KR20180036977A - 인플루엔자 효능 검정 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 인플루엔자 백신에 대한 안정성-표시 효능 검정을 개시한다.

Description

인플루엔자 효능 검정
본 출원은 유럽 특허 출원 번호 15175765.5 (2015년 7월 7일에 출원됨) 및 유럽 특허 출원 번호 16152829.4　 (2016년 1월 26일에 출원됨)의 이익을 주장하며, 이것들의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 출원은 일반적으로 백신, 더 구체적으로는 인플루엔자 백신용 검정에 관한 것이다.
최근 인플루엔자의 발생은 잠재적으로 치명적인 합병증을 일으키는 이 질환으로부터 일반 대중을 보호하기 위해 충분한 양의 인플루엔자 백신을 빠르게 생산하고 방출해야 할 필요성을 강조한다.
비활성화된 인플루엔자 백신에서 헤마글루티닌 (HA) 함량에 대한 표준 검정은 1978년에 WHO에 의해 적혈구의 응집 반응에 기초한 테스트를 대체하도록 권장된 일원 방사 면역확산법 (single radial immunodiffusion; "SRID")을 기반으로 한다 (참고문헌 1 & 2).
SRID 검정의 또 다른 문제점은 검정에 사용된 항혈청이 완전히 특이적이지 않을 수도 있고 두 형태 모두와 반응할 수도 있기 때문에 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 항원의 면역원성 활성 형태 및 면역원이 아닌 것들을 확실하게 구별하지 못할 수도 있다는 것이지만, 일반적으로는 이러한 항혈청이 SRID 검정에서 고유한 면역원성 형태를 우선적으로 인식하도록 조정될 수 있다고 생각된다 (참고문헌 125). 인플루엔자 백신의 면역원성 (이로 인한 면역보호)은 면역원성 활성 HA의 양에 의해 결정되기 때문에, 검정이 HA의 면역원성 활성 형태를 특이적으로 측정할 수 있는 것이 바람직하다.
참고문헌 3은 한외여과에 이어서 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 이어지는 SRID 검정에 대한 대안을 제안하고, 참고문헌 4 및 5는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 기반 검정을 교시한다. 참고문헌 6 및 7은 정량적 질량 분석법 기반 검정을 개발하였다. 이 검정들은 전체 HA를 정확하게 정량할 수 있고 균주-특이적 항혈청에 의존적인 것은 아니지만, 면역학적 활성 HA와 비활성 HA를 구별하는데 실패하였다. ELISA 검정은 면역학적 활성 HA를 특이적으로 정량할 수 있지만 균주 특이적 항체의 생성에 의존적이며 (참고문헌 8), 이것은 백신이 방출될 수 있기 전에 필요한 시간을 크게 증가시킨다.
본 발명은 기존의 인플루엔자 효능 검정으로 문제의 원인을 확인하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 백신 생산용 인플루엔자 바이러스 항원을 정량화하는데 사용되는 통상적인 방법들이 면역원으로서 백신에 포함된 인플루엔자 바이러스 단백질의 양을 정확하게 측정하지 않는다는 인식에 적어도 어느 정도는 기초하고 있다. 본원에서 및 다른 곳에서 제공된 작업은 분리된 인플루엔자 바이러스 단백질이 생체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 기능적 면역원으로서가 아니라, 시험관 내 면역검정에서 항원으로서의 역할을 할 수도 있다는 것을 제안한다. 이들 기능적으로 및 구조적으로 별개의 형태의 인플루엔자 단백질들을 별도로 측정해야 할 필요가 있으므로, 인플루엔자 백신은 그 안에 함유된 기능적 면역원의 정확한 양을 반영하도록 제조될 수 있다. 그 목적을 달성하기 위해서는, 본 명세서의 발명자들은 활성이고 면역원성인 입체구조와 비활성 대응물 간의 구조적 차이를 구별하기 위해 생물물리학적 측정 (면역화학적 측정과는 반대)에 기초한 검정을 개발하고자 하였다. 이 접근법에 대한 근거는 다음을 포함한다: i) 단백질/항원 그 자체의 더 직접적인 측정; ii) 이러한 검정이 수행될 수 있는 속도; iii) 다수의 항원을 가진 샘플이 동시에 가공될 수 있는 단순성; 및/또는, iv) 상응하는 항혈청 (전형적으로 양 항혈청)의 이용 가능성에 의존할 필요 없음.
따라서, 본원에서 제공된 방법은 백신 제조사들이 단지 제품에 포함된 단백질의 총량뿐만 아니라, 얼마나 많은 면역원성 항원이 각각의 백신에 함유되는지를 정확하게 나타낼 수 있게 한다. 이것은 공중 위생의 관점에서 중요한데, 얼마나 많은 면역원성 HA가 존재하는지를 결정하는 것이 필요하고, 얼마나 많은 비-기능적 HA가 백신에 존재하는지를 아는 것이 바람직하며, 백신의 순도 및 효험에 대하여 더 초점을 맞추는데 도움이 되기 때문이다.
그러므로 고전적인 SRID 검정보다 더 빠르고 인플루엔자 백신에서 면역원성 활성 HA의 양의 더욱 신뢰 가능한 평가를 추가로 제공하는 인플루엔자 효능 검정을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 개선된 SRID 검정을 더 제공하는데, 고전적인 SRID 검정이 본원에서 기술된 생물학적 단백질 가수분해의 이점, 즉, 면역원성 형태의 HA와 불량한 면역원성 형태의 HA를 구별하는 능력을 이용하도록 변형되었다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 SRID 이전에 생물학적 단백질 가수분해 단계 (예를 들어, 트립신 전처리)를 포함하며, 이로 인해 샘플에서 면역학적 활성 HA의 양을 결정하는데 있어서 검정의 정확도를 개선하는 SRID 검정을 제공한다. 적합한 샘플은 본원에서 정의된 샘플일 수도 있다. 적합한 샘플은, 예를 들어, 항원 벌크 조제물 (예컨대, 모노벌크(monobulk)), 제조 중 및/또는 최종 제형화 이후의 중간 조제물, 방출 이전의 최종 백신 제형 및/또는 생성물, 저장 이후의 백신 생성물, 등으로부터 얻어질 수도 있다. 생물학적 단백질 가수분해에 의한 전처리를 거친 SRID는, 본원에서 기술된 바와 같이, 유리하게는 고전적인 SRID 포맷에서 볼 수 있는 면역학적 활성 HA의 과다추정를 방지한다.
본원에서 기술된 방법은 인플루엔자 백신의 제조 중에 인플루엔자 바이러스 항원의 양의 측정, 뿐만 아니라 품질 관리 목적, 예를 들어, 일정 기간 이후, 예를 들어, 저장 이후에 샘플 (중간 조제물, 벌크 조제물, 및 최종 백신 생성물 포함)의 효능의 평가에 적합하다.
도 1은 환원된 SDS-PAGE (A) 및 RP-HPLC (B) 둘 다에 의해 도시된 바와 같이, 저 pH-유도된 융합 후 HA1이 트립신 분해에 민감한 한편, 대조군 융합 전 HA1은 심지어 높은 프로테아제 농도에서도 트립신에 대하여 저항성이라는 것을 도시한다.
도 2는 인플루엔자 효능 검정의 흐름도를 제공한다.
도 3은 본 발명의 검정 및 SRID에 의해 테스트된 pH 4-스트레스트(stressed) 4가 인플루엔자 백신 (QIV) 샘플의 결과를 제공한다. (A) 별도로 처리된 샘플의 RPLC 크로마토그램 (피크의 주석은 표준 모노벌크의 체류 시간에 기초함); (B) 본 검정 (왼쪽 패널) 및 SRID (오른쪽 패널)에 의한 검정 결과. -/- 대조군에서 각각의 균주의 효능은 100%로 도시된다.
도 4는 본 발명의 검정 및 SRID에 의해 테스트된 pH 11-스트레스트 4가 인플루엔자 백신 (QIV) 샘플의 결과를 제공한다. (A) 별도로 처리된 샘플의 RPLC 크로마토그램 (피크의 주석은 표준 모노벌크의 체류 시간에 기초함); (B) 본 검정 (왼쪽 패널) 및 SRID (오른쪽 패널)에 의한 검정 결과. -/- 대조군에서 각각의 균주의 효능은 100%로 도시된다.
도 5는 본 검정 및 SRID에 의해 테스트된 열 (56℃)-스트레스트 4가 인플루엔자 백신 (QIV) 샘플의 결과를 제공한다. (A) 별도로 처리된 샘플의 RPLC 크로마토그램 (피크의 주석은 표준 모노벌크의 체류 시간에 기초함); (B) 본 검정 (왼쪽 패널) 및 SRID (오른쪽 패널)에 의한 검정 결과. -/- 대조군에서 각각의 균주의 효능은 100%로 도시된다.
도 6은 A/Victoria, A/Brisbane 및 B/Brisbane 균주에 대하여 아세톤 침전 후 회수된 면역원성 HA의 퍼센트를 도시한다.
도 7은 상이한 세척 프로토콜 이후에 남아있는, 분해된 비활성 HA 펩타이드의 퍼센트를 상세히 설명하는 표를 제공한다. 샘플을 i) 아세톤으로 3회; ii) 아세톤으로 2회 세척 후 에탄올 세척 1회; 또는 iii) 에탄올로 3회 세척하였다. 에탄올로 3회 세척하는 것이 가장 많은 양의 분해된 비활성 HA 펩타이드를 제거함으로써 최고의 결과를 생산하였다.
도 8은 트립신 분해 여부에 관계없이, pH 7.2로 유지되거나 또는 pH 4.0에 일시적으로 노출된 1 μg 난(egg)-생산된 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA로 2회 주사된 마우스의 면역원성을 나타내는 그래프를 제공한다. (A) A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스 및 칠면조 혈액 세포를 사용한 HI 역가. (B) MDCK 세포를 감염시키기 위해 A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스를 사용하여 A와 같은 혈청 세트에서 마이크로중화(microneutralization) 역가.
도 9는 트립신 분해 여부에 관계없이, pH 7.2로 유지되거나 또는 pH 4.0에 일시적으로 노출된 난-생산된 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA의 SDS-PAGE, RP-HPLC, ELISA 및 SRID 분석을 도시한다. (A) 비-환원된 (왼쪽) 및 환원된 (오른쪽) 샘플의 SDS-PAGE. (B) (A)와 같은 샘플 세트의 분석적 RP-HPLC 크로마토그램. (C) (A)와 같은 샘플 세트의 ELISA, 플레이트 상에서 코팅된 HA로 수행되고, SRID에서 사용된 양 다클론성 항혈청에 의해 검출됨. (D) (A)와 같은 샘플 세트의 SRID 겔 이미지. (E) 마우스의 면역원성의 HI 역가로의 RP-HPLC, ELISA 및 SRID에 의한 HA 정량화의 요약.
도 10은 pH 7.2로 유지되거나 또는 pH 4.0에 일시적으로 노출된 난-생산된 A/Perth/16/2009 (H3N2) HA의 균질한 샘플 및 두 개의 샘플의 혼합물에 대한 SRID 및 트립신/RP-HPLC 분석을 도시한다. (A) 비-스트레스트 HA, 저 pH 스트레스트 HA 및 2x, 1.5x, 1x 및 0.5x의 저 pH 스트레스트 HA가 첨가된(spiked) 비-스트레스트 HA를 검정하는 SRID 겔의 이미지. (B) A의 SRID 겔 및 스트레스트 샘플들 및 그것들의 혼합물의 트립신/RP-HPLC 검정으로부터 HA의 상대적 정량화.
도 11은 트립신 분해 여부에 관계없이, 7.2로 유지되거나 또는 pH 4.0에 일시적으로 노출된 HA 또는 두 개의 HA 샘플의 혼합물에 대한 SRID 및 RP-HPLC 분석을 도시한다. (A) 이들 처리를 거친 난-생산된 B/Brisbane/60/2008 샘플에 대한 SRID 이미지. 이들 처리를 거친 (B) 난-생산된 B/Brisbane/60/2008 HA; (C) A/California/07/2009 (H1N1) HA; (D) A/Texas/50/2012 (H3N2) HA; 및 (E) B/Massachusetts/02/2012 HA에 대한 SRID 및 RP-HPLC에 의한 HA 정량화.
