JP2015526062A - 改善された安全性試験 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ワクチン抗原または組換えタンパク質のような、宿主細胞で産生される生物学的産物を含む組成物の、安全性試験の改善された方法を提供する。1つの実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のDNA安全係数を決定するための方法を提供する:a)宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する;b)増幅したDNAを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する;c)その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物の用量中の癌遺伝子の数を計算する;およびd)DNA安全係数(SF)を決定する。

Description

本特許出願は、2012年6月4日に出願された米国特許仮出願第61/655,178号の優先権の利益を請求し、その内容は、本開示に参照によって組み込まれる。
本発明は、助成金番号HHSO100200600012Cによる国庫支出金より部分的になされた。政府は本発明における特定の権利を有する。
本発明は、生物学的産物の安全性試験の分野である。
細胞由来ワクチンにおける残留DNAのリスクを特徴付けるために、DNA安全係数を決定し得る。安全係数は、少なくとも5%の可能性で腫瘍原性の事象を引き起こすために個人に注射しなければならない、ワクチン用量の数を示す。2005年、米国食品医薬品局(FDA)は、哺乳類細胞培養において調製された抗原を含むワクチンに関して、>10の安全係数を推奨した[1]。
以前に、細胞培養に基づく生物学的産物の安全性を、キャピラリーゲル電気泳動によって残留DNAサイズ分布を決定することによって評価した。規定の長さのDNA断片の数を評価することによって、ヒトの用量当たりの癌遺伝子の潜在的な数、およびその結果としてのDNA安全係数を計算した。しかし、この方法は、非機能的な長いDNA断片(例えばアルキル化またはニックの入ったDNA)を計算から除外せず、そしてサンプル中の機能的な癌遺伝子の実際の数を過大に評価する。
参考文献2は、癌遺伝子の推定数を、サンプル中のDNAの全量と関連付けることによって、安全係数を決定する方法を開示する。それは、酵素の不活性化のために、安全係数は多くの場合不正確であることを教示し、そして酵素の不活性化を考慮する代替の計算を示唆する。
ワクチンのような、細胞培養由来の生物学的産物の安全性を評価するための、さらなる、およびより正確なアッセイを提供することが、本発明の目的である。
Sheng−Fowler et al. (2010) Int J Biol Sci; 6(2):151−162 Yang et al. (2010) Vaccine. 28(19):3308−11
(本発明の開示)
本発明者らは、細胞培養由来生物学的産物の安全性を評価するための改善されたアッセイを提供し、それはDNA安全係数をより正確に評価することを可能にする。
1つの実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のDNA安全係数を決定するための方法を提供する:
a)宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する;
b)増幅したDNAを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する;
c)その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物の用量中の癌遺伝子の数、
Figure 2015526062
を計算する;および
d)DNA安全係数(SF)を決定する。
DNA安全係数SFを、好ましくは式
Figure 2015526062
によって決定し、式中、
Figure 2015526062
は、組成物の用量中に存在し得る、用量当たりの癌遺伝子の最大数である。
増幅工程に起因して、例えばニックの入った、またはアルキル化された非機能的DNA断片は、そのようなDNA分子は増幅のための良くない鋳型であるので、分析から除外される。よってDNA安全係数を計算する場合に、機能的DNAのみが考慮され、それはその方法の正確性を改善する。
本発明はさらに、宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物を提供し、ここでその組成物は、1mLあたりn個より少ない反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を含み、ここでnは式
Figure 2015526062
によって計算され、式中、Rは宿主細胞における反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合である。
生物学的産物を含む組成物を作製する方法も提供され、それは(a)宿主細胞を培養してその生物学的産物を産生する;(b)(a)において産生された生物学的産物から組成物を調製する;および(c)本発明による方法によって、その組成物のDNA安全係数を決定する工程を含む。その組成物はワクチン組成物であり得、そしてその方法は、(a)宿主細胞を培養してウイルスを産生する;(b)(a)において産生されたウイルスからワクチンを調製する;および(c)本発明による方法によって、そのワクチン組成物のDNA安全係数を決定する工程を含み得る。
本発明はさらに、細胞を特徴付ける方法を提供し、それは
(a)その細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する;
(b)その増幅したDNAを用いて、その細胞におけるその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する;および
(c)反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Rを計算する工程を含む。
その割合Rを、好ましくは式
Figure 2015526062
によって計算し、
式中、
onco:ゲノムあたりの癌遺伝子の数
rep:反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子の数[rep/mL]
DNA:テストサンプル中の細胞DNAの濃度[pg/mL]
hap.gen.:細胞の一倍体ゲノムの質量
である。
安全係数
ワクチンの安全係数(SF)を、式
Figure 2015526062
によって計算し、
式中、
Figure 2015526062
は、組成物の用量中に安全に存在し得る癌遺伝子の最大数であり、そして
Figure 2015526062
は、組成物の用量あたりの計算された癌遺伝子数である。
腫瘍を誘発する発癌性DNAの臨界用量が、米国食品医薬品局(FDA)によって決定された。2つの癌遺伝子をコードする、直鎖状DNA断片の800pgの量が、テスト動物において腫瘍を引き起こすために十分であることが見出された。この量は、研究において使用された発現プラスミドの長さに基づいて、8.0×10の二重癌遺伝子と同等である[3]。両方の遺伝子が同じDNA断片に位置するその構築物のデザインは、癌遺伝子が別のプラスミドにあるよりも、腫瘍の誘発においてより有効であることが以前に示された。効率の増加は、約20の係数であった、すなわち、2つの癌遺伝子が同じプラスミドに位置する場合、それらが別々のプラスミドにある場合よりも、腫瘍を誘発するために必要な全DNAが約20倍少ない。この情報に基づいて、腫瘍を誘発するために必要な癌遺伝子断片の臨界数を、式
Figure 2015526062
によって計算し得る。
組成物中の反復エレメントおよび/またはハウスキーピング遺伝子の数に基づいてDNA安全係数を評価するために、宿主細胞のゲノムにおける、癌遺伝子および反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子の間の割合を知ることも必要である。この割合を、例えばその生物学的産物を産生する宿主細胞からゲノムDNAを抽出し、必要に応じてその抽出DNAを希釈し、そしてその抽出DNAの希釈系列を提供することによって決定し得る。その希釈サンプルを、反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅するプライマーを用いて、DNA増幅(例えばPCRによる)にかける。次いでそのサンプルを、例えばアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして増幅産物が検出できない最も高い希釈を決定する。反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数(Nrep)を、以下の式によって決定し得、ここで「DL」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり(反復エレメント/mL)、「PCR(−)」は最初の陰性増幅シグナルの希釈係数を示し、そして「希釈」は必要に応じてDNA抽出の後に行い得る任意の最初の希釈の希釈係数を指す:
Figure 2015526062
特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界DLは、使用する増幅条件によって変動する。それを、アッセイにおいて増幅する反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の断片を発現ベクターにクローニングし、そして既知の量のプラスミドを有するベクターの希釈系列を調製することによって決定し得る。そのベクターを、アッセイにおいて使用することが意図される特定の増幅条件を用いたDNA増幅の鋳型として使用し、そしてこれらの条件下で最も低い検出可能なベクターの量を、例えばアガロースゲルにおいて増幅産物が検出できない希釈係数を決定することによって決定する。コピー数を計算するために、ベクター中のヌクレオチドの数を決定し、そして1.1×10−9pg/bpの係数をかける。この計算から、全増幅DNAの重量を、個々のベクターの重量で割ることによって、ベクターのコピー数を決定し得る。それぞれのベクターは単一の断片しか含んでいないので、増幅産物が依然として検出可能な最も低い希釈におけるベクターの数は、その断片の検出限界と同等である。この技術を用いて、本発明者らは、例えばLINEエレメントの検出限界は、Tris緩衝液において1mLあたり10,000 LINEであることを示すことができた。
反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Rを、以下のように計算し得る:
Figure 2015526062
式中、Nonco:ゲノムあたりの癌遺伝子の数
rep:反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子の数[rep/mL]
DNA:テストサンプル中の宿主細胞DNAの濃度[pg/mL]
hap.gen.:一倍体ゲノムの質量
宿主細胞の一倍体ゲノムの質量は、通常当該分野において公知であり、そして例えばAnimal Genome Size Database[4]において見出し得る。例えば、MDCK細胞の一倍体ゲノムは、一倍体ゲノムあたり3.09pgの質量を有し、そしてCHO細胞は、一倍体ゲノムあたり2.73pgの質量を有すると推定される。同様に、ゲノム中の癌遺伝子の数を、文献から得ることができる。例えば、MDCK細胞は、ゲノムあたり10個の癌遺伝子を有すると推定される。
これらの値を用いて、本発明者らは、例えばMDCK細胞におけるLINEエレメントの値は、LINEエレメントあたり6.2×10−6個の癌遺伝子であることを計算した。
その割合Rを、各宿主細胞に関して個々に決定し得る。しかし、生物学的産物は、多くの場合医薬品組成物の産生に適切な、特定の細胞系において増殖する。そのような細胞系の例は、MDCK細胞(MDCK33016[33]のような)、CHO細胞、ベロ細胞(例えば、カタログ番号CCL81、CCL81.2、CRL1586およびCRL−1587American Type Cell Culture(ATCC)コレクションの下で得られるもの)、293T細胞、およびPER.C6細胞を含む。これらの細胞を、ワーキングセルバンクまたはマスターセルバンク(American Type Cell Culture(ATCC)コレクション[5]、Coriell Cell Repositories[6]、またはEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)から入手可能なもののような)から得ることができ、そしてそのようなセルバンク由来の細胞において割合Rを決定することが可能である。各宿主細胞を個々に試験する必要を回避するので、これは好ましい。従って、本発明は、細胞を特徴付ける方法を提供し、それは(a)細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する;(b)その増幅したDNAを用いて、その細胞におけるその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する;および上記で議論した式によってRの割合を計算する工程を含む。
本発明の方法によって特徴付けられた宿主細胞を、生物学的産物を作製するための方法において使用し得る。従って、本発明は、(a)本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける;および(b)その宿主細胞の培養物を用いて、生物学的産物を調製する工程を含む、生物学的産物を作製するための方法を提供する。その生物学的産物は、ウイルスであり得、その場合、その方法は、(a)本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける;および(b)その宿主細胞の培養物を用いて、ウイルスを調製する(例えば、宿主細胞にウイルスを感染させる、または逆遺伝学のための1つまたは複数の発現構築物でそれをトランスフェクトすることによって)工程を含み得る。そのウイルスを調製する工程は、宿主細胞培養物にウイルスを感染させる、または逆遺伝学のための1つまたは複数の発現構築物でそれをトランスフェクトする、およびその宿主細胞培養物を培養してウイルスを産生する工程を含み得る。宿主細胞培養物にウイルスを感染させる工程は、培養物中のあらゆる単一細胞が感染することを必要としないことが理解される。そうではなく、培養物中の1つまたは複数の細胞が感染すれば十分である。
