとも１つの切断部位を含有するＨＡ配列を含むように選択しうることも、当業者により察知されるであろう。例えば、キモトリプシン様プロテアーゼを、生物学的タンパク質分解ステップにおいて使用する（例えば、単独で、またはトリプシンなどのトリプシン様プロテアーゼと共に）が、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用しない場合に、キモトリプシン様プロテアーゼ（例えば、キモトリプシン）により切断されるＨＡ配列を含む、免疫原性ＨＡを定量するために使用されるサロゲートＨＡペプチドを選択することができる。
別の態様では、本発明は、標準的なＳＲＩＤアッセイより正確な、試料中の免疫原性ＨＡを定量するための改良型ＳＲＩＤ法を提供する。上記で例示した通り、免疫原性ＨＡおよび不活性ＨＡは、タンパク質分解に対するそれらの差別できる感受性に反映される、それらの異なるコンフォメーションにより分離することができる。本発明のＳＲＩＤ法は、典型的には抗血清を使用し（すなわち、本発明のＳＲＩＤ法は、抗血清に依存しないわけではなく）、また、生物物理的前処理を利用して、免疫学的に不活性のＨＡ（例えば、低免疫原性コンフォメーション、ストレスを受けたコンフォメーション、または融合後コンフォメーション）の選択的除去を可能とする。本発明のＳＲＩＤ法では、この前処理（生物学的タンパク質分解）の後に、免疫原性ＨＡの定量が続く。
したがって、本発明はさらに、試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、
ａ）試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；
ｂ）（ａ）による試料中の免疫原性ＨＡの量を、ＳＲＩＤアッセイにより定量するステップと
を含む方法も提供する。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）のＳＲＩＤアッセイを、ポリクローナル抗血清（例えば、ヒツジポリクローナル抗血清）および／またはモノクローナル抗体抗血清（例えば、適切なモノクローナル抗体を含む）など、抗血清の使用を伴って実行する。１つまたは複数の適切な抗血清は、株特異的であり、ＨＡ特異的でありうる。したがって、ＳＲＩＤアッセイは、株特異的な抗ＨＡポリクローナル（ヒツジ）抗血清の使用を伴って実行することができる。
本発明はさらに、インフルエンザワクチンを製造するための方法であって、
ａ）インフルエンザＨＡを含むバルク調製物に由来する試料を提供するステップと；
ｂ）免疫原性ＨＡの量を、本発明の方法に従い定量するステップと；
ｃ）単位剤形を、バルク調製物から、試料中の免疫原性ＨＡの量に従いパッケージングするステップと
を含む方法も提供する。
本発明はさらに、インフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
ａ）本発明の方法により、バルクワクチン中のＨＡの量を定量するステップと；
ｂ）ワクチンをバルクから調製するステップと
を含む方法も提供する。
生物学的タンパク質分解および解析的タンパク質分解
インフルエンザウイルス表面ＨＡは、免疫学的に最も関与性の状態である融合前状態では、主にオリゴマー（三量体など）として存在する。多様なストレス条件下で、ＨＡは、良好な免疫応答を誘発しない、融合後状態への不可逆的移行を受ける場合がある。インフルエンザワクチンの調製は結果として、融合後ＨＡの存在をもたらすことが多く、標準的なＳＲＩＤアッセイは、融合前（免疫原性）ＨＡと、融合後（不活性）ＨＡとを識別することができず、したがって、ワクチン中に含有される、実際の免疫原性ＨＡの量についての過大評価を結果としてもたらす。本発明の方法は、免疫原性形態だけを定量するように、生物学的タンパク質分解により、ＨＡのこれらの異なる形態を識別する。
したがって、本明細書で使用される「生物学的タンパク質分解」とは、タンパク質の免疫学的活性形態（例えば、融合前状態にあるＨＡ）は、無傷（すなわち、消化されない）のままであるが、タンパク質の不活性形態（例えば、融合後状態にあるＨＡ）は消化される、酵素ベースのＨＡの消化を指す。したがって、生物学的タンパク質分解のステップは、タンパク質のコンフォメーションに応じて、差別的な消化を達成する。変性ステップを受けていないＨＡタンパク質は、生物学的タンパク質分解に対して耐性である。したがって、本明細書で使用される、生物学的タンパク質分解のステップは、タンパク質の構造的完全性またはコンフォメーションに応じて、制御されたタンパク質の消化または限定的なタンパク質の消化を達成する。
これに対して、本明細書で使用される「解析的タンパク質分解」とは、そのコンフォメーションに関わらず、典型的に、質量分析など、その後の解析的ステップを目的とする、標的タンパク質の断片化（すなわち、消化）を指す。解析的タンパク質分解は、消化の前に、タンパク質を変性させるステップを伴う。
参考文献９では、ＨＡのコンフォメーションはｐＨに応じて変化すること、およびＨＡの一部に形態がプロテアーゼ消化を受けやすいのに対し、ＨＡの他の形態は、プロテアーゼ消化を受けやすくないことが報告された。これは、免疫原性ＨＡの表面上の、十分な充填構造および稠密なグリコシル化外被に帰することができるであろう。本発明者らは、融合前ＨＡが、高プロテアーゼ濃度（ＨＡ：トリプシン＝５：１）であってもなお、その天然状態において、タンパク質分解に対して極めて耐性であることを確認した。これに対し、低ｐＨにより誘導された、融合後ＨＡ１は、天然であってもなお、タンパク質分解に対して極めて感受性であった。
定量の前に、生物学的タンパク質分解のステップを含むことにより、本発明の方法は、免疫原性ＨＡと、不活性ＨＡとの区別を可能とする。特に、免疫原性ＨＡが、プロテアーゼ耐性であるのに対し、不活性ＨＡは、プロテアーゼ感受性である。これは、プロテアーゼを、試料へと添加する場合（例えば、酵素：基質比を１：２０として、トリプシンを添加し、３７℃で２時間にわたりインキュベートする場合）、不活性ＨＡの実質的に全てが消化されるのに対し、免疫原性ＨＡの実質的に全ては、構造的に無傷のままであることを意味する。したがって、生物学的タンパク質分解ステップが、不活性（融合後）ＨＡの実質的に全てを実質的に消化するのに対し、免疫原性（融合前）ＨＡの実質的に全ては、消化されないままである。この点で、免疫原性ＨＡは、プロテアーゼ依存的切断自体に対して、完全に耐性であることが理解されるであろう。特に、ＨＡ０は、ある特定のプロテアーゼ（トリプシンなど）により、ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されうるが、タンパク質が断片へと解離するわけではない。そうではなくて、ＨＡ１およびＨＡ２は、複合体として会合したままであり、これは、同じ構造的完全性（例えば、融合前状態）を維持する。これらのＨＡ１／ＨＡ２複合体は、依然として、免疫原性であると考えられる。切断された融合前ＨＡは、不活性ＨＡの実質的に全てが、プロテアーゼにより、ペプチドへと断片化されるという点で、不活性ＨＡの消化生成物から識別することができる。
タンパク質分解（消化）の文脈における「実質的に」とは、試料中に存在する不活性（融合後）ＨＡのうちの、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が消化されていることを意味する。同様に、免疫原性ＨＡの文脈における「実質的に」とは、免疫原性（融合前）ＨＡのうちの、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、消化されないままであることを意味する。
免疫原性ＨＡは、融合前ＨＡ三量体、融合前ＨＡオリゴマー（例えば、いわゆるロゼット）、またはこれらの組合せの形態にある。不活性ＨＡとは、ＨＡ単量体、融合後ＨＡ三量体、変性タンパク質、凝集タンパク質、またはこれらの組合せである。融合前ＨＡおよび融合後ＨＡの立体配置は、例えば、結晶構造解析など、当技術分野で公知の方法を使用して、同定することができる。
免疫原性ＨＡは一般に、不活性ＨＡと比較して、はるかに高度な免疫応答を誘発し得る。例えば、対象に免疫原性ＨＡを注射することにより得られるＧＭＴは、不活性ＨＡと比較した免疫原性ＨＡについて、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、または少なくとも１６倍高い。したがって、当業者は、本明細書で使用される「不活性ＨＡ」（例えば、ＨＡ融合後形態またはストレス形態）が、免疫原性を完全に欠くことを必ずしも意味するわけではなく、トリプシン耐性である、ＨＡの融合前形態、ストレスを受けていない形態と比較して、低免疫原性であることをたやすく理解するはずである。
生物学的タンパク質分解は、不活性ＨＡを消化しうる、任意のプロテアーゼにより実施することができる。このような酵素は、当技術分野で公知であり、例えば、セリンプロテアーゼ（トリプシンなど）、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含む。例示的なセリンプロテアーゼは、限定せずに述べると、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、およびスブチリシン様プロテアーゼを含む。免疫原性ＨＡおよび不活性ＨＡに対して、異なるタンパク質分解活性は、プロテアーゼが、タンパク質を消化することを物理的に防止する、充填構造と、免疫原性ＨＡの表面上の稠密なグリコシル化外被とに起因するので、これらの酵素の全ては、本発明の方法において働くことが予測される。実際、本発明者らはまた、キモトリプシンが、生物学的タンパク質分解ステップにおいて、不活性（融合後）ＨＡを消化しうることも示した。したがって、生物学的タンパク質分解は、トリプシンおよび／またはキモトリプシンを使用することができる。本発明の方法は、２種、３種、４種、またはこれを超えるプロテアーゼを使用して実施することができる。
当技術分野では、プロテアーゼが、不活性ＨＡを消化しうるのかどうかを決定するための方法が周知である。例えば、当業者は、参考文献９において記載されている方法を使用して不活性ＨＡを用意し、異なるプロテアーゼについて調べて、どのプロテアーゼが不活性ＨＡを消化しうるのかを確立することができる。
不活性ＨＡを消化することが公知のプロテアーゼの群は、セリンプロテアーゼである。これらは、セリンが活性部位において求核性アミノ酸として働くタンパク質内の、ペプチド結合を切断する酵素である。このようなプロテアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける宿主細胞へのインフルエンザウイルス感染に要請され、前駆体であるＨＡ０を、ＨＡ１形態およびＨＡ２形態へと分割し、こうして、インフルエンザウイルスが、膜への融合を推進することを介して、宿主細胞への感染を可能とすることにより機能する。セリンプロテアーゼは、インフルエンザＨＡを消化することが公知であるので、本発明における使用のために好ましい。
インフルエンザＨＡを消化するために最も一般に使用されるセリンプロテアーゼは、トリプシンであり、本発明の方法におけるこのプロテアーゼの使用が特に好ましい。しかし、ＨＡを消化しうる、他のセリンプロテアーゼもまた、使用することができる。このようなプロテアーゼの例は、ＴＭＰＲＳＳ２およびＨＡＴを含む（参考文献１０）。
プロテアーゼは、好ましくは試料へと直接添加する。これは、定量工程を容易とし、試料の操作に起因する、免疫原性ＨＡの量についての、任意の過大評価をさらに回避するため好ましい。しかし、状況によっては、プロテアーゼを添加する前に、試料中の生物学的タンパク質分解のための条件を最適化させることが望ましい場合がある。これは、例えば、試料中の緩衝液が、最適なプロテアーゼ活性を可能としない場合に必要でありうる。これらの実施形態では、試料中の緩衝液を、例えば、透析など、当技術分野において標準的な方法により、交換することができる。また、試料を、さらなる緩衝液で希釈することも可能である。例えば、これは、不正確な定量を結果としてもたらしうるので、緩衝液のｐＨを低下させることにより、さらなる不活性ＨＡが形成される条件を創出しないように、注意を払わなければならないことが理解されるであろう。これが不回避的である場合も、免疫原性ＨＡの相対的喪失を決定し、この量により、定量から得られる結果を補正するように、パイロット実験を実施することにより、本発明の方法を使用して、ＨＡを定量することがやはり可能である。
インフルエンザウイルスを、細胞培養物中で増殖させる場合、インフルエンザウイルスの増殖時に、トリプシンなどのプロテアーゼを、規定通りに添加することができる。インフルエンザワクチンのための作製工程は、精製ステップを含み、インフルエンザウイルスから調製されるインフルエンザワクチン中に存在する残留プロテアーゼは、無視しうる量に過ぎないであろう。誤解を避けるために述べると、生物学的タンパク質分解のステップは、存在しうる残留プロテアーゼに依拠することができず、プロテアーゼを、試料へと添加する必要がある。
当業者は、消化に適する条件を、容易に決定することができる。例えば、本発明の方法は、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０Ｕ／ｍＬのトリプシンなどのプロテアーゼを使用して実施することができる。本発明の方法は、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００Ｕ／ｍＬのトリプシンなどのプロテアーゼを使用して実施することができる。多くのプロテアーゼは、３２℃～４０℃の間、３４℃～３８℃の間または約３７℃の最適の温度を必要とするので、消化は、この温度で実施することができる。消化のための正確な時間は、変動しうるが、反応は一般に、不活性ＨＡの実質的に全てが消化されるまで進行させる。例えば、試料は、プロテアーゼと共に、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１０分間、１２０分間、１３０分間、１４０分間、１５０分間、１６０分間、または１７０分間にわたりインキュベートすることができる。当業者は、消化のために必要とされる時間を、パイロット実験により、容易に決定することができる。
上記で論じた、生物学的タンパク質分解のステップはまた、ワクチン製造工程においても有益でありうる。特に、このようなステップを、ワクチン製造工程に組み入れることが可能であり、これは、不活性ＨＡが、選択的に除去されるので、結果として得られるワクチンが、主に、免疫原性ＨＡを含有するという利点を有する。このような方法は、ワクチンを製剤化する前に、プロテアーゼを除去するように、精製ステップを伴うであろう。
したがって、本発明は、ワクチン中間体を製造するための方法であって、抗原を含むバルク調製物（ＨＡモノバルクなど）を調製するステップを含み、抗原のストレスを受けた形態または不活性形態を消化するように、バルク調製物またはその一部を、生物学的タンパク質分解に供する方法を包含する。その後、結果として得られる中間体を使用して、プロテアーゼに耐性である、抗原の免疫学的活性形態について濃縮されたワクチン製品を製剤化することができる。したがって、本発明は、ワクチン製品を製造するための方法であって、抗原を含むバルク調製物（ＨＡモノバルクなど）を調製するステップと、バルク調製物またはその一部を、生物学的タンパク質分解に供するステップと、生物学的タンパク質分解にかけたバルク調製物またはその一部を使用して、ワクチンを製剤化するステップとを含む方法を含む。抗原は、インフルエンザ抗原でありうる。しかし、本発明は、プロテアーゼ感受性（またはプロテアーゼ耐性）が、目的の生物学的活性（例えば、免疫原性）と相関するように、複数のコンフォメーションで存在しうる、任意の抗原に有用でありうる。一部の実施形態では、ワクチン製品は、免疫学的に活性のコンフォメーションにある抗原のうちの、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および少なくとも９０％を含有する。一部の実施形態では、免疫学的に活性の抗原で濃縮された、このようなワクチン製品は、標準量未満の抗原を含有しうるが、対象において、抗原の免疫学的活性形態で濃縮されていない標準品と比較して、同等であるかまたはこれを超える免疫応答を誘発することが可能である。例えば、投与当たり株当たりのＨＡ １５μｇを伴う標準的なインフルエンザワクチンと比較して、本発明のワクチン製品は、低量の総抗原、例えば、投与当たり株当たりのＨＡ １２μｇ未満、９μｇ未満、７．５μｇ未満、５μｇ未満、３．７５μｇ未満により、同等または良好な効能または有効性を有しうる。
プロテアーゼ消化のステップはまた、抗原調製物中に存在しうる、ある程度の凝集を転導し、これにより、喪失を低減し、調製１回当たりの抗原の収率を増大させる、さらなる利益も提供しうる。
上記で論じた通り、一部の実施形態では、本発明の方法において、１種を超えるプロテアーゼを使用することができる。異なるプロテアーゼ、または異なるプロテアーゼのセットを、本明細書で記載される、生物学的タンパク質分解ステップおよび解析的タンパク質分解ステップの各々において使用することができる。各異なるプロテアーゼは、異なる基質特異性を有しうる。例えば、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、およびスブチリシン様プロテアーゼは、典型的には、互いと異なる基質特異性を有する。プロテアーゼは、一方が、所与の切断部位において、所与のペプチドを切断することが可能であるのに対し、他方は、同一な条件下でそうでない場合に、異なる基質特異性を有すると考えることができる。例えば、トリプシン様プロテアーゼは、典型的には、アミノ酸であるリシンまたはアルギニン（いずれかにプロリンが後続する場合を除き）のカルボキシル側において、ペプチドを切断する。キモトリプシン様プロテアーゼは、典型的には、大型の疎水性アミノ酸（例えば、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン）のカルボキシル側において、ペプチドを切断する。エラスターゼ様プロテアーゼは、典型的には、小型の疎水性アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、およびバリン）のカルボキシル側において、ペプチドを切断する。
定量が質量分析を介する、ある特定の実施形態では、１種を超える異なるプロテアーゼを、解析的タンパク質分解ステップにおいて使用することができる。本明細書で記載される通り、解析的タンパク質分解に、分離ステップを先行させることができる。本明細書で記載される代替的実施形態では、分離ステップは、なしで済ませることができる。いずれの場合にも、解析的タンパク質分解は、異なる基質特異性を有する１種を超える異なるプロテアーゼ（すなわち、異なる切断部位）を使用することができる。解析的タンパク質分解段階における、１種を超える異なるプロテアーゼの使用は、少数の異なるプロテアーゼを使用する場合に作製される、免疫原性ＨＡ由来のペプチドより短い、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片をもたらしうる。したがって、定量のために、短い基準／サロゲートペプチドを使用し、これにより、定量される免疫原性ＨＡ内で保存される配列を有する基準ペプチドを選び出すのに、大きな自由度をもたらしうると有利でありうる。この技法はまた、修飾（例えば、定量結果に、望ましくない形で影響を及ぼしうる、化学修飾または翻訳後修飾）を受けやすいアミノ酸を含有しない、基準ペプチドの利用可能性を増大させるのにも使用することができる。解析的タンパク質分解に、分離ステップを先行させる、一部の好ましい実施形態では、生物学的タンパク質分解は、１つのプロテアーゼ（例えば、トリプシンなどのトリプシン様プロテアーゼ）を使用し、解析的タンパク質分解は、生物学的タンパク質分解で使用される、同じ型のプロテアーゼと、異なる基質特異性を有する、１種または複数種の異なるプロテアーゼ（例えば、キモトリプシンなどのキモトリプシン様プロテアーゼ）とを使用する。
分離
消化の後、消化されていない免疫原性ＨＡを、試料中の他の成分から分離することが好ましい。特に、消化されていない免疫原性ＨＡを、消化された不活性ＨＡから分離することが、非常に望ましい。これは、下流における定量を容易とするために有利である。特に、免疫原性ＨＡを、消化された不活性ＨＡから分離することは、質量分析などの方法を介する、免疫原性ＨＡの定量を可能とする。
しかしながら、上記で論じた通り、本発明の一部の実施形態では、例えば、解析的タンパク質分解が、不活性ＨＡ由来のペプチドと識別可能な、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片をもたらす場合、分離ステップを、なしで済ませることができる。
当技術分野では、試料中の免疫原性ＨＡを、他の成分から分離するための方法が周知であり、例えば、逆相クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む。
これらの先行技術による分離法は、本発明の一部の実施形態（特に、免疫原性ＨＡを定量するのに、質量分析に依拠しない実施形態）における使用に適するが、本発明者らは、逆相クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーを使用する初期の試みが、多数の理由：１）いずれのクロマトグラフィーも、最適のベースライン分解能を達成することが可能でなかったこと；２）カラム上の実質的な試料喪失が観察されたこと；３）分画の回収時において、顕著な変異の導入；４）分画の回収、緩衝液の交換、および容量の低減と関連する、多大な労力およびアッセイスループットの低下のために、満足のゆくものではないことを見出した。