도 12는 IRDye-라벨링된 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA의 SRID 분석의 이미지를 제공한다. (A) 각각 IRDye800으로 라벨링된 비-스트레스트 HA 및 저 pH 스트레스트 HA는 SRID에 의해 분석되었다. 라벨링된 단백질은 SRID 겔에서 적외선 형광 이미지화에 의해 추적되었다. 비-라벨링된 HA는 또한 SRID 겔을 블롯팅하는데 사용된 나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 막 상에서 항-H3 항체로의 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해 검출되었다. (B) 비-스트레스트 HA는 IRDye800로 라벨링되었고, 저 pH 스트레스트 HA는 IRDye680으로 라벨링되었다. 비-스트레스트 HA, 스트레스트 HA, 및 비-스트레스트 및 스트레스트 HA의 혼합물은 트립신 처리 여부에 관계없이 SRID 겔에서 이미지화 장치의 녹색 및 빨간색 채널을 통해 검출되었다.
본 발명은 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하는 방법을 제공하며, 이것은 더 빠르고, 더 정확하며 항혈청의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따르면, 면역원성 HA 및 비활성 HA는 그것들의 상이한 입체구조로 인해 분리될 수 있으며, 이것은 단백질 가수분해에 대한 그것들의 차등적 민감도에 반영된다. 이 방법들은 항혈청으로부터 독립적이고 생물물리학적 전처리를 이용하여 면역학적 비활성 HA (예를 들어, 불량한 면역원성, 스트레스트 또는 융합 후 입체구조)를 선택적으로 제거한 후 이어서, 면역원성 HA를 분리하고 정량화한다. 그러므로 면역원성 HA의 양만이 측정되기 때문에 이 방법들이 표준 SRID 검정보다 훨씬 더 빠르고 훨씬 더 정확하다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계;
c) 샘플에서 분해된 비활성 HA를 분해되지 않은 면역원성 HA로부터 분리하는 단계;
d) 분해되지 않은 면역원성 HA를 분석적 단백질 가수분해시켜서 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계; 및
e) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해, 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry; LC-ESI-MS)을 수행하는 단계.
샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법이 더 제공되며, 다음 단계를 포함한다:
a) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계;
b) 샘플에서 면역원성 HA를 다른 구성요소로부터 분리하는 단계; 및
c) 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하는 단계.
특히 바람직한 구체예에서, 단계 (c)는 질량 분석법, 특히 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 사용하여 수행된다.
면역원성 HA의 정량화는 원칙적으로 업계에 공지된 임의의 단백질 정량화 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 기술된 특정 구체예는 또한 SRID에 의한 정량화와 호환 가능할 것이다.
본원에서 기술된 바와 같이 샘플에서 다른 구성요소들로부터 면역원성 HA를 분리하는 단계 (예를 들어, 샘플에서, 분해된 비활성 HA를 분해되지 않은 면역원성 HA로부터 분리하는 단계)가 생략된 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은, 분리 단계를 수반하는, 본원에서 기술된 방법, 특히 정량화가 질량 분석법에 의해 이루어지는 방법에 대한 대안일 수도 있다. 이러한 방법은 가공 또는 조작 단계의 수를 감소시키고 (예를 들어, 단백질 침전에 의한 분리 단계를 제거함으로써) 샘플 손실을 최소화하는 이점을 갖는다. 발명자들은 상이한 기질 특이성 (또는 기질 특이성들 중 선택물)을 갖는 상이한 프로테아제, 또는 프로테아제들 중 상이한 선택물이 생물학적 및 분석적 단백질 가수분해 단계 각각에 사용되는 경우, 샘플에서 면역원성 HA와 비활성 HA의 양을 더 구별할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 방법에서, 비활성 HA는 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 하나 이상의 프로테아제에 의해 분해되어, 분해된 비활성 HA를 생산하는 한편, 면역원성 HA (또는 실질적으로 모든 면역원성 HA)는 분해되지 않은 채로 유지된다. 그 다음에 분해되지 않은 면역원성 HA 및 분해된 비활성 HA의 혼합물은 하나 이상의 프로테아제에 의해 분석적 단백질 가수분해된다. 중요하게는, 분석적 단백질 가수분해는 생물학적 단백질 가수분해 동안에 비활성 HA에서 절단될 수 있는 하나 이상의 절단 부위(들)에서 면역원성 HA를 절단할 수 없는 프로테아제 또는 프로테아제들 중 선택물을 사용하여 수행된다. 이 방법으로, 분석적 단백질 가수분해는 비활성 HA-유래 펩타이드와 구별 가능한 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)를 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공할 수 있다. 예를 들어, 분해된 면역원성 HA의 단편은 적어도 하나의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 적어도 하나의 절단 부위를 함유하는 하나 이상의 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)를 포함할 것이며, 적어도 하나의 프로테아제가 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용되지만, 분석적 단백질 가수분해 단계에서는 사용되지 않았다.
따라서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 프로테아제에 의해 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계;
c) 분해되지 않은 면역원성 HA 및 분해된 비활성 HA의 혼합물을, 생물학적 단백질 가수분해 동안에 비활성 HA에서 절단될 수 있는 하나 이상의 절단 부위(들)에서 면역원성 HA를 절단할 수 없는 하나 이상의 프로테아제를 사용하는 분석적 단백질 가수분해시켜서, 비활성 HA-유래 펩타이드와 구별 가능한 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)을 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계; 및
d) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해, 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 수행하는 단계.
이 방법들의 바람직한 구체예에서, 하나의 프로테아제 (예를 들어, 키모트립신-유사 프로테아제)는 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용되고 상이한 기질 특이성을 가진 상이한 프로테아제 (예를 들어, 트립신-유사 프로테아제)는 분석적 단백질 가수분해에서 사용된다. 대안으로, 하나 이상의 상이한 프로테아제 (예를 들어, 두 개)가 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용될 수도 있고 단일 프로테아제가 분석적 단백질 가수분해 단계에서 사용될 수도 있다. 둘 이상의 상이한 프로테아제 (예를 들어, 세 개, 네 개 또는 그 이상)의 세트가 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용되는 경우, 더 적은 수의 상이한 프로테아제의 세트가 분석적 단백질 가수분해 단계에서 사용될 수도 있다.
이러한 방법들은, 예를 들어, 샘플을 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제에 의해 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계를 수반할 수도 있으며, 제2 프로테아제의 기질 특이성은 제1 프로테아제와 다르다. 그 다음에 방법은 분해되지 않은 면역원성 HA 및 분해된 비활성 HA의 혼합물을 단지 제1 프로테아제에 의해서만 분석적 단백질 가수분해시키는 단계를 수반할 수도 있다. 대안으로, 제1 및 제2 프로테아제 둘 다와 다른 기질 특이성을 가진 제3 프로테아제가 분석적 단백질 가수분해에서 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 프로테아제는 생물학적 단백질 가수분해에 사용되는데, 제1 프로테아제는 트립신-유사 프로테아제 (예를 들어, 트립신)이고 제2 프로테아제는 키모트립신-유사 프로테아제 (예를 들어, 키모트립신)이다.
분석적 단백질 가수분해는 단일 프로테아제를 사용할 수도 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 분석적 단백질 가수분해에 사용된 단일 프로테아제는 트립신-유사 프로테아제 (예를 들어, 트립신)이다.
적합한 프로테아제의 추가의 예가 하기 제공되며 당업자에게 공지될 것이다. 본 발명에서 사용되는 프로테아제의 적합한 조합은 당업자에 의해 예비 실험에서 쉽게 결정될 수 있다. 면역원성 HA에 사용된 참조 / 대리 HA 펩타이드(들)은 적어도 하나의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 적어도 하나의 절단 부위를 함유하는 HA 서열을 포함하도록 선택될 수도 있으며, 상기 적어도 하나의 프로테아제는 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용되지만, 분석적 단백질 가수분해 단계에서는 사용되지 않는다는 것이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 키모트립신-유사 프로테아제가 분석적 단백질 가수분해 단계가 아니라, 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 사용될 때 (예를 들어, 단독으로 또는 트립신-유사 프로테아제, 예컨대 트립신과 함께), 면역원성 HA 정량화에 사용되는, 키모트립신-유사 프로테아제 (예를 들어, 키모트립신)에 의해 절단된 HA 서열을 포함하는 대리 HA 펩타이드가 선택될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하기 위해 개선된 SRID 방법을 제공하며, 이것들은 표준 SRID 검정보다 더 정확하다. 상기 설명된 바와 같이, 면역원성 HA 및 비활성 HA는 상이한 입체구조로 인해 분리될 수 있으며, 이것은 단백질 가수분해에 대한 그것들의 차등적 민감도에 반영된다. 본 발명의 SRID 방법은 전형적으로 항혈청을 사용하고 (즉, 그것들은 항혈청으로부터 독립적이지 않음) 또한 생물물리학적 전처리를 이용하여 면역학적 비활성 HA (예를 들어, 불량한 면역원성, 스트레스트 또는 융합 후 입체구조)의 선택적 제거를 가능하게 한다. 본 발명의 SRID 방법에서, 이 전처리 (생물학적 단백질 가수분해)는 면역원성 HA의 정량화로 이어진다.
따라서, 본 발명은 샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법을 더 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
a) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계; 및
b) SRID 검정에 의해 (b)의 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계.
일부 구체예에서, 단계 (b)의 SRID 검정은 항혈청, 예컨대 다클론성 항혈청 (예를 들어, 양 다클론성 항혈청) 및/또는 단클론성 항체 항혈청 (예를 들어, 적합한 단클론성 항체 포함)의 사용으로 수행된다. 적합한 항혈청 또는 항혈청들은 균주-특이적이고 HA-특이적일 수도 있다. 따라서, SRID 검정은 균주-특이적, 항-HA, 다클론성 (양) 항혈청의 사용으로 수행될 수도 있다.
본 발명은 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 더 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
a) 인플루엔자 HA를 포함하는 벌크 조제물로부터 샘플을 제공하는 단계
b) 본 발명의 방법에 따라 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계; 및
c) 샘플에서 면역원성 HA의 양에 따라 벌크 조제물로부터 단일 투약 형태를 포장하는 단계.
본 발명은 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 더 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
a) 본 발명의 방법에 의해 벌크 백신 내 HA의 양을 정량화하는 단계; 및
b) 벌크로부터 백신을 제조하는 단계.
생물학적 단백질 가수분해 및 분석적 단백질 가수분해
인플루엔자 바이러스 표면 HA는, 면역학적으로 가장 적절한 상태인, 융합 전 상태에서 주로 올리고머 (예컨대 트라이머)로서 존재한다. 다양한 스트레스 조건 하에서, HA는 융합 후 상태로의 비가역적 전환을 거칠 수 있는데, 이것이 양호한 면역 반응을 유도하는 것은 아니다. 인플루엔자 백신의 제조는 종종 융합 후 HA의 존재를 초래하고 표준 SRID 검정은 융합 전 (면역원성) HA와 융합 후 (비활성) HA를 구별할 수 없으며, 따라서 백신에 함유된 면역원성 HA의 실제량의 과다추정를 초래한다. 본 발명의 방법은 단지 면역원성 형태만이 정량화되도록 생물학적 단백질 가수분해에 의해 이러한 상이한 형태의 HA들을 구별한다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "생물학적 단백질 가수분해"는 HA의 효소-기반 분해를 말하며, 면역학적 활성 형태의 단백질 (예를 들어, 융합 전 상태의 HA)은 온전한 채로 유지되는 한편 (즉, 분해되지 않음), 비활성 형태의 단백질 (예를 들어, 융합 후 상태의 HA)은 분해된다. 그러므로 생물학적 단백질 가수분해 단계는 단백질의 입체구조에 따라 차등적 분해를 달성한다. 변성 단계를 거치지 않은 HA 단백질은 생물학적 단백질 가수분해에 대하여 저항성이다. 따라서, 생물학적 단백질 가수분해 단계는, 본원에서 사용된 바와 같이, 단백질의 구조적 온전함 또는 입체구조에 따라 단백질의 제어된 또는 제한된 분해를 달성한다.
대조적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, "분석적 단백질 가수분해"는 전형적으로, 표적 단백질의 입체구조에 관계없이, 차후 분석 단계(들), 예컨대 질량분석의 목적을 위한 표적 단백질의 단편화 (즉, 분해)를 말한다. 분석적 단백질 가수분해는 분해 전 단백질을 변성시키는 단계를 수반한다.
참고문헌 9에서는 HA의 입체 구조가 pH에 따라 변화되며 어떤 형태의 HA는 프로테아제 분해에 민감하지만 다른 형태들은 그렇지 않다고 보고되었다. 이것은 면역원성 HA의 표면 상에서 잘 적층된(well-packed) 구조 및 밀집된 글리코실화 코팅에 기인할 수 있다. 발명자들은 융합전 HA가 높은 프로테아제 농도 (HA:트립신 = 5:1)에서도 고유한 상태에서의 단백질 가수분해에 의한 분해에 대하여 매우 저항성이라는 것을 확인하였다. 이에 반해, 저 pH 유도된 융합 후 HA1은, 고유한 상태일 때도, 단백질 가수분해에 의한 분해에 매우 민감하였다.