(a)本発明の方法によって、宿主細胞を特徴付ける;(b)その宿主細胞の培養を用いて、生物学的産物を調製する;および(c)(i)工程(b)で産生した生物学的産物または(ii)工程(b)で産生した生物学的産物から作製した化合物を含む組成物を調製する工程を含む、組成物を作製する方法も提供される。その組成物がワクチンである場合、その方法は、(a)本発明の方法によって宿主細胞を特徴付ける;(b)その宿主細胞の培養を用いてウイルスを産生する(例えば、その宿主細胞にウイルスを感染させる、または1つまたは複数の逆遺伝学のための発現構築物でトランスフェクトすることによって);(c)その細胞を培養してウイルスを産生する;および(d)(c)で産生したウイルスを用いてワクチンを調製する工程を含み得る。
生物学的産物を細胞において産生する場合、セルバンクシステム(細胞シードシステムとしても公知である)を用いるのが、一般的な方法である。これらのシステムは、当該分野において周知である。簡単には、これらのシステムは、マスターセルバンク(マスター細胞シード)由来の細胞において、その生物学的産物を産生することを含む。マスターセルバンクから、1つまたは複数の作業用セルバンク(作業用細胞シード)を産生し得る(例えば希釈、継代等によって)。本発明の方法を用いて、マスターセルバンク、または特定のマスターセルバンク由来のあらゆるセルバンク由来の細胞を特徴付け得る。従って、本発明は、生物学的産物を産生するための方法を提供し、それは(a)本発明の方法によって、セルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する;および(b)そのセルバンク由来の細胞を用いて、生物学的産物を調製する工程を含む。その生物学的産物はウイルスであり得、その場合本方法は、(a)本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けたセルバンク由来の細胞を提供する;および(b)そのセルバンク由来の細胞を用いてウイルスを調製する工程を含む。ウイルスを調製する工程は、その細胞にウイルスを感染させ、そしてその細胞を培養してウイルスを産生する工程を含み得る。これらの方法の工程(a)において特徴付けられた細胞は、工程(b)において生物学的産物を産生するために使用される、同じセルバンク由来の細胞であり得る。その細胞はまた、特徴付けられる細胞および生物学的産物を産生するために使用される細胞が、同じマスターセルバンクのクローンまたは子孫であるなら、異なるセルバンク由来であり得る。
組成物を作製する方法も提供され、それは(a)本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する;(b)そのセルバンク由来の細胞を用いて、生物学的産物を調製する;および(c)(i)工程(b)で産生された生物学的産物、または(ii)工程(b)で産生された生物学的産物から産生された化合物を含む組成物を調製する工程を含む。その組成物がワクチンである場合、その方法は、(a)本発明の方法によってセルバンク由来の細胞を特徴付ける、または本発明の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する;(b)そのセルバンク由来の細胞を用いてウイルスを調製する;および(c)(b)において産生されたウイルスからワクチンを調製する工程を含み得る。
工程(b)で使用される細胞は、工程(a)で使用される細胞の子孫であり得る、および/またはそれは工程(a)で使用される細胞のクローンであり得る、および/またはそれは工程(a)および(b)の間に少なくとも1回、工程(a)で使用される細胞から継代された細胞であり得る。細胞を特徴付ける方法をまた、ワクチンを調製するための方法において使用し得、ここで(a)細胞を本発明の方法によって特徴付ける;(b)その細胞にウイルスを感染させる;(c)その細胞を培養して、ウイルスを産生する;および(d)(c)において産生されたウイルスからワクチンを調製する。
例えば、宿主細胞を特徴付ける工程は通常細胞を損傷する、または破壊するので、前の段落の方法の工程(a)および(b)において使用される細胞は、通常同一ではない。従って、工程(b)で使用する細胞は、工程(a)で使用する細胞の子孫であり得る、および/またはそれは工程(a)で使用する細胞のクローンであり得る、および/またはそれは工程(a)および(b)の間に少なくとも1回、工程(a)で使用する細胞から継代された細胞であり得る。その細胞は、工程(a)および(b)の間に、少なくとも2回(例えば5回より多く、10回より多く、20回より多く、または40回より多く)継代され得る。これらの方法において使用される細胞は、例えばMDCK、CHO、Per.C6またはベロ細胞のような細胞系由来であり得る。
一旦割合Rが既知となったら、組成物中の癌遺伝子の濃度(conco)を、式
Figure 2015526062
によって計算し得、
式中、「DL」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり(反復エレメント/mL)、そして「PCR(−)」は、最初の陰性PCRシグナルの希釈係数を示す。
PCRの代わりに、任意の公知のDNA増幅技術を用いて、本発明を実施することも可能である。次いで記載された方法および計算を、使用した特定の増幅技術に適合させる。例えば、DNAを、ローリングサークル型(RCL)増幅を用いて増幅する場合、上記の計算を、最初の陰性RCLシグナルの希釈係数を参照するよう適合させる。
用量中の癌遺伝子の実際の数
Figure 2015526062
は、理論的な考察であり、それは異なる因子に依存して計算し得る。例えば、DNA安全係数を、組成物の用量は、x ng、例えば10ngのDNA含有量を有するという仮定を用いて計算し得る。この場合、その安全係数は、組成物の用量の仮定DNA含有量(例えば10ng)に対して算出され、そして式
Figure 2015526062
によって計算され、
式中、concoは、モノバルク(monobulk)中の癌遺伝子の濃度であり[癌遺伝子/mL]、そしてcDNAはモノバルク中のDNA濃度である[ng/mL]。DNA含有量を、定量的DNAアッセイによって、例えばピコグラムレベルの全DNAのための定量的アッセイであり、生物学的産物中の混入DNAのレベルをモニタリングするために使用されるThresholdTMアッセイによって測定し得る[7]。典型的なアッセイは、ビオチン化ssDNA結合タンパク質、標識化(例えばウレアーゼコンジュゲート化)抗ssDNA抗体、およびDNAの間の反応複合体の非配列特異的な形成を含む。DNAを定量する別の方法も当該分野において公知であり、そしてサザンブロットまたはスロットブロット[8]のようなハイブリダイゼーション法、および定量的PCR[9]を含む。様々な商業的製造会社、例えばAppTecTM Laboratory Services、BioRelianceTM、Althea Technologies等が、残留宿主細胞DNAを検出するための定量的PCRアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞DNAの混入を測定するための、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイおよび全DNA ThresholdTMシステムの比較を、参考文献10において見出し得る。
あるいは、安全係数SFを、組成物の用量体積に関して計算し得る。この実施態様において、DNA安全係数を、式
Figure 2015526062
によって計算し、式中、Vdoseは、組成物の用量の体積である[mL]。
組成物の用量は多くの場合有意に10ng未満のDNAを含み、そして従ってこのDNA含有量に対して安全係数を外挿することは、その安全係数は組成物の実際の用量体積を有意に超える理論的用量に関して計算されることを意味し得るので、(DNA含有量とは対照的に)用量体積に関連して安全係数SFを計算することは、より現実的な安全係数の値を提供するという利点を有する。
DNA安全係数の最も現実的な評価は、用量あたりの生物学的産物の濃度(cdose)、例えばワクチンの抗原含有量または組換えタンパク質の量に関して計算することである。その安全係数を、式
Figure 2015526062
によって計算し、式中、cdoseは、用量当たりの生物学的産物の濃度[μg/用量]であり、そしてcactualは、組成物中の活性成分の実際の濃度[μg/mL]である。例えば、三価の季節性インフルエンザワクチンは、典型的には用量あたり45μgの赤血球凝集素(HA)のHA濃度を有し、この場合その安全係数を式
Figure 2015526062
によって計算する。
サンプル中の活性成分の実際の濃度を測定する方法は、当該分野で公知である。例えば、ワクチンのHA含有量を、一元放射免疫拡散(「SRiD」)アッセイ[11、12]によって決定し得、そして全タンパク質濃度を、Bradfordアッセイ[13]によって測定し得る。
10未満の安全係数を有する組成物を却下し得る。
組成物
本発明の組成物は、宿主細胞において産生し得るあらゆる産物であり得る生物学的産物を含む。適切な生物学的産物は、細胞培養において増殖したウイルス由来のワクチン抗原、および組換えタンパク質を含む。
本発明の組成物は、単一の生物学的産物を含み得るが、2つまたはそれ以上の生物学的産物、例えば2つまたはそれ以上の異なる抗原または組換えタンパク質も含み得る。その2つまたはそれ以上の生物学的産物は、好ましくは全て宿主細胞において産生された。しかし、本発明の組成物はまた、それが宿主細胞において産生された少なくとも1つの生物学的産物を含むという条件で、宿主細胞において産生されていない生物学的産物を含み得る。
その組成物は、好ましくは卵由来物質を含まない(例えば、オボアルブミンを含まない、オボムコイドを含まない、ニワトリDNAを含まない)。組成物中の生物学的産物は、好ましくは、MDCKのような哺乳類細胞系(例えば本明細書中で記載された細胞系)における増殖から得られるグリカンでグリコシル化されている。
その組成物は、細胞培養物中で増殖し得るウイルス由来の抗原である生物学的産物を含むワクチン組成物であり得る。そのようなウイルスは、当該分野で公知であり、そして例えば、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ロスリバーウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ロタウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、狂犬病および黄熱を含む。
本組成物は、好ましくはヒトにおいて使用することが意図される組成物、特にワクチン組成物である。安全係数を正確に決定することが、そのようなワクチンにおいて最も重要であるので、これは好ましい。そのようなワクチンの例は、インフルエンザワクチン(例えばOptafluTM)、狂犬病ワクチン(例えばRabAvertTM)、B型肝炎ワクチン(GenHevacBTM)、麻疹ワクチン(例えばAttenuvaxTM)、流行性耳下腺炎ワクチン(例えばMumpsvax)、風疹ワクチン(例えばMeruvaxIITM)、および麻疹、流行性耳下腺炎および風疹併用ワクチン(例えばM−M−R IITM)である。
卵においてこれらのウイルスを増殖させる従来の方法に関連する欠点に起因して、細胞培養におけるインフルエンザワクチンの増殖は、特に有利であると考えられるので、本発明は、インフルエンザワクチン組成物に特に適切である。例えば、インフルエンザウイルスは迅速な変異を起こすためインフルエンザワクチンは頻繁に変更する必要があり、そしてワクチンは多くの場合、特にパンデミックの間、早急に利用可能である必要があるので、卵におけるインフルエンザウイルスの増殖が、最大6ヶ月までの長い準備期間が必要であることは、問題であり得る。
ワクチン組成物、特にインフルエンザワクチンは一般的に、生ウイルス、または不活性化ウイルスのどちらかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、または精製された表面抗原に基づき得る。抗原をまた、ビロソームの形式で提示し得る。本発明を、これらの型のワクチンのいずれにも使用し得る。
不活性化ウイルスを用いる場合、そのワクチンは、ビリオン全体、スプリットビリオン、または精製された表面抗原(赤血球凝集素を含む、および通常ノイラミニダーゼも含む)を含み得る。ウイルスを不活性化する化学的な手段は、有効な量の1つまたは複数の以下の薬剤による処理を含む:界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン(C60)、バイナリーエチルアミン(binary ethylamine)、アセチルエチレンイミン、またはその組み合わせ。例えばUV光またはガンマ線照射のような、ウイルス不活性化のための非化学的方法が、当該分野で公知である。
ビリオンを、ウイルスを含む液体、例えば尿膜液または細胞培養上清から、様々な方法によって回収し得る。例えば、精製過程は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む、線形ショ糖勾配溶液を用いたゾーン遠心分離を含み得る。次いで抗原を、任意で希釈した後、ダイアフィルトレーションによって精製し得る。