したがって、試料中の免疫原性ＨＡは、タンパク質沈殿により、試料中の他の成分（特に、消化された不活性ＨＡ）から分離することが好ましい。この手法の利点は、試料喪失を最小化する、同じチューブによる試料調製／処理；アーチファクト導入の低減；および下流における試料調製のために、回収されたタンパク質ペレットを、所望容量の適合性緩衝液中に再懸濁させることの簡便さを含む。本発明者らは、タンパク質沈殿が、試料中の免疫原性ＨＡのほぼ１００％を、一貫して回収することを見出した。
当技術分野では、タンパク質を沈殿させるための多様な方法が公知である。これらは、塩析、等電点沈殿、有機溶媒、非イオン性親水性ポリマーによる沈殿、および高分子電解質による軟凝集を含む。したがって、一部の実施形態では、分離するステップは、消化された不活性ＨＡ断片を、無傷の、消化されていない免疫原性ＨＡを保持する試料から除去することを含む。
本発明者らは、有機溶媒、特に、アセトンに関して、良好な結果を認めており、これらは、試料からの、免疫原性ＨＡの、ほぼ１００％の回収を結果としてもたらした。好ましい実施形態では、（消化されていない）免疫原性ＨＡを分離するステップは、有機溶媒、特に、ケトンまたはアルコールを添加するステップを含む。有機溶媒は、アセトン、エタノール、またはメタノールでありうる。本発明の方法はさらに、沈殿したタンパク質を、アルコールで洗浄するステップも含みうる。添加されたアルコールは、温度が４℃未満でありうる。アルコールは、好ましくはエタノールである。本発明者らは、このステップが、不活性ＨＡに由来する消化されたペプチドの完全な除去に影響を与えることを見出した。次いで、沈殿物を、例えば、通気乾燥または真空遠心分離により乾燥させることができる。
タンパク質沈殿の後、沈殿したタンパク質を再懸濁させる。これは、例えば、強い変性グアニジン緩衝液など、強い変性条件を導入する緩衝液を添加することにより達成することができる。試料をさらに加熱して、タンパク質の再懸濁を容易とすることもできる。当技術分野では、このような方法が標準的であり、したがって、当業者は、それらを容易に実施することができる。
免疫原性インフルエンザＨＡを定量するステップが、ＳＲＩＤアッセイを使用する、下記の実施例において示される通り、ＳＲＩＤアッセイ自体、免疫原性ＨＡの、試料中の他の成分（例えば、不活性ＨＡ）からの分離を可能としうる。
定量
免疫原性ＨＡの定量は、原理的に、当技術分野で公知である、タンパク質定量のための任意の方法を使用して実施することができる。例えば、本発明の方法は、上記で記載した通り、不活性ＨＡを消化するステップとしてのＳＲＩＤによる定量と適合性であり、試料中の免疫原性ＨＡの量の、より正確な決定を可能とするであろう。したがって、本発明の方法では、免疫原性ＨＡを定量するステップは、ＳＲＩＤの使用を含みうる。しかし、上記で言及した通り、ＳＲＩＤは、作製するのに数週間または数カ月間までも要する、株特異的抗血清の使用に依拠する欠点を有する。したがって、免疫原性ＨＡを定量するステップは、ＳＲＩＤの使用を含まないことが好ましい。
したがって、本発明は、好ましくは株特異的抗血清の使用を要請しない定量方法を活用する。このような方法は、毎シーズンの基準抗原の調製および較正を要請しないので、インフルエンザワクチン作製の現時点でのボトルネックを回避する。このような方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー法を含むが、また、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）および液体クロマトグラフィー－質量分析／質量分析（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）などの質量分析法、ならびに二次元ゲル電気泳動（２－ＤＥ）も含む。
ＲＰ－ＨＰＬＣ
ＲＰ－ＨＰＬＣとは、液体（溶媒などの移動相）を、クロマトグラフィーカラム（固定相）へと適用し、固定相と、試料中に存在する成分との相互作用に応じて、カラム上の保持を伴う、クロマトグラフィーの形態である。ポンプが、カラムを通して液体相を移動させ、条件を変化させると、異なる時点において、カラムから、異なる分子を溶出させることができる。ＲＰ－ＨＰＬＣは、非極性の固定相と、水性で中程度に極性の移動相とを有する。ＲＰ ＨＰＬＣの保持時間は一般に、移動相中の水の比率を増大させること（これにより、疎水性解析物の、疎水性固定相に対するアフィニティーを、今現在、より親水性の移動相と比べて強くすること）により増大させることができるが；逆に、非極性であるかまたは極性の小さな有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリル）の比率を増大させることにより減少させることもできる。
ＲＰ－ＨＰＬＣカラムおよび溶出条件は、ＨＡ１を、これらの他のタンパク質から分解しうるように選択する。ＲＰ－ＨＰＬＣがこの分解を達成する能力は、例えば、参考文献１１から、既に公知である。
多様な形態のＲＰ－ＨＰＬＣが利用可能である。ＲＰ－ＨＰＬＣを使用する場合、小孔サイズを４０００Åとする、１０μｍのポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）粒子によるカラム上で実施しうると簡便であるが、他の支持材料（例えば、シリカ内のシラノール基へと共有結合させた、オクタデシル、デシル、またはブチルによる、ｎアルキル疎水性鎖など、他の疎水性ポリマー）、粒子サイズ（例えば、３～５０μｍ）、および小孔サイズ（例えば、２５０～５０００Åの間）も、使用することができ、共重合化時またはβ－誘導体化（例えば、スルホアシル化）時における、ＰＳおよびＤＶＢの比を変化させることにより、ＰＳＤＶＢの特性を変化させることもできる。適切なＲＰ－ＨＰＬＣ支持体は、ＨＡを保持し、溶出させ、試料中に存在する他の材料から分離するそれらの能力に基づき、たやすく選択することができる。２つの小孔クラスを有するビーズによる支持体を使用することができ、対流が、粒子自身を通して生じることを可能とし、試料分子を、内側の短い「拡散性」小孔へと迅速に移動させる、大型の「スルーポア」も使用することができる。この小孔配置は、拡散が生じる必要がある距離を短縮し、試料分子が、結合性部位と相互作用するのに要請される時間を短縮する。したがって、拡散は、無制限であることが可能であり、分解能または容量を損なわずに、流量も増大させることができる（例えば、１０００～５０００ｃｍ／時）。
例えば、アセトニトリル勾配を使用して、多様な溶出緩衝液を使用することができる。例えば、０．１～５ｍｌ／の間（例えば、０．５～１．５ｍｌ／分の間、または約０．８ｍｌ／分）の適切な流量を、たやすく選択することができる。溶出は、室温でも行いうるが、５０℃～７０℃の範囲内、例えば、５５℃～６５℃の間、または約６０℃における溶出が好都合である。
ＲＰ－ＨＰＬＣ溶出物は、試料中の任意のＨＡを検出するように、モニタリングすることができる（例えば、約２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度、または約２９０ｎｍにおける励起波長および約３３５ｎｍにおける発光波長を使用する内在的蛍光）。ＨＰＬＣ溶出クロマトグラム上のＨＡピーク下面積を使用して、ＨＡを定量することができる。次いで、既知の容量の試料を使用することにより、これらの方法により決定されるＨＡの量を使用して、そこから試料を採取した、元の材料中のＨＡ濃度、例えば、バルク抗原調製物中、または個別のワクチン用量中のＨＡ濃度を計算することができる。個別の株の、潜在的なピークの重複のために、この測定法は、多価ワクチン調製物ではなく、一価ワクチン調製物を測定するための、最も信頼できる方法である。
質量分析
本発明に従いＨＡを定量するための、最も好ましい方法は、質量分析（ＭＳ）、特に、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ ＥＳＩ－ＭＳ）などの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）法である。
ＬＣ－ＭＳを使用する顕著な利点は、試料中のタンパク質の特異的な定量を可能とすることである。さらに、ＬＣ－ＭＳは、同時の複数のインフルエンザ株に由来するＨＡの同時的測定も可能とする。これは、各ＨＡを個別に解析する必要を回避するので、多価インフルエンザワクチンを解析する場合に、特に、有利である。方法は、従来型のＳＲＩＤアッセイに干渉しうる、ＭＦ５９など、アジュバントの存在と適合性であるという、さらなる利点も有する。
当技術分野では、タンパク質を、質量分析により定量するための方法が周知であり、例えば、参考文献１２において記載されている。これらの方法は一般に、定量されるタンパク質のペプチドをもたらす、変性させた試料のプロテアーゼ消化の初期ステップを伴う。次いで、これらのペプチドを通例、クロマトグラフィーにより分離し、次いで、ＭＳにより解析する。
解析的タンパク質分解の初期ステップは、エンドプロテアーゼを使用して実施することができる。適切なエンドプロテアーゼは、参考文献１３において記載されており、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、テルモリシン、エラスターゼ、パパイン、プロテイナーゼＫ、スブチリシン、クロストリパイン、エクソペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、またはカルボキシペプチダーゼＹ、カテプシンＣ、アシルアミノ酸放出酵素、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、またはこれらの組合せを含む。
免疫原性ＨＡは、典型的にはＨＡを変性させる水溶液中で消化する。水溶液は、無機酸または有機酸を含みうる。無機酸は、グアニジン塩酸塩、硝酸、リン酸、硫酸、塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。有機酸を使用する場合、これは、シュウ酸、マロン酸、酒石酸、酢酸、ギ酸、乳酸、プロピオン酸、フタル酸、安息香酸、クエン酸、コハク酸、これらの塩、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。その主要な目的は、タンパク質を変性させて、消化を容易とすることであるので、酸の正確な性質は重要ではない。
本発明の方法が、タンパク質沈殿のステップを伴う場合、沈殿したタンパク質は、解析的タンパク質分解のために使用される緩衝液へと、直接再懸濁させることができる。代替的に、沈殿したタンパク質は、異なる緩衝液へと再懸濁させ、さらなる成分（無機酸または有機酸など）を、再懸濁させたタンパク質へと、後で添加することもできる。
消化の後、反応は、例えば、トリフルオロ酢酸など、公知のクエンチング剤を使用して、クエンチングすることができる。
得られたペプチドを、ＭＳにより解析する前に、標識化サロゲートペプチドを、反応混合物へと添加することができる。これらのサロゲートペプチドの使用は、対照実験を並行して試行する必要がないので、免疫原性ＨＡの定量を容易とする利点を有する。したがって、サロゲートペプチドは、目的の断片が定量の目的のために比較される、基準ペプチド（すなわち、対照）として使用することができる。典型的には、サロゲートペプチドは、所定のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドである。それが容易に検出されうるように、任意の適切なサロゲートペプチドを、その質量の公知のシフトを示す基準として使用することができる。例えば、サロゲートペプチドは、コアのアミノ酸の連なりに加えて質量が既知である、１つまたは複数の化学的部分を含みうる。一部の実施形態では、サロゲートペプチドは、それらが、それらの天然の対応物と比較して、わずかに異なる質量を有するように、１つまたは複数の修飾アミノ酸を含有しうる。一部の実施形態では、サロゲートペプチドは、同位体により標識化することができる。好ましくは、同位体標識は、１５Ｎおよび１３Ｃからなるリストから選択される。
当技術分野では、サロゲートペプチドを調製するための方法が周知である。これらのサロゲートペプチドは、好ましくは、それらが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）上で、良好な保持時間を有し、ＥＳＩ上で許容可能なイオン化効率を有し、潜在的な翻訳後修飾（Ｎ結合型グリカンおよびメチオニンなど）を含まないように選び出す。
１種を超えるインフルエンザ抗原の数量を評価する場合、いくつかの株特異的なサロゲートペプチドを添加することができる。例えば、試料が、ｎ個のインフルエンザ株由来の抗原を含む場合、ｎ種類の株特異的サロゲートペプチドを添加することができる。株特異的サロゲートペプチドの数はまた、試料中の異なる株に由来する抗原の数とも異なる。例えば、当業者は、四価試料中の２つの抗原だけを解析しようと望むことができる。
サロゲートペプチドに適する標識は、フッ素、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎグリーンなどの蛍光標識、または当技術分野で公知の他の標識である、放射性標識、質量標識を含む（参考文献１３）。検量線は、任意選択で使用され、少なくとも１つの免疫原性抗原断片ペプチドの既知量と、比との数学的関係であって、比が、少なくとも１つのペプチドの既知量と、少なくとも１つの標準ペプチドの一定量との割合である数学的関係を表す。
試料は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に続いて、質量分析（ＭＳ）ステップを使用して解析することができる。当業者には、適切なＬＣ法が公知であり、高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）、超高速ＬＣ（ＵＰＬＣ）、および標準カラム、またはスラブゲルクロマトグラフィー法を含む。好ましくは、ペプチドは、ＵＰＬＣを使用して分離する。
クロマトグラフィーの後、質量分析を使用して、ペプチドを検出することができる。これは、目的のペプチドの特異的な検出を可能とし、したがって、より正確な定量をもたらす利点を有する。特に、クロマトグラフィーカラムからの溶出物は、夾雑物を含有することが多く、ＭＳステップを追加することは、これらの夾雑物に起因する、試料中の免疫原性ＨＡの過剰定量を回避する。
本発明の方法は、任意のＭＳ法を使用して実施することができる。適切な検出システムおよび定量システムは、エレクトロスプレー、マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間（ＴＯＦ）、多段四重極、および当技術分野で公知の、他の種類の質量分析システムを含む。例示的に述べると、Ｗａｔｅｒｓ，Ｃｏｒｐ．から入手可能な、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－Ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＴＯＦ四重極タンデム質量分析計またはＡＰＩ ４０００－Ｑ ｔｒａｐ三段四重極タンデム質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は各々、本発明における使用に適する。
特に、本発明に従う免疫原性ＨＡを定量するのに好ましい方法は、液体クロマトグラフィー選択反応モニタリング（ＬＣ－ＳＲＭ）アッセイである（参考文献１４）。
改変型一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイ
上記で記載した通り、抗原試料のプロテアーゼ消化は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）など、そうしなければ、コンフォメーション的に感受性でない生物物理的定量方法を使用して、プロテアーゼに耐性である、免疫学的に活性の抗原を特異的に定量しうるように、抗原の不活性形態を選択的に分解する（また、下記の実施例も参照されたい）。プロテアーゼを使用して、望ましくない形態の抗原を選択的に分解しうるという認識に部分的に基づき、別の態様における本発明は、精度の改善を達成する「改変型」ＳＲＩＤアッセイを提供する。
本発明のこの態様に従い、生物学的タンパク質分解（例えば、プロテアーゼ消化）を、他の点では標準的なＳＲＩＤプロトコールへと組み込み、より正確なアッセイ結果を達成することができうる。下記の実施例で詳述する通り、トリプシン消化は、免疫学的に不活性である融合後ＨＡと混合された場合の、免疫学的に活性である融合前ＨＡを定量しうるように、ＳＲＩＤの特異性を改善しうる。本分野において、依然として標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイであるＳＲＩＤアッセイは、免疫学的に活性のＨＡを特異的に検出すると考えられている。実施例で裏付けられる通り、コンフォメーション的に均質なＨＡ調製物については、ＳＲＩＤアッセイを使用して、マウスにおいて、インフルエンザを中和し、血球凝集を阻害する抗体を誘発する、天然の融合前ＨＡを特異的に検出することができるが、ブロッティングステップ時にＳＲＩＤゲルから選択的に除去され、免疫学的にも活性ではなかった、低ｐＨストレスを受けた融合後ＨＡは検出しない。驚くべきことに、本明細書で開示される作業結果は、この選択的検出が、ＳＲＩＤフォーマット自体に起因するものであり、ＥＬＩＳＡフォーマットで使用される場合、同じ抗血清が、ストレスを受けていないＨＡと、低ｐＨストレスを受けたＨＡとを同様に検出しうるので、ＳＲＩＤにおいて使用されるヒツジ抗血清のコンフォメーション特異性に起因するわけではないことを明らかにした。しかし、低ｐＨストレスを受けたＨＡを、ストレスを受けていないＨＡと混合すると、ＳＲＩＤは、いずれの形態も検出することが可能であり、免疫学的に活性のＨＡについての過剰定量をもたらす。
したがって、本発明は、改良型ＳＲＩＤアッセイへと招来される方法および中間体を提供する。したがって、本発明は、ＳＲＩＤによりＨＡを定量する前に、ＨＡを含有する試料を、生物学的タンパク質分解（例えば、トリプシン消化）に供するステップを含む方法を含む。本発明は、ＳＲＩＤアッセイを実行する（例えば、試料中の免疫原性ＨＡを定量するために）ときに、生物学的タンパク質分解（本明細書で規定される）にかけられている試料の使用をさらに含む。
試料
試料は通例、インフルエンザワクチンまたはワクチンのバルク抗原調製物である。これは、バルクワクチンから得られた試料の場合もあり、ワクチンの単位用量の場合もあるが、定量は、最大ＨＡ用量（季節性インフルエンザワクチンの成人用量では、株当たり、通例１５μｇ）が、ワクチンの投与容量（通例０．５ｍＬ）中に存在することを確実にするのに使用されるので、方法は通例、バルクワクチンに対して実施される。
本発明の方法は、バルクワクチンに対して実施することもでき、最終的なワクチンに対して実施することもできる。本発明の方法はまた、作製工程中に見出される中間生成物に対して実施することもできる。
最終的なワクチンに対する試験を実施して、正確な免疫原性ＨＡの量が存在することを確実にすることができる。本発明の方法はまた、適正な免疫原性ＨＡの量を、最終的なワクチンへと添加することを確実にするように、バルクワクチンに対して実施することもできる。バルクまたはワクチンは、一価でありうる。バルクまたはワクチンはまた、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのモノバルクを混合した後において、多価でもありうる。季節性インフルエンザワクチンは典型的に、三価または四価であるので、多価バルクまたはワクチンは通例、三価または四価であろう。本発明の方法は、バルクまたはワクチンの滅菌濾過の前に実施することもでき、滅菌濾過の後で実施することもできる。本発明の方法はさらに、アジュバント添加の前に実施することもでき、アジュバント添加の後で実施することもできる。試料がワクチンである場合、方法は、パッケージングの前に実施することもでき、パッケージングの後で実施することもできる。
また、本発明の方法を、保管されたバルクワクチン（一価または多価）またはワクチンに対して実施することも有用でありうる。バルクまたはワクチンは、１０℃を下回る温度（例えば、４℃）または０℃を下回る温度（例えば、－２０℃）で、例えば、１週間を超える、２週間を超える、３週間を超える、４週間を超える期間などにわたり保管されている場合がある。保管は、免疫原性状態ＨＡから、不活性ＨＡへのＨＡのコンフォメーション変化を結果としてもたらす可能性がある。本発明の方法を、保管された試料に対して実施することにより、正確な免疫原性ＨＡの量が、最終的なワクチン中に見出されることを確実にすることができる。本発明の方法はまた、試料の保管寿命を評価することも可能とする。特に、試料を保管することができ、どの時点において、免疫原性ＨＡの量が降下するのかを評価するように、試料の画分を、いくつかの時点において、本発明の方法を使用して、免疫原性ＨＡの量について調べることができる。試料の安定性が大きいほど、免疫原性ＨＡの量が顕著に減少するのに要する期間は長い。これに要する期間が長い試料は、安定性が大きいと考えられるであろう。
多様な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり、ワクチンは一般に、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオンに基づく場合もあり、スプリットビリオンに基づく場合もあり、精製表面抗原に基づく場合もある。インフルエンザ抗原はまた、ウィロソームの形態で提示することもでき、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞系）内で発現させることもでき、精製形態で使用することができる（参考文献１５）。本発明は、これらのワクチン型のうちのいずれと共に使用することもできるが、典型的には不活化ワクチンと共に使用するであろう。