정량화 전에 생물학적 단백질 가수분해 단계를 포함함으로써, 본 발명의 방법은 면역원성 HA와 비활성 HA 간의 구별을 허용한다. 특히, 면역원성 HA는 프로테아제-저항성인 한편 비활성 HA는 프로테아제-민감성이다. 이것은 프로테아제가 샘플에 추가될 때 (예를 들어, 트립신이 1:20의 효소:기질 비로 추가되고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션된 경우) 실질적으로 모든 비활성 HA가 분해되는 반면 실질적으로 모든 면역원성 HA는 구조적으로 온전한 채로 유지된다는 것을 의미한다. 그러므로 생물학적 단백질 가수분해 단계는 실질적으로 모든 비활성 (융합 후) HA를 분해시키는 한편 실질적으로 모든 면역원성 (융합 전) HA는 분해되지 않은 채로 유지된다. 이 점에 있어서, 면역원성 HA는 프로테아제-의존적 절단 그 자체로 완전히 저항성이 아닌 것으로 이해될 것이다. 특히, HA0은 특정 프로테아제 (예컨대 트립신)에 의해 HA1 및 HA2로 절단될 수 있지만 단백질은 단편으로 해리되지 않는다. 오히려, HA1 및 HA2는 같은 구조적 온전함 (예를 들어, 융합 전 상태)을 유지하는 복합체로서 회합된 채로 유지된다. 이 HA1/HA2 복합체들은 면역원성인 것으로 간주된다. 절단된 융합 전 HA는 실질적으로 모든 비활성 HA가 프로테아제에 의해 펩타이드로 단편화된다는 점에서 비활성 HA의 분해된 생성물과 구별될 수 있다.
단백질 가수분해 (분해)의 맥락에서 "실질적으로"는 샘플에 존재하는 비활성 (융합 후) HA의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 분해된다는 것을 의미한다. 유사하게, 면역원성 HA의 맥락에서 "실질적으로"는 면역원성 (융합 전) HA의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 분해되지 않은 채로 유지된다는 것을 의미한다.
면역원성 HA는 융합 전 HA 트라이머, 융합 전 HA 올리고머 (예를 들어, 소위 로제트(rosette)) 또는 이것들의 조합의 형태로 되어 있다. 비활성 HA는 HA 모노머, 융합 후 HA 트라이머, 변성된 단백질, 응집된 단백질, 또는 이것들의 조합이다. 융합 전 및 융합 후 HA 입체배치는, 예를 들어, 결정학과 같이 업계에 공지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
면역원성 HA는 일반적으로 비활성 HA와 비교하여 훨씬 더 높은 면역 반응을 유도할 것이다. 예를 들어, 대상체에 면역원성 HA를 주사하는 것으로부터 얻어진 기하 평균 역가 (GMT)는 비활성 HA와 비교하여 면역원성 HA로 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 8배 또는 적어도 16배 더 높을 수도 있다. 따라서, 본원에서 사용된 "비활성 HA" (예를 들어, 융합 후, 또는 스트레스트 형태의 HA)가 반드시 면역원성이 완전히 결핍되어 있다는 것을 의미하는 것이 아니라는 것은 당업자에 의해 쉽게 이해되어야 한다; 오히려, 트립신-저항성인, 융합 전, 비-스트레스트 형태의 HA와 비교하여 불량한 면역원성이다.
생물학적 단백질 가수분해는 비활성 HA를 분해할 수 있는 임의의 프로테아제로 수행될 수 있다. 이러한 효소는 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 세린 프로테아제 (예컨대 트립신), 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 및 메탈로프로테아제를 포함한다. 예시의 세린 프로테아제는, 제한하는 것이 아니라, 트립신-유사 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 엘라스타제-유사 프로테아제 및 서브틸리신-유사 프로테아제를 포함한다. 이 효소들 모두는 본 발명의 방법에서 작동할 것으로 예상되는데 면역원성 HA 및 비활성 HA에 대하여 상이한 단백질 가수분해 활성이 프로테아제가 단백질을 분해시키는 것을 물리적으로 방지하는 면역원성 HA의 표면 상에서 잘 적층된 구조 및 밀집된 글리코실화 코팅으로 인한 것이기 때문이다. 실제로, 발명자들은 또한 키모트립신이 생물학적 단백질 가수분해 단계에서 비활성 (융합 후) HA를 분해시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 생물학적 단백질 가수분해는 트립신 및/또는 키모트립신을 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법은 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 프로테아제를 사용하여 실행될 수도 있다.
프로테아제가 비활성 HA를 분해할 수 있는지를 결정하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 당업자는 참고문헌 9에서 기술된 방법을 사용하여 비활성 HA를 제공하고 상이한 프로테아제를 테스트하여 어느 것이 비활성 HA를 분해할 수 있는지를 확립할 수 있다.
비활성 HA를 분해하는 것으로 공지되어 있는 프로테아제의 군은 세린 프로테아제이다. 이것들은 단백질에서 펩타이드 결합을 절단하는 효소이며, 여기서 세린은 활성 부위에서 친핵성 아미노산의 역할을 한다. 이러한 프로테아제는 생체 내에서 숙주 세포의 인플루엔자 바이러스 감염에 필요하고 전구체 HA0을 HA1 및 HA2 형태로 분할함으로써 기능하며, 따라서 막 융합을 촉진하여 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포를 감염시킬 수 있게 한다. 세린 프로테아제는 인플루엔자 HA를 분해하는 것으로 공지되어 있기 때문에 본 발명에서의 사용에 바람직하다.
인플루엔자 HA를 분해하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세린 프로테아제는 트립신이고 본 발명의 방법에서는 이 프로테아제의 사용이 특히 바람직하다. 하지만, HA를 분해할 수 있는 다른 세린 프로테아제가 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로테아제의 예는 TMPRSS2 및 HAT를 포함한다 (참고문헌 10).
프로테아제는 바람직하게는 샘플에 직접 추가된다. 이것은 정량화 공정을 더 쉽게 만들고 샘플의 조작으로 인해 면역원성 HA의 양의 임의의 과다추정를 더 방지하기 때문에 바람직하다. 하지만, 어떤 상황에서는 프로테아제가 추가되기 전에 샘플에서 생물학적 단백질 가수분해를 위한 조건을 최적화하는 것이 바람직할 수도 있다. 이것은, 예를 들어, 샘플의 버퍼가 최적의 프로테아제 활성을 허용하지 않는 경우에는 필수적일 수도 있다. 이들 구체예에서, 샘플의 버퍼는, 예를 들어, 투석과 같은 업계의 표준 방법을 통해 교체될 수도 있다. 또한 샘플을 추가의 버퍼로 희석하는 것도 가능하다. 부정확한 정량화를 초래할 수 있기 때문에 버퍼의 pH를 낮춤으로써 추가적인 비활성 HA가 형성되는 조건을 생성하지 않도록 주의를 기울여야 한다. 이것이 불가피한 경우, 본 발명의 방법을 사용하여 면역원성 HA의 상대적 손실을 결정하기 위한 예비 실험을 수행하고 정량화로부터 얻어진 결과를 이 양만큼 교정함으로써 HA를 정량화하는 것이 가능하다.
인플루엔자 바이러스가 세포 배양물에서 키워지는 경우, 트립신과 같은 프로테아제는 인플루엔자 바이러스의 성장 동안에 일상적으로 추가된다. 인플루엔자 백신에 대한 생산 공정은 정제 단계를 포함하며 그래서 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신에는 극미량의 잔류 프로테아제만이 존재할 것이다. 의심의 여지를 없애기 위해서, 생물학적 단백질 가수분해 단계는 존재할 수도 있는 잔류 프로테아제에 의존할 수 없지만 프로테아제는 샘플에 추가될 필요가 있다.
분해에 적합한 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 U/mL의 프로테아제, 예컨대 트립신을 사용하여 수행될 수도 있다. 본 발명의 방법은 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 U/mL의 프로테아제, 예컨대 트립신을 사용하여 수행될 수도 있다. 많은 프로테아제는 32℃ 내지 40℃, 34℃ 내지 38℃ 또는 약 37℃의 최적의 온도를 필요로 하며 그래서 분해는 상기 온도에서 수행될 수도 있다. 정확한 분해 시간은 달라질 수도 있지만 반응은 일반적으로는 실질적으로 모든 비활성 HA가 분해될 때까지 진행될 것이다. 예를 들어, 샘플은 프로테아제와 함께 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 100분, 110분, 120분, 130분, 140분, 150분, 160분 또는 170분 동안 인큐베이션될 수도 있다. 분해에 필요한 시간은 예비 실험에서 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
상기 논의된 생물학적 단백질 가수분해 단계는 또한 백신 제조 공정에 유익할 수 있다. 특히, 백신 제조 공정에서 이러한 단계를 포함하는 것이 가능하며, 이것은 비활성 HA가 선택적으로 제거되기 때문에 결과로 생성된 백신은 대부분 면역원성 HA를 함유할 것이라는 이점을 갖는다. 이러한 방법은 백신의 제형화 전에 프로테아제를 제거하기 위한 정제 단계를 수반할 것이다.
따라서, 본 발명은 백신 중간물을 제조하는 방법을 포함하며, 방법은 항원 (예컨대 HA 모노벌크)을 포함하는 벌크 조제물을 제조하여, 스트레스트 또는 비활성 형태의 항원을 분해하기 위해서 벌크 조제물 또는 이것의 일부를 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계를 포함한다. 결과로 생성된 중간물은 그 이후 프로테아제-저항성, 면역학적 활성 형태의 항원이 풍부한 백신 생성물을 제형화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 백신 생성물을 제조하는 방법을 포함하며, 항원 (예컨대 HA 모노벌크)을 포함하는 벌크 조제물을 제조하여, 벌크 조제물 또는 이것의 일부를 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계; 및, 생물학적 단백질 가수분해된 벌크 조제물 또는 이것의 일부를 사용하여 백신을 제형화하는 단계를 포함한다. 항원은 인플루엔자 항원일 수도 있다. 하지만, 본 발명은 프로테아제-민감도 (또는 프로테아제-저항성)가 관심있는 생물학적 활성 (예를 들어, 면역원성)과 상관관계에 있도록 다수의 입체구조로 존재할 수 있는 임의의 항원에 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 백신 생성물은 면역학적 활성 입체구조에서 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 및 적어도 90%의 항원을 함유한다. 일부 구체예에서, 면역학적 활성 항원(들)이 풍부한 이러한 백신 생성물은 기준량 미만의 항원(들)을 함유할 수도 있지만 면역학적 활성 형태의 항원(들)이 풍부하지 않은 기준 생성물과 비교하여 대상체에서 동등하거나 더 큰 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 용량 당 균주 당 15 μg HA가 들어있는 기준 인플루엔자 백신과 비교하여, 본 발명의 백신 생성물은 더 적은 총 항원, 예를 들어, 용량 당 균주 당 12 μg 미만, 9 μg 미만, 7.5 μg 미만, 5 μg 미만, 3.75 μg 미만의 HA로 동등하거나 더 양호한 효험 또는 효과를 나타낼 수도 있다.
프로테아제 분해 단계는 또한 항원 조제물에 존재할 수도 있는 일부 응집체를 반전시키며, 이로 인해 조제물 당 항원의 손실을 감소시키고 수율을 증가시키는 추가적인 이점을 제공할 수도 있다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 구체예에서, 하나 이상의 프로테아제가 본 발명의 방법에 사용될 수도 있다. 상이한 프로테아제, 또는 프로테아제의 상이한 세트가 본원에서 기술된 생물학적 및 분석적 단백질 가수분해 단계 각각에 사용될 수도 있다. 각각의 상이한 프로테아제는 상이한 기질 특이성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 트립신-유사 프로테아제, 키모트립신-유사 프로테아제, 엘라스타제-유사 프로테아제 및 서브틸리신-유사 프로테아제는 전형적으로 상이한 기질 특이성을 갖는다. 프로테아제는 동일한 조건 하에서, 하나가 주어진 절단 부위에서 주어진 펩타이드를 절단할 수 있는 한편, 다른 것은 그렇지 않은 경우에, 상이한 기질 특이성을 갖는 것으로 간주될 수도 있다. 예를 들어, 트립신-유사 프로테아제는 전형적으로 아미노산 리신 또는 아르기닌의 카르복실 측에서 (어느 쪽이든 프롤린으로 이어질 때를 제외하고) 펩타이드를 절단한다. 키모트립신-유사 프로테아제는 전형적으로 큰 소수성 아미노산 (예를 들어, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌, 류신)의 카르복실 측에서 펩타이드를 절단한다. 엘라스타제-유사 프로테아제는 전형적으로 작은 소수성 아미노산 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 및 발린)의 카르복실 측에서 펩타이드를 절단한다.