「Tween−エーテル」スプリット過程を含む、精製ビリオンを界面活性剤(例えばエチルエーテル、ポリソルベート80、デオキシコール酸、トリ−N−ブチルホスフェート、Triton X−100、Triton N101、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、Tergitol NP9等)で処理してサブビリオン調製物を産生することによって、スプリットビリオンを得る。例えば、インフルエンザウイルスをスプリットする方法は、当該分野で周知であり、例えば参考文献14〜19等を参照のこと。ウイルスのスプリットを、典型的には、感染性または非感染性に関わらず、破壊濃度のスプリット剤で、ウイルス全体を破壊または断片化することによって行う。その破壊は、完全なまたは部分的なウイルスタンパク質の可溶化を引き起こし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット剤は、非イオン性およびイオン性(例えば陽イオン性)界面活性剤(例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、N,N−ジアルキル−グルカミド、Hecameg、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、NP9、4級アンモニウム化合物、サルコシル、CTAB(セチルトリメチルアンモニウム臭化物)、トリ−N−ブチルホスフェート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびDOT−MA)、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えばTriton X−100、またはTriton N101のようなTriton界面活性剤)、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(Tween界面活性剤)、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等である。1つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を用い、そしてスプリットは最初のビリオンの精製の間に起こり得る(例えばショ糖密度勾配溶液において)。従って、スプリット過程は、ビリオンを含む物質の清澄化(非ビリオン物質を除去する)、回収したビリオンの濃縮(例えばCaHPO吸着のような吸着方法を用いて)、全ビリオンの非ビリオン物質からの分離、密度勾配遠心工程における、スプリット剤を用いたビリオンのスプリット(例えばデオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット剤を含むショ糖勾配を用いて)、および次いで望ましくない物質を除去するためのろ過(例えば限外ろ過)を含み得る。スプリットビリオンを、リン酸ナトリウム緩衝化等張塩化ナトリウム溶液中に有用に再懸濁し得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM、およびFLUSHIELDTM製品である。
別の形式の不活性化抗原は、ビロソーム[20](核酸を含まないウイルス様のリポソーム粒子)である。ウイルスの界面活性剤による可溶化、続くヌクレオカプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構築によって、ビロソームを調製し得る。ビロソームを調製するための代替の方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、その膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じることを含む。
精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチン組成物は、表面抗原赤血球凝集素、および典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製した形式でこれらのタンパク質を調製するための過程は、当該分野で周知である。OPTAFLUTM、CELTURATM、FLUVIRINTM、AGRIPPALTMおよびINFLUVACTM製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。
現在の不活性化インフルエンザワクチン組成物において、HAは主な免疫原であり、そしてワクチン用量は、典型的にはSRiDによって測定されるHAレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは、典型的には株あたり約15μgのHAを含むが、例えば小児、またはパンデミックの状況において、またはアジュバントを使用する場合には、より低い用量を使用し得る。より高い用量(例えば3×または9×の用量[21、22])と同様、1/2(すなわち株あたり7.5μgのHA)、1/4および1/8のような分画の用量が使用された。従って、ワクチンは、ワクチン用量あたりインフルエンザ株あたり0.1および150μgの間、好ましくは0.1および50μgの間、例えば0.1〜20μg、0.1〜15μg、0.1〜10μg、0.1〜7.5μg、0.5〜5μg等のHAを含み得る。特定の用量は、用量あたり株あたり、例えば約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約3.75、約1.9、約1.5等を含む。
本発明をまた、生インフルエンザ抗原のような、生ウイルス抗原を含む組成物で実施し得る。そのような組成物を、通常ビリオンを含む液体からビリオンを精製することによって調製する。例えば、その液体を遠心分離によって清澄化し、そして緩衝液(例えばショ糖、リン酸カリウム、およびグルタミン酸ナトリウムを含む)で安定化し得る。現在、様々な形式のインフルエンザウイルスワクチンが利用可能である(例えば参考文献23の第17および18章を参照のこと)。生ウイルスワクチンは、MedImmuneのFLUMISTTM製品(3価の生ウイルスワクチン)を含む。
インフルエンザワクチン組成物において、そのインフルエンザウイルスを弱毒化し得る。そのインフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。そのインフルエンザウイルスは、低温順応であり得る。これらの3つの特徴は、生ウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。
生ワクチンに関して、投薬は、HA含有量ではなく、50%組織培養感染量(TCID50)によって測定され、そして株あたり10および10の間(好ましくは106.5〜107.5の間)のTCID50が典型的である。
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスで見出されるような天然HA、または修飾HAを有し得る。例えば、ウイルスを鳥類の種において高度に病原性にする決定基(例えばHA1/HA2切断部位周辺の高度に塩基性の領域)を除去するためにHAを修飾することが公知である。逆遺伝学の使用が、そのような修飾を促進する。
ワクチンにおいて使用するためのインフルエンザウイルス株は、シーズンごとに変化する。パンデミックの間の時期には、ワクチンは典型的には2つのA型インフルエンザ株(H1N1およびH3N2)および1つのB型インフルエンザ株を含み、そして3価のワクチンが典型的である。本発明はまた、H2、H5、H7、またはH9サブタイプ株のような、パンデミックウイルス株(すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株、特にA型インフルエンザウイルス)を使用し得、そしてパンデミック株のインフルエンザワクチンは、1価であり得る、またはパンデミック株によって補足された通常の3価のワクチンに基づき得る。しかし、シーズン、およびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、1つまたは複数のHAサブタイプH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16に対して保護し得る。本発明は、1つまたは複数のA型インフルエンザウイルスNAサブタイプN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、またはN9に対して保護し得る。
パンデミックの間の株に対して免疫するために適切であるのと同様に、本発明の組成物は、パンデミックまたは潜在的なパンデミック株に対して免疫するために特に有用である。従って、その組成物は、パンデミックまたは潜在的なパンデミックインフルエンザ株由来の抗原を含み得る。パンデミックの発生を引き起こす可能性のあるインフルエンザ株の特徴は:(a)それは現在流布しているヒト株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素、すなわち10年以上の間ヒト集団において明らかでなかったもの(例えばH2)、またはヒト集団において以前に全く見られなかったもの(例えば一般的に鳥類集団においてのみ見出されるH5、H6、またはH9)を含み、その結果、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである;(b)ヒト集団において水平に伝染し得る;および(c)ヒトに対して病原性であることである。H5N1株のような、H5赤血球凝集素タイプを有するウイルスが、パンデミックインフルエンザに対して免疫するために好ましい。他の可能性のある株は、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1、およびH7N7、およびあらゆる他の出現しつつある潜在的なパンデミック株を含む。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへ広がり得る、または広がった、潜在的なパンデミックウイルス株、例えばブタ起源のH1N1またはH3N2インフルエンザ株に対して保護するために特に適切である。次いで本発明の組成物は、非ヒト動物と同様、ヒトにワクチン接種するために適切である。
抗原を組成物中に有用に含み得る他の株は、耐性パンデミック株[25]を含む、抗ウイルス治療に耐性である(例えばオセルタミビル[24]および/またはザナミビルに耐性である)株である。
本発明の組成物は、A型インフルエンザウイルスおよび/またはB型インフルエンザウイルスを含む、1つまたは複数(例えば1、2、3、4、またはそれ以上)のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが1つ以上のインフルエンザ株を含む場合、異なる株を典型的には別々に増殖させ、そしてウイルスを回収し、そして抗原を調製した後に混合する。従って、本発明の過程は、1つ以上のインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。2つのA型インフルエンザウイルス株および1つのB型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む、3価のワクチンが典型的である。2つのA型インフルエンザウイルス株および2つのB型インフルエンザウイルス株、または3つのA型インフルエンザウイルス株および1つのB型インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む、4価のワクチンも有用である[26]。
本発明の組成物は、組換えタンパク質を含み得る。その組換えタンパク質は、好ましくは哺乳類細胞培養物中に産生される。組換えタンパク質は、多くの場合治療薬として使用され、そして哺乳類細胞における増殖は、適切なタンパク質フォールディング、集合、および翻訳後修飾を可能にするので、これは好ましい[27]。従って、タンパク質の質および有効性は、細菌、植物および酵母のような他の宿主に対して、哺乳類細胞において発現した場合により優位であり得る。多くの場合細胞培養物において産生され、そして従ってその産生過程が本発明から利益を得ることができる組換えタンパク質を含む組成物は、抗癌薬(VectibixTM、CampathTM、またはRituxanTMのような)、成長ホルモン、インスリン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、エリスロポエチン(AranespTM)、および血液因子(第VIII因子(ReFactoTM)および第IX因子(BenefixTM)のような)を含む。
細胞培養物において組換えタンパク質を産生する方法は、当該分野で公知である[28]。その組換えタンパク質を、宿主細胞内に含まれるベクター中にコードされる核酸分子の発現によって、組換え形式で調製し得る。一般的に、組換えタンパク質を産生するために、核酸分子を維持、増殖または発現するために適切な任意のシステムまたはベクターを使用し得る。適切なヌクレオチド配列を、例えば、参考文献28において記載されるもののような、様々な周知の、および慣例的な技術のいずれかによって、発現システムに挿入し得る。一般的に、形質転換した宿主細胞において望ましいポリペプチドをコードするDNA配列がRNAに転写されるように、コードする遺伝子を、プロモーター、リボソーム結合部位(細菌の発現のために)、および必要に応じてオペレーターのような、調節エレメントの調節下に置き得る。
細胞
本発明を、目的の生物学的産物の産生を可能にする、あらゆる真核細胞または原核細胞で実施し得る。本発明は、典型的には細胞系を使用するが、例えば代替として初代細胞を使用し得る。その細胞は典型的には哺乳類である。適切な哺乳類細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類(ヒトおよびサルを含む)、およびイヌ細胞を含むがこれに限らない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞等のような、様々な細胞型を使用し得る。適切なハムスター細胞の例は、BHK21またはHKCCの名前を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えばベロ細胞系における腎細胞のような、アフリカミドリザル細胞である[29〜31]。適切なイヌ細胞は、例えばCLDKおよびMDCK細胞系におけるような、腎細胞である。
さらなる適切な細胞は、CHO;293T;BHK;MRC5;PER.C6[32];FRhL2;WI−38等を含むがこれに限らない。適切な細胞は、例えばAmerican Type Cell Culture(ATCC)コレクション[5]から、Coriell Cell Repositories[6]から、またはEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)から広く入手可能である。例えば、ATCCは、カタログ番号CCL81、CCL81.2、CRL1586、およびCRL−1587で、様々な異なるベロ細胞を供給し、そしてカタログ番号CCL34でMDCK細胞を供給する。PER.C6は、寄託番号96022940でECACCから入手可能である。