抗原は、全弱毒化ウイルスの形態を取る場合もあり、不活化ウイルスの形態を取る場合もある。ウイルスを不活化させるための化学的手段は、有効量の、以下の薬剤：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ペルオキシド、ホルマリン、ベータプロピオラクトン、またはＵＶ光のうちの１つまたは複数などの不活化剤による処理を含む。ベータ－プロピオラクトンは、調製物から容易に除去しうるという利点を有し、したがって、この薬剤が好ましい。不活化のための、さらなる化学的手段は、メチレンブルー、ソラーレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはこれらのうちのいずれかの組合せによる処理を含む。当技術分野では、例えば、二元エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線照射など、他のウイルス性不活化方法も公知である。ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）剤は、全ビリオン不活化ワクチンである。
不活化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原（ヘマグルチニンを含み、通例、ノイラミニダーゼもまた含む）を含みうる。
ビリオンは、ウイルスを含有する流体から、多様な方法で採取することができる。例えば、精製工程は、ビリオンを破壊するように洗浄剤を含む、直線スクロース勾配溶液を使用する、ゾーン遠心分離を伴いうる。次いで、任意選択の希釈の後、抗原を、透析濾過により精製することができる。
スプリットビリオンは、ビリオン内調製物を作製するように、「Ｔｗｅｅｎ－エーテル」スプリッティング工程を含む、ビリオンの、洗浄剤または溶媒（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ－Ｎ－ブチルリン酸、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなど）による処理により得られる。当技術分野では、インフルエンザウイルスをスプリッティングする方法が周知である（例えば、参考文献１６～２１などを参照されたい）。ウイルスのスプリッティングは、典型的には、感染性であれ、非感染性であれ、全ウイルスを破壊濃度のスプリッティング剤で破壊または断片化することにより実行される。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化、ウイルスの完全性の変更を結果としてもたらす。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン（betain）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジアルキル－グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ－ポリエトキシエタノール、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ－Ｎ－ブチルリン酸、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ－ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン（ethlene）エステルなどである。１つの有用なスプリッティング手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続効果を使用し、スプリッティングは、初期ビリオン精製（例えば、スクロース密度勾配溶液中の）時に生じうる。スプリットビリオンは、ナトリウムリン酸緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁させると有用でありうる。ＡＦＬＵＲＩＡ（商標）剤、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）剤、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）剤、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）剤、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）剤は、スプリットワクチンである。
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原であるＨＡを含み、また、典型的には、ノイラミニダーゼも含む。当技術分野では、これらのタンパク質を、精製形態で調製するための工程が周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）剤、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）剤、ＦＬＵＡＤ（商標）剤、ＦＬＵＣＥＬＶＡＸ（商標）剤、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）剤は、サブユニットワクチンである。
インフルエンザ抗原はまた、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）剤およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）剤における通り、ウィロソームの形態で提示することもできる（参考文献２２）（核酸非含有ウイルス様リポソーム粒子）。
本発明はまた、組換えインフルエンザワクチンと共に使用することもできる。このようなワクチンの例は、Ｆｌｕｂｌｏｋ（商標）である。
インフルエンザウイルスは、弱毒化させることができる。インフルエンザウイルスは、温度感受性でありうる。インフルエンザウイルスは、低温適応させることができる。これらの３つの可能性は特に、生ウイルスに当てはまる。
ワクチンにおける使用のためのインフルエンザウイルス株は、シーズンごとに変化する。本汎発間期では、ワクチンは、典型的には２つのＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と、１つまたは２つのＢ型インフルエンザ株とを含み、三価ワクチンまたは四価ワクチンが典型的である。本発明は、これらのワクチンと共に使用することができる。本発明はまた、Ｈ２亜型株、Ｈ５亜型株、Ｈ７亜型株、またはＨ９亜型株（特に、Ａ型インフルエンザウイルスの）など、汎発性株（すなわち、ワクチンレシピエント５および一般のヒト集団が、免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスにも有用であり、汎発性株のためのインフルエンザワクチンは、一価の場合もあり、汎発性株により補完された、通常の三価ワクチンに基づく場合もある。しかし、シーズンおよびワクチン中に含まれる抗原の性質に応じて、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン亜型である、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のうちの１つまたは複数に対して防御するワクチンと共に使用することもできる。本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスＮＡ亜型である、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９のうちの１つまたは複数に対して防御するワクチンと共に使用することもできる。
ワクチン組成物中に有用に組入れうる他の株は、耐性汎発性株（参考文献２４）を含む、抗ウイルス治療に対して耐性（例えば、オセルタミビル（参考文献２３）および／またはザナミビルに対して耐性）の株である。
上記で論じた通り、ＨＡは、天然の安定性の限界またはワクチンを作製する場合に必要な製造ステップ（不活化など）に起因して、ワクチン作製工程中に、融合後状態への移行を受ける可能性がある。本発明は、試料中のＨＡのうちの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％；少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、活性／免疫原性（融合前）形態にあり、かつ／また試料中のＨＡのうちの２０％、１５％、１０％、５％または１％未満が、不活性（融合後）形態にある試料について実施することができる。試料中の活性ＨＡの、不活性ＨＡに対する比は、少なくとも４：１、１０：１、２０：１、５０：１または１００：１でありうる。
一般に、インフルエンザワクチンの標準的な成人用量は、株当たりの抗原０．５ｍＬ当たりのＨＡ １５μｇを要請するので、試料は、株当たり３０μｇ／ｍＬと同等であるかまたはこれを超える活性ＨＡを含有することが有用である。ＨＡ濃度を、株当たり≧３０μｇ／ｍＬの活性ＨＡとする試料を有することは、ヒト用量をもたらすのに、抗原を濃縮する必要がないので、ワクチン作製工程を容易とする。濃度を、株当たり３０μｇ／ｍＬ未満の活性ＨＡ、例えば、株当たり少なくとも２５μｇ／ｍＬの活性ＨＡ、株当たり２０μｇ／ｍＬの活性ＨＡ、株当たり少なくとも１５μｇ／ｍＬの活性ＨＡ、株当たり少なくとも１０μｇ／ｍＬの活性ＨＡなどとする試料もまた、使用することができる。この場合、最終的なワクチンは、投与当たり１５μｇの最終ＨＡ量に対応する投与容量より大きな投与容量を有する可能性があり、当技術分野における標準的な方法を使用して、抗原を濃縮する場合もあり、最終的なワクチンが、低ＨＡ量を含有する場合もある。低ＨＡ量は、汎発性インフルエンザワクチンに使用することができ、例えば、この場合、ワクチンをアジュバント処理することができる。試料は、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、または０．２５μｇ未満の不活性ＨＡを含有しうる。
最終ワクチン製品は、投与当たり株当たり１５μｇを超えない総ＨＡ、例えば、株当たり１４μｇを超えない、１３μｇを超えない、１２μｇを超えない、１１μｇを超えない、１０μｇを超えない、９μｇを超えない、８μｇを超えない、７μｇを超えない、６μｇを超えない、５μｇを超えない総ＨＡを含有しうる。一部の実施形態では、このような製品中の総ＨＡである抗原のうちの少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％は、免疫原性形態にある。一部の実施形態では、最終ワクチン製品中に含有される総ＨＡのうちの５０％を超えないＨＡ、例えば、総ＨＡのうちの４０％を超えない、３０％を超えない、２０％を超えない、１０％を超えないＨＡは、トリプシン感受性形態にある。
抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵上で増殖させることもでき、細胞培養物上で増殖させることもできる。インフルエンザウイルスを増殖させるための、現行の標準的な方法は、特定病原体非含有でありうる孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、卵内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、より近年になって、速度および患者アレルギーの理由で、ウイルスは、動物細胞培養物中で増殖させており、この増殖法が好ましい。卵ベースのウイルスの増殖を使用する場合、１つまたは複数のアミノ酸および／またはステロイドを、ウイルスと併せて、卵の尿膜腔液へと導入する場合がある（参考文献２５）。
細胞培養物を使用する場合、ウイルス増殖基質は、典型的には哺乳動物由来の細胞系などの真核細胞であろう。適切な哺乳動物細胞は、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長動物（ヒトおよびサルを含む）細胞、およびイヌ細胞を含むがこれらに限定されない。線維芽細胞および上皮細胞など、多様な細胞型を使用することができる。適切な細胞型の非限定的な例は、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などを含む。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系などの、腎臓細胞などのアフリカングリーンモンキー細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系などの、腎臓細胞である。したがって、適切な細胞系は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ－５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ－３８などを含むがこれらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるのに好ましい哺乳動物細胞系は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞（参考文献２６～２９）；アフリカングリーンモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞（参考文献３０～３２）；またはヒト胎児性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞（参考文献３３）を含む。これらの細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション（参考文献３４）、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（参考文献３５）、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、型番ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６、およびＣＲＬ－１５８７下で、異なる多様なＶｅｒｏ細胞を供給しており、型番ＣＣＬ ３４下で、ＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、受託番号９６０２２９４０下で、ＥＣＡＣＣから入手可能である。
インフルエンザウイルスはまた、鳥類胚性幹細胞（参考文献３６および３９）およびアヒル（例えば、アヒル網膜）または雌ニワトリに由来する細胞系を含む鳥類細胞系（例えば、参考文献３６～３８）上で増殖させることもできる。適切な鳥類胚性幹細胞は、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系である、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４－０７４を含む（参考文献４０）。また、ニワトリ胎仔線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用することができる。最も好ましい鳥類細胞系は、アヒル胚性幹細胞に由来する、ＥＢ６６細胞系である。この細胞系は、インフルエンザ抗原を作製するために良好に働くことが報告されている（参考文献４１）。
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、ＭＤＣＫ細胞である。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＣＣＬ ３４として、ＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞系の派生細胞もまた、使用することができる。例えば、参考文献２６は、浮遊培養物中の増殖に適応したＭＤＣＫ細胞系（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として受託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）について開示している。同様に、参考文献４２は、無血清培養物中の浮遊状態で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞系（ＦＥＲＭ ＢＰ－７４４９として受託された「Ｂ－７０２」）について開示している。参考文献４３は、「ＭＤＣＫ－Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５００）、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５０１）、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５０２）、および「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０３」（ＰＴＡ－６５０３）を含む非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞について開示している。参考文献４４は、「ＭＤＣＫ.５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）を含む、感染への感受性が高いＭＤＣＫ細胞系について開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系のうちのいずれも使用することができる。
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、組成物は、有利には卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、これにより、アレルゲン性を低減するであろう。
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、増殖のための培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、シルコウイルス（特に、ブタシルコウイルス）、および／またはパルボウイルスを含まず、また、培養を開始するのに使用されるウイルス接種物も、好ましくはこれらを含まない（すなわち、これらの夾雑について調べ、これについて陰性の結果が与えられている）であろう（参考文献４５）。単純ヘルペスウイルスの非存在は、特に、好ましい。
ウイルスを細胞系上で増殖させている場合、組成物は、好ましくは投与１回当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満であり、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡ（典型的に、小児で０．２５ｍＬであるか、または成人で０．５ｍＬ）を含有するが、微量の宿主細胞ＤＮＡは存在しうる。一般に、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡである。
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は今や、生物学的薬剤についての、規定の規制要件であり、当業者の通常の能力の範囲内にある。ＤＮＡを測定するのに使用されるアッセイは、典型的には妥当性の確認されたアッセイであろう（参考文献４６および４７）。妥当性の確認されたアッセイの性能特徴は、数学的および定量的に記載することができ、その誤差の可能な源泉は、同定されているであろう。アッセイは一般に、確度、精度、特異度などの特徴について調べられているであろう。アッセイを較正（例えば、宿主細胞ＤＮＡの公知の標準的な数量に対して）し、調べたら、定量的ＤＮＡ測定を、規定通りに実施することができる。ＤＮＡ定量化のための、３つの主要な技法：サザンブロットまたはスロットブロット（参考文献４８）などのハイブリダイゼーション方法；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システム（参考文献４９）などのイムノアッセイ方法；および定量的ＰＣＲ（参考文献５０）を使用することができる。当業者は、これらの方法全てに精通しているが、各方法の正確な特徴、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選出し、増殖のためのプライマーおよび／またはプローブの選出しなどは、当該宿主細胞に依存しうる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの総ＤＮＡのための定量的アッセイであり、生物学的製剤中の夾雑ＤＮＡレベルをモニタリングするために使用されている（参考文献４９）。典型的アッセイは、ビオチニル化ｓｓＤＮＡ結合性タンパク質と、ウレアーゼコンジュゲート抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の、反応複合物の非配列特異的形成を伴う。全てのアッセイ構成要素は、製造元から入手可能な、Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ一式中に組み入れられている。多様な市販品製造元、例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどが、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの夾雑を測定するための、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと、全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムとの比較については、参考文献５１において見出すことができる。