특정 구체예에서, 정량화가 질량 분석법에 의해 이루어지는 경우, 하나 이상의 상이한 프로테아제가 분석적 단백질 가수분해 단계에 사용될 수도 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 분석적 단백질 가수분해에서 분리 단계가 선행될 수도 있다. 본원에서 기술된 대안의 구체예에서, 분리 단계는 생략될 수도 있다. 각각의 경우에서, 분석적 단백질 가수분해는 상이한 기질 특이성 (즉, 상이한 절단 부위)을 갖는 하나 이상의 상이한 프로테아제를 사용할 수도 있다. 분석적 단백질 가수분해 단계에서 하나 이상의 상이한 프로테아제의 사용은 더 적은 상이한 프로테아제를 사용할 때 생산되는 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)보다 더 짧은 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)를 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 생산할 수도 있다. 그러므로, 유리하게는, 더 짧은 참조 / 대리 펩타이드가 정량화에 사용될 수도 있으며, 따라서 정량화되는 면역원성 HA에서 보존되는 서열을 가진 참조 펩타이드(들)를 선택할 수 있는 더 큰 자유를 제공한다. 이 기술은 또한 변형 (예를 들어, 정량화 결과에 원치 않는 영향을 미칠 수 있는 화학적 또는 번역 후 변형)에 취약한 아미노산을 함유하지 않는 참조 펩타이드(들)의 이용 가능성을 증가시키는데 사용될 수도 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 분석적 단백질 가수분해에서 분리 단계가 선행하는 경우, 생물학적 단백질 가수분해는 하나의 프로테아제 (예를 들어, 트립신-유사 프로테아제, 예컨대 트립신)을 사용하여 분석적 단백질 가수분해는 생물학적 단백질 가수분해에서 사용된 프로테아제와 같은 유형 및 상이한 기질 특이성을 가진 하나 이상의 상이한 프로테아제(들) (예를 들어, 키모트립신-유사 프로테아제, 예컨대 키모트립신)을 사용한다.
분리
분해 이후 샘플에서 분해되지 않은 면역원성 HA가 다른 구성요소로부터 분리되는 것이 바람직하다. 특히, 분해되지 않은 면역원성 HA가 분해된 비활성 HA로부터 분리되는 것이 매우 바람직하다. 이것은 다운스트림 정량화를 더 쉽게 만들기 때문에 유리하다. 특히, 분해된 비활성 HA로부터 면역원성 HA를 분리하는 것은 질량 분석법과 같은 방법에 의한 면역원성 HA의 정량화를 허용한다.
그럼에도 불구하고, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 구체예에서는, 분석적 단백질 가수분해가 비활성 HA-유래 펩타이드와 구별 가능한 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)를 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하는 경우, 분리 단계가 생략될 수도 있다.
샘플에서 면역원성 HA를 다른 구성요소로부터 분리하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
이들 선행 기술 분리 방법 (특히 면역원성 HA를 정량화하기 위해 질량 분석법에 의존하지 않는 것들)은 본 발명의 일부 구체예에서의 사용에 적합하지만, 발명자들은 역상 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 최초의 시도가 많은 이유로 인해 만족스럽지 못하다는 것을 발견하였다: 1) 두 가지 크로마토그래피 모두가 최적의 베이스라인 분해능을 달성할 수 없었다; 2) 컬럼에서 상당한 샘플 손실이 관찰되었다; 3) 분획 수거 동안에 도입된 유의한 변화; 4) 분획 수거, 버퍼 교체, 및 부피 감소와 관련된 강도높은 노동력 및 낮아진 검정 처리량.
그러므로 샘플의 면역원성 HA는 단백질 침전에 의해 샘플의 다른 구성요소 (특히 분해된 비활성 HA)로부터 분리되는 것이 바람직하다. 이 접근법의 이점은 샘플 손실을 최소화하는 같은-튜브 샘플 제조/가공; 인공물 도입의 감소; 및 다운스트림 샘플 제조를 위해 원하는 부피의 호환 가능한 버퍼에 회수된 단백질 펠릿 재현탁의 편의성을 포함한다. 발명자들은 단백질 침전이 샘플에서 거의 100%의 면역원성 HA를 지속적으로 회수했다는 것을 발견하였다.
단백질을 침전시키기 위한 다양한 방법들이 업계에 공지되어 있다. 그것들은 염석(salting out), 등전점 침전, 유기 용매로의 침전, 비-이온성 친수성 폴리머, 및 고분자 전해질에 의한 응집(flocculation)을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 분리 단계는 온전한 분해되지 않은 면역원성 HA를 보유한 샘플로부터 분해된 비활성 HA 단편을 제거하는 단계를 포함한다.
발명자들은 유기 용매, 특히 샘플로부터 면역원성 HA의 거의 100% 회수를 초래하는 아세톤으로 양호한 결과를 얻었다. 바람직한 구체예에서 (분해되지 않은) 면역원성 HA를 분리하는 단계는 유기 용매, 특히 케톤 또는 알콜을 추가하는 단계를 포함한다. 유기 용매는 아세톤, 에탄올 또는 메탄올일 수도 있다. 본 발명의 방법은 침전된 단백질을 알콜로 세척하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 추가된 알콜은 4℃ 미만의 온도를 가질 수도 있다. 알콜은 바람직하게는 에탄올이다. 발명자들은 이 단계가 비활성 HA로부터 유래된, 분해된 펩타이드의 완전한 제거에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 그 다음에 침전제는, 예를 들어, 공기 건조 또는 진공 원심분리에 의해 건조될 수도 있다.
단백질 침전 후, 침전된 단백질은 재현탁된다. 이것은, 예를 들어, 강력한 변성 조건을 도입하는 버퍼, 예컨대 강력한 변성 구아니딘 버퍼를 추가함으로써 달성될 수 있다. 샘플은 단백질 재현탁을 용이하게 하기 위해서 추가로 가열될 수도 있다. 이러한 방법들은 업계의 표준이며 그러므로 당업자는 그것들을 쉽게 실행할 수 있다.
하기 실시예에서 나타난 바와 같이, 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 단계가 SRID 검정을 포함하는 경우, SRID 검정 그 자체는 샘플의 다른 구성요소 (예를 들어, 비활성 HA)로부터 면역원성 HA의 분리를 가능하게 할 수도 있다.
정량화
면역원성 HA의 정량화는 원칙적으로는 업계에 공지된 임의의 단백질 정량화 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 비활성 HA를 분해하는 단계가, 상기 기술된 바와 같이, 샘플에서 면역원성 HA의 양의 더 정확한 결정을 허용하기 때문에, SRID에 의한 정량화와 호환 가능할 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 면역원성 HA를 정량화하는 단계는 SRID의 사용을 포함한다. 하지만, 상기 언급된 바와 같이, SRID는 생산하는데 수주 또는 심지어는 수개월이 걸리는 균주-특이적 항혈청의 사용에 의존한다는 문제점을 갖는다. 그러므로 면역원성 HA를 정량화하는 단계가 SRID의 사용을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
그러므로 본 발명은 바람직하게는 균주-특이적 항혈청의 사용을 필요로 하지 않는 정량화 방법을 이용한다. 이러한 방법들은 계절마다 참조 항원의 제조 및 보정을 필요로 하지 않기 때문에 인플루엔자 백신 생산에 대한 현재의 병목현상을 방지한다. 이러한 방법들은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 특히 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)와 같은 크로마토그래피 방법, 뿐만 아니라 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법/질량 분석법 (LC-MS-MS)과 같은 질량 분석법 및 2차원 겔 전기영동 (2-DE)을 포함한다.
RP- HPLC
RP-HPLC는 액체 (이동상, 예컨대 용매)를 크로마토그래피 컬럼 (정지상)에 도포하고, 정지상 및 샘플에 존재하는 구성요소 간의 상호작용에 따라 컬럼 상에 체류시키는 크로마토그래피의 형태이다. 펌프는 컬럼을 통해 액체상을 이동시키고, 조건이 변함에 따라, 상이한 분자들이 상이한 시점에 컬럼으로부터 용출될 수 있다. RP-HPLC는 비-극성 정지상 및 수성이고, 중간 정도로 극성인 이동상을 갖는다. RP HPLC 체류 시간은 일반적으로 이동상에서 물의 비율을 증가시킴으로써 증가될 수 있으며 (이로 인해 소수성 정지상에 대한 소수성 분석물의 친화도를 현재 더 친수성인 이동상에 비해 더 강력하게 만든다); 반대로 그것들은 비-극성 또는 덜 극성인 유기 용매 (예를 들어, 메탄올, 아세토니트릴)의 비율을 증가시킴으로써 감소될 수 있다.
HA1가 이들 다른 단백질로부터 용해될 수 있는 RP-HPLC 컬럼 및 용출 조건이 선택된다. 이 분해능을 달성하는 RP-HPLC의 능력은, 예를 들어, 참고문헌 11로부터 이미 공지되어 있다.
다양한 형태의 RP-HPLC가 이용 가능하다. RP-HPLC가 사용되는 경우 그것은 4000 Å 기공 크기를 가진 10 μm 폴리스티렌디비닐벤젠 (PSDVB) 입자의 컬럼 상에서 편리하게 수행될 수 있지만, 다른 지지 물질 (예를 들어, 다른 소수성 폴리머, 예컨대 실리카의 실라놀 기에 공유 결합된 옥타데실, 데실 또는 부틸의 n 알킬 소수성 사슬), 입자 크기 (예를 들어, 3-50 μm) 및 기공 크기 (예를 들어, 250-5000 Å)가 사용될 수 있으며, PSDVB의 성질은 코폴리머화, 또는 β-유도체화 (예를 들어, 설포아실화) 동안에 PS 및 DVB의 비율을 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 적합한 RP-HPLC 담지체는 HA를 보유하고 용출하며 그것을 샘플에 존재하는 다른 재료들로부터 분리하는 능력에 기초하여 쉽게 선택될 수 있다. 두 개의 기공 등급을 가진 비드를 갖는 담지체가 사용될 수 있다: 입자 그 자체를 통해 대류 흐름을 발생시키며, 샘플 분자를 내부의 짧은 "확산" 기공으로 신속하게 운반하는 큰 "통과기공(throughpore)". 이 기공 배열은 확산이 발생할 필요가 있는 거리를 감소시키고 샘플 분자가 결합 부위와 상호작용하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 따라서 확산은 비-제한적일 수 있고 유속은 분해능 또는 수용력을 손상시키지 않으면서 증가할 수 있다 (예를 들어, 1000-5000 cm/시간)
예를 들어, 아세토니트릴 구배를 사용하는 다양한 용출 버퍼가 사용될 수 있다. 적합한 유속은 쉽게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 0.1 내지 5 ml/분 (예를 들어, 0.5 내지 1.5 ml/분, 또는 약 0.8 ml/분)이다. 용출은 실온에서 일어날 수 있지만 50-70℃의 범위, 예를 들어, 55-65℃, 또는 약 60℃에서의 용출이 유익하다.
샘플에서 임의의 HA를 검출하기 위해 (예를 들어, 약 214 nm에서 UV 흡광도에 대하여, 또는 약 290 nm에서의 여기 및 약 335 nm에서의 방출을 사용하여 고유 형광에 대하여) RP-HPLC 용출액이 관찰될 수 있다. HPLC 용출 크로마토그램 상의 HA 피크 아래 면적은 HA를 정량화하는데 사용될 수 있다. 공지된 부피의 샘플을 사용하여, 이 방법들에 의해 결정된 HA의 양은 그 다음에 샘플이 취해진 원재료에서, 예를 들어, 벌크 항원 조제물에서, 또는 개개의 백신 용량에서, HA 농도를 계산하는데 사용될 수 있다. 개개의 균주의 잠재적 피크 중첩으로 인해, 이 측정 기술은 다원자가 백신 조제물 대신에 1가 백신 조제물을 측정하기 위해 가장 신뢰할 수 있다.
질량 분석법
본 발명에 따라 HA를 정량화하기 위해 가장 바람직한 방법은 질량 분석법 (MS), 특히 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS) 기술, 예컨대 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC ESI-MS)이다.
LC-MS 사용의 큰 이점은 샘플에서 단백질의 특이적 정량화를 허용한다는 것이다. 게다가, 그것은 동시에 다수의 인플루엔자 균주로부터 HA의 동시 측정을 허용한다. 이것은 각각의 HA를 개별적으로 분석할 필요성을 방지하기 때문에 다원자가 인플루엔자 백신이 분석되는 경우에 특히 유리하다. 방법은 보조제, 예컨대 고전적인 SRID 검정을 방해할 수도 있는 MF59의 존재와 호환 가능하다는 추가의 이점을 갖는다.