本発明で使用するための好ましい細胞(特にインフルエンザウイルスを増殖させるための)は、Madin Darbyイヌ腎臓由来のMDCK細胞である[33〜35]。もとのMDCK細胞は、CCL34としてATCCから入手可能である。これらの細胞の誘導体または他のMDCK細胞を使用することが好ましい。そのような誘導体は、例えば参考文献33において記載され、それは懸濁培養における増殖に適合したMDCK細胞を開示する(DSM ACC2219として寄託された、「MDCK33016」または「33016−PF」;参考文献33も参照のこと)。さらに、参考文献36は、血清を含まない培養において懸濁液中で増殖するMDCK由来細胞を開示する(「B−702」、FERM BP−7449として寄託された)。いくつかの実施態様において、使用したMDCK細胞系は、腫瘍原性であり得る。非腫瘍原性MDCK細胞を使用することも想定される。例えば、参考文献37は、「MDCK−S」(ATCC PTA−6500)、「MDCK−SF101」(ATCC PTA−6501)、「MDCK−SF102」(ATCC PTA−6502)、および「MDCK−SF103」(ATCC PTA−6503)を含む、非腫瘍原性MDCK細胞を開示する。参考文献38は、「MDCK.5F1」細胞(ATCC CRL 12042)を含む、感染に対して高い感受性を有するMDCK細胞を開示する。
本発明の方法を実施するために1つより多くの細胞型の混合物を使用することが可能である。しかし、本発明の方法を、単一の細胞型で、例えばモノクローナル細胞で実施することが好ましい。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、単一の細胞系由来である。
好ましくは、一般的な混入源を回避するために、その細胞を血清の非存在下で培養する。真核細胞培養のための様々な血清を含まない培地が当業者に公知である(例えばイスコフ培地、ウルトラCHO培地(BioWhittaker)、EX−CELL(JRH Biosciences))。さらに、タンパク質を含まない培地を使用し得る(例えばPF−CHO(JRH Biosciences))。そうでなければ、複製のための細胞をまた、慣例的な血清を含む培地で培養し得る(例えば0.5%から10%のウシ胎児血清を含むMEMまたはDMEM培地)。
その細胞は、接着培養または懸濁培養であり得る。マイクロキャリア培養を使用し得る。いくつかの実施態様において、その細胞を、懸濁液中での増殖に適合させ得る。
細胞の増殖を、当業者に公知の方法によって行い得る。例えば、細胞を、遠心分離またはろ過のような通常の補助的方法を用いて、灌流システムにおいて培養し得る。さらに、細胞を、感染の前に、フェドバッチシステムで本発明によって増殖させ得る。本発明の関係において、細胞を最初にバッチシステムにおいて培養し、そして培地中の栄養分(または栄養分の一部)の欠乏が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補填される培養システムは、フェドバッチシステムと呼ばれる。感染前の細胞の増殖の間、培地のpH値をpH6.6およびpH7.8の間、および特にpH7.2およびpH7.3の間の値に調節することが有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは30および40℃の間の温度で起こる。工程(iii)において、細胞を、好ましくは30℃および36℃の間、または32℃および34℃の間、または33℃の温度で培養する。この温度範囲における感染細胞のインキュベーションは、ワクチンに処方した場合に改善された有効性を生じるウイルスの産生を引き起こすことが示されたので、本発明の方法を、インフルエンザウイルスを産生するために使用する場合、これは特に好ましい[39]。
感染前の培養の間、酸素分圧を、好ましくは25%および95%の間の値に、および特に35%および60%の間の値に調節し得る。本発明の関係において述べられた酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、好ましくはバッチシステムにおいて約8〜25×10細胞/mL、または好ましくは灌流システムにおいて約5〜20×10細胞/mLの細胞密度で起こる。その細胞を、10−8および10の間、好ましくは0.0001および0.5の間のウイルス用量(MOI値、「感染効率」;感染時の細胞あたりのウイルスユニットの数に対応する)で感染させ得る。
本発明による方法はまた、組換えタンパク質またはウイルスあるいはウイルスによって産生されたタンパク質の回収および単離を含み得る。タンパク質またはウイルスの単離の間に、その細胞を、分離、ろ過、または限外ろ過のような標準的な方法によって、培養培地から分離する。次いでそのタンパク質またはウイルスを、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィー等のような、当業者に十分公知である方法によって濃縮し、次いで精製する。ウイルスを、精製の間またはその後に不活性化することも、本発明によれば好ましい。ウイルスの不活性化は、例えばβ−プロピオラクトン、またはホルムアルデヒドによって、精製過程内のいずれかの時点で起こり得る。
組換えタンパク質の発現のためのシステムは、当該分野で公知である(例えば参考文献28を参照のこと)。組換えタンパク質を通常、プロモーター(SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、または単純ヘルペスウイルスプロモーターのような)、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む発現システムを用いて、細胞において発現させる。エンハンサー、機能的スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むイントロン、およびリーダー配列も、発現構築物に含み得る。組換えタンパク質を、哺乳類細胞において細胞内で発現し得る。あるいは、哺乳類細胞における外来性タンパク質の分泌を提供するリーダー配列断片から成る融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作り出すことによって、その組換えタンパク質をまた、細胞から増殖培地中に分泌し得る。
反復エレメント
本発明は、原則として、細胞のゲノムに存在するあらゆる反復エレメントによって実施し得る。しかし、本発明を、宿主細胞のゲノムに1コピー数より多く(例えば10コピー数より多く、100コピー数より多く、500コピー数より多く、または1000コピー数より多く)存在する反復エレメントで実施することが好ましい。高いコピー数で存在するゲノムセグメントは、増幅反応においてより容易に検出可能であり、そのため本発明の方法の感受性を改善し得るので、これは好ましい。
好ましくは、増幅される反復エレメントおよび/またはハウスキーピング遺伝子の断片は、宿主細胞における既知の癌遺伝子の長さと同等の長さを有する。癌遺伝子は、全長遺伝子として存在する場合、ワクチンの安全性に対して最も大きな問題を提起するが、ワクチン製造の間に使用されるDNA除去工程は、多くの場合DNAを断片化する。既知の癌遺伝子とおよそ同じ長さの反復エレメントの断片を増幅することによって、本発明の方法はまた、当業者が、全長癌遺伝子が存在する可能性を評価することを可能にする。例えば、反復エレメントの断片が増幅されなかった場合、全長癌遺伝子をコードするために十分長い宿主細胞DNAは細胞内に存在しない可能性がある。増幅されるDNA断片は、700〜1300bp、800〜1200bp、900〜1100bp、または約1000bpの長さを有し得る。
高いコピー数で存在し、そして従って本発明において使用するために特に適切であるゲノムセグメントは、末端反復配列(LTR)レトロトランスポゾンおよび非LTRレトロトランスポゾンのようなレトロトランスポゾンを含む。
長鎖散在反復配列(LINE)、短鎖散在反復配列(SINE)、SVAまたは偽遺伝子は、最も豊富なゲノムエレメントの1つであり、そして広く様々な種において見出されるので、本発明において、これらを使用することが特に好ましい。
LINEは、約6kbの長さであり、そして一倍体哺乳類ゲノムあたり約10,000〜100,000コピーの頻度で存在する(ゲノムの5%から17%)。特に、LINE1(L1)は、ゲノムにおいて最も豊富な自己複製トランスポゾンであり、そしてヒトゲノム中に約80,000コピーを有する。これらのLINEエレメントの10,000近くは、全長であり、そして2つの長いオープンリーディングフレーム(ORF1およびORF2)を含み、それらはどちらもレトロトランスポジションに必要なタンパク質をコードする。LINE1エレメントのORF2配列の配列を、配列番号3で示す。LINEは、高いコピー数で存在するので、本発明で使用するために特に好ましい。さらに、それらは多くの場合1000bpを超える長さを有し、そのため既知の癌遺伝子のおよそのサイズを有する断片を増幅することが可能である。
SINEエレメントは、その長さに基づいてLINEエレメントと区別され、そしてその名の通り長さ500bp未満である。最も豊富なSINEは、Aluエレメントである[40]。Aluエレメントは、約300bpの長さを有し、そして500,000コピー数より多く存在すると推定される。構造的に、Aluエレメントは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターを含む5’領域および5’領域よりわずかに長い3’領域の2部構造を有する。5’領域および3’領域は、配列5’−ATACA−3’(配列番号4)から成る、介在、中央Aリッチ領域によって分けられる。典型的なAluエレメントは、ポリ(A)テールで終わる。
SVAエレメント[41]は、SINE−R、VNTR、およびAluエレメントの組み合わせから生じていると考えられる。SVAは、env遺伝子の3’末端由来のSINE−R配列の490bpの部分、ヒト内因性レトロウイルスK−10(HERV−K10)の3’末端反復配列の部分、それぞれ35〜50ヌクレオチドから成る可変数のタンデムリピート(VNTR)を含む領域、およびAlu様配列を含む。SVAエレメントは、ヒトに約2700コピー存在する。
偽遺伝子は、ゲノム中の機能的遺伝子に相同性を有する、非機能的遺伝子である。ヒトゲノムには、約20,000の偽遺伝子が存在する。例えば、リボソームタンパク質偽遺伝子は、ゲノム中に約2000コピーを有する偽遺伝子の大きなファミリーを含む。
LTRレトロトランスポゾンは、最も豊富なゲノムエレメントの1つであり、そしてゲノム中に一倍体ゲノムあたり最大で数百万コピーまで存在し得る。ヒトゲノムの約8%は、そのようなLTRレトロトランスポゾンから成る。LTRレトロトランスポゾンを、copia/Ty1およびgypsy/Ty3ファミリーに大きく分け得る。LTRレトロトランスポゾンは、全長エレメントが一般的に、5’および3’末端における末端反復配列(LTR)の存在によって特徴付けられるサイズにおいて、長さが100bpから5kbの範囲である。
ハウスキーピング遺伝子
本発明をまた、細胞のゲノムに存在するあらゆるハウスキーピング遺伝子で実施し得る。宿主細胞のゲノムに1コピー数より多く(例えば2コピー数より多く、5コピー数より多く、または10コピー数より多く)存在するハウスキーピング遺伝子で、本発明を実施することが好ましい。高いコピー数で存在するゲノムセグメントは、増幅反応においてより容易に検出可能であり、そのため本発明の方法の感受性を改善し得るので、これは好ましい。
ハウスキーピング遺伝子は、細胞において構成的に発現し、そして通常細胞の機能のために重要な遺伝子をコードする遺伝子である。使用し得る適切なハウスキーピング遺伝子の例は、GAPDH、β−アクチン、チューブリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PBGD)、およびリボソームタンパク質(RPL7およびRPL32のような)を含む。
反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する
反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅し、その増幅産物を希釈系列で希釈し、そしてその増幅産物を、例えばアガロースゲル上の分離によって検出することによって決定し得る。反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数(Nrep)を、以下の式によって決定し得、ここで「DL」は所定の条件下における特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり(反復エレメント/mL)、「PCR(−)」は、最初の陰性増幅シグナルの希釈係数を示し、そして「希釈」は、DNA抽出後に必要に応じて行い得る任意の最初の希釈の希釈係数を指す:
Figure 2015526062
増幅反応の検出限界をどのように決定し得るのかは、既に上記で説明した。
DNA増幅のために使用し得る核酸増幅技術(NAAT)は、熱サイクル技術および等温技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ローリングサークル増幅(RCA)[42]、ブーメランDNA増幅(BDA)[43]、Qbレプリカーゼシステム、修復連鎖反応(RCR)、自続式配列複製(3SR)、鎖置換アッセイ(SDA)等を含む。
これらの増幅技術は一般的に、二本鎖標的の反対の鎖にハイブリダイズする、1つまたは複数のプライマーのペアの使用を含む。使用する反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅するように、これらのプライマーをデザインする必要がある。全長反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を増幅する方法も使用し得る。適切なプライマーを提供する方法は、当業者に公知である。
その増幅産物を、DNAの検出を可能にするあらゆる方法によって検出し得る。例えば、その産物を、アガロースゲルで分離することによって検出し得る。それをまた、ThresholdTMシステムまたはAbsorbance DNA Quantitationのようなアッセイによって検出し得る。それをまた、Molecular Countingのような他の方法によって検出し得る。
医薬品組成物
本発明の組成物は、薬剤学的に許容可能である。それらは通常、抗原に加えて成分を含む、例えばそれらは典型的には1つまたは複数の薬剤学的担体および/または賦形剤を含む。下記で記載するように、アジュバントも含み得る。そのような成分の詳細な議論が、参考文献44において入手可能である。
組成物、特にワクチン組成物は、一般的に水性形式である。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形式、例えば注射用固体、またはパッチ上の乾燥またはポリマー化調製物の形式であり得る。