夾雑ＤＮＡは、例えば、クロマトグラフィーなど、標準的な精製手順を使用して、ワクチン調製時に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮアーゼを使用することによりヌクレアーゼ処理により増強することができる。宿主細胞ＤＮＡの夾雑を低減するための簡便な方法は、参考文献５２および５３において開示されており、まず、ウイルスの増殖時に使用しうるＤＮアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用し、次いで、ビリオンの破壊時に使用しうるカチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２ステップの処理を伴う。また、β－プロピオラクトンなどのアルキル化剤による処理も、宿主細胞ＤＮＡを除去するのに使用することができ、また、有利にはビリオンを不活化させるのに使用することもできる（参考文献５４）。アルキル化剤、またはＤＮアーゼと、アルキル化剤との組合せによる、２ステップの処理を使用する方法についてもまた、記載されている（参考文献５５）。
投与当たり１０ｎｇを超えない残留宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。例えば、ヘマグルチニン１５μｇ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンは、容量０．２５ｍｌ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンと同様に好ましい。ヘマグルチニン５０μｇ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンは、容量０．５ｍｌ当たり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンと同様により好ましい。
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均長は、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
ＭＤＣＫ細胞などの細胞系上で増殖させるために、ウイルスは、浮遊培養物中の細胞上で増殖させることができ（参考文献２６、５６および５７）、または接着培養物中の細胞上で増殖させることもできる。浮遊培養に適する１つのＭＤＣＫ細胞系は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として受託されている）である。代替法として、マイクロキャリア培養を使用することもできる。
インフルエンザウイルスの複製を支援する細胞系は、好ましくは無血清培養培地中および／または無タンパク質培地中で増殖させる。本発明の文脈では、ヒト由来または動物由来の血清に由来する添加剤が存在しない培地を、血清非含有培地と称する。タンパク質非含有とは、細胞の増多が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加剤、および非血清タンパク質を除外して生じる培養物を意味すると理解されるが、任意選択で、ウイルスの増殖に必要でありうる、トリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含みうる。このような培養物中で増殖する細胞自体は、天然で、タンパク質を含有する。
インフルエンザウイルスの複製を支援する細胞系は、好ましくは、例えば、ウイルス複製時に、３７℃よりも下で（参考文献５８）（例えば、３０～３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃で）増殖させる。
ウイルスを、培養細胞内で繁殖させる方法は一般に、培養細胞に、培養される株を接種するステップと、感染させた細胞を、例えば、ウイルス力価または抗原の発現により決定される時間（例えば、接種の２４～１６８時間後の間）などの、ウイルスの繁殖に所望される時間にわたり培養するステップと、繁殖させたウイルスを回収するステップとを含む。培養細胞に、１：１０００～１：１、１：５００～１：１、１：１００～１：５、または１：５０～１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定される）対細胞比で接種する。ウイルスを、細胞の懸濁液へと添加するか、または細胞の単層へと適用し、ウイルスを、細胞上で、２５℃～４０℃、好ましくは２８℃～３７℃で、少なくとも６０分間であるが、通例３００分間未満、好ましくは９０～２４０分間の間にわたり吸収させる。感染させた細胞培養物（例えば、単層）は、採取された培養物上清のウイルス含量を増大させるように、凍結－融解または酵素作用により除去することができる。次いで、採取された流体を、不活化または凍結保存する。培養細胞は、約０．０００１～１０、好ましくは０．００２～５、より好ましくは０．００１～２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染の３０～６０時間後に採取することができる。好ましくは、細胞は、感染の３４～４８時間後、例えば、感染の３８～４０時間後に採取する。一般に、ウイルスの放出を可能とするように、細胞培養時に、プロテアーゼ（典型的には、トリプシン）を添加するが、プロテアーゼは、培養時の、任意の適する段階において、添加することができる。
インフルエンザウイルスは、遺伝子再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）株であることが可能であり、逆遺伝学技法により得られている。逆遺伝学技法（例えば、参考文献５９～６３）は、プラスミドまたは直鎖状発現構築物を使用して、所望のゲノムセグメントを伴うインフルエンザウイルスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて調製することを可能とする。典型的には、逆遺伝学技法は、細胞中の両方の種類のＤＮＡの発現が、完全無欠の感染性ビリオンのアセンブリーをもたらすように、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ｐｏｌＩプロモーターから発現させるステップと、（ｂ）ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターから発現させるステップとを伴う。ＤＮＡは、好ましくはウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てをもたらすが、また、ヘルパーウイルスを使用して、一部のＲＮＡおよびタンパク質をもたらすことも可能である。各ウイルスＲＮＡをもたらすために、別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が好ましく（参考文献６４～６６）、これらの方法はまた、ウイルスタンパク質の全部または一部（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、およびＮＰタンパク質だけ）を発現させるのにも、プラスミドの使用を伴い、一部の方法では、１２のプラスミドを使用するであろう。また、直鎖状発現構築物の使用も可能である（参考文献６７）。
必要とされるプラスミドの数を低減するため、近年の手法（参考文献６８）は、同じプラスミド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）上における、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡの合成のための）と、別のプラスミド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）上における、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを伴う、複数のタンパク質コード領域とを組み合わせる。参考文献６８の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上の、ＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域、およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域と；（ｂ）単一のプラスミド上の、８つ全てのｖＲＮＡコードセグメントとを伴う。ＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを、１つのプラスミド上に組み入れ、他の６つのセグメントを、別のプラスミド上に組み入れることによってもまた、事態を容易とすることができる。
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするために、ｐｏｌＩプロモーターを使用することの代替として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することも可能である（参考文献６９）。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、またはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターは、簡便に使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）で、より簡便でありうるが、細胞にはまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドもトランスフェクトしなければならない。
他の技法では、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩ二重プロモーターを使用して、ウイルスＲＮＡと、単一の鋳型発現可能なｍＲＮＡとを同時にコードすることも可能である（参考文献７０および７１）。
したがって、特に、ウイルスを卵内で増殖させる場合、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する、１または複数のＲＮＡセグメント（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６つのセグメントであり、ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２の遺伝子再集合体）を含みうる。Ａ型インフルエンザウイルスはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス、またはワクチン調製物のための遺伝子再集合体ウイルスを作出するのに有用な、他の任意のウイルス株に由来する、１または複数のＲＮＡセグメントも含みうる。参考文献７２および７３はまた、Ａ型インフルエンザ株と、Ｂ型インフルエンザ株とを再集合させるのに適切な骨格についても論じている。
典型的には、本発明は、ヒト対ヒトの伝染が可能な株に対して防御し、株のゲノムは通例、哺乳動物の（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来した、少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むであろう。株のゲノムは、鳥類インフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含みうる。
ヘマグルチニン（ＨＡ）とは、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的には一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイにより測定される、ＨＡレベルを参照することにより標準化される。ワクチンは、典型的には株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば、小児のために、または汎発性状況では、低用量もまた使用される。１／２用量（すなわち、株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４用量、および１／８用量などの部分用量も、高用量（例えば、３倍用量または９倍用量（参考文献７６および７７））と同様に使用される（参考文献７４および７５）。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株当たり０．１～１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは０．１～５０μｇの間、例えば、０．１～２０μｇ、０．１～１５μｇ、０．１～１０μｇ、０．１～７．５μｇ、０．５～５μｇなどを含みうる。特定の用量は、例えば、株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらの低用量は、本発明の場合と同様、アジュバントがワクチン中に存在する場合に最も有用である。本発明のワクチンの成分、キット、および工程（例えば、それらの容量および濃度）は、最終生成物中に、これらの抗原用量をもたらすように選択することができる。
生ワクチンでは、投与量は、ＨＡ含量ではなく、中央値組織培養物感染性用量（ＴＣＩＤ５０）により測定し、株１つ当たり１０６～１０８の間のＴＣＩＤ５０（好ましくは、１０６．５～１０７．５の間）が典型的である。
本発明に使用されるＨＡは、ウイルス中に見出される天然ＨＡの場合もあり、修飾されている場合もある。例えば、鳥類および他の種においてウイルスを高病原性とする決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位近傍の多塩基性領域）は、除去しなければ、ウイルスが卵内で増殖することを妨げうるので、これらの決定基を除去するように、ＨＡを修飾することが公知である。
組成物は、洗浄剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００など）またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、または、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのための、デオキシコール酸ナトリウムを含みうる。洗浄剤は、微量だけで存在しうる。したがって、ワクチンは、オクトキシノール１０、α－トコフェリル水素スクシネート、およびポリソルベート８０の各々１ｍｇ／ｍｌ未満ずつを含みうる。微量中の他の残りの成分は、抗生剤（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）でありうるであろう。
不活化の、しかし非全細胞のワクチン（例えば、スプリットウイルスワクチンまたは精製表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置する、さらなるＴ細胞エピトープから利益を得るために、マトリックスタンパク質を含みうる。したがって、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む、非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は加えて、Ｍ１マトリックスタンパク質および／またはＭ２マトリックスタンパク質を含みうる。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ１マトリックスタンパク質の組入れが好ましい。ヌクレオタンパク質もまた、存在しうる。
試料中の抗原は、典型的にはインフルエンザビリオンから調製されるが、代替法として、ヘマグルチニンなどの抗原は、組換え宿主内（例えば、プラスミド発現系を使用する酵母内、またはバキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞系内）で発現させ、精製形態で使用することができる（参考文献７８および７９）。しかし、一般に、抗原は、ビリオンに由来するであろう。
試料は、ストレス条件へと曝露されている場合もあり、これが疑われる場合もある。本発明の方法を使用して、試料が、ある範囲のストレス条件のうちの１つまたは複数へと曝露されている場合に、正確な免疫原性ＨＡの量が、試料中に存在することを確実にすることができる。一部の実施形態では、ストレス条件は、６．５を下回るｐＨ、凍結融解、およびボルテックス処理から選択される。一部の実施形態では、ストレス条件は、６．５を下回るｐＨ、凍結融解、およびボルテックス処理から選択され、本明細書で記載される通り、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、定量を実施する。一部の実施形態では、ストレス条件は、６．５を下回るｐＨ、７．５を上回るｐＨ、５０℃を上回る温度、または凍結融解から選択される。一部の実施形態では、ストレス条件は、６．５を下回るｐＨ、７．５を上回るｐＨ、５０℃を上回る温度、または凍結融解から選択され、本明細書で記載される通り、質量分析を使用して、定量を実施する。質量分析法は、本明細書で記載される方法であって、分離ステップ（例えば、沈殿）をなしで済ませる方法でありうる。６．５を下回るｐＨは、４～６のｐＨ（例えば、ｐＨ４．０～ｐＨ６．０の間）を含む。凍結融解は、ＰＢＳ緩衝液中の凍結融解でありうる。凍結融解は、トリス緩衝液中の凍結融解でありうる。好ましい実施形態では、ストレス条件は、６．５を下回るｐＨ（例えば、ｐＨ４～ｐＨ６）である。好ましくは、試料は、不活性ＨＡ（例えば、融合後ＨＡ）を含有するか、またはこれが疑われる。
医薬組成物
本発明に従い調製されるワクチンは、薬学的に許容される。それらは、抗原およびアジュバントに加えた成分も含みうる、例えば、それらは典型的に、１つまたは複数の医薬担体および／または賦形剤を含むであろう。このような成分についての完全な議論は、参考文献８０において閲覧可能である。粘膜ワクチン中で使用される担体／賦形剤は、非経口ワクチン中で使用される担体／賦形剤と、同じ場合もあり、異なる場合もある。
組成物は、チオメルサールまたは２－フェノキシエタノールなどの保存剤を含みうる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満である）、例えば、チオメルサール非含有であることが好ましい（参考文献２０および８１）。水銀を含有しないワクチンが、より好ましい。
等張性を制御するために、特に、注射用ワクチンでは、ナトリウム塩など、生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１～２０ｍｇ／ｍｌの間で存在しうる。存在しうる他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
注射用の組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有し、より好ましくは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まるであろう。浸透圧は、ワクチン接種により引き起こされる疼痛に対して、影響を及ぼさないことが既に報告されている（参考文献８２）が、それに関わらず、浸透圧をこの範囲内に保つことが好ましい。
組成物は、１または複数の緩衝液を含みうる。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には５～２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
組成物のｐＨは一般に、５．０～８．１の間であり、より典型的には６．０～８．０の間、例えば、６．５～７．５の間、または７．０～７．８の間であろう。したがって、本発明の工程は、パッケージングの前に、バルクワクチンのｐＨを調整するステップを含みうる。
組成物は、好ましくは滅菌である。組成物は、好ましくは非発熱物質性である、例えば、投与１回当たり＜１ＥＵ（標準尺度である内毒素単位）を含有し、好ましくは投与１回当たり＜０．１ＥＵである。組成物は、好ましくはグルテン非含有である。
組成物は、単回の免疫化のための材料を含む場合もあり、複数回の免疫化のための材料を含む場合もある（すなわち、「複数回投与」キット）。複数回投与の設定では、保存剤の組入れが好ましい。複数回投与用組成物中に保存剤を組み入れることに対する代替として（またはこれに加えて）、組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器内に含有される場合もある。
インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投与容量で投与するが、小児には、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を投与することもできる。鼻腔内投与では、この総投与容量を、鼻孔間で分割する、例えば、各鼻孔内に１／２ずつに分割することができる。
組成物およびキットは、好ましくは２℃～８℃の間で保存する。組成物およびキットは、凍結させるべきではない。組成物およびキットは、理想的には、直接的な光の外で保存するべきである。
アジュバント
本発明の方法の利点のうちの１つは、それらが、アジュバント処理されたインフルエンザワクチン中の、免疫原性ＨＡのＨＡ定量を可能とすることである。したがって、本発明の方法で使用される試料は、アジュバント処理されたインフルエンザワクチンでありうる。アジュバントは、インフルエンザ抗原と共に良好に働くことが示されているので、好ましくは水中油エマルジョンアジュバントである。
水中油エマルジョンアジュバント