질량 분석법에 의해 단백질을 정량화하는 방법이 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 참고문헌 12에 기술되어 있다. 이 방법들은 일반적으로 정량화되는 단백질의 펩타이드를 제공하기 위해 변성된 샘플의 프로테아제 분해의 초기 단계를 수반한다. 이 펩타이드들은 그 다음에 보통 크로마토그래피에 의해 분리된 다음 MS로 분석된다.
분석적 단백질 가수분해의 초기 단계는 엔도프로테아제를 사용하여 수행될 수도 있다. 적합한 엔도프로테아제는 참고문헌 13에서 기술되어 있고 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 GIu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 써모리신, 엘라스타제, 파파인, 프로테이나제 K, 서브틸리신, 클로스트리파인, 엑소펩티다제, 카르복시펩티다제 A, B, P, 또는 Y, 카텝신 C, 아실아미노산-방출 효소, 파이로글루타메이트 아미노펩티다제, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
면역원성 HA는 전형적으로 HA를 변성시키는 수용액에서 분해된다. 수용액은 무기 또는 유기산을 포함할 수도 있다. 무기산은 구아니딘 하이드로클로라이드, 질산, 인산, 황산, 암모늄 클로라이드, 암모늄 바이카보네이트, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 유기산이 사용되는 경우 이것은 옥살산, 말론산, 타르타르산, 아세트산, 포름산, 락트산, 프로피온산, 프탈산, 벤조산, 시트르산, 숙신산, 이것들의 염, 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 상기 산의 정확한 성질은 분해를 촉진하기 위해 단백질을 변성시키는 것이 주 목적이기 때문에 중요하지 않다.
본 발명의 방법이 단백질 침전 단계를 수반하는 경우, 침전된 단백질은 분석적 단백질 가수분해에 사용된 버퍼로 직접 재현탁될 수도 있다. 대안으로, 그것은 상이한 버퍼로 재현탁될 수도 있으며 나중에 추가적인 구성요소 (예컨대 무기 또는 유기산)가 재현탁된 단백질에 추가될 수도 있다.
분해 후, 반응은 예를 들어, 트리플루오로아세트산과 같이 공지된 퀸칭제(quenching agent)를 사용하여 퀸칭(quench)될 수도 있다.
획득한 펩타이드가 MS로 분석되기 전에, 라벨링된 대리 펩타이드가 반응 혼합물에 추가될 수도 있다. 이 대리 펩타이드들의 사용은 대조군 실험을 동시에 실행할 필요가 없기 때문에 면역원성 HA의 정량화를 촉진하는 이점을 갖는다. 그러므로 대리 펩타이드는 정량화 목적을 위해 관심있는 단편이 비교되는 참조 펩타이드 (즉, 대조군)로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 대리 펩타이드는 미리 결정된 아미노산 서열의 합성 폴리펩타이드이다. 임의의 적합한 대리 펩타이드가 참조로서 사용될 수도 있으며, 이것은 쉽게 검출될 수 있도록 공지된 질량 이동을 제공한다. 예를 들어, 대리 펩타이드는 코어 아미노산 신장에 더하여 공지된 질량의 하나 이상의 화학적 모이어티 또는 모이어티들을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 대리 펩타이드는 천연 대응물과 비교하여 약간 다른 질량을 갖도록 하나 이상의 변형된 아미노산을 함유할 수도 있다. 일부 구체예에서, 대리 펩타이드는 동위원소로 라벨링될 수도 있다. 바람직하게는, 동위원소 라벨은 15N 및 13C로 구성된 목록으로부터 선택된다.
대리 펩타이드를 제조하는 방법이 업계에 널리 공지되어 있다. 이 대리 펩타이드들은 바람직하게는 액체 크로마토그래피 (LC) 상에서 양호한 체류 시간을 갖고, ESI 상에서 허용 가능한 이온화 효율을 갖고, 잠재적인 번역 후 변형 (예컨대 N-결합된 글리칸 및 메티오닌)이 없도록 선택된다.
하나 이상의 인플루엔자 항원의 양이 평가되는 경우, 여러 균주-특이적 대리 펩타이드가 추가될 수도 있다. 예를 들어, 샘플이 n 인플루엔자 균주의 항원을 포함하는 경우, n 유형의 균주-특이적 대리 펩타이드가 추가될 수 있다. 균주-특이적 대리 펩타이드의 개수는 또한 샘플의 다른 균주의 항원의 개수와 다를 수도 있다. 예를 들어, 당업자는 4가 샘플에서 단지 두 개의 항원을 분석하기를 바랄 수도 있다.
대리 펩타이드에 적합한 라벨은 플루오린, 형광 라벨, 예컨대 로다민, 오레곤 그린(Oregon green) 또는 업계에 공지된 다른 것들, 방사성 라벨, 질량 라벨을 포함한다 (참고문헌 13). 보정 곡선이 선택적으로 사용되고 적어도 하나의 면역원성 항원 단편 펩타이드의 공지된 양과 비율 사이의 수학적 관계를 나타낸다; 여기에서 비율은 공지된 양의 적어도 하나의 펩타이드와 일정량의 적어도 하나의 기준 펩타이드의 지수(quotient)이다.
샘플은 액체 크로마토그래피 (LC)에 이어서 질량 분석 (MS) 단계를 사용하여 분석될 수도 있다. 적합한 LC 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 고성능 LC (HPLC), 초고성능 LC (UPLC), 및 표준 컬럼 또는 평판 겔 크로마토그래피 기술을 포함한다. 바람직하게는, 펩타이드는 UPLC를 사용하여 분리된다.
크로마토그래피 이후, 펩타이드는 질량 분석법을 사용하여 검출될 수도 있다. 이것은 관심있는 펩타이드의 특이적 검출을 허용하며 따라서 더 정확한 정량화를 제공하는 이점을 갖는다. 특히, 크로마토그래피 컬럼의 용출액은 종종 오염물질들을 함유하고 MS의 단계를 추가하는 것은 이 오염물질들로 인해 샘플에서 면역원성 HA의 과정량화(over-quantification)를 방지한다.
본 발명의 방법은 임의의 MS 기술을 사용하여 실행될 수도 있다. 적합한 검출 및 정량화 시스템은 전자분무, 매트릭스 보조 레이져 탈착 이온화 (MALDI), 비행 시간 (TOF), 다수의 4중극자(quadrupole), 및 업계에 공지된 다른 유형의 질량 분석법을 포함한다. 예시적으로, Waters, Corp.로부터 이용 가능한 Waters Q-Tof Premier TOF 4중극자 탠덤 질량 분석기 또는 API 4000-Q 트랩(trap) 3개의 4중극자 탠덤 질량 분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)는 각각 본 발명에서의 사용에 적합하다.
본 발명에 따라 면역원성 HA를 정량화하기 위해 특히 바람직한 방법은 액체 크로마토그래피 선택된 반응 관찰 (LC-SRM) 검정이다 (참고문헌 14).
변형된 일원 방사 면역확산법 ( SRID ) 검정
상기 기술된 바와 같이, 항원 샘플의 프로테아제 분해는 비활성 형태의 항원을 선택적으로 분해하여, 다른 입체구조적으로 둔감한 생물물리학적 정량화 기술, 예컨대 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)이 프로테아제-저항성, 면역학적 활성 항원을 특이적으로 정량화하는데 사용될 수 있다 (하기 실시예 참조). 프로테아제가 바람직하지 않은 형태의 항원을 선택적으로 분해하는데 사용될 수 있다는 인식에 부분적으로 기초하여, 또 다른 양태에서 본 발명은 개선된 정확도를 달성한 "변형된" SRID 검정을 제공한다.
본 발명의 이 양태에 따르면, 생물학적 단백질 가수분해 (예를 들어, 프로테아제 분해)는 더 정확한 검정 결과를 달성하기 위해 다른 표준 SRID 프로토콜에 통합될 수 있다. 하기 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이, 트립신 분해는 면역학적 비활성, 융합 후 HA와 융합될 때 면역학적 활성, 융합 전 HA를 정량화할 수 있도록 SRID의 특이성을 개선할 수 있다. 해당 분야에서 표준 시험관 내 효능 검정으로 남아있는 SRID 검정은 면역학적 활성 HA를 특이적으로 검출하는 것으로 생각된다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 입체구조적으로 균질한 HA 조제물로, SRID 검정은 인플루엔자 중화 및 적혈구 응집 억제 항체를 유도하는 고유한, 융합 전 HA를 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있지만, 블롯팅 단계 중에 SRID 겔로부터 선택적으로 제거되고 면역학적 활성이 아닌 저 pH 스트레스트, 융합 후 HA를 검출하지는 않는다. 본원에서 개시된 작업은 놀랍게도 같은 항혈청이 유사하게 ELISA 포맷으로 사용될 때에는 비-스트레스트 및 저 pH-스트레스트 HA를 검출할 수 있기 때문에, 이 선택적 검출이 SRID에서 사용된 양 항혈청의 입체구조적 특이성이 아니라 SRID 포맷 그 자체로 인한 것이라는 것을 나타냈다. 하지만, 저 pH 스트레스트 HA가 비-스트레스트 HA와 혼합될 때, SRID는 두 형태 모두를 검출할 수 있으며, 면역학적 활성 HA의 과정량화로 이어진다.
따라서, 본 발명은 개선된 SRID 검정에 대한 방법 및 중간물을 제공한다. 따라서 본 발명은 SRID에 의해 HA를 정량화하기 전에 HA를 함유하는 샘플을 생물학적 단백질 가수분해 (예를 들어, 트립신 분해)하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 본 발명은 SRID 검정을 수행하는데 있어서 (예를 들어, 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하기 위해) 생물학적 단백질 가수분해된 (본원에서 한정된 바와 같이) 샘플의 사용을 더 포함한다.
샘플
샘플은 보통 인플루엔자 백신 또는 백신 벌크 항원 조제물이다. 전체 HA 용량 (계절성 인플루엔자 백신의 성인 용량에 대하여 균주 당 보통 15 μg)이 백신의 투여 부피 (보통 0.5 mL)에 존재한다는 것을 보장하기 위해 정량화가 사용되기 때문에 방법이 보통 벌크 백신에서 수행되지만 이것은 벌크 백신 또는 백신의 단위 용량으로부터 얻어진 샘플일 수 있다.
본 발명의 방법은 벌크 백신 또는 최종 백신에서 수행될 수 있다. 그것들은 생산 공정 동안에 발견되는 중간 생성물에서도 수행될 수 있다.
최종 백신에서의 테스트는 정확한 양의 면역원성 HA가 존재한다는 것을 보장하기 위해 수행될 수도 있다. 본 발명의 방법은 또한 정확한 양의 면역원성 HA가 최종 백신에 추가된다는 것을 보장하기 위해 벌크 백신에서 수행될 수도 있다. 벌크 또는 백신은 1가일 수도 있다. 그것은, 예를 들어 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개의 모노벌크를 혼합한 이후에는, 다원자가일 수도 있다. 계절성 인플루엔자 백신이 전형적으로 3가 또는 4가이기 때문에, 다원자가 벌크 또는 백신은 보통 3가 또는 4가일 것이다. 본 발명의 방법은 벌크 또는 백신의 멸균 여과 전에 또는 후에 수행될 수도 있다. 그것들은 보조제의 추가 전에 또는 후에 더 수행될 수도 있다. 샘플이 백신인 경우, 방법은 포장 전에 또는 후에 수행될 수도 있다.
벌크 백신 (1가 또는 다원자가) 또는 저장되어 있는 백신에서 본 발명의 방법을 수행하는 것이 유용할 수도 있다. 벌크 또는 백신은, 예를 들어, 1주 초과, 2주 초과, 3주 초과, 4주 초과, 등의 기간 동안 10℃ 미만 (예를 들어, 4℃) 또는 0℃ 미만 (예를 들어, -20℃)의 온도에서 저장되어 있을 수도 있다. 저장이 면역원성 상태에서 비활성 HA로의 HA의 입체구조적 변화를 일으키는 것이 가능하다. 저장되어 있는 샘플에서 본 발명의 방법을 수행함으로써, 정확한 양의 면역원성 HA가 최종 백신에서 발견된다는 것이 보장될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 샘플의 유통기한을 평가할 수 있다. 특히, 샘플이 저장될 수 있으며 샘플의 분획은 어느 시점에서 면역원성 HA의 양이 하락하는지를 평가하기 위해 본 발명의 방법을 사용하여 면역원성 HA에 대하여 여러 시점에서 테스트될 수도 있다. 샘플의 안정성이 높을수록, 면역원성 HA의 양이 크게 감소하는데 걸리는 시간이 길어진다. 더 오래 걸리는 샘플이 더 높은 안정성을 갖는 것으로 간주될 것이다.