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは2−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、ワクチンは、実質的に水銀物質を含まない(すなわち5μg/ml未満)、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい[45]。水銀を含まないワクチンがより好ましい。コハク酸α−トコフェロールを、水銀化合物の代わりとして含み得る。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
浸透圧を調節するために、ナトリウム塩のような生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム(NaCl)が好ましく、それは1および20mg/mlの間で存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む。
ワクチン組成物は一般的に、200mOsm/kgおよび400mOsm/kgの間、好ましくは240〜360mOsm/kgの間のオスモル濃度を有し、そしてより好ましくは290〜310mOsm/kgの範囲内にある。オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に影響を与えないことが以前に報告された[46]が、それでもこの範囲にオスモル濃度を維持することは好ましい。
ワクチン組成物は、1つまたは複数の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液;Tris緩衝液;ホウ酸緩衝液;コハク酸緩衝液;ヒスチジン緩衝液(特に水酸化アルミニウムアジュバントを含む);またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には5〜20mMの範囲で含まれる。
ワクチン組成物のpHは、一般的に5.0および8.1の間、そしてより典型的には6.0および8.0の間、例えば6.5および7.5、または7.0および7.8の間である。従って、本発明の過程は、包装の前に、バルクワクチンのpHを調節する工程を含み得る。
そのワクチン組成物は、好ましくは無菌である。そのワクチン組成物は、好ましくは非発熱性である、例えば用量あたり<1EU(エンドトキシンユニット、標準的な基準)、および好ましくは用量あたり<0.1EUを含む。そのワクチン組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
本発明のワクチン組成物は、特にスプリットまたは表面抗原ワクチンに関して、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(「Tween」として知られている)、オクトキシノール(オクトキシノール−9(Triton X−100)、またはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールのような)、セチルトリメチルアンモニウム臭化物(「CTAB」)、またはデオキシコール酸ナトリウムを含み得る。その界面活性剤は、微量しか存在し得ない。従って、そのワクチンは、それぞれ1mg/ml未満のオクトキシノール−10およびポリソルベート80を含み得る。他の微量の残留成分は、抗生物質(例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンB)であり得る。
ワクチン組成物は、単回免疫のための物質を含み得る、または複数回の免疫のための物質を含み得る(すなわち、「複数回投与」キット)。複数回投与の配合では、保存剤を含むことが好ましい。複数回投与の組成物において、保存剤を含む代替として(またはそれに加えて)、その組成物を、物質を除去するための無菌アダプターを有する容器に入れ得る。
その組成物は、0.1〜1mL、例えば0.2〜0.8mL、0.3〜0.7mL、0.4〜0.6m、または約0.5mLの体積を有し得る。インフルエンザワクチンを、典型的には約0.5mlの投与体積で投与するが、半分の用量(すなわち約0.25ml)を小児に投与し得る。
組成物およびキットを、好ましくは2℃および8℃の間で保存する。それらを凍結するべきではない。それらは、理想的には直接光を避けるべきである。
宿主細胞DNA
ウイルスのような生物学的産物を細胞系において産生、単離、および/または増殖した場合、DNAのあらゆる発癌活性を最小限にするために、最終的な組成物中の残留細胞系DNAの量を最小限にすることが、標準的なやり方である。
従って、本発明による組成物(特にワクチン組成物)は、用量あたり好ましくは10ng未満(好ましくは1ng未満、およびより好ましくは100pg未満)の残留宿主細胞DNAを含むが、微量の宿主細胞DNAが存在し得る。
あらゆる残留宿主細胞DNAの平均長さは、500bp未満、例えば400bp未満、300bp未満、200bp未満、100bp未満等であることが好ましい。
混入DNAを、標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィー等を用いて、ワクチン調製の間に除去し得る。残留宿主細胞DNAの除去を、例えばDNA分解酵素を用いることによる、ヌクレアーゼ処理によって増強し得る。宿主細胞DNAの混入を減少させる簡便な方法が、参考文献47および48において開示されており、それは2段階の処理を含み、最初はウイルス増殖の間に用い得るDNA分解酵素(例えばBenzonase)を、そして次いでビリオン破壊の間に用い得る、陽イオン性界面活性剤(例えばCTAB)を用いる。β−プロピオラクトンのようなアルキル化剤による処理も、宿主細胞DNAを除去するために使用し得、そしてビリオンを不活性化するためにも有利に使用し得る[49]。
残留宿主細胞DNAの量を測定し得る。従って、さらなる局面において、本発明は、宿主細胞で産生された生物学的産物を含む組成物において、残留宿主細胞DNAの量を決定するために、反復エレメント(特にLINEエレメント、SVAエレメント、または偽遺伝子)またはハウスキーピング遺伝子を使用する方法を提供する。これらの方法は、(a)宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する;(b)その増幅DNAを用いて、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する;および(c)その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、組成物中の残留宿主細胞DNAの量を計算する工程を含み得る。
組成物中の残留宿主細胞DNAの量を計算するために、反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数およびDNAの全量の間の相関を知る必要がある。細胞中の全DNAから反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を増幅し、その反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定し、そしてその反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子のコピー数および細胞中のDNAの全量の間の割合を計算することによって、これを決定し得る。
アジュバント
本発明の組成物は、有利にアジュバントを含み得、それはその組成物を投与された患者において誘発された免疫応答(体液性および/または細胞性)を増強するよう機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルションを含む。様々なそのようなアジュバントが公知であり、そしてそれらは典型的には少なくとも1つの油および少なくとも1つの界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生物分解性(代謝可能)および生体適合性である。エマルション中の油滴は、一般的に直径5μm未満であり、そして理想的にはμm未満の直径を有し、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザーによって達成される。220nm未満のサイズの液滴が、ろ過滅菌にかけ得るので好ましい。
そのエマルションは、動物(魚のような)または植物供給源由来のものなど油を含み得る。植物油の供給源は、ナッツ、種子、および穀物を含む。最も一般的に入手可能な、ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、ナッツ油を例示する。例えば、ホホバ豆から得たホホバオイルを使用し得る。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等を含む。穀物グループにおいて、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライ、コメ、テフ、ライコムギ等のような他の穀物の油も使用し得る。グリセロールおよび1,2−プロパンジオールの6〜10炭素脂肪酸エステルを、種子油に天然には存在しないが、ナッツおよび種子油から出発する適切な物質の加水分解、分離、およびエステル化によって調製し得る。哺乳類乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、そして従って本発明の実施において使用し得る。分離、精製、けん化、および動物供給源から純粋な油を得るために必要な他の手段のための手順は、当該分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に回収し得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などの鯨油は、本明細書中で使用し得るいくつかの魚油を例示する。多くの分岐鎖油が、5炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサエンとして知られている分岐不飽和テルペノイドを含み、それは本明細書中で特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランも、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能である、または当該分野で公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α−トコフェロールである(下記を参照のこと)。
油の混合物を使用し得る。
界面活性剤を、その「HLB」(親水性/親油性バランス)によって分類し得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、そしてより好ましくは少なくとも16のHLBを有する。本発明を、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(一般的にTweenと呼ばれる)、特にポリソルベート20およびポリソルベート80;直鎖状EO/POブロックコポリマーのような、DOWFAXTMの商品名で販売されている、エチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)、および/またはブチレンオキシド(BO)のコポリマー;反復するエトキシ(オキシ−1,2−エタンジイル)基の数が変動し得るオクトキシノール(オクトキシノール−9(Triton X−100、またはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)が特に目的のものである);(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA−630/NP−40);ホスファチジルコリン(レシチン)のようなリン脂質;TergitolTMNPシリーズのような、ノニルフェノールエトキシレート;トリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Brij30)のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brij界面活性剤として知られている);およびソルビタントリオレエート(Span85)およびソルビタンモノラウレートのような、ソルビタンエステル(一般的にSPANとして知られている)を含むがこれに限らない界面活性剤と共に使用し得る。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルションに含めるために好ましい界面活性剤は、Tween80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)、Span85(ソルビタントリオレエート)、レシチン、およびTriton X−100である。
界面活性剤の混合物、例えばTween80/Span85混合物を使用し得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80)のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X−100)のようなオクトキシノールの組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス9ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含む。
好ましい界面活性剤の量(重量%)は:ポリオキシエチレンソルビタンエステル(Tween80のような)0.01から1%、特に約0.1%;オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール(Triton X−100、またはTritonシリーズの他の界面活性剤のような)0.001から0.1%、特に0.005から0.02%;ポリオキシエチレンエーテル(ラウレス9のような)0.1から20%、好ましくは0.1から10%、および特に0.1から1%または約0.5%である。
そのワクチンがスプリットウイルスを含む場合、水相に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。遊離界面活性剤が、抗原に対して「スプリット効果」を発揮し、それによって、そうでなければ存在し得る、あらゆる非スプリットビリオンおよび/またはビリオンの凝集を破壊し得るので、これは有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る[50]。