水中油エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバント処理における使用に、特に適することが見出されている。このような多様なエマルジョンは、公知であり、典型的には、少なくとも１つの油と、油を伴う少なくとも１つの界面活性剤と、生体分解性（代謝性）かつ生体適合性の界面活性剤とを含む。エマルジョン中の油滴は一般に、直径が５μｍ未満であり、１ミクロン未満の直径を有する場合もあり、これらの小さなサイズは、安定的なエマルジョンをもたらすように、マイクロフルイダイザーにより達成される。平均サイズを２２０ｎｍ未満とする液滴が、濾過無菌にかけうるので好ましい。
好ましい実施形態では、水中油エマルジョンは、均一である。均一なエマルジョンは、その中に分散させた液滴（粒子）の大部分が、指定されたサイズ範囲（例えば、直径範囲）内にあることにより特徴付けられる。適切な指定のサイズ範囲は、例えば、５０～２２０ｎｍの間、５０～１８０ｎｍの間、８０～１８０ｎｍの間、１００～１７５ｎｍの間、１２０～１８５ｎｍの間、１３０～１９０ｎｍの間、１３５～１７５ｎｍの間、１５０～１７５ｎｍの間でありうる。一部の実施形態では、均一エマルジョンは、指定の直径範囲外にある液滴（粒子）のうちの、≦１０％の数の液滴（粒子）を含有する。一部の実施形態では、水中油エマルジョン調製物中の油滴の、平均値粒子サイズは、動的光散乱により測定される通り、１３５～１７５ｎｍの間、例えば、１５５ｎｍ±２０ｎｍであり、このような調製物は、光学粒子センシングにより測定される通り、調製物１ｍＬ当たり１×１０７を越えない大型粒子を含有する。本明細書で使用される「大型粒子」とは、直径を＞１．２μｍ、典型的に１．２～４００μｍの間とする粒子を意味する。好ましい実施形態では、均一エマルジョンは、好ましいサイズ範囲外にある液滴のうちの１０％未満、５％未満、または３％未満を含有する。一部の実施形態では、水中油エマルジョン調製物中の粒子の平均値液滴サイズは、１２５～１８５ｎｍの間、例えば、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、または約１８０ｎｍであり、水中油エマルジョンは、調製物中の液滴のうちで、１２５～１８５ｎｍの範囲外にある液滴の数は、５％未満であるという意味で均一である。
本発明は、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来する油などの油と共に使用することができる。植物油のための供給源は、堅果、種、および穀物を含む。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油は、最も一般に利用可能であり、堅果油を例示する。例えば、ホホバ豆から得られたホホバ油を使用することができる。種油は、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油などを含む。穀物群では、トウモロコシ油が、最もたやすく入手可能であるが、コムギ、オオムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど、他の穀類の油もまた、使用することができる。種油中で自然発生するわけではないが、グリセロールおよび１，２－プロパンジオールの、６～１０炭素の脂肪性酸エステルも、堅果油および種油から出発する適切な材料の、加水分解、分離、およびエステル化により調製することができる。哺乳動物のミルクに由来する脂肪および油は、代謝性であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。当技術分野では、分離、精製、サポニン化のための手順、および純粋な油を、動物供給源から得るために必要な他の手段が周知である。大半の魚類は、たやすく回収されうる、代謝性の油を含有する。例えば、肝油、サメ肝油、およびマッコウクジラなどの鯨油は、本明細書で使用されうる魚油のうちのいくつかを例示する。多数の分枝鎖油が、５－炭素イソプレン単位内で、生化学的に合成されており、一般に、テルペノイドと称する。サメ肝油は、本明細書で特に好ましい、２，６，１０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサヘキサエンである、スクアレンとして公知である、分枝状の不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンの飽和類似体であるスクアランもまた、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販品供給源からたやすく入手可能であるか、または当技術分野で公知の方法により得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロール（下記を参照されたい）である。油の混合物を使用することができる。
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）により分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと称する）、とりわけ、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に目的である、反復するエトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数を変動させうるオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）などの、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来する、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知である）を含むがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に組み入れるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）などのオクトキシノールとの組合せもまた適する。別の有用な組合せは、ｌａｕｒｅｔｈ ９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０など）０．０１～１％、特に、約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の洗浄剤など）０．００１～０．１％、特に、０．００５～０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９など）０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％であり、特に、０．１～１％または約０．５％である。
最も好ましい水中油エマルジョンは、水中スクアレンエマルジョン、好ましくは、１ミクロン未満の水中スクアレンエマルジョンである。
本発明で有用な、具体的な水中油エマルジョンは、以下を含むがこれらに限定されず、それらの中では、スクアレン含有エマルジョンが好ましい。
１ミクロン未満のスクアレンエマルジョン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエート。エマルジョンは、水性相中のクエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含みうる。エマルジョンは、３．２～４．６ｍｇ／ｍｌのスクアレン、４．１～５．３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および４．１～５．３ｍｇ／ｍｌのソルビタントリオレエートを含みうる。エマルジョン組成は、容量で約４．６％のスクアレン、約０．４５％のポリソルベート８０、および約０．５％のソルビタントリオレエートでありうる。「ＭＦ５９」として公知のアジュバント（参考文献８３～８５）は、参考文献８６の第１０章および参考文献８７の第１２章においてより詳細に記載されている。スクアレン、ポリソルベート８０、およびソルビタントリオレエートは、９７５０：１１７５：１１７５の重量比で存在しうる。約３９ｍｇ／ｍＬのスクアレン、約４．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および約４．７ｍｇ／ｍＬのソルビタントリオレエートの濃度が典型的である。多分散性を＜０．２とする、Ｚ平均による１５５～１８５ｎｍの間の液滴サイズが好ましい。
スクアレン、トコフェロール（特に、ＤＬ－α－トコフェロール）、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝液生理食塩液を含みうる。これらのエマルジョンは、容量で２～１０％のスクアレン、２～１０％のトコフェロール、および０．３～３％のポリソルベート８０を有することが可能であり、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定的なエマルジョンをもたらしうるので、好ましくは＜１（例えば、０．９０）である。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容量比または約１１：５の重量比で存在しうる。したがって、３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおよそ５５：６１：２５の重量比で存在しうる。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、重量で４．３％のスクアレン、重量で４．８％のトコフェロール、および重量で２％のポリソルベート８０を含む。約４２．７ｍｇ／ｍＬのスクアレン、約４７．４ｍｇ／ｍＬのＤＬ－α－トコフェロール、および約１９．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０の濃度が典型的である。１４０～１７０ｎｍの間のＺ平均液滴サイズが好ましい。エマルジョンはまた、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ ＭＰＬ）も含みうる。この種類の別の有用なエマルジョンは、ヒトへの投与当たり、例えば、上記で論じた比である、０．５～１０ｍｇのスクアレン、０．５～１１ｍｇのトコフェロール、および０．１～４ｍｇのポリソルベート８０（参考文献８８）を含みうる。
スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルによる親水性の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリールエーテル）、および疎水性の非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、かつ／またはサイズを２００ｎｍ未満とする、少なくとも９０％の油滴（容量で）を有する（参考文献８９）。エマルジョンはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１つまたは複数も含みうる。エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含みうる（参考文献９０）。このようなエマルジョンは、凍結乾燥させることができる。好ましいエマルジョンは、平均液滴サイズが１５０ｎｍを下回る、スクアレン、ソルビタンオレエート、ポリオキシエチレンセトステアリールエーテル、およびマンニトール（例えば、３２．５％のスクアレン、４．８２％のソルビタンオレエート、６．１８％のポリオキシエチレンセトステアリールエーテル、および６％のマンニトール；重量％）を含む。約４９．６ｍｇ／ｍＬのスクアレン、約７．６ｍｇ／ｍＬのソルビタンオレエート、および約９．６ｍｇ／ｍＬのポリオキシエチレンセトステアリールエーテル、および９．２ｍｇ／ｍＬのマンニトールの濃度が典型的である。
スクアレン、ホスファチジルコリン、ポロキサマー１８８、グリセロール、およびリン酸アンモニウム緩衝液を含み（参考文献９１）、任意選択で、α－トコフェロール（「ＳＥ」）もまた含むエマルジョン。
スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）によるエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ－ＭＰＬ（下記を参照されたい）も含みうる。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有しうる。
ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、およびトコフェロール（例えば、α－トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１００μｇ／ｍｌの、α－トコフェロールスクシネート）の質量比で含むことが可能であり、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。エマルジョンはまた、スクアレンも含みうる。水性相は、リン酸緩衝液を含有しうる。
スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝液生理食塩液、ｐＨ７．４中で製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ－１」アジュバント中で、トレオニル－ＭＤＰと共に使用されている（参考文献９２）（０．０５～１％のＴｈｒ－ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント中の場合のように、Ｔｈｒ－ＭＤＰを伴わずに使用することもできる（参考文献９３）（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ－Ｃａｒｅによるエマルジョン（参考文献９４）。アジュバント処理されたワクチン中の、これらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）、および２％のＡｂｉｌ－Ｃａｒｅ ８５（Ｂｉｓ－ＰＥＧ／ＰＰＧ－１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ－１６／１６ジメチコン；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル）である。
０．５～５０％の油、０．１～１０％のリン脂質、および０．０５～５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献９５に記載される通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴サイズが、有利である。
非代謝性油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ ８０など）による、１ミクロン未満の水中油エマルジョン：ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン－親油性物質コンジュゲート（参考文献９６において記載されている、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニンへと添加することにより作製されたＧＰＩ－０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyidioctadecylammonium bromide）、および／またはＮ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤も組み入れることができる。
サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）と、ステロール（例えば、コレステロール）とが、ヘリカルミセルとして会合するエマルジョン（参考文献９７）。
ミネラル油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（参考文献９８）。
ミネラル油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（参考文献９８）。
注射用のワクチンを作製するためには、これらのエマルジョンを一般に、水性の免疫原調製物と混合するであろう。この混合は典型的に、水性形態にあるエマルジョンを、水性形態にある免疫原と共に、１：１の容量比で伴い、この場合、エマルジョンの成分の比率は、最終的なワクチン中で半分となる。例えば、容量で５％のスクアレンを伴うエマルジョンを、抗原溶液と１：１の比で混合して、最終濃度を容量で２．５％とするワクチンをもたらすことができる。当然ながら、例えば、５：１～１：５の間の、混合のための２つの液体の容量比を使用する、他の混合比も可能である。したがって、ワクチン組成物中で、上記で言及したエマルジョンの成分の濃度を、それらの比を同じままとする希釈（例えば、２または３などの整数による）により改変することもできる。例えば、小児ワクチンは、低濃度のアジュバント、例えば、容量で４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、または１％のスクアレンを含有しうる。
抗原とアジュバントとを混合した後で、ヘマグルチニン抗原は一般に、なおも水溶液中にあるが、油／水界面の近傍に分布しうる。一般に、エマルジョンの油相に入るヘマグルチニンは、存在するとしても少量である。
組成物が、トコフェロールを含む場合、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロール、またはξトコフェロールのうちのいずれも使用しうるが、α－トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／またはアイソマーを取りうる。塩は、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などの有機塩を含む。Ｄ－α－トコフェロールおよびＤＬ－α－トコフェロールのいずれも使用することができる。トコフェロールは、ビタミンＥは、この患者群内で、免疫応答に対して、肯定的な効果を及ぼすことが報告されているため、老齢患者（例えば、６０歳またはそれ超）における使用のためのワクチン中に含まれると有利である（参考文献９９）。トコフェロールはまた、エマルジョンを安定化させる一助となる、抗酸化特性も有する（参考文献１００）。好ましいα－トコフェロールは、ＤＬ－α－トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＴＮＦ関連のリガンドと協同作用することが見出されている。さらに、α－トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物の代替物としても有用な保存剤であることが公知である（参考文献２０）。保存剤非含有ワクチンが特に好ましい。
全般
「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のほか、「～からなること」も包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘからもっぱらなる場合もあり、さらなる何物か、例えば、Ｘ＋Ｙを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）場合もある。
「実質的に」という語は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明による定義から省略することができる。
数値ｘとの関連における「約」という用語は、任意選択であり、例えば、ｘ＋１０％を意味する。
具体的に言明されない限りにおいて、２つまたはこれを超える成分を混合するステップを含む工程は、いかなる具体的な混合順序も要請しない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を、互いと組み合わせ、次いで、この組合せを、第３の成分と組み合わせることができるなどである。
動物（そして、特に、ウシ）材料を、細胞培養物中で使用する場合、それらは、伝染性海綿状脳症（transmissible spongiform encaphalopathies）（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るものとする。総じて、動物由来の材料の完全な非存在下で、細胞を培養することが好ましい。
本発明について、例だけを目的として記載してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内にとどまりながら、改変を行いうることが理解されるであろう。本発明は、以下の非限定的な実施形態を包含する。
１）（ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；（ｂ）前記試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、前記不活性ＨＡが消化され、前記免疫原性ＨＡが消化されないままであるステップと；（ｃ）前記試料中の、前記消化された不活性ＨＡを、前記消化されていない免疫原性ＨＡから分離するステップと；（ｄ）消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、前記消化されていない免疫原性ＨＡを、解析的タンパク質分解に供するステップと；（ｅ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、前記試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップとを含む方法。