다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 이용 가능하며, 백신은 일반적으로 생 바이러스 또는 비활성화된 바이러스를 기반으로 한다. 비활성화된 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 기반으로 할 수도 있다. 인플루엔자 항원은 또한 비로솜의 형태로 제공될 수 있거나 또는 재조합 숙주에서 (예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 사용하는 곤충 세포주에서) 발현되어 정제된 형태로 사용될 수 있다 (참고문헌 15). 본 발명은 이들 유형의 백신들 중 어느 것과 함께 사용될 수 있지만, 전형적으로는 비활성화된 백신과 함께 사용될 것이다.
항원은 전체 감쇠된 바이러스 또는 비활성화된 바이러스의 형태를 취할 수도 있다. 바이러스를 비활성화시키기 위한 화학적 수단은 비활성화제, 예컨대 다음 작용제들 중 하나 이상의 유효량의 처리를 포함한다: 세제, 포름알데하이드, 과산화물, 포르말린, 베타 프로피오락톤, 또는 UV 광. 베타-프로피오락톤은 조제물로부터 쉽게 제거될 수 있다는 이점을 가지며 그러므로 이 작용제는 바람직하다. 추가적인 화학적 비활성화 수단은 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌 (C60) 또는 이것들의 조합의 처리를 포함한다. 예를 들어, 2원 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 감마선 조사와 같은 다른 바이러스 비활성화 방법이 업계에 공지되어 있다. INFLEXAL™ 제품은 전체 비리온 비활성화된 백신이다.
비활성화된 바이러스가 사용된 경우, 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원 (헤마글루티닌을 포함하고, 보통은 뉴라미니다제도 포함함)을 포함할 수도 있다.
비리온은 다양한 방법에 의해 유동체를 함유한 바이러스로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 정제 공정은 비리온을 붕괴시키기 위해 세제를 포함한 선형 수크로스 구배 용액을 사용하는 띠원심분리를 수반할 수도 있다. 그 다음에 항원은, 선택적 희석 이후에, 정용여과에 의해 정제될 수도 있다.
분할 비리온은 서브비리온(subvirion) 조제물을 생산하기 위해, 'Tween-에테르' 분할 공정을 포함한, 비리온을 세제 (예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리 N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 등.)로의 처리에 의해 얻어진다. 인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법은 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 참고문헌 16-21, 등을 참조하면 된다. 바이러스의 분할은 전형적으로는, 감염성이든 비감염성이든, 전체 바이러스를 분할제의 붕괴 용량으로 붕괴시키거나 또는 단편화함으로써 수행된다. 붕괴는 바이러스 단백질의 전체적 또는 부분적 가용화를 초래하여, 바이러스의 온전함을 변화시킨다. 바람직한 분할제는 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, Hecameg, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사코실, CTAB (세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, Cetavlon, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton 계면활성제, 예컨대 Triton X-100 또는 Triton N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 (Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스터, 등이다. 한 유용한 분할 과정은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데하이드의 연속적인 효과를 사용하고, 분할은 초기 비리온 정제 동안에 일어날 수 있다 (예를 들어, 수크로스 밀도 구배 용액에서). 분할 비리온은 유용하게는 나트륨 포스페이트-완충된 등장성 나트륨 클로라이드 용액에 현탁될 있다. AFLURIA™, BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품이 분할 백신이다.
정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 HA을 포함하고, 전형적으로는, 뉴라미니다제도 포함한다. 이 단백질들을 정제된 형태로 제조하는 공정은 업계에 널리 공지되어 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™, FLUAD™, FLUCELVAX™, 및 INFLUVAC™ 제품이 서브유닛 백신이다.
인플루엔자 항원은 또한, INFLEXAL V™ 및 INVAVAC™ 제품과 같이, 비로솜 (무핵산 바이러스-유사 리포솜 입자)의 형태로 제공될 수 있다 (참고문헌 22).
본 발명은 또한 재조합 인플루엔자 백신과 함께 사용될 수 있다. 이러한 백신의 예는 Flublok™이다.
인플루엔자 바이러스는 감쇠될 수도 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성일 수도 있다. 인플루엔자 바이러스는 저온 적응된 것일 수도 있다. 이들 세 가지 가능성은 특히 생 바이러스에 적용된다.
백신에서 사용되는 인플루엔자 바이러스 균주는 계절마다 달라진다. 현재의 유행기 사이의 기간에, 백신은 전형적으로 두 개의 인플루엔자 A 균주 (H1N1 및 H3N2) 및 하나 또는 두 개의 인플루엔자 B 균주를 포함하고, 3가 또는 4가 백신이 전형적이다. 본 발명은 이 백신들과 함께 사용될 수 있다. 또한 그것은 유행성 균주 (즉, 백신 수령체 5 및 밀반적인 인간 집단이 면역학적 나이브(naive)한 균주), 예컨대 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주 (특히 인플루엔자 A 바이러스)의 바이러스에 유용하고, 유행성 균주에 대한 인플루엔자 백신은 1가일 수도 있거나 또는 유행성 균주가 보충된 보통의 3가 백신에 기초할 수도 있다. 하지만, 계절 및 백신에 포함된 항원의 성질에 따라, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16 중 하나 이상으로부터 보호하는 백신과 함께 사용될 수도 있다. 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9 중 하나 이상으로부터 보호하는 백신과 함께 사용될 수도 있다.
유용하게 백신 조성물에 포함될 수 있는 다른 균주는 저항성 유행성 균주를 포함한, 항바이러스 요법에 대하여 저항성 (예를 들어, 오셀타미비르 (참고문헌 23) 및/또는 자나미비르에 대하여 저항성)인 균주이다 (참고문헌 24).
상기 논의된 바와 같이, HA는 자연적인 안정성 제한으로 인해 또는 백신을 생산할 때 필요한 조작 단계 (예컨대 비활성화)로 인해 백신 생산 공정 동안에 융합 후 상태로 전환될 수 있다. 본 발명은 샘플에서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 80%, 적어도 85%; 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 HA가 활성/면역원성 (융합전) 형태로 되어 있고 및/또는 샘플에서 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 미만의 HA가 비활성 (융합 후) 형태로 되어 있는 샘플로 실행될 수도 있다. 샘플에서 활성 대 비활성 HA의 비는 적어도 4:1, 10:1, 20:1, 50:1 또는 100:1일 수도 있다.
일반적으로, 샘플은 인플루엔자 백신의 표준 성인 용량이 균주 당 항원 0.5mL 당 15 μg HA를 필요로 하기 때문에 균주 당 30 μg/mL 이상의 활성 HA를 함유하는 것이 유용하다. 샘플이 균주 당 ≥30 μg/mL의 활성 HA의 HA 농도를 가지면, 인간 용량을 제공하기 위해 항원이 농축될 필요가 없기 때문에 백신 생산 공정을 더 쉽게 만든다. 균주 당 30 μg/mL 미만의 활성 HA, 예를 들어, 균주 당 적어도 25 μg/mL의 활성 HA, 균주 당 20 μg/mL의 활성 HA, 균주 당 적어도 15 μg/mL의 활성 HA, 균주 당 적어도 10 μg/mL의 활성 HA, 등의 농도를 가진 샘플이 또한 사용될 수도 있다. 이 경우에, 최종 백신은 용량 당 15 μg HA의 최종량을 제공하기 위해서 더 큰 투여 부피를 가질 수도 있으며, 항원은 업계의 표준 방법을 사용하여 농축되거나 또는 최종 백신은 더 작은 양의 HA를 함유할 수도 있다. 더 작은 양의 HA가 유행성 인플루엔자 백신에 사용될 수도 있으며, 예를 들어, 이 경우에 백신에 보조제가 추가될 수도 있다. 샘플은 4 μg, 3 μg, 2 μg, 1 μg, 0.5 μg 또는 0.25 μg 미만의 비활성 HA를 함유할 수도 있다.
최종 백신 생성물은 용량 당 균주 당 15 μg 이하의 전체 HA, 예를 들어, 균주 당 14 μg 이하, 13 μg 이하, 12 μg 이하, 11 μg 이하, 10 μg 이하, 9 μg 이하, 8 μg 이하, 7 μg 이하, 6 μg 이하, 5 μg 이하의 전체 HA를 함유할 수도 있다. 일부 구체예에서, 이러한 생성물에서 전체 HA, 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 항원이 면역원성 형태로 되어 있다. 일부 구체예에서, 최종 백신 생성물에 함유된 50% 이하의 전체 HA, 예를 들어, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하의 전체 HA는 트립신-민감성 형태로 되어 있다.
항원의 공급원으로서 사용된 바이러스는 난에서 또는 세포 배양에서 키워질 수 있다. 인플루엔자 바이러스 성장을 위한 본 표준 방법은 배양된 계란을 사용하는데, 이것은 구체적으로 무병원체일 수도 있으며, 바이러스는 난 내용물 (요막액)로부터 정제된다. 하지만, 더 최근에는, 동물 세포 배양으로 키워졌고, 속도 및 환자 알레르기(allergy)의 이유로, 이 성장 방법을 선호한다. 난-기반 바이러스 성장이 사용되면 하나 이상의 아미노산 및/또는 스테로이드가 바이러스와 함께 난의 알란토이드(allantoid) 유체로 도입될 수도 있다 (참고문헌 25).
세포 배양이 사용될 때, 바이러스 성장 기질은 전형적으로 진핵세포, 예컨대 포유류 기원의 세포주일 것이다. 적합한 포유류 세포는 햄스터, 소, 영장류 (인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 세포 유형, 예컨대 섬유아세포 및 상피 세포가 사용될 수도 있다. 적합한 세포 유형의 비-제한적 예는 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포, 등을 포함한다. 적합한 햄스터 세포의 예는 BHK21 또는 HKCC라는 명칭을 가진 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는, 예를 들어, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 예컨대 Vero 세포주와 같은 신장 세포이다. 적합한 개 세포는, 예를 들어, MDCK 세포주와 같은 신장 세포이다. 따라서 적합한 세포주는 MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 인플루엔자 바이러스를 키우기 위해 바람직한 포유류 세포주는 마딘 다비(Madin Darby) 개 신장으로부터 유래된 MDCK 세포 (참고문헌 26-29); 아프리카 녹색 원숭이 (세르코피테쿠스 애티오프스(Cercopithecus aethiops)) 신장으로부터 유래된 Vero 세포 (참고문헌 30-32); 또는 인간 배아 망막아세포로부터 유래된 PER.C6 세포 (참고문헌 33)를 포함한다. 이 세포주들은, 예를 들어, American Type Cell Culture (ATCC) 컬렉션 (참고문헌 34), Coriell Cell Repositories (참고문헌 35), 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)으로부터 광범위하게 이용 가능하다. 예를 들어, ATCC는 제품 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에서 다양한 상이한 Vero 세포를 공급하고, 제품 번호 CCL 34 하에서 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940 하에서 ECACC로부터 이용 가능하다.
인플루엔자 바이러스는 또한 조류 배아 줄기 세포 (참고문헌 36 & 39) 및 오리 (예를 들어, 오리 망막)로부터 유래된 세포주를 포함한 조류 세포주 (예를 들어, 참고문헌 36-38)에서, 또는 암탉으로부터 키워질 수 있다. 적합한 조류 배아 줄기 세포는 닭 배아 줄기 세포로부터 유래된 EBx 세포주, EB45, EB14, 및 EB14-074를 포함한다 (참고문헌 40). 닭 배아 섬유아세포 (CEF)가 또한 사용될 수 있다. 가장 바람직한 조류 세포주는 오리 배아 줄기 세포로부터 유래된 EB66 세포주이다. 이 세포주는 인플루엔자 항원을 생산하기 위해 잘 작동하는 것으로 보고되어 있다 (참고문헌 41).
인플루엔자 바이러스를 키우기 위해 가장 바람직한 세포주는 MDCK 세포이다. 원래의 MDCK 세포주는 ATCC로부터 CCL 34로서 이용 가능하지만, 이 세포주의 유도체가 또한 사용될 수도 있다. 예를 들어, 참고문헌 26은 현탁 배양에서의 성장에 맞춰 조정된 MDCK 세포주 ('MDCK 33016', DSM ACC 2219로 기탁됨)를 개시한다. 유사하게, 참고문헌 42는 무혈청 배양의 현탁액에서 성장한 MDCK-유래 세포주 ('B-702', FERM BP-7449로 기탁됨)를 개시한다. 참고문헌 43은 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (PTA-6503)을 포함한 비-종양 형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 44는 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL 12042)를 포함한, 감염에 대하여 높은 민감성을 가진 MDCK 세포주를 개시한다. 이 MDCK 세포주들 중 어느 것도 사용될 수 있다.