好ましいエマルションは、<1μm、例えば≦750nm、≦500nm、≦400nm、≦300nm、≦250nm、≦220nm、≦200nm、またはより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズを、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって、簡便に達成し得る。
本発明で有用な特定の水中油型エマルションアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない:
・スクアレン、Tween80、およびSpan85のμm未満のエマルション。体積によるそのエマルションの組成は、約5%のスクアレン、約0.5%のポリソルベート80、および約0.5%のSpan85であり得る。重量に関しては、これらの割合は、4.3%のスクアレン、0.5%のポリソルベート80、および0.48%のSpan85になる。このアジュバントは「MF59」[51〜53]として知られており、参考文献54の第10章および参考文献55の第12章でより詳細に説明される。MF59エマルションは、クエン酸イオン、例えば10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液を有利に含む。
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート80を含むエマルション。そのエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。これらのエマルションは、体積で、2から10%のスクアレン、2から10%のトコフェロール、および0.3から3%のポリソルベート80を有し得、そして、より安定なエマルションを生じ得るので、スクアレン:トコフェロールの重量比は好ましくは<1(例えば0.90)である。スクアレンおよびポリソルベート80は、約5:2の体積比で、または約11:5の重量比で存在し得る。従って、3つの成分(スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート80)は、1068:1186:485または約55:61:25の重量比で存在し得る。そのようなエマルションの1つ(「AS03」)を、Tween80をPBSに溶解して2%の溶液を生じ、次いで90mlのこの溶液を、(5gのDL αトコフェロールおよび5mlのスクアレン)の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイゼーションすることによって作製し得る。生じたエマルションは、μm未満の油滴、例えば100および250nmの間、好ましくは約180nmの平均直径を有し得る。そのエマルションはまた、3−de−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3d MPL)を含み得る。この型の別の有用なエマルションは、ヒト用量あたり、0.5〜10mgのスクアレン、0.5〜11mgのトコフェロール、および0.1〜4mgのポリソルベート80を、例えば上記で議論した割合で含み得る。
・スクアレン、トコフェロール、およびTriton界面活性剤(例えばTriton X−100)のエマルション。そのエマルションはまた、3d−MPLも含み得る(下記を参照のこと)。そのエマルションは、リン酸緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート(例えばポリソルベート80)、Triton界面活性剤(例えばTriton X−100)、およびトコフェロール(例えばコハク酸α−トコフェロール)を含むエマルション。そのエマルションは、これら3つの成分を、約75:11:10の質量比で含み得(例えば750μg/mlのポリソルベート80、110μg/mlのTritonX−100および100μg/mlのコハク酸α−トコフェロール)、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のあらゆる寄与も含む。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、3d−MPLを含み得る(下記を参照のこと)。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアレン、ポリソルベート80およびポロキサマー401(「PluronicTML121」)のエマルション。そのエマルションを、リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4中に処方し得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、そして「SAF−1」アジュバント[56]においてスレオニル−MDPと共に使用された(0.05〜1%のThr−MDP、5%のスクアレン、2.5%のPluronic L121、および0.2%のポリソルベート80)。それをまた、「AF」アジュバント[57]のように、Thr−MDP無しで使用し得る(5%のスクアレン、1.25%のPluronic L121、および0.2%のポリソルベート80)。マイクロ流動化が好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル)、および疎水性非イオン性界面活性剤(例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Span80」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル)を含むエマルション。そのエマルションは、好ましくは熱可逆性である、および/または少なくとも90%の油滴が(体積で)、200未満のサイズを有する[58]。そのエマルションはまた、1つまたは複数のアルジトール;凍結保護剤(例えばドデシルマルトシドおよび/またはスクロースのような糖);および/またはアルキルポリグリコシドを含み得る。そのエマルションは、TRL4アゴニスト[59]を含み得る。そのようなエマルションを、凍結乾燥し得る。
・スクアレン、ポロキサマー105およびAbil−Care[60]のエマルション。アジュバントワクチンにおけるこれらの成分の最終的な濃度(重量)は、5%のスクアレン、4%のポロキサマー105(pluronicポリオール)、および2%のAbil−Care85(Bis−PEG/PPG−16/16 PEG/PPG−16/16 ジメチコン;カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド)である。
・0.5〜50%の油、0.1〜10%のリン脂質、および0.05〜5%の非イオン性界面活性剤を有するエマルション。参考文献61で記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。μm未満の液滴サイズが有利である。
・非代謝性油(軽油のような)および少なくとも1つの界面活性剤(レシチン、Tween80またはSpan80のような)のμm未満の水中油型エマルション。QuilAサポニン、コレステロール、サポニン−親油性コンジュゲート(参考文献62に記載されており、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンをデスアシルサポニンに加えることによって産生されるGPI−0100のような)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、および/またはN,N−ジオクタデシル−N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)プロパンジアミンのような添加物を含み得る。
・サポニン(例えばQuilAまたはQS21)およびステロール(例えばコレステロール)が、らせん状ミセル[63]として会合しているエマルション。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤を含むエマルション(例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび/またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)[64]。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤を含むエマルション(例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび/またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)[64]。
いくつかの実施態様において、エマルションを、送達時に、その場で抗原と混合し得、そして従ってアジュバントおよび抗原は、包装された、または分配されたワクチンにおいて、使用時の最終的な処方に備えて、別々に維持され得る。他の実施態様において、製造の間に、エマルションを抗原と混合し、そして従って、その組成物は、液体アジュバント形式で包装される。その抗原は一般的に、水性形式であり、その結果、そのワクチンを最終的に2つの液体を混合することによって調製する。混合するための2つの液体の体積比は、変動し得る(例えば5:1および1:5の間)が、一般的に約1:1である。成分の濃度が特定のエマルションの上記の説明で与えられる場合、これらの濃度は、典型的には未希釈の組成物のものであり、そして従って抗原溶液と混合した後の濃度は減少する。
ワクチン組成物の包装
本発明の組成物(またはキット成分)のために適切な容器は、バイアル、シリンジ(例えば使い捨てシリンジ)、鼻腔内スプレー等を含む。これらの容器は、無菌であるべきである。
組成物/成分がバイアル中に有る場合、そのバイアルは好ましくはガラスまたはプラスチック材料製である。そのバイアルを、好ましくは、組成物を加える前に滅菌する。ラテックス感受性の患者の問題を回避するために、好ましくはバイアルを、ラテックスを含まない栓で密封し、そして全ての包装材料においてラテックスが存在しないのが好ましい。そのバイアルは、単回投与のワクチンを含み得る、またはそれは1回より多い投与(「複数回投与」バイアル)、例えば10回の投与を含み得る。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
バイアルは、充填済みのシリンジをそのキャップに挿入し得、シリンジの内容物をバイアル中に放出し得(例えばそこで凍結乾燥物質を再構成するために)、そしてバイアルの内容物をシリンジに戻し得るように適合させた、キャップ(例えばLuerロック)を有し得る。バイアルからシリンジを除去した後、次いで針をつけ得、そしてその組成物を患者に投与し得る。そのキャップは、好ましくはシールまたはカバーの内側にあり、その結果、キャップに接近し得る前にそのシールまたはカバーを除去しなくてはならない。バイアルは、特に複数回投与バイアルに関して、その内容物の無菌的な除去を可能にするキャップを有し得る。
成分がシリンジに包装される場合、そのシリンジは、それに取り付けられた針を有し得る。針が取り付けられていない場合、組み立ておよび使用のために分離した針をシリンジと共に供給し得る。そのような針は、鞘付きであり得る。安全針が好ましい。1インチ23ゲージ、1インチ25ゲージ、および5/8インチ25ゲージ針が典型的である。記録を促進するために、シリンジを、ロット番号、インフルエンザシーズン、および内容物の有効期限を印字し得る、剥離ラベルと共に提供し得る。シリンジのプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引の間に偶発的に取れることを防止するために、ストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムのキャップおよび/またはプランジャーを有し得る。使い捨てのシリンジは、単回投与のワクチンを含む。そのシリンジは一般的に、針を取り付ける前に先端を密封するための先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくはブチルゴム製である。シリンジおよび針が別々に包装されていない場合、その針は好ましくはブチルゴムのシールドが装着されている。好ましいシリンジは、商品名「Tip−Lok」TMで販売されているものである。
例えば、小児への送達を促進するために、容器に、半分の用量の体積を示す印を付け得る。例えば、0.5mlの用量を含むシリンジは、0.25mlの体積を示す印を有し得る。
ガラス容器(例えばシリンジまたはバイアル)を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスでできた容器を有することが好ましい。
キットまたは組成物を、ワクチンの詳細、例えば投与の説明書、ワクチン中の抗原の詳細等を含むリーフレットと共に包装し得る(例えば同じ箱に)。その説明書はまた、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に、アドレナリン溶液を容易に利用可能なようにしておく等の警告を含み得る。
処置の方法、およびワクチンの投与
本発明は、本発明によって製造されたワクチンを提供する。これらのワクチン組成物は、ヒトまたはブタのような非ヒト動物被験体への投与に適切であり、そして本発明は、本発明の組成物をその被験体に投与する工程を含む、被験体において免疫反応を引き起こす方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、そして被験体において免疫反応を引き起こすための医薬の製造のために本発明の組成物を使用することを提供する。
これらの方法および使用によって引き起こされた免疫反応は、一般的に抗体反応、好ましくは保護的抗体反応を含む。インフルエンザウイルスのワクチン接種後の抗体反応、中和能力および保護を評価する方法は、当該分野で周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が、保護と相関することを示した(約30〜40の血清サンプル赤血球凝集素−阻害力価は、相同的なウイルスによる感染から約50%の保護を与える)[65]。抗体反応を、典型的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和試験によって、一元放射免疫拡散(SRID)によって、および/または一元放射状拡散溶血反応(SRH)によって測定する。これらのアッセイ技術は、当該分野で周知である。