２）（ａ）免疫原性ＨＡ、不活性ＨＡ、またはこれらの組合せを含む試料を提供するステップと；（ｂ）前記試料を、１種または複数種のプロテアーゼにより、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、前記不活性ＨＡが、消化され、前記免疫原性ＨＡが、消化されないままであるステップと；（ｃ）前記不活性ＨＡ由来のペプチドと識別可能な、免疫原性ＨＡ由来のペプチドを含む、消化された免疫原性ＨＡの断片を提供するように、消化されていない免疫原性ＨＡと、消化された不活性ＨＡとの混合物を、１種または複数種のプロテアーゼを使用する解析的タンパク質分解に供するステップであって、前記解析的タンパク質分解が、生物学的タンパク質分解の間に、前記不活性ＨＡ内で切断されうる、１つまたは複数の切断部位において、前記免疫原性ＨＡを切断しえないステップと；（ｄ）少なくとも１つの標識化基準ＨＡペプチドの存在下で、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）を実行して、前記試料中の免疫原性ＨＡの量を定量するステップとを含む方法。
３）ステップ（ｄ）の、消化されていない免疫原性ＨＡが、ストレス形態にある、実施形態１による方法。
４）消化されていない免疫原性ＨＡのストレス形態が、６．５を下回るｐＨ、７．５を上回るｐＨ、５０℃を上回る温度；または凍結融解への曝露により得られる、実施形態３による方法。
５）低ｐＨが、ｐＨ６．０を下回る、実施形態４による方法。
６）低ｐＨが、ｐＨ４．０～６．０の間である、実施形態５による方法。
７）解析的タンパク質分解ステップが、免疫原性ＨＡの断片を作出するのに十分な条件下における、セリンプロテアーゼによる消化を含む、任意の先行する実施形態による方法。
８）解析的タンパク質分解を、約３７℃で、最長１８時間にわたり実施する、実施形態７による方法。
９）ステップ（ｂ）におけるプロテアーゼと、ステップ（ｄ）におけるプロテアーゼとが、同じであるか、または異なる、実施形態１に従属する、任意の先行する実施形態による方法。
１０）試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；試料中の免疫原性ＨＡを、他の成分から分離するステップと；試料中の免疫原性ＨＡを定量するステップとを含む方法。
１１）生物学的タンパク質分解が、プロテアーゼによるタンパク質分解を含む、実施形態１に従属する、任意の先行する実施形態による方法。
１２）プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、実施形態１１による方法。
１３）セリンプロテアーゼが、トリプシンである、実施形態１２による方法。
１４）生物学的タンパク質分解を、３７℃で実行する、任意の先行する実施形態による方法。
１５）生物学的タンパク質分解を、３０分間、６０分間、９０分間、または１２０分間にわたり実行する、実施形態１０～１４のうちのいずれか１つによる方法。
１６）免疫原性ＨＡを、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）により定量する、実施形態１０～１５のうちのいずれか１つによる方法。
１７）免疫原性ＨＡを分離するステップが、タンパク質沈殿を含む、実施形態１または１０に従属する、任意の先行する実施形態による方法。
１８）タンパク質沈殿が、有機溶媒を添加するステップを含む、実施形態１７による方法。
１９）有機溶媒が、ケトンまたはアルコールである、実施形態１８による方法。
２０）有機溶媒が、アセトン、エタノール、またはメタノールである、実施形態１９による方法。
２１）沈殿したタンパク質を、アルコールで洗浄するステップを含む、実施形態１または１０に従属する、任意の先行する実施形態による方法。
２２）アルコールが、エタノールである、実施形態２１による方法。
２３）試料が、全ビリオンインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、サブユニットインフルエンザワクチン、および組換えインフルエンザワクチンからなる群から選択される、任意の先行する実施形態による方法。
２４）試料が、アジュバントを含む、実施形態２３による方法。
２５）アジュバントが、水中油エマルジョンアジュバントである、実施形態２４による方法。
２６）試料が、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるインフルエンザ株に由来するＨＡを含む、任意の先行する実施形態による方法。
２７）試料が、一価バルク調製物、多価バルク調製物、一価生成物、または多価生成物から採取された、任意の先行する実施形態による方法。
２８）ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳが、同位体希釈質量分析（ＩＤＭＳ）である、実施形態１～９または１６～２７のうちのいずれか１つによる方法。
２９）標識化基準ＨＡペプチドが、同位体標識を含む、任意の先行する実施形態による方法。
３０）同位体標識が、１５Ｎおよび１３Ｃからなるリストから選択される、実施形態２９による方法。
３１）試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、（ａ）試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップと；（ｂ）（ａ）による試料中の免疫原性ＨＡの量を、ＳＲＩＤアッセイにより定量するステップとを含む方法。
３２）ステップ（ｂ）を、ポリクローナル抗血清（例えば、ヒツジ抗血清）および／または適切なモノクローナル抗体など、抗血清の使用を伴って実行する、実施形態３１による方法。
３３）生物学的タンパク質分解が、プロテアーゼ（例えば、トリプシンなどのセリンプロテアーゼ）によるタンパク質分解を含む、実施形態３２による方法。
３４）生物学的タンパク質分解を、３７℃で実行する、実施形態３１～３３のうちのいずれか１つによる方法。
３５）試料が、全ビリオンインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、サブユニットインフルエンザワクチン、および組換えインフルエンザワクチンからなる群から選択される、実施形態３１～３４のうちのいずれか１つによる方法。
３６）試料が、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるインフルエンザ株に由来するＨＡを含む、任意の先行する実施形態による方法。
３７）試料が、一価バルク調製物、多価バルク調製物、一価生成物、または多価生成物から採取された、任意の先行する実施形態による方法。
３８）試料／ワクチン中のＨＡのうちの少なくとも６０％が、活性／免疫原性形態にあり；かつ／または、試料／ワクチン中のＨＡのうちの２０％未満が、不活性形態にあり；かつ／または、試料中の活性ＨＡ：不活性ＨＡの比が、少なくとも４：１である、任意の先行する実施形態による方法。
３９）インフルエンザワクチンを製造するための方法であって、インフルエンザＨＡを含むバルク調製物に由来する試料を提供するステップと；免疫原性ＨＡの量を、任意の先行する実施形態による方法に従い定量するステップと；単位剤形を、バルク調製物から、試料中の免疫原性ＨＡの量に従いパッケージングするステップとを含む方法。
４０）インフルエンザワクチンを調製するための方法であって、実施形態１～３８のうちのいずれか１つによる方法により、バルクワクチン中のＨＡの量を定量するステップと；ワクチンをバルクから調製するステップとを含む方法。
４１）滅菌調製物をもたらすように、濾過するステップをさらに含む、実施形態３９または４０による方法。
４２）アジュバントと組み合わせるステップをさらに含む、実施形態３９～４１のうちのいずれか１つによる方法。
４３）単位投与量が、液体、凍結乾燥固体、凍結乾燥粉末、または経鼻エアゾールの形態にある、実施形態３９～４２のうちのいずれか１つによる方法。
４４）ステップ（ｃ）の後の、実施形態１による方法を反復するステップをさらに含む、実施形態３９～４３のうちのいずれか１つによる方法。
４５）バルクが、一価または多価である、実施形態３９～４４のうちのいずれか１つによる方法。
本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは、限定的であるとはみなされるべきではない。
（実施例１）
生物学的トリプシン処理による前処理。
インフルエンザウイルス表面ＨＡは、免疫学的に最も関与性の状態である融合前状態では、主に三量体として存在する。多様なストレス条件下で、ＨＡは、融合後状態への不可逆的移行を受ける場合がある。融合後ＨＡは、強力な中和免疫応答を誘発しない。
融合前ＨＡのトリプシン消化に対する感受性と、融合後ＨＡのトリプシン消化に対する感受性とを、調製したばかりのトリプシン（酵素：基質比を、１：２０とする）を試料へと添加し、３７℃で２時間にわたりインキュベートすることにより比較した。
還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示される通り（図１Ａ）、対照の融合前ＨＡ（ＨＡ１およびＨＡ２）は、高プロテアーゼ濃度（ＨＡ：トリプシン＝５：１）であってもなお、トリプシン消化に対して、極めて耐性である。これに対し、コンフォメーション変化を受けた、低ｐＨにより誘導された融合後ＨＡ１は、トリプシンに対して極めて感受性になった。しかし、融合後ＨＡ２は、そのプロテアーゼ耐性を、やはり保持した。
試料はまた、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によっても解析した。ＲＰ－ＨＰＬＣのために、Ｐｒｏｓ Ｒ１／１０カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および３０～３５％のＡＣＮ（０．１％のＴＦＡ）勾配を使用して、ＵＶによる検出を伴う、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣにより、ＤＴＴ還元試料を分解した。
ＲＰ－ＨＰＬＣは、ＨＡ１ピークが、対照条件（融合前対照、ｐＨ４．０処理だけ、およびトリプシン処理だけ）下で、変化しないで維持されることを明らかに示した。しかし、ＨＡ１ピークは、低ｐＨおよびトリプシンで二重処理された試料中では、有意に減衰した。
前処理ステップ（生物学的トリプシン処理と呼ばれる）を、定量的質量分析と組み合わせることにより、効力アッセイを開発した。生物学的トリプシン処理の最適化は、融合前ＨＡ１に影響を及ぼさずに、融合後ＨＡ１の、短時間における、短いペプチドへの、最高レベルの消化を達成することに焦点を当てた。
（実施例２）
タンパク質沈殿、解析的消化、およびＩＤＭＳ
生物学的トリプシン処理の後、消化された融合後ＨＡ１ペプチドを、無傷の融合前ＨＡ分子から分離する。タンパク質沈殿法を開発し、最適化した。タンパク質沈殿のために、１ｍＭのＨＣｌ中で作製作製されたばかりの、１０ｍＭのＮα－トシル－Ｌ－リシンクロロメチルケトンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）を、生物学的トリプシン処理を受けた試料へと、１００μＭの最終濃度まで添加し、室温で１０分間にわたりインキュベートした。４倍容量の低温アセトンを、溶液へと添加し、－２０℃で２時間にわたりインキュベートした。その後、混合物を、約２１ｋ ＲＣＦで遠心分離して、沈殿物をペレット化させた。上清を、注意深く除去した。次いで、沈殿物を、１ｍＬの低温エタノール中で、３回にわたり洗浄した。沈殿物を撹乱しないように、注意を払った。最後に、沈殿物を、１０分間にわたり通気乾燥させた。
この手法の利点は、試料調製が、同じチューブ内であり、これにより、試料の喪失が最小化されるという事実を含む。これはまた、下流における試料調製のために、回収されたタンパク質ペレットの、所望される容量の適合性の緩衝液中の簡便な再懸濁ももたらした。この手法は、アーチファクトの導入も、減少させた。
この最適化されたプロトコールにより、ほぼ１００％の無傷ＨＡ分子を、大半の場合、アセトンタンパク質沈殿（図６を参照されたい）により一貫して回収し、エタノール洗浄により、消化されたペプチドのうちの９７～１００％を除去した（図７を参照されたい）。
分離後、回収されたタンパク質ペレットを、完全な再可溶化のために、６ＭのグアニジンＨＣｌ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中に）中に再懸濁させ、７０℃で５分間にわたり加熱した。消化の前に、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を添加することにより、グアニジン緩衝液を、０．６Ｍへと希釈した。次いで、トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ混合物を添加し（酵素：基質比を１：５とする）、３７℃でインキュベートして、直接的な同位体希釈質量分析（ＩＤＭＳ）解析のためのペプチドを作出する、解析的消化を始めた。経時変化研究は、選択された条件下で、全てではないにせよ、大半の標的サロゲートペプチドシグナルが、４時間後にプラトーに達することを示した。消化は、２０％のＴＦＡを、２％の最終濃度まで添加することにより、クエンチングした。
標識化サロゲートペプチドのカクテルを、反応混合物へと添加し、標準サロゲートペプチドの、消化緩衝液中の濃度系列を作製して、標準検量線を作成した。エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）を装備し、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣへとカップリングさせたＴｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｅｎｄｕｒａ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳを使用して、液体クロマトグラフィー標準反応モニタリング（ＬＣ－ＳＲＭ）を実施した。流量を０．２５ｍＬ／分とし、カラム温度を５０℃として、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍの粒子）を使用して、クロマトグラフィーを実施した。ＳＲＭは、本質的に、文献（参考文献１４）において記載されている通り、各ペプチドについてモニタリングされる、３つのトランジションにより実施した。データは、ＳｋｙｌｉｎｅソフトウェアおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒにより解析した。
ＨＡ２サブユニットは、タンパク質分解に対して耐性であるので、サロゲートペプチドは、ＨＡ１配列だけから選択した。アッセイの目的に応じて、サロゲートペプチドについての選択基準は変動する。目標が、全ＨＡを定量することであった場合は、株にわたる保存された配列を、サロゲートペプチドとして選択した。目標が、多価試料中の特異的な株を定量することであった場合は、目的の各株に固有の配列を、サロゲートペプチドとして選択した。一般に、各株について、少なくとも２つのサロゲートペプチドを使用した。
全アッセイについてまとめた流れ図を、図２に示す。
（実施例３）
アジュバントとのアッセイの適合性
アジュバントは、ワクチン中で、それらの有効性をブーストするように、広く使用されている。水中油エマルジョンアジュバントであるＭＦ５９は、インフルエンザワクチン中で使用され、免疫不全／障害集団における防御の顕著な改善と連関していた、ごく少数のアジュバントのうちの１つであった（参考文献１０１）。したがって、代替的効力アッセイが、アジュバントと適合性であると有利であろう。
アッセイが、アジュバントと適合性であるのかどうかを決定するように、本発明のアッセイを使用して、３つの異なるＨＡモノバルクについて、ＭＦ５９アジュバントの存在下または非存在下で調べた。データは、ＭＦ５９の存在が、アッセイに干渉しなかったことを示す（表１）。
Figure 0007232893000001
（実施例４）
ストレスを受けた多価ワクチン中のＨＡの定量。
アッセイの安定性を指し示す特色を確認するように、アッセイを使用して、低ｐＨ下、高ｐＨ下、および高温下のインフルエンザワクチンストレスについて調べた。高度に選択的であり、単一の試行時に、何千ものＳＲＭトランジションを定量することが可能な、ＬＣ－ＳＲＭベースの定量の性格のために、各株について、固有のサロゲートペプチドを使用する限りにおいて、本アッセイは、多価ワクチン中の異なる株を同時に定量するときに、内在的利点を有する。したがって、このアッセイでは、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、およびＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０の各々を、３０μｇ（ＳＲＩＤ値に基づく）ずつ含む四価ワクチンを使用した。各々が前処理（生物学的トリプシン処理）を伴うかまたは伴わない、ストレス対照試料またはストレスを受けていない対照試料について、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＲＩＤ、および本アッセイにより、並行して調べた。
低ｐＨによるストレス
低ｐＨは、ＨＡの、融合前から融合後のコンフォメーション移行を誘発する（参考文献９）。低ｐＨストレス負荷は、０．５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を、ＱＩＶ試料（約１２０μｇ／ｍＬのＨＡ、最終ｐＨを約４．１とする）へと添加することにより開始し、試料を、室温で１時間にわたりさらにインキュベートした。ストレス負荷は、１Ｍのトリス（ｐＨ８．５）を添加して、ｐＨを約７．１へと中和することによりクエンチングした。「低ｐＨ陰性」対照試料も、酢酸ナトリウムの代わりに、Ｈ２Ｏを使用することを除き、同様に処理した。
低ｐＨストレス負荷実験では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、４つの株全てに対応するＨＡ１ピークが、ｐＨ４．０および生物学的トリプシン処理による二重処理試料（低ｐＨ＋／トリプシン＋）で、ほぼ消滅することを示したことから、生物学的トリプシン処理が、融合後ＨＡを除去することが指し示される。「低ｐＨ－／トリプシン＋」試料では、ＨＡ１ピークは、大部分が無傷であったことから、生物学的トリプシン処理が、融合前ＨＡに影響を及ぼさなかったことが指し示される。
生物学的トリプシン処理を伴わない試料でもまた、ＨＡ１ピークは、低ｐＨストレス負荷の存在または非存在に関わらず、不変であったが、これは、ＲＰ－ＨＰＬＣが、融合前ＨＡまたは融合後ＨＡを鑑別させえなかったことから、予測されていた（図３Ａを参照されたい）。
本アッセイによる定量結果が、二重処理試料中の４つの株全てについて、劇的な降下を示す一方、「低ｐＨ＋／トリプシン－」試料についての結果は、不変を維持したが、これは、生物学的トリプシン処理ステップの必要性を指し示した。
「低ｐＨ－／トリプシン＋」試料でも、選択された株について、ごくわずかな減少が検出されたが、これは、おそらく、対照試料中にあらかじめ存在する、低レベルの融合後ＨＡに起因するものであろう（図３Ｂ）。
同じ試料のセットについてのＳＲＩＤ試験が、生物学的トリプシン処理の存在／非存在に関わらず、低ｐＨで処理された試料中の劇的な降下を示した（図３Ｂ）ことから、低ｐＨにより誘導される融合後転換が確認される。
このデータセットは、異なる株に由来するＨＡタンパク質がいずれも、低ｐＨストレス負荷に対して非常に感受性であることを指し示す。さらに、生物学的トリプシン処理ステップを援用する場合、本発明のアッセイは、免疫学的に活性の融合前ＨＡを、免疫学的に不活性の融合後ＨＡからたやすく鑑別することができる。
高ｐＨおよび熱によるストレス
同じ実験スキームを、高ｐＨストレス（脱アミド化）条件下および熱ストレス（５６℃）条件下で実行した。
高ｐＨストレス負荷は、０．２ＭのＮ－シクロヘキシル（cyclonhexyl）－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液を、ＱＩＶ試料（最終ｐＨを約１１とする）へと添加することにより開始し、３７℃で２時間にわたりインキュベートした後で、酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を添加して、ｐＨを中和させた。「高ｐＨ陰性」対照試料は、ＣＡＰＳ緩衝液の代わりに、Ｈ２Ｏの使用を含んだ。熱ストレスのためには、試料を、５６℃で６時間にわたり処理した。「トリプシン陰性」試料では、ブランク緩衝液を、トリプシンの代わりに添加した。
低ｐＨストレスに関して、本発明のアッセイ結果と、ＲＰ－ＨＰＬＣ／ＳＲＩＤ結果との優れた相関は、生物学的トリプシン処理ステップが、提起される代替的効力アッセイに、安定性を指し示す特色をもたらすことを確認した（図４～５）。
これらの条件下で、データは、ＨＡタンパク質が、高ｐＨおよび熱ストレスに対してそれほど感受性ではなく、感受性は、株特異的であると考えられることを示唆した。例えば、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（Ｈ３Ｎ２）は、高温に対する感受性が高かったが、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）の効力は、５６℃で６時間にわたる加熱の影響をそれほど受けなかった。
加えて、データセットは、交差干渉を伴わずに、多価ワクチン中の特異的な株を定量する、本アッセイの能力を確認した。
（実施例５）
混合型モノバルクの測定。