바이러스가 세포주에서 키워진 경우 조성물은 유리하게는 난 단백질 (예를 들어, 오발부민 및 오보뮤코이드) 및 닭 DNA가 없을 것이며, 이로 인해 알레르기 항원성이 감소할 것이다.
바이러스가 세포주에서 키워진 경우 성장을 위한 배양, 및 또한 배양을 시작하는데 사용된 바이러스 접종물은 바람직하게는 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스(coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 레오바이러스(reoviruses), 폴리오마바이러스(polyomavirus), 비르나바이러스(birnavirus), 서코바이러스(circovirus) (특히 돼지 서코바이러스), 및/또는 파르보바이러스(parvovirus) (참고문헌 45)이 없을 것이다 (즉, 이것들에 의한 오염에 대하여 테스트되고 음성 결과가 제공될 것이다). 단순 헤르페스 바이러스의 부재가 특히 바람직하다.
바이러스가 세포주에서 키워진 경우 조성물은 바람직하게는 용량 (전형적으로 아동에게는 0.25 mL 또는 성인에게는 0.5 mL) 당 10 ng 미만 (바람직하게는 1 ng 미만, 및 더 바람직하게는 100 pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하지만, 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물로부터 배제되는 것이 바람직한 숙주 세포 DNA는 100 bp보다 더 긴 DNA이다.
잔류 숙주 세포 DNA의 측정은 이제는 생물학적 제제에 대한 일상적인 규제 요건이며 당업자의 정상적인 능력의 범위 내에 있다. DNA를 측정하는데 사용된 검정은 전형적으로 입증된 검정일 것이다 (참고문헌 46 & 47). 입증된 검정의 성능 특성은 수학적 및 정량화 가능한 용어로 기술될 수 있으며, 가능한 오류의 원인이 확인될 것이다. 검정은 일반적으로 정확도, 정밀도, 특이성과 같은 특성에 대하여 테스트될 것이다. 검정이 보정되고 (예를 들어, 숙주 세포 DNA의 공지된 표준량에 대하여) 테스트된 경우에는 정량적 DNA 측정이 일상적으로 수행될 수 있다. DNA 정량화를 위해 세 가지 원칙적인 기술이 사용될 수 있다: 잡종화 방법, 예컨대 서던 블롯(Southern blot) 또는 슬롯 블롯(slot blot) (참고문헌 48); 면역검정 방법, 예컨대 Threshold™ 시스템 (참고문헌 49); 및 정량적 PCR (참고문헌 50). 이 방법들은 모두 당업자들에게 익숙하지만, 각 방법의 정밀한 특성들, 예를 들어, 잡종화를 위한 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택, 등은 문제의 숙주 세포에 따라 다를 수도 있다. Molecular Devices의 Threshold™ 시스템은 피코그램 수준의 총 DNA에 대한 정량적 검정이고, 생물 약제에서 오염된 DNA의 수준을 관찰하는데 사용되었다 (참고문헌 49). 전형적인 검정은 비오티닐화된 ssDNA 결합 단백질, 유레아제-컨쥬게이션된(conjugated) 항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의 반응 복합체의 비-서열-특이적 형성을 수반한다. 모든 검정의 구성요소는 제조사로부터 이용 가능한 완전 Total DNA Assay Kit에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들, 예를 들어, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, 등이 잔류 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적 PCR 검정을 제의한다. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 잡종화 검정 및 총 DNA Threshold™ 시스템의 비교가 참고문헌 51에서 발견될 수 있다.
오염된 DNA는 백신 제조 동안에 표준 정제 과정, 예를 들어, 크로마토그래피, 등을 사용하여 제거될 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예를 들어, DNase를 사용함으로써 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위해 편리한 방법은 참고문헌 52 & 53에 개시되어 있으며, 2단계 처리를 수반하는데, 먼저 바이러스 성장 동안에 사용될 수 있는 DNase (예를 들어, 벤조나제)에 이어서, 피리온 붕괴 동안에 사용될 수 있는 양이온성 세제 (예를 들어, CTAB)를 사용하는 것이다. 알킬화제, 예컨대 β-프로피오락톤의 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하는데 사용될 수 있고, 유리하게는 비리온을 비활성화시키는데 사용될 수도 있다 (참고문헌 54). 알킬화제 또는 DNase와 알킬화제의 조합의 2 단계 처리를 사용하는 방법이 또한 기술되어 있다 (참고문헌 55).
투약 당 10 ng 이하의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직하다. 예를 들어, 0.25 ml 부피 당 <10 ng (예를 들어, <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신과 마찬가지로, 헤마글루티닌 15 μg 당 <10 ng (예를 들어, <1 ng, <100 pg) 숙주 세포를 함유하는 백신이 바람직하다. 0.5 ml 부피 당 <10 ng (예를 들어, <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신과 마찬가지로, 헤마글루티닌 50 μg 당 <10 ng (예를 들어, <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 더 바람직하다.
임의의 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500 bp 미만, 예를 들어, 400 bp 미만, 300 bp 미만, 200 bp 미만, 100 bp 미만, 등인 것이 바람직하다.
세포주, 예컨대 MDCK 세포에서의 성장을 위해, 바이러스는 현탁액 중의 세포에서 (참고문헌 26, 56 & 57) 또는 부착 배양에서 키워질 수도 있다. 현탁 배양을 위해 하나의 적합한 MDCK 세포주는 MDCK 33016 (DSM ACC 2219로 기탁됨)이다. 대안으로서, 미소담체 배양이 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지지하는 세포주는 바람직하게는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 키워진다. 배지는 본 발명의 맥락에서 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터 첨가제가 없는 무혈청 배지를 말한다. 무단백질은 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질을 제외하고 세포의 증식이 일어나지는 배양를 의미하는 것으로 이해되지만, 단백질, 예컨대 트립신 또는 바이러스 성장에 필요할 수도 있는 다른 프로테아제를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 배야에서 성장하는 세포는 자연적으로 단백질 그 자체를 함유한다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지지하는 세포주는 바람직하게는, 예를 들어, 바이러스 복제 동안에 37℃ 미만에서 (참고문헌 58) (예를 들어, 30-36℃, 또는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃) 키워진다.
배양된 세포에서 바이러스를 증식시키는 방법은 일반적으로 배양된 세포를 배양되는 균주로 접종하는 단계, 예를 들어, 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정된 바와 같이, 바이러스 증식을 위해 원하는 기간 (예를 들어, 접종 후 24 내지 168시간) 동안 감염된 세포를 배양하는 단계 및 증식된 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 1:1000 내지 1:1, 1:500 내지 1:1, 1:100 내지 1:5, 또는 1:50 내지 1:10의 세포 비로 바이러스로 (PFU 또는 TCID50에 의해 측정됨) 접종된다. 바이러스는 세포의 현탁액에 추가되거나 세포의 단층에 도포되고, 바이러스는 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서 적어도 60분, 하지만 보통은 300분 미만, 바람직하게는 90 내지 240분 동안 세포에서 흡수된다. 감염된 세포 배양물 (예컨대 단층)은 수확된 배양 상층액의 바이러스 함량을 증가시키기 위해 동결-해동에 의해 또는 효소 작용에 의해 제거될 수도 있다. 수확된 유체는 그 다음에 비활성화되거나 냉동 저장된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도 ("m.o.i.")로 감염될 수도 있다. 더 바람직하게는, 세포는 약 0.01의 m.o.i로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60시간에 수확될 수도 있다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간, 예를 들어, 수확 후 38 내지 40시간에 수확된다. 프로테아제 (전형적으로 트립신)는 일반적으로 세포 배양 동안에 추가되어 바이러스 방출을 허용하고, 프로테아제는 배양 동안에 임의의 적합한 스테이지에서 추가될 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 재조합체 균주일 수도 있고, 역유전학 기술에 의해 얻어질 수도 있다. 역유전학 기술 (예를 들어, 참고문헌 59-63)은 플라스미드 또는 선형 발현 구조체를 사용하여 시험관 내에서 원하는 게놈 세그먼트를 가진 인플루엔자 바이러스가 제조되게 한다. 전형적으로, 그것은 세포에서 두 가지 유형의 DNA의 발현이 완전히 온전한 감염성 비리온의 조립으로 이어지도록 (a) 예를 들어, polI 프로모터로부터 원하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b), 예를 들어, polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 발현하는 것을 수반한다. DNA는 바람직하게는 바이러스 RNA 및 단백질 모두를 제공하지만, RNA 및 단백질의 일부를 제공하기 위해서는 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하는 것이 가능하다. 각각의 바이러스 RNA를 생산하기 위해 별도의 플라스미드를 사용하는 플라스미드-기반 방법이 바람직하고 (참고문헌 64-66), 이 방법은 또한 바이러스 단백질 모두 또는 일부 (예를 들어, 단지 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현하도록 플라스미드의 사용을 수반할 것이며, 어떤 방법에서는 12개의 플라스미드가 사용된다. 선형 발현 구조체의 사용이 또한 가능하다 (참고문헌 67).
필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위해서, 최근의 접근법 (참고문헌 68)은 같은 플라스미드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두의 인플루엔자 A vRNA 세그먼트를 암호화하는 서열) 상에서 복수의 RNA 폴리머라제 I 전사 카세트 (바이러스 RNA 합성을 위해), 및 또 다른 플라스미드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두의 인플루엔자 A mRNA 전사물을 암호화하는 서열) 상에서 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 가진 복수의 단백질 암호화 영역을 조합한다. 참고문헌 68 방법의 바람직한 양태는 (a) 단일 플라스미드 상에서 PB1, PB2 및 PA mRNA 암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상에서 세그먼트를 암호화하는 모두 8개의 vRNA를 수반한다. 한 플라스미드 상에서 NA 및 HA 세그먼트 및 또 다른 플라스미드 상에서 6개의 다른 세그먼트를 포함하는 것은 또한 문제를 촉진할 수 있다.
바이러스 RNA 세그먼트를 암호화하기 위해 polI 프로모터를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 박테리오파지 폴리머라제 프로모터를 사용하는 것이 가능하다 (참고문헌 69). 예를 들어, SP6, T3 또는 T7 폴리머라제에 대한 프로모터는 편리하게 사용될 수 있다. polI 프로모터의 종 특이성 때문에, 박테리오파지 폴리머라제 프로모터가 많은 세포 유형 (예를 들어, MDCK)에 대하여 더 편리할 수 있지만, 세포는 외인성 폴리머라제 효소를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션되어야 한다.
다른 기술에서 단일 주형으로부터 바이러스 RNA 및 발현 가능한 mRNA를 동시에 암호화하기 위해 이중 polI 및 polII 프로모터를 사용하는 것이 가능하다 (참고문헌 70 & 71).
따라서 인플루엔자 A 바이러스는 특히 바이러스가 난에서 키워질 때 A/PR/8/34 바이러스의 하나 이상의 RNA 세그먼트 (전형적으로 A/PR/8/34의 6개의 세그먼트이며, HA 및 NA 세그먼트는 백신 균주의 것, 즉 6:2 재조합체임)를 포함할 수도 있다. 그것은 또한 A/WSN/33 바이러스, 또는 백신 제조를 위해 재조합체 바이러스를 생성하는데 유용한 임의의 다른 바이러스 균주로부터 하나 이상의 RNA 세그먼트를 포함할 수도 있다. 참고문헌 72 및 73은 또한 인플루엔자 A 및 B 균주를 재배열하는데 적합한 백본을 논의한다.
전형적으로, 본 발명은 인간-대-인간 전염이 가능한 균주로부터 보호하고, 그래서 균주의 게놈은 보통 포유류 (예를 들어, 인간) 인플루엔자 바이러스에서 기원한 적어도 하나의 RNA 세그먼트를 포함할 것이다. 그것은 조류 인플루엔자 바이러스에서 기원한 NS 세그먼트를 포함할 수도 있다.
헤마글루티닌 (HA)는 비활성화된 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신은 전형적으로 일원 방사 면역확산법 (SRID) 검정에 의해 측정된 바와 같이 HA 수 균주 당 약 15 μg의 HA를 함유하지만, 예를 들어, 아동에게, 또는 유행성 상황에서는 더 낮은 용량이 사용된다. 더 높은 용량 (예를 들어, 3x 또는 9x 용량 (참고문헌 76 & 77))이 사용됨에 따라, 일부 용량, 예컨대 ½ (즉, 균주 당 7.5 μg HA), ¼ 및 ⅛이 사용되었다 (참고문헌 74 & 75), 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150 μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50 μg, 예를 들어, 0.1-20 μg, 0.1-15 μg, 0.1-10 μg, 0.1-7.5 μg, 0.5-5 μg, 등을 포함할 수도 있다. 특정 용량은, 예를 들어, 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다. 본 발명에서와 같이, 백신에 보조제가 존재할 때에는 이들 더 낮은 용량이 가장 유용하다. 본 발명의 백신, 키트 및 공정의 구성요소 (예를 들어, 부피 및 농도)는 최종 생성물로 이 항원 용량을 제공하도록 선택될 수도 있다.
생 백신에 대하여, 용량은 HA 함량 대신에 중간 조직 배양 감염성 용량 (TCID50)에 의해 측정되고, 균주 당 106 내지 108 (바람직하게는 106.5-107.5)의 TCID50이 전형적이다.
본 발명과 함께 사용된 HA는 바이러스에서 발견된 천연 HA일 수도 있거나, 변형될 수도 있다. 예를 들어, 바이러스를 조류 및 다른 종에서 고도로 병원성이 되게 하는 결정요인들 (예를 들어, HA1 및 HA2 사이의 절단 부위 주위의 다염기성 영역)이 난에서 바이러스가 성장하는 것으로부터 보호할 수 있기 때문에, 이 결정요인을 제거하도록 HA를 변형시키는 것이 공지되어 있는데, 이 이다.
조성물은 세제, 예를 들어, 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대하여 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 ('Tween'으로 알려져 있음), 옥톡시놀 (예컨대 옥톡시놀-9 (Triton X-100) 또는 t 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수도 있다. 세제는 단지 미량으로 존재할 수도 있다. 따라서 백신은 각각 1 mg/ml 미만의 옥톡시놀 10, α-토코페릴 하이드로겐 숙시네이트 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수도 있다. 미량의 다른 잔류 구성요소는 항생제 (예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다.
비활성화되었지만 비-전체 세포 백신 (예를 들어, 분할 바이러스 백신 또는 정제된 표면 항원 백신)은 이 항원 내에 위치하는 T 세포 에피토프로부터 이익을 얻기 위해 매트릭스 단백질을 포함할 수도 있다. 따라서 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하는 비-전체 세포 백신 (특히 분할 백신)은 추가적으로 M1 및/또는 M2 매트릭스 단백질을 포함할 수도 있다. 매트릭스 단백질이 존재하는 경우, 검출 가능한 수준의 M1 매트릭스 단백질의 포함이 바람직하다.
샘플의 항원은 전형적으로 인플루엔자 비리온으로부터 제조될 것이지만, 대안으로서, 헤마글루티닌과 같은 항원은 재조합 숙주 (예를 들어, 플라스미드 발현 시스템을 사용하는 효모, 또는 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 곤충 세포주)에서 발현될 수 있고 정제된 형태로 사용될 수 있다 (참고문헌 78 & 79). 하지만, 일반적으로, 항원은 비리온의 것이다.
샘플은 스트레스 조건에 노출되었을 수도 있거나, 또는 노출된 것으로 의심될 수도 있다. 본 발명의 방법은 샘플이 다양한 스트레스 조건들 중 하나 이상에 노출되었을 때 정확한 양의 면역원성 HA가 샘플에 존재한다는 것을 보장하는데 사용될 수도 있다. 일부 구체예에서, 스트레스 조건은 6.5 미만의 pH, 동결해동 및 보텍싱(vortexing)으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 스트레스 조건은 6.5 미만의 pH, 동결해동 및 보텍싱으로부터 선택되고 정량화는 본원에서 기술된 바와 같이 RP-HPLC를 사용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 스트레스 조건은 6.5 미만의 pH, 7.5 초과의 pH, 50℃ 초과의 온도, 또는 동결해동으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 스트레스 조건은 6.5 미만의 pH, 7.5 초과의 pH, 50℃ 초과의 온도, 또는 동결해동으로부터 선택되고, 정량화는 본원에서 기술된 바와 같이 질량 분석법을 사용하여 수행된다. 질량 분석법은 본원에서 기술된 바와 같이 분리 단계 (예를 들어, 침전)이 생략된 방법이다. 6.5 미만의 pH는 4 내지 6의 pH (예를 들어, pH 4.0 내지 pH 6.0)을 포함한다. 동결해동은 PBS 버퍼에서 이루어질 수도 있다. 동결해동은 Tris 버퍼에서 이루어질 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 스트레스 조건은 6.5 미만의 pH (예를 들어, pH 4 내지 pH 6)이다. 바람직하게는, 샘플은 비활성 HA (예를 들어, 융합 후 HA)를 함유하거나, 또는 함유하는 것으로 의심된다.
약학적 조성물
본 발명에 따라 제조된 백신은 약학적으로 허용 가능하다. 그것들은 항원 및 보조제 이외의 구성요소들을 포함할 수도 있으며, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함할 것이다. 이러한 구성요소들의 철저한 논의는 참고문헌 80에서 이용 가능하다. 점막 백신에서 사용된 담체(들)/부형제(들)는 모체 백신에서 사용된 것들과 같거나 다를 수도 있다.
조성물은 티오머살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수도 있다. 하지만, 백신은 수은 물질이 실질적으로 없는 (즉, 5 μg/ml 미만) 것, 예를 들어, 무-티오머살이 바람직하다 (참고문헌 20 & 81). 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다.
특히 주사 가능한 백신에서 긴장성을 제어하기 위해서는, 생리학적 염, 예컨대 나트륨 염을 포함하는 것이 바람직하다. 나트륨 클로라이드 (NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수도 있다. 존재할 수도 있는 다른 염은 포타슘 클로라이드, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디나트륨 포스페이트 데하이드레이트, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 등을 포함한다.
조사용 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 오스몰 농도를 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위 내에 있을 것이다. 오스몰 농도는 앞서 백신접종에 의해 유발된 통증에 대하여 엉향을 미치지 않는 것으로 보고되었지만 (참고문헌 82), 그럼에도 불구하고 이 범위에서 오스몰 농도를 유지하는 것이 바람직하다.
조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수도 있다. 전형적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; Tris 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼; 또는 시트레이트 버퍼를 포함한다. 버퍼는 전형적으로 5-20 mM 범위로 포함될 것이다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 그러므로 본 발명의 공정은 보장하기 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수도 있다.
조성물은 바람직하게는 멸균 상태이다. 조성물은 바람직하게는 비-발열성이며, 예를 들어, 용량 당 <1 EU (엔도톡신 유닛, 표준 측정), 및 바람직하게는 용량 당 <0.1 EU를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.
조성물은 단일 면역화를 위한 재료를 포함할 수도 있거나, 또는 다회수 면역화를 위한 재료를 포함할 수도 있다 (즉, '다중투여' 키트). 다중투여 배치에서는 보존제의 포함이 바람직하다. 다중투여 조성물에서 보존제를 포함하는 것의 대안으로서 (또는 이에 더하여), 조성물은 재료의 재거를 위한 무균성 어댑터를 가진 용기에 함유될 수도 있다.
인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5 ml의 투약 부피로 투여되지만, 아동에게는 절반 용량 (즉, 약 0.25 ml)이 투여될 수도 있다. 비강 내 투여를 위해서, 이 전체 투약 부피는 콧구멍 사이에서, 예를 들어, 각 콧구멍에 ½로 분할될 수 있다.
조성물 및 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃ 사이에서 저장된다. 그것들은 냉동되어서는 안 된다. 그것들은 이상적으로는 직사광선을 피해야 한다.
보조제
본 발명의 방법의 이점들 중 하나는 보조제가 추가된 인플루엔자 백신에서 면역원성 HA의 HA 정량화를 허용한다는 것이다. 따라서 본 발명의 방법에서 사용된 샘플은 보조제가 추가된 인플루엔자 백신일 수도 있다. 보조제는 인플루엔자 항원과 함께 잘 작동하는 것으로 나타났기 때문에 바람직하게는 수중유 에멀젼 보조제이다.
수중유 에멀젼 보조제
수중유 에멀젼은 인플루엔자 바이러스 백신에 보조제를 추가하는데 사용에 특히 적합한 것으로 발견되었다. 다양한 이러한 에멀젼들이 공지되어 있고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나이 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해 가능하고 (대사 가능함) 생체 적합하다. 에멀젼 중 오일 방울은 일반적으로 직경이 5 μm 미만이고, 심지어는 마이크론 미만의 직경을 가지며, 이 작은 크기들은 미세유동체화기로 달성되어 안정한 에멀젼을 제공한다. 220 nm 미만의 평균 크기를 가진 방울들이 필터 멸균될 수 있기 때문에 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 수중유 에멀젼은 균일하다. 균일한 에멀젼은 그 안에 분산된 대부분의 방울 (입자)이 명시된 크기 범위 (예를 들어, 직경) 내에 있는 것을 특징으로 한다. 적합한 명시된 크기 범위는, 예를 들어, 50-220 nm, 50-180 nm, 80-180 nm, 100-175 nm, 120-185 nm, 130-190 nm, 135-175 nm, 150-175 nm일 수 있다. 일부 구체예에서, 균일한 에멀젼은 직경의 명시된 범위 밖에 있는 방울 (입자)의 수를 ≤10%으로 함유한다. 일부 구체예에서, 수중유 에멀젼 조제물 내 오일 방울의 평균 입자 크기는 동적 광 산란에 의해 측정된 바와 같이 135-175 nm, 예를 들어, 155 nm ± 20 nm이고, 이러한 조제물은 광학 입자 감지(optical particle sensing)로 측정된 바와 같이 조제물 mL 당 1 x 107개 이하의 큰 입자를 함유한다. "큰 입자"는 본원에서 사용된 바와 같이 직경 1.2 μm, 전형적으로 1.2-400 μm를 가진 것들을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 균일한 에멀젼은 바람직한 크기 범위 밖에 있는 방울을 10% 미만, 5% 미만, 또는 3% 미만으로 함유한다. 일부 구체예에서, 수중유 에멀젼 조제물에서 입자의 평균 방울 크기는 125-185 nm, 예를 들어, 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm, 약 155 nm, 약 160 nm, 약 170 nm, 또는 약 180 nm이고, 수중유 에멀젼은 조제물 중 방울의 수의 5% 미만이 125-185 nm 범위 밖에 있다는 점에서 균일하다.
본 발명은 동물성 (예컨대 물고기) 또는 식물성 공급원의 것들과 같은 오일과 함께 사용될 수 있다. 식물서 오일의 공급원은 견과류, 씨앗 및 곡물을 포함한다. 가장 흔히 이용 가능한 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일이 견과류 오일을 예시한다. 예를 들어, 호호바 콩으로부터 얻어진 호호바(jojoba) 오일이 사용될 수 있다. 씨앗 오일은 잇꽃 오일, 목화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 곡물 군에서는, 옥수수 오일이 가장 쉽게 이용 가능하지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프(teff), 라이밀(triticale) 등과 같은 다른 곡물의 오일이 또한 사용 가능하다. 씨앗 오일에서 자연적으로 발생하는 것은 아니지만, 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개의 탄소 지방산 에스터는 견과류 및 씨앗 오일로부터 시작하여 적절한 재료의 가수분해, 분리 및 에스터화에 의해 제조될 수도 있다. 포유류 유의 지방 및 오일은 대사 가능하며 그러므로 본 발명의 실행에 사용될 수도 있다. 동물성 공급원으로부터 순수한 오일을 얻는데 필요한 분리, 정제, 사포닌화 및 다른 수단들의 과정들이 업계에 공지되어 있다. 대부분의 물고기는 쉽게 회수될 수 있는 대사 가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구간 오일, 상어간 오일, 및 경뇌(spermaceti)와 같은 고래 오일이 본원에서 사용될 수도 있는 여러 물고기 오일을 예시한다. 많은 분지형 사슬 오일이 5-탄소 아이소프렌 유닛에서 생화학적으로 합성되고 일반적으로는 테르페노이드로 불린다. 상어간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산으로 공지되어 있는 분지형, 불포화 테르페노이드를 함유하며, 이것이 본원에서 특히 바람직하다. 스쿠알렌의 포화된 유사체인 스쿠알란이 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 물고기 오일이 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능하거나 업계에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다 (하기 참조). 오일의 혼합물이 사용될 수도 있다.
계면활성제는 그것들의 'HLB' (친수성기/친유성기 평형)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 및 더 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 (흔히 Tween으로 불림), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명 하에 판매되는 에틸렌 산화물 (EO), 프로필렌 산화물 (PO), 및/또는 부틸렌 