本発明の組成物を、様々な方法で投与し得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射による(例えば腕または脚)が、他の利用可能な経路は、皮下注射、鼻腔内[66〜68]、経口[69]、皮内[70、71]、経皮(transcutaneous)、経皮(transdermal)[72]等を含む。
本発明によって調製されたワクチンを、小児および成人の両方を処置するために使用し得る。インフルエンザワクチンは現在、6ヶ月の年齢から、小児および成人の免疫化における使用に推奨される。従って、ヒトの被験体は、1歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳、または少なくとも55歳であり得る。そのワクチンを投与する好ましい被験体は、高齢者(例えば≧50歳、≧60歳、および好ましくは≧65歳)、若年(例えば≦5歳)、入院被験体、医療従事者、軍隊および軍人、妊娠中の女性、慢性的な病気、免疫不全被験体、ワクチンを投与される前7日以内に抗ウイルス化合物(例えばオセルタミビルまたはザナミビル化合物;下記を参照のこと)を投与されている被験体、卵アレルギーを有する人々、および海外旅行者である。しかし、そのワクチンはこれらのグループ単独に適切ではなく、そして集団においてより一般的に使用し得る。パンデミック株に関して、全ての年齢グループへの投与が好ましい。
本発明の好ましい組成物は、有効性のCPMP基準の1、2、または3つを満足させる。成人(18〜60歳)において、これらの基準は:(1)≧70%の抗体保有率;(2)≧40%の抗体陽転;および/または(3)≧2.5倍のGMT増加である。高齢者(>60歳)において、これらの基準は:(1)≧60%の抗体保有率;(2)≧30%の抗体陽転;および/または(3)≧2倍のGMT増加である。これらの基準は、少なくとも50人の患者による非盲検試験に基づく。
処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールにより得る。一次免疫スケジュールおよび/または追加免疫スケジュールにおいて、複数回投与を使用し得る。複数回投与スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路によって、例えば非経口一次追加免疫および粘膜追加免疫、粘膜一次追加免疫および非経口追加免疫等によって投与し得る。1回より多くの投与(典型的には2回投与)が、免疫学的にナイーブな患者、例えば前にインフルエンザワクチンを投与されたことのない人々において、または新しいHAサブタイプに対するワクチン接種のために(パンデミックの発生におけるように)、特に有用である。複数回投与は、典型的には、少なくとも1週あけて(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間等)投与する。
本発明によって産生されたワクチンを、他のワクチンと実質的に同じ時に(例えば医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ受診または訪問の間に)、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、コンジュゲート化H.influenzae b型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン(4価A−C−W135−Yワクチンのような)、呼吸器合抱体ウイルスワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン等と実質的に同時に、患者に投与し得る。高齢者の患者において、肺炎球菌ワクチンおよび/または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与することが特に有用である。
同様に、本発明のワクチンを、抗ウイルス化合物、および特にインフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物(例えばオセルタミビルおよび/またはザナミビル)と実質的に同時に(例えば医療専門家への同じ受診または訪問の間に)、患者に投与し得る。これらの抗ウイルス剤は、(3R,4R,5S)−4−アセチルアミノ−5−アミノ−3(1−エチルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボン酸または5−(アセチルアミノ)−4−[(アミノイミノメチル)−アミノ]−2,6−アンヒドロ−3,4,5−トリデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクトノン−2−エノン酸のような、ノイラミニダーゼ阻害剤を含み、そのエステル(例えばエチルエステル)およびその塩(例えばリン酸塩)を含む。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル(TAMIFLUTM)としても知られている、(3R,4R,5S)−4−アセチルアミノ−5−アミノ−3(1−エチルプロポキシ)−1−シクロヘキセン−1−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート(1:1)である。
一般
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」および「〜から成る」を包含し、例えばXを「含む」組成物は、排他的にXから成り得る、またはさらに何か、例えばX+Yを含み得る。
「実質的に」という用語は、「完全に」を排除しない、例えばYを「実質的に含まない」組成物は、完全にYを含み得ない。必要な場合、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。
数値xに関連して「約」という用語は、任意選択であり、そして例えばx±10%を意味する。
明確に述べなければ、2つまたはそれ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合の順番も必要でない。従って、成分を、あらゆる順番で混合し得る。3つの成分が存在する場合、2つの成分をお互いに組み合わせ、そして次いでその組み合わせを3番目の成分と組み合わせる等し得る。
異なる工程を、実質的に同時に行い得る、または別々に行い得る。それらを同じ場所で、または異なる場所で、異なる国でさえ行い得る(例えばワクチンを、ある場所で調製し得、そこはDNA安全係数を決定する場所とは異なる、および/またはそれをある人が調製し、その人は安全係数を決定する人とは異なる)。
動物(および特にウシ)材料を、細胞の培養において使用する場合、それらを、伝達性海綿状脳症(TSE)を含まない、および特にウシ海綿状脳症(BSE)を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物由来材料が全く存在しない中で細胞を培養することが好ましい。
(配列リストの簡単な説明)
配列番号1は、LINE ORF2の断片を増幅するために使用するフォワードプライマーである。
配列番号2は、LINE ORF2の断片を増幅するために使用するリバースプライマーである。
配列番号3は、LINE−ORF2の2078bpの断片である。
配列番号4は、SINEエレメントの、中央のAリッチ領域である。
LINE断片の増幅
サンプル中のLINE断片を決定するためのPCRアッセイに関して、プライマー配列ACTGTAGTGAGAGATGAAGAGG(配列番号1)およびGGCGTATACCTGTTCATAAT(配列番号2)を使用し、それはORF2(配列番号3)の1002bpの断片を増幅する。
1000bpの断片サイズは、1925bpと報告されたヒト癌遺伝子の平均サイズの半分である[73]。New England Biolabsという会社の、ロングレンジポリメラーゼを、ポリメラーゼとして使用する。94℃で2分の最初の変性工程、続く35サイクルのDNA増幅(94℃で30秒;53℃で30秒、72℃で1分)、および72℃で4分の最終的な伸長工程を用いて、LINE断片を増幅する。
PCR産物の希釈系列を産生し、そしてそのPCR産物を、アガロースゲルで分析する。その結果の評価を、エンドポイント評価によって行う。希釈系列において、最初の陰性PCRシグナルを、計算のために取る。モノバルクマトリックス中の1002bpの断片の検出限界(DL)、およびMDCKゲノム中の癌遺伝子に対するLINE断片の割合(R)を、次のサンプル中の癌遺伝子の計算に組み込む。
9つのモノバルクを、PCR法で、two−fold determinationで測定した。希釈系列で最初の陰性PCRシグナル(PCR(−))を、計算のために取る。この希釈係数、モノバルクマトリックス中の1002bpの断片の検出限界およびLINEあたりの癌遺伝子の割合によって、モノバルク中の癌遺伝子の濃度を、以下のように計算し得る:
Figure 2015526062
式中、「DL」は、所定の条件下における、特定の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の検出限界であり(反復エレメント/mL)、そして「PCR(−)」は、最初の陰性PCRシグナルの希釈係数を示す。その結果は以下の通りである:
Figure 2015526062
DNA安全係数の決定
DNA安全係数を10ngのDNAまでスケールアップする
DNA安全係数を、以下の式を用いて、ワクチン用量中の最大許容DNA含有量に関して計算する:
Figure 2015526062
式中、Ncritical:腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数[癌遺伝子]、Conco:モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]、cDNA:閾値によるモノバルク中のDNA濃度[ng/mL]
腫瘍を産生するための必要な癌遺伝子の数は、1.6×10であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、表1によってPCRにより与えられる。従って、H1N1株に関する計算の例は:
Figure 2015526062
モノバルクワクチンの安全係数を、表2に示す:
Figure 2015526062
DNA安全係数を、10ngのDNAまでスケールアップする
DNA安全係数の2番目の考慮する点は、1回用量の体積に関連する。インフルエンザワクチンの場合、1回用量は、通常0.5mLと同等である。
DNA安全係数は、以下
Figure 2015526062
によって計算され、
式中、Ncritical:腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数[癌遺伝子]
onco:モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]
腫瘍を産生するための必要な癌遺伝子の数は、1.6×10であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、PCRによって与えられる。従って、H1N1株に関する計算の例は以下である:
Figure 2015526062
モノバルクワクチンの安全係数を、表3に示す:
Figure 2015526062
DNA安全係数を、用量あたりの活性成分(HA)までスケールアップする
このDNA安全係数の考慮する点は、モノバルクのHA含有量に関連する。1つの最終的なワクチン用量は、50μgのHAの全量を含む。
DNA安全係数を、以下によって計算する
Figure 2015526062
式中、Ncritical:腫瘍を産生するために必要な用量あたりの癌遺伝子の数[癌遺伝子]
onco:モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]
HA:モノバルク中のHA濃度(μg/mL)
腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数は、1.6×10であり、そしてモノバルク中の癌遺伝子の濃度は、PCRによって与えられる。HA抗原の量は、SRIDによって245μg/mLと決定される。
従って、H1N1株の計算の例は、以下である:
Figure 2015526062
モノバルクワクチンの安全係数を、表4に示す。
Figure 2015526062
本発明を、実施例のみによって説明し、そして本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら、改変を行い得ることが理解される。
Figure 2015526062
Figure 2015526062
Figure 2015526062
Figure 2015526062

Claims (54)

  1. 宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物のDNA安全係数を決定するための方法であって、以下:
    a)該宿主細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程;
    b)増幅したDNAを用いて、該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程;
    c)該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、該組成物の用量中の癌遺伝子の数、
    Figure 2015526062
    を計算する工程;および
    d)該DNA安全係数(SF)を決定する工程
    を含む、方法。
  2. 前記DNA安全係数を、式
    Figure 2015526062
    によって決定する、
    式中、
    Figure 2015526062
    は、前記組成物の用量中に存在し得る、用量当たりの癌遺伝子の最大数である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記組成物の用量は、前記宿主細胞に由来するx ngの細胞DNAを含むと仮定され、前記安全係数SFは、式
    Figure 2015526062
    によって計算される、
    式中、
    Figure 2015526062
    は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、concoは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]であり、そしてcDNAは、該組成物中の該宿主細胞のDNAの濃度[ng/mL]である、請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. 前記組成物が、前記宿主細胞に由来する10ngの細胞DNAを含むと仮定される、請求項3に記載の方法。