本発明のアッセイを使用して、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅによるモノバルク試料、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅによるモノバルク試料、およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａによるモノバルク試料について調べ、１：１：１の比で混合された、同じ株による混合型モノバルク試料と比較した。
混合型モノバルク試料中のＨＡの定量は、単一モノバルク試料の場合と同じであった（表２を参照されたい）。これは、アッセイが、多価試料中の特異的な株を定量することが可能であることを指し示す。
Figure 0007232893000002
（実施例６）
トリプシン前処理は、混合型免疫沈降リングにより引き起こされる、ＳＲＩＤによる、免疫学的に活性のＨＡについての過大評価を補正する
ジスルフィド連結されたＨＡ１およびＨＡ２断片からなる、ＨＡの各単量体サブユニットは、ウイルスエンベロープ（または細胞膜）の外側に露出された２つのドメイン：もっぱらＨＡ１残基から構成される球状「ヘッド」ドメイン、ならびにＨＡ１およびＨＡ２に由来する残基から構成される長型「ステム」ドメインと、ＨＡ２残基から構成される膜貫通ドメインおよび細胞質側ドメインとを有する（WileyおよびSkehel、１９７７年）。ＨＡは一般に、中性のｐＨでは、「準安定的」な融合前コンフォメーションを維持する。低ｐＨにより、エネルギー障壁が乗り越えられると、ＨＡは、より安定的な融合後コンフォメーションへと、不可逆的にリフォールディングする（Ruigrok、Aitkenら、１９８８年；Bullough、Hughsonら、１９９４年；SkehelおよびWiley、２０００年）。熱もまた、ＨＡの再構成を誘発しうる（Ruigrok、Martinら、１９８６年；Wharton、Skehelら、１９８６年）。マウスにおいて、融合前コンフォメーションにあるＨＡによる免疫化は、インフルエンザに対する顕著な免疫を誘発するが、融合後コンフォメーションにあるＨＡによる免疫化は、結合性の中和抗体を誘発できない（Quan、Liら、２０１１年）。
不活化インフルエンザワクチン（「ＩＩＶ」）の防御有効性および免疫原性は、原理的には、実験動物を免疫化することにより評価しうるが、このようなｉｎ ｖｉｖｏ効力試験は、時間がかかり、不正確である。そうではなくて、免疫学的に活性（中和抗体応答または血球凝集阻害［ＨＩ］抗体応答を誘発することが可能）なＩＩＶ内のＨＡの数量を決定するのに、より実践的なｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイが開発されている。インフルエンザワクチンの抗原含量についての、サロゲートｉｎ ｖｉｔｒｏ効力被験としての一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）が、１９７０年代に開発され、妥当性も確認された（Schild、Woodら、１９７５年；Wood、Schildら、１９７７年；Williams、１９９３年）。この改変オクタロニー試験は、ワクチン抗原（またはワクチン中の正確な株に相同な抗原標準物質）が、円形のウェルから、均一濃度の株特異的ヒツジ抗血清と共に成形されたアガロースゲルへと、放射状に拡散するときに形成される、免疫沈降リングの直径に基づき、ＨＡを定量する。免疫沈降リングは、濾紙でブロッティングすることにより、遊離抗原および遊離抗体を除去した後で、クーマシーブルー染色により検出される。ＩＩＶ内のＨＡは、ロゼットおよび他の複合体を形成するが、リングのサイズが、ＨＡ濃度とより直接的に比例するように、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを抗原へと添加して、ＨＡを均質な三量体へと分散させる（Williams、１９９３年）。
アガロースＳＲＩＤゲル中の株特異的抗血清は、ヒツジを、ブロメラインにより全ウイルスから切断されたＨＡで、複数回にわたり免疫化することにより作出する（BrandおよびSkehel、１９７２年）。抗血清は、ビリオンから切断され、天然であると推定されるＨＡに対して惹起されているため、ＳＲＩＤは、ＨＡの天然形態を伴う、読取り可能な免疫沈降リングだけをもたらすと考えられている（Minor、２０１５年）。ＳＲＩＤにより測定されたワクチン効力と、臨床試験におけるワクチン免疫原性との相関は示されているが、相関は比較的弱い（Ennis、Maynerら、１９７７年、LaMontagne、Nobleら、１９８３年、Rowlen、２０１５年）。ＳＲＩＤは、規制機関により許容され、４０年間にわたり、ＩＩＶ製剤のためのインフルエンザワクチンの製造、出荷、および安定性試験に使用されている。
対照的に、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、同位体希釈質量分析（ＩＤＭＳ）、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥなど、ＨＡの数量についての生物物理的アッセイは、ＨＡの異なるコンフォメーション状態を識別しないように、定量の前にＨＡを変性させる。上記の実施例は、株特異的抗体を要請せず、別の形でコンフォメーション的に感受性でもない、代替的な生物物理的インフルエンザ効力アッセイに、コンフォメーション特異性を付与する前選択ステップとして、トリプシン消化を使用しうることを示している（Wen、Hanら、２０１５年）。この前処理の基盤は、天然の融合前ＨＡのトリプシン耐性、ならびに融合後ＨＡおよび他のストレスにかけたＨＡのトリプシン感受性である（Skehel、Bayleyら、１９８２年；Ruigrok、Martinら、１９８６年）。トリプシンは、免疫学的に不活性のＨＡを選択的に分解する。
この実施例は、コンフォメーション的に均質なＨＡ調製物について、ＳＲＩＤが、実のところ、マウスにおいて免疫原性である、ストレスを受けていない推定融合前ＨＡは検出および定量するが、マウスにおいて免疫原性でない、低ｐＨストレスを受けた推定融合後ＨＡは検出しないこともさらに裏付ける。融合後ＨＡは、ブロッティングステップ時に、ＳＲＩＤゲルから選択的に除去される。ＳＲＩＤで使用されるヒツジ抗血清は、ＥＬＩＳＡフォーマットで使用されると、ＨＡのいずれの形態も同等に検出することから、ＳＲＩＤのコンフォメーション選択性が、ＳＲＩＤフォーマットに起因するものであり、抗血清のコンフォメーション選択性に起因するものではないことが示唆される。低ｐＨストレスを受けたＨＡを、ストレスを受けていないＨＡと混合する場合、ＳＲＩＤは、融合前形態と、融合後形態とを識別せず、混合型免疫沈降リング内で、いずれのコンフォメーション異性体も、効率的に検出し、試料中の免疫学的に活性のＨＡ含量を過大評価する。トリプシン前処理が、ＲＰ－ＨＰＬＣに、免疫学的に活性のＨＡを特異的に定量することを可能とするのと全く同様に、トリプシン消化はまた、ＳＲＩＤの精度も改善することから、アッセイに、免疫学的に不活性のＨＡと混合された場合の、免疫学的に活性のＨＡを定量することも可能とする。
結果
マウスにおいて低減されたｐＨへと曝露されたＨＡの免疫原性
融合前コンフォメーションにあるＨＡおよび融合後コンフォメーションにあるＨＡにおける免疫原性について評価するため、マウスを、ｐＨ４．０の緩衝液中でインキュベートされた、０．１μｇの卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡで、２回にわたり免疫化し、次いで、ｐＨ７．２へと戻す（融合後コンフォメーションにあると想定される）か、または一定のｐＨ７．２で維持した（融合前コンフォメーションにあると想定される）。ＨＩを実施して、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによるシチメンチョウ赤血球の血球凝集を遮断しうる、マウス免疫血清中に存在する抗体の力価を査定した。ｐＨ７．２で維持されたＨＡは、３×１０２のＧＭＴ ＨＩ力価を誘発したが、ｐＨ４．０へと一過性に曝露されたＨＡは、＜１０のＧＭＴ ＨＩ力価を誘発した（図８Ａ）。Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞への、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの感染を遮断する、抗体の中和力価を定量するのに、マイクロ中和アッセイもまた使用したが、同様の結果が示された（図８Ｂ）。低ｐＨによるストレスを受けたＨＡは、検出可能な中和応答を誘発しなかったが、中性のｐＨで維持されたＨＡは、抗体の顕著な中和力価を誘発した。したがって、融合前コンフォメーションにあるＨＡは、マウスにおいて、融合後コンフォメーションにあるＨＡより、顕著に免疫原性であり、かつての知見と符合した（Quan、Liら、２０１１年）。また、ＨＡ試料を、天然条件下で、トリプシンにより消化し、マウスを免疫化するのにも使用した。ＨＩアッセイおよびマイクロ中和アッセイのいずれも、ＨＡに対するＨＩ応答および中和抗体応答が、トリプシン消化による影響を受けないことを示した（図８）。
ＨＡの、低減されたｐＨへの曝露についての、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤによる特徴付け
同じＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ試料を、非還元条件下および還元条件下の両方において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、さらに特徴付けた。ｐＨ７．２で維持されたＨＡについての、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるバンド強度と、一過性にｐＨ４．０へと曝露されたＨＡについての、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるバンド強度とは同等であり（図９Ａ）、本発明者らによるかつての知見（Wen、Hanら、２０１５年）と符合した。天然条件下におけるトリプシン処理の後で、低ｐＨによりストレスを受けたＨＡ（非還元試料による）およびＨＡ１（還元試料による）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドが消滅したのに対し、ｐＨ７．２で維持されたＨＡについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドは不変であった。同様に、低ｐＨ処理を伴う未消化ＨＡに由来するＲＰ－ＨＰＬＣによるＨＡ１ピークと、低ｐＨ処理を伴わない未消化ＨＡに由来するＲＰ－ＨＰＬＣによるＨＡ１ピークとは、ほぼ同一であった（図９Ｂ）。しかし、トリプシン消化の後では、低ｐＨにより処理されたＨＡについてのＨＡ１ピークだけが消滅した。Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡに対するＳＲＩＤ基準抗血清によるＥＬＩＳＡを、これらのＨＡ試料について実施した。低ｐＨによるストレスを受けていない未消化ＨＡ、または低ｐＨによるストレスを受けた未消化ＨＡは、ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるＳＲＩＤ抗血清により、同様に認識された（図８Ｃ）。トリプシン処理は、ｐＨ７．２で維持されたＨＡについてのＥＬＩＳＡシグナルをわずかに減少させた（＜１５％の減少）が、低ｐＨストレスを受けたＨＡについてのＥＬＩＳＡシグナルは大幅に減少させた（＞５０％の減少）。これらの結果は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、およびＥＬＩＳＡは、低ｐＨストレスを受けたＨＡと、低ｐＨストレスを受けていないＨＡとについて、同様の結果を示すが、トリプシン処理とカップリングさせると、これらのアッセイは、中性のｐＨで維持されたＨＡを、低ｐＨによるストレスを受けたＨＡから識別することが可能であることを示唆したことから、免疫原性研究による結果と相関する結果がもたらされる（図９Ｅ）。
これらのＨＡ試料について、ＳＲＩＤもまた実施した。予測される通り、中性ｐＨで維持された、トリプシン処理を伴うＨＡと、トリプシン処理を伴わないＨＡとについて、顕著に異なるＳＲＩＤリングが検出され、試料をトリプシン消化したのかどうかに関わらず、低ｐＨへと曝露されたＨＡについては、ＳＲＩＤリングが検出されなかった（図９Ｄ）。したがって、ＳＲＩＤは、マウスにおける、ストレスを受けていないＨＡの免疫原性を、低ｐＨストレスを受けたＨＡの、顕著に低度の免疫原性から自律的に識別し（図８）、トリプシン処理ステップ（例えば、生物学的タンパク質分解）と組み合わせたときの、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、およびＥＬＩＳＡも同様であった（図９Ｅ）。
低ｐＨストレスを受けたＨＡでスパイクされたストレスを受けていないＨＡのＳＲＩＤによる定量
卵により作製されたＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）ＨＡについて、ＳＲＩＤにより査定し、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２１０２（Ｈ３Ｎ２）についての結果と同じ結果を得た：ストレスを受けていないＨＡは、陽性ＳＲＩＤリングにより検出され、低ｐＨストレスを受けたＨＡは、リングをもたらさなかった（図１０Ａ）。驚くべきことに、ストレスを受けていないＨＡを、低ｐＨストレスを受けたＨＡでスパイクしたところ、ＳＲＩＤリングは、強度を低減したが、低ｐＨ処理されたＨＡの添加量の増大と共に、用量反応的に拡大された（図１０Ａ）。リングサイズの定量は、低ｐＨストレスを受けたＨＡの、ストレスを受けていないＨＡへの添加量を、０．５倍から２倍とすると、検出されるＨＡ数量が、２５％から７０％へと増大することを確認した（図１０Ｂ）。また、この試料セットを、トリプシン処理後におけるＲＰ－ＨＰＬＣによっても定量したところ、相対ＨＡ数量は、ストレスを受けていないＨＡ単独と比較して、１００％で維持された（図１０Ｂ）。これらの結果は、ストレスを受けたＨＡと、ストレスを受けていないＨＡとを混合すると、ＳＲＩＤは、いずれの形態のＨＡも検出し、免疫学的に活性のＨＡについてのその特異性を失うことを示した。
本発明者らは次に、ストレスを受けたＨＡと、ストレスを受けていないＨＡとの混合物中の、免疫学的に活性のＨＡについての、このＳＲＩＤによる過大評価が、異なるインフルエンザ株による、さらなるＨＡ試料についても再現可能であるのかどうかについて探索した。卵により作製されたＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ＨＡについて、ＳＲＩＤにより査定し、ストレスを受けていないＨＡ調製物と、ストレスを受けたＨＡ調製物とについて、別個に解析したところ、ストレスを受けていないＨＡについては、陽性ＳＲＩＤリングがもたらされ、低ｐＨストレスを受けたＨＡについては、陰性リングがもたらされた（図１１Ａ）。しかし、ストレスを受けていないＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８ ＨＡを、等量の、低ｐＨストレスを受けたＨＡと混合したところ、ＳＲＩＤリングは、大きくなり、ストレスを受けていないＨＡ単独と比較して１５０％の相対測定ＨＡ数量をもたらした（図１１Ｂ）。ＳＲＩＤの前におけるトリプシン処理は、ストレスを受けていないＨＡに対する相対ＨＡ数量も、ストレスを受けたＨＡ単独に対する相対ＨＡ数量も変化させなかったが、ストレスを受けていないＨＡと、ストレスを受けたＨＡとの混合物について測定されるＨＡ含量を、ストレスを受けていないＨＡ単独の量まで減少させ、免疫沈降リングを、より顕著に異なるものとした（図１１Ａ）。予測される通り、ＲＰ－ＨＰＬＣは、混合物中の総ＨＡ含量を、ストレスを受けていない数量単独の２００％で定量し、トリプシン前処理を伴う場合、ＲＰ－ＨＰＬＣによる混合物の定量もまた、ストレスを受けていないＨＡだけの量へと減少した。
さらなるＨＡ試料である、卵により作製されたＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２もまた、ＳＲＩＤおよびＲＰ－ＨＰＬＣで定量した（図１１Ｃ、１１Ｄ、および１１Ｅ）。各場合に、等量の、低ｐＨストレスを受けたＨＡの、ストレスを受けていないＨＡへの添加は、ＳＲＩＤにより測定されるＨＡ数量の、３０～５０％の増大をもたらした。前ステップとしてのトリプシン消化は、相対ＳＲＩＤ定量を、ストレスを受けていない試料の１００％まで戻した。ＲＰ－ＨＰＬＣ単独は、混合物中の総ＨＡを、ストレスを受けていない試料を２００％として、相対数量で定量した。トリプシン処理はまた、ＲＰ－ＨＰＬＣによる数量も、１００％まで減少させた。これらの結果は、低ｐＨストレスを受けたＨＡを、ストレスを受けていないＨＡと混合する場合、ＳＲＩＤは、ストレスを受けたＨＡを、ストレスを受けていないＨＡの、０％ではなく、２０～５０％で定量することを確認した。これに対し、ｉｎ ｖｉｖｏ効力試験は、低ｐＨストレスを受けたＨＡは、免疫学的に不活性であることを指し示した（図８）。トリプシン処理は、ＲＰ－ＨＰＬＣが、ストレスを受けていないＨＡを、選択的に定量することを可能としただけでなく、また、免疫学的に活性のＨＡの、ＳＲＩＤによる過大評価も補正した。
ＳＲＩＤによるＨＡの定量機構
ＳＲＩＤの機構をよりよく理解するため、本発明者らは、ＨＡを標識化し、ＳＲＩＤゲルへと拡散させるときに、これを追跡した。卵により作製されたＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡを、低ｐＨへと一過性に曝露するか、またはｐＨ７．２で維持し、次いで、各ＨＡ２上に位置する、１つずつの遊離システインを介して、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷマレイミドとコンジュゲートさせた。遠赤外線蛍光走査を伴うＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＨＡ２特異的標識化を確認し、ストレスを受けていないＨＡ上と、ストレスを受けたＨＡ上とで、同等な標識化効率を確認した（データは示さない）。ＩＲＤｙｅで標識化されたＨＡおよび標識化されていないＨＡについて、ＳＲＩＤアッセイにより査定した。ＨＡ試料を、ＳＲＩＤゲルのウェルにロードし、室温で１６時間にわたり、ゲルへと拡散させた。ストレスを受けていないＩＲＤｙｅ標識化ＨＡおよび低ｐＨストレスを受けたＩＲＤｙｅ標識化ＨＡは、ウェルから、ゲル内の同様の距離へと拡散した（図１２Ａ）。濾紙の代わりに、ニトロセルロース膜を使用して、遊離抗原および遊離抗体を払拭した。低ｐＨストレスを受けたＨＡについての膜上の蛍光シグナルは、ストレスを受けていないＨＡについての蛍光シグナルより強かった。非標識化ＨＡについてのブロッティング膜への、抗Ｈ３抗体によるウェスタンブロット法は、ストレスを受けていないＨＡより多くの、低ｐＨストレスを受けたＨＡが、ブロッティング膜へと写し取られていることを確認した。ＳＲＩＤゲルをブロッティングした後における蛍光シグナルは、ストレスを受けていないＨＡ試料についての明瞭な免疫沈降リングと、低ｐＨストレスを受けたＨＡについての弱い塗抹状のシグナルとを示した。同じＳＲＩＤゲルについてのクーマシーブルー染色は、ストレスを受けていないＨＡについての、予測されたＳＲＩＤリングと、低ｐＨストレスを受けたＨＡについてのリングの非存在とを確認した。これらの結果は、低ｐＨストレスを受けたＨＡについての陰性ＳＲＩＤシグナルが、ＳＲＩＤアッセイ時のブロッティングを介するその除去により引き起こされることを示唆した。標識化ＨＡおよび非標識化ＨＡについての、ＳＲＩＤゲルのクーマシーブルー染色が、同一なＳＲＩＤリングプロファイルを示したことから、ＨＡの標識化は、ＳＲＩＤによるＨＡの定量に対して、検出可能な影響を及ぼさないことが確認される。
本発明者らは次に、ストレスを受けていないＨＡを、緑色蛍光シグナルを有するＩＲＤｙｅ８００ＳＷで標識化し、低ｐＨストレスを受けたＨＡを、赤色蛍光シグナルを有するＩＲＤｙｅ６８０ＣＴで標識化し、ＳＲＩＤにより試料を解析した（図１２Ｂ）。緑色シグナルは、ストレスを受けていないＨＡを含有する免疫複合体により形成されるＳＲＩＤリングを示したが、低ｐＨストレスを受けたＨＡを含有する免疫複合体に対応する赤色リングは、目視できなかった。クーマシーブルー染色も、同等の結果を示した。ストレスを受けていないＨＡと、ストレスを受けたＨＡとを、１対１の比で含有する混合型試料では、ストレスを受けていないＨＡは、低ｐＨストレスを受けたＨＡの非存在下で観察される緑色リングより大きな緑色リングを形成した。混合物中の、低ｐＨストレスを受けたＨＡもまた、極めて明確な大きな赤色リングを形成した。重合せ画像は、ストレスを受けていないＨＡについてのリングと、低ストレスを受けたＨＡについてのリングとが重複することを示したことから、ストレスを受けていないＨＡと、ストレスを受けたＨＡとが、混合型免疫沈降リング内で、直接的にまたは間接的に、一体に会合することが示唆される。大きなリングはまた、クーマシーブルー染色によっても検出されたことから、全ＨＡは、ウェルからさらに遠くへ拡散することが指し示され、ストレスを受けたＨＡと、ストレスを受けていないＨＡとの組合せ量を反映する。混合型試料を、トリプシンで消化したところ、ストレスを受けていないＨＡにより形成される緑色リングは、その元のサイズに戻り、ストレスを受けたＨＡにより形成される赤色リングは、消滅した。クーマシーで染色されたリングもまた、ストレスを受けていないＨＡ単独により形成されるリングのサイズに戻った。これらの結果は、トリプシンが、ストレスを受けていないＨＡと共に、混合型免疫沈降リングを形成することが可能な、ストレスを受けたＨＡを消化することを示唆した。
考察
ＨＡの完全性は、ワクチンの作製時および保管時において、生物学的生成物に一般に影響を及ぼす、多数のストレス条件により損なわれうる。加えて、ＨＡは、軽度の低ｐＨで、再構成（ウイルスの細胞への侵入時において、その膜融合機能を果たす）へとプライミングされるため、インフルエンザワクチン中のＨＡは特に、低ｐＨ曝露に対して感受性である。全幅のストレスにかけたＨＡの免疫原性は、完全には探索されていないが、本研究（図８）および他の研究（Quan、Liら、２０１１年）では、マウスにおいて、融合前状態にあるＨＡは、低ｐＨにより、融合後状態への再構成を誘発されるＨＡより強力に、中和抗体を誘発することが示されている。したがって、ＨＡベースのワクチン効力アッセイは、ＨＡコンフォメーションに対して感受性であるべきである。
ＩＩＶ効力についての「ゴールドスタンダード」のサロゲートアッセイであるＳＲＩＤ（Williams、１９９３年）は、効力決定のために、ヒツジ抗血清に依拠する（Wood、Schildら、１９７７年）。ヒツジ抗血清は、完全に天然の融合前コンフォメーションにある場合もあり、そうでない場合もある、精製全ウイルスから抽出されたＨＡにより惹起される。本発明者らの研究では、ＳＲＩＤのために使用されるヒツジポリクローナル抗血清が、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、融合前コンフォメーションにあるＨＡ、および融合後コンフォメーションにあるＨＡのいずれにも、同等によく結合した（図９Ｃ）ことから、抗体のうちの主要部分は、天然の融合前ＨＡに特異的でないことが示唆される。したがって、ＳＲＩＤによる、融合後ＨＡではなく、融合前ＨＡの選択的検出は、ヒツジ抗血清単独の特異性によるのではなく、ＳＲＩＤフォーマットにより決定しなければならなかった。
ＳＲＩＤの根底をなす前提は、アッセイが、リングが大きいほど、割り当てられるＨＡ濃度が大きくなるように、免疫沈降リングのサイズ（直径）だけに基づき、ＨＡを定量するということである（Williams、１９９３年）。アッセイの解釈では、リングの強度も、鋭利さも、考慮されない。ＩＩＶ中のＨＡは、ＨＡ間相互作用、ＨＡ－他のウイルス性タンパク質間の相互作用、およびＨＡ－細胞膜間相互作用を介して、ロゼットおよび他の凝集物を形成する（Tay、Agiusら、２０１５年）。ＳＲＩＤ解析のための、ワクチン抗原の、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによる前処理は、ＨＡを、小型オリゴマーへと分散させるが、完全に均質なＨＡ三量体へは分散させない（データは示さない）。したがって、ＳＲＩＤゲル中では、ＨＡの不均質形態は、推定ＨＡ数量がＨＡ濃度単独と単純には相関しないように、ウェルから多様な距離へと拡散する。
低ｐＨストレスを受けたＨＡまたはストレスを受けていないＨＡの純粋調製物について、ＳＲＩＤは、免疫学的に活性の、ストレスを受けていない形態に対する特異性を示さなかった。さらなる探索は、融合後ＨＡも、融合前ＨＡと同様に、ＳＲＩＤゲルへと拡散するが、クーマシー染色による検出の前のブロッティングステップにより、ゲルから選択的に除去されることを示した。融合後ＨＡの選択的ブロッティングの理由は、完全に明らかではない。ヒツジ抗血清が、融合後ＨＡの純粋調製物を、融合前ＨＡの純粋調製物ほど広範には架橋しない可能性がある（ＥＬＩＳＡフォーマットにおける形態の検出が同様であるにも拘わらず）。
ワクチン調製物中では、比率に多少の増減はあるが、変性するか、損傷するか、または融合後のＨＡが、天然で無傷の融合前ＨＡと一体に存在することが予測される。本発明者らの実験では、ＳＲＩＤは、天然ＨＡと混合した場合の、低ｐＨストレスを受けたＨＡは検出したが、低ｐＨストレスを受けたＨＡ単独は検出しなかった。この観察は、多数の株に由来するＨＡにより再現された。ストレスを受けていないＨＡと、低ｐＨストレスを受けたＨＡとの、代替的蛍光シグナルによる差別的標識化が、低ｐＨストレスを受けた融合後ＨＡは、天然の融合前ＨＡと共に、混合型免疫沈降リングを形成することを示したことから、これらの２種のＨＡは、直接的にまたは間接的に、一体に会合することが示唆される。ヒツジ抗血清は、ＥＬＩＳＡでは、ＨＡのいずれの形態にも同等に結合するが、また、見かけ上、いずれのＨＡコンフォメーション異性体とも架橋形成することが可能であり、ＳＲＩＤで検出可能な、３つの成分による複合体も形成する。混合リングは、クーマシー染色後において、おそらく、ヒツジ抗血清により、ＨＡ混合物の架橋が損なわれたことを反映して、純粋な融合前リングほど明瞭ではなかった。しかしながら、複合体内の高ＨＡ濃度により、天然ＨＡおよび抗血清単独により形成されるリングより大きなリングのサイズがもたらされる結果として、免疫学的に活性のＨＡ含量についての過大評価がなされた。
天然条件下で、トリプシンは、低ｐＨ、高温、および脱アミド化の影響を受けたＨＡを選択的に消化する（Wen、Hanら、２０１５年）。免疫学的に不活性のＨＡを除去することにより、ＨＡを変性させる効率的で正確な生物物理的ＨＡ定量方法の前における前処理として、トリプシン消化を使用し、アッセイにコンフォメーション感受性を付加することができる。本実施例において、本発明者らは、トリプシン前処理が、大きな混合型ＳＲＩＤリングを、天然ＨＡ単独の濃度に対応するサイズに戻すことを示した。トリプシン消化された、低ｐＨストレスを受けたＨＡと、ストレスを受けていないＨＡとの混合物により形成されるＳＲＩＤリング内では、融合後ＨＡについての蛍光シグナルは検出可能でなかったことから、消化が、検出可能な３つの成分による免疫沈降リングを形成することが可能な融合後ＨＡを除去したことが示唆される。
ＳＲＩＤはかつて、ＷＨＯおよび国内規制機関により、インフルエンザワクチン効力の定量について承認され、インフルエンザワクチン製造元により、ＨＡ定量のための「ゴールドスタンダード」として広範に使用された。実際、ＨＡ定量においてＳＲＩＤに見合うことの必要は、潜在的により高精度で、正確で、効率的なインフルエンザワクチン効力アッセイの導入に対する障壁である。本発明者らは、本実施例において、ＳＲＩＤが、融合後ＨＡと混合された場合に、免疫学的に活性のＨＡを体系的に過大評価することを示した。トリプシン前処理は、各株の変化に応じた、ヒツジ抗血清の作出を要請しない、生物物理的ＨＡ定量アッセイに対して、コンフォメーション選択性を付与しうるのと全く同様に、また、免疫学的に活性のＨＡについての、ＳＲＩＤによる過大評価も補正する。この補正は、ＳＲＩＤによるワクチンの製剤化および出荷を改善し、また、これに見合う、より「ピュアなゴールド」スタンダードをもたらすことにより、改良型効力アッセイの導入も容易としうるであろう。
方法
インフルエンザの基準試薬
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に対する、ヒツジポリクローナル基準抗血清、および較正基準抗原は、米国食品医薬品局の、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＦＤＡ ＣＢＥＲ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）により提供された。
インフルエンザワクチン
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／０２／２０１２、およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のモノバルク（サブユニットワクチン抗原の非ブレンドロット）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓにより作製された。卵により作製されたモノバルクは、パイロットバッチまたは操作バッチからの、Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）サブユニットインフルエンザワクチン工程により、孵化させた鶏卵から作製した。
低ｐＨによる試料へのストレス
インフルエンザモノバルクは、ｐＨ４．０の５０ｍＭクエン酸により、室温で３０分間にわたり処理した。ｐＨ８．５、１０％（容量／容量）の１Ｍトリスを添加して、ｐＨを、７．２へと中和させた。試料は、解析するまで、４℃で保管した。
トリプシンによる消化
試料を、ＰＢＳ中、トリプシン（ＨＡ １００μｇ当たり５０Ｕ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、３７℃で、１２０分間にわたりインキュベートした。トリプシンによる消化は、０．１ｍＭのＮ－α－トシル－Ｌ－リシニル－クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ；Ｓｉｇｍａ）を添加することにより停止させた。試料は、解析するまで、４℃で保管した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、およびＳＲＩＤ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、およびＳＲＩＤについては、（Wen、Hanら、２０１５年）において記載されている。直接的ＥＬＩＳＡのために、プレートを、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌのＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ＨＡにより、室温で、一晩にわたりコーティングし、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）で、４回にわたり洗浄し、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ（ＰＢＳＢ）で、６０分間にわたりブロッキングした。次いで、ＰＢＳＢ中のヒツジ血清の希釈系列を、プレート上で、９０分間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで、４回にわたり洗浄し、捕捉されたＩｇＧを、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒツジＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、６０分間にわたり検出した後、ＰＢＳＴで、４回にわたり洗浄し、テトラメチルベンジジン（berzidine）基質を伴う、３０分間にわたるインキュベーションを行った。プレートは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ）により読み取った。
免疫原性研究
０および２１日目において、８～１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、後側四頭筋における、０．１μｇのＨＡを伴う、５０μｌの両側筋内注射により免疫化した（１群当たりマウス１０匹）。血清試料は、２０日目における眼窩後採血と、４２日目における、安楽死させた動物からの全採血とにより得た。全ての研究は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
血清学的解析
血清試料を、ＨＩおよびインフルエンザマイクロ中和アッセイにより、中和抗体について調べた。
ＨＩのために、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）により、５６℃で、３０分間にわたり熱不活化させた血清試料を、系列希釈し、次いで、９６ウェルプレート内、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスと共に、２～８℃で、６０分間にわたりインキュベートした。シチメンチョウ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｓ）を添加し、各ウェル内で混合し、混合物を、２～８℃で、９０分間にわたりインキュベートした。
マイクロ中和のために、不活化血清試料を、系列希釈し、次いで、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスと共に、３７℃で、２時間にわたりインキュベートした。これらの血清およびウイルス混合物を、９６ウェルプレート内で調製されたＭＤＣＫ細胞へと添加し、３７℃で一晩にわたりインキュベートした。感染細胞を、氷冷１：１アセトン：メタノール溶液で固定し、ＰＢＳＢでブロッキングし、抗Ａ型インフルエンザ一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートさせたヤギ抗マウス二次ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴うインキュベーションの後、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ５ ＵＶ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ）を使用して、蛍光細胞をカウントした。
ＩＲＤｙｅによるＨＡの標識化
ＰＢＳ中のＨＡを、水中で再構成された、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷマレイミドまたはＩＲＤｙｅ６８０ＣＴ（ＬＩ－ＣＯＲ）と共に、室温で、２時間にわたりインキュベートした。遊離ＩＲＤｙｅは、販売元により提供されているプロトコールに従い、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）により除去した。ＩＲＤｙｅは、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉｃｏｒ）により検出した。
（実施例７）
ストレス条件のパネルへと曝露されたインフルエンザ抗原試料を使用する、ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＳＲＩＤによる効力アッセイの結果と、免疫原性研究との相関
本発明のインフルエンザワクチン効力アッセイは、多様なストレス条件へと曝露された、多様なＡ型ウイルスの亜型およびＢ型ウイルスの亜型に由来する抗原を使用する、ＳＲＩＤおよび免疫原性研究（ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイおよびマイクロ中和（ＭＮ）力価）との優れた相関を有する結果をもたらしうる。例えば、実施例４および６、ならびに図３～５および８～９を参照されたい。
本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス株のＨ３Ｎ２亜型およびＨ１Ｎ１亜型に由来する抗原を使用して、さらなる研究を実行した。抗原モノバルクを、同一な群に分け、次いで、それらの各々を、低ｐＨ（３０分間にわたるｐＨ４．０）、凍結／融解（トリス緩衝液中で５回にわたる）、脱アミド化（３７℃で２４時間にわたるｐＨ１１．０）、およびボルテックスストレス（室温で３０分間にわたるボルテックス）、またはストレスなし（対照）を含む、異なるストレス条件へと曝露した。前トリプシン処理を伴わないか、またはこれを伴う、ＲＰ－ＨＰＬＣおよびＳＲＩＤを使用して、各群に由来する試料中のＨＡ数量を測定した。本発明者らは、前トリプシン処理を伴わないＲＰ－ＨＰＬＣにより測定される相対ＨＡ数量（例えば、前トリプシン処理を伴わない対照群についてのＳＲＩＤ結果と比べた）が、全ての被験ストレス条件について、ＳＲＩＤ結果（前トリプシン処理を伴うかまたは伴わない）と良好に相関しないことを見出した。これに対し、前トリプシン処理を伴うＲＰ－ＨＰＬＣにより測定される相対ＨＡ数量は、とりわけ、前トリプシン処理を伴って実行されたＳＲＩＤについて、ＳＲＩＤ結果と、良好に相関した。例えば、低ｐＨ（顕著な）および脱アミド化（わずかな）は、ＳＲＩＤ（トリプシン処理を伴うかまたは伴わない）および前トリプシン処理を伴うＲＰ－ＨＰＬＣにより測定されるＨＡ数量を減少させた。凍結／融解ストレスおよびボルテックスストレスは、ＳＲＩＤ（トリプシン処理を伴うかまたは伴わない）または前トリプシン処理を伴うＲＰ－ＨＰＬＣにより測定されるＨＡ数量をそれほど減少させなかった。
ＨＩアッセイおよびＭＮアッセイを使用して、同じストレス群および同じ対照Ｈ３Ｎ２抗原試料群による免疫原性をさらに調べた。０および２１日目に、各群に由来する抗原を、群１つ当たり８匹ずつのＢＡＬＢ／ｃ雌マウスへと投与し（０．１μｇのＨＡ用量）、４２日目の採血（２回目の免疫化の３週間後）を使用することにより、各群に対する抗血清を作出した。次いで、抗血清を、ＨＩアッセイおよびＭＮアッセイにおいて使用した。予備結果は、ＨＩおよびＭＮにより測定される免疫原性が、少なくとも、低ｐＨ群、凍結／融解群、およびボルテックスストレス群について、前トリプシン処理を伴うＲＰ－ＨＰＬＣおよびＳＲＩＤにより決定される相対ＨＡ数量と相関することを確認した。
Figure 0007232893000003
Figure 0007232893000004
Figure 0007232893000005
Figure 0007232893000006
本発明について、例だけを目的として記載してきたが、本発明の範囲および精神の範囲内にとどまりながら、改変を行いうることが理解されるであろう。

Claims (17)

  1. 試料中の免疫原性インフルエンザＨＡを定量するための方法であって、
    ａ）前記試料を、生物学的タンパク質分解に供するステップであって、不活性ＨＡが消化され、前記免疫原性ＨＡが消化されないままであり、前記生物学的タンパク質分解が、プロテアーゼによるタンパク質分解を含み、さらに、前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼである、ステップと；
    ｂ）（ａ）からの前記試料中の免疫原性ＨＡの量を、ＳＲＩＤアッセイにより定量するステップと
    を含む、方法。
  2. ステップ（ｂ）が抗血清の使用を伴って実行される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗血清がポリクローナル抗血清および／またはモノクローナル抗体抗血清である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ポリクローナル抗血清がヒツジ抗血清である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記セリンプロテアーゼが、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、またはスブチリシン様プロテアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記プロテアーゼが前記試料に直接添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記試料が、融合前ＨＡおよび融合後ＨＡを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記試料が、全ビリオンインフルエンザワクチン、スプリットインフルエンザワクチン、サブユニットインフルエンザワクチン、および組換えインフルエンザワクチンからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記試料が、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるインフルエンザ株に由来するＨＡを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記試料が、インフルエンザワクチンバルク調製物、またはインフルエンザワクチンから採取された、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記バルクまたは前記ワクチンが多価である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記試料がアジュバントを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記アジュバントが水中油エマルジョンアジュバントである、請求項１３に記載の方法。
  15. ａ）前記試料中のＨＡの少なくとも６０％が免疫原性形態にある；
    ｂ）前記試料中のＨＡの２０％未満が不活性形態にある；および／または
    ｃ）前記試料中の免疫原性ＨＡ：不活性ＨＡの比は少なくとも４：１である、
    請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. インフルエンザワクチンを製造するための請求項１～１５のいずれかに記載の方法であって、
    ａ）インフルエンザＨＡを含むバルク調製物に由来する試料を提供するステップと；
    ｂ）免疫原性ＨＡの量を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法に従い定量するステップと；
    ｃ）単位剤形を、前記バルク調製物から、前記試料中の免疫原性ＨＡの量に従いパッケージングするステップと
    を含む、方法。
  17. インフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
    ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法により、バルクワクチン中のＨＡの量を定量するステップと；
    ｂ）ワクチンを前記バルクから調製するステップと
    を含む、方法。
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