  5. 前記組成物の用量が、該組成物の体積によって規定され、前記安全係数SFは、式
    Figure 2015526062
    によって計算される、
    式中、
    Figure 2015526062
    は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、concoは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]であり、そしてVdoseは、該組成物の用量の体積[mL]である、請求項1または請求項2に記載の方法。
  6. 前記組成物の用量は、前記生物学的産物の量によって規定され、前記安全係数SFは、式、
    Figure 2015526062
    によって計算される、
    式中、
    Figure 2015526062
    は、腫瘍を産生するために必要な癌遺伝子の数であり、concoは、モノバルク中の癌遺伝子の濃度[癌遺伝子/mL]であり、cdoseは、用量当たりの活性成分の濃度[μg/用量]であり、そしてcactualは、該組成物中の該活性成分の実際の濃度[μg/mL]である、請求項1または請求項2に記載の方法。
  7. 工程(a)で増幅される前記断片は、700〜1300bpのサイズを有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  8. 工程(a)で増幅される前記断片は、800〜1200bpのサイズを有する、請求項7に記載の方法。
  9. 工程(a)で増幅される前記断片は、900〜1100bpのサイズを有する、請求項7または請求項8に記載の方法。
  10. 工程(a)で増幅される前記断片は、約1000bpのサイズを有する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 生物学的産物を含む組成物を作製する方法であって、以下:
    a)宿主細胞を培養して該生物学的産物を産生する工程;
    b)(a)において産生された該生物学的産物から組成物を調製する工程;および
    c)前記請求項のいずれかに記載の方法によって、該組成物のDNA安全係数を決定する工程
    を含む、方法。
  12. ワクチン組成物を作製する方法であって、以下:
    a)宿主細胞を培養してウイルスを産生する工程;
    b)(a)において産生された該ウイルスからワクチンを調製する工程;および
    c)前記請求項のいずれかに記載の方法によって、該ワクチンのDNA安全係数を決定する工程
    を含む、方法。
  13. 前記安全係数が10未満の場合、前記組成物は却下される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  14. 前記反復エレメントまたは前記ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、前記組成物中の残留宿主細胞DNAの量を計算する工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  15. 宿主細胞において産生された生物学的産物を含む組成物であって、n個より少ない反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子を含み、ここでnは式
    Figure 2015526062
    によって計算され、
    式中、
    Rは、該宿主細胞における反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合であり、
    oncoは、癌遺伝子である、
    組成物。
  16. 前記反復エレメントはレトロトランスポゾンである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  17. 前記レトロトランスポゾンはLINEエレメントである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  18. 前記産物は、1mLあたり5.16×10未満のLINEエレメントを含む、請求項17に記載の組成物。
  19. 前記レトロトランスポゾンは、SINEエレメント、SVAエレメントまたは偽遺伝子である、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  20. 前記ハウスキーピング遺伝子は、GAPDH、β−アクチン、チューブリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、およびリボソームタンパク質からなる群から選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
  21. 前記組成物はワクチンである、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  22. 前記ワクチンは、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ロスリバーウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ロタウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、狂犬病および黄熱からなる群から選択されるウイルスに由来する抗原を含む、請求項21に記載の方法または組成物。
  23. 前記ワクチンはモノバルクワクチンである、請求項21または請求項22に記載の組成物。
  24. 前記ワクチンはインフルエンザワクチンである、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  25. 前記ワクチン中の赤血球凝集素(HA)濃度は、用量あたり0.1〜50μgである、請求項24に記載の組成物の組成物。
  26. 前記ワクチン中の赤血球凝集素(HA)濃度は、用量あたり0.1〜20μgである、請求項25に記載の組成物。
  27. 前記ワクチン中の赤血球凝集素(HA)濃度は、用量あたり約15μgまたは約7.5μである、請求項26に記載の組成物。
  28. 生ウイルスワクチンである、請求項21〜27のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  29. 不活性化ウイルスワクチンである、請求項21〜27のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  30. 全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、またはウイルスサブユニットワクチンである、請求項29に記載の方法または組成物。
  31. 3価のインフルエンザワクチンである、請求項24〜30のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  32. 3価のインフルエンザワクチンである、請求項24〜30のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  33. パンデミックインフルエンザウィルス株を含む、請求項24〜32のいずれか1項に記載の方法または組成物。
  34. 前記宿主細胞は、MDCK細胞系、CHO細胞系、ベロ細胞系、またはPER.C6細胞系である、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  35. 前記組成物は、オボアルブミンおよびニワトリDNAを含まない、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  36. 前記組成物の用量は、0.1〜1mLの体積を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法または組成物。
  37. 前記組成物の用量は、約0.5mLの体積を有する、請求項36に記載の方法または組成物。
  38. 細胞を特徴付ける方法であって、以下
    a)該細胞の反復エレメントまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程;
    b)増幅したDNAを用いて、該細胞における該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程;および
    c)反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Rを計算する工程
    を含む、方法。
  39. 反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子に対する癌遺伝子の割合Rを、式
    Figure 2015526062
    によって計算する、
    式中、
    onco:ゲノムあたりの癌遺伝子の数
    rep:反復エレメント/ハウスキーピング遺伝子の数[rep/mL]
    DNA:テストサンプル中の細胞DNAの濃度[pg/mL]
    hap.gen.:前記細胞の一倍体ゲノムの質量
    である、請求項38に記載の方法。
  40. 前記細胞は、ワーキングセルバンクまたはマスターセルバンクに由来する、請求項38または請求項39に記載の方法。
  41. 生物学的産物を調製する方法であって、以下:
    a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって宿主細胞を特徴づける工程;および
    a)該宿主細胞において該生物学的産物を産生する工程
    を含む、方法。
  42. (b)において産生された前記生物学的産物を含む組成物を調製する工程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
  43. 請求項1〜37のいずれか1項に記載の方法によって、前記組成物のDNA安全係数を決定する工程をさらに含む、請求項41または請求項42に記載の方法。
  44. 前記細胞は、工程(a)と工程(b)との間に少なくとも2回継代される、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
  45. 請求項42〜44のいずれか1項に記載の方法であって、前記組成物はワクチンであり、該方法は以下:
    a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程;
    b)該細胞にウイルスを感染させる工程;
    c)該細胞を培養して、ウイルスを産生する工程;および
    d)(c)において産生された該ウイルスからワクチンを調製する工程
    を含む、方法。
  46. 前記細胞は、MDCK細胞系、CHO細胞系、ベロ細胞系、またはPER.C6細胞系である、請求項38〜45のいずれか1項に記載の方法。
  47. 宿主細胞で産生された生物学的産物を含む組成物において、残留宿主細胞DNAの量を決定する方法であって、以下:
    a)該宿主細胞の反復エレメントのまたはハウスキーピング遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程;
    b)増幅したDNAを用いて、該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を決定する工程;および
    c)該反復エレメントまたは該ハウスキーピング遺伝子のコピー数を用いて、該組成物中の残留宿主細胞DNAの量を計算する工程
    を含む、方法。
  48. 前記反復エレメントは、LINEエレメント、SVAエレメントまたは偽遺伝子である、請求項47に記載の方法。
  49. 生物学的産物を作製するための方法であって、(a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程;および(b)該宿主細胞の培養物を用いて、該生物学的産物を調製する工程を含む、方法。
  50. 生物学的産物を含む組成物を調製するための方法であって、(a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって宿主細胞を特徴付ける工程;(b)該宿主細胞の培養物を用いて、該生物学的産物を調製する工程;および(c)(i)工程(b)で産生された該生物学的産物または(ii)工程(b)で産生された該生物学的産物から作製された化合物を含む組成物を調製する工程を含む、方法。
  51. 工程(b)で使用される前記細胞は、工程(a)で使用される前記細胞の子孫であり、および/または工程(a)で使用される前記細胞のクローンであり、および/または工程(a)および(b)の間に少なくとも1回、工程(a)で使用される前記細胞から継代された細胞である、請求項49または請求項50に記載の方法。
  52. 生物学的産物を作製するための方法であって、(a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって、セルバンク由来の細胞を特徴付けるか、または請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって特徴付けられたセルバンク由来の細胞を提供する工程;および(b)該細胞バンク由来の細胞を用いて、該生物学的産物を調製する工程を含む、方法。
  53. 生物学的産物を含む組成物を作製するための方法であって、(a)請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって細胞バンク由来の細胞を特徴付けるか、または請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法によって特徴付けられた細胞バンク由来の細胞を提供する工程;(b)該細胞バンク由来の細胞を用いて、該生物学的産物を調製する工程;および(c)(i)工程(b)で産生された該生物学的産物、または(ii)工程(b)で産生された該生物学的産物から作製された化合物を含む組成物を調製する工程を含む、方法。
  54. 工程(a)および工程(b)で使用される前記細胞は、異なる細胞バンクに由来する、請求項52または請求項53のいずれかに記載の方法。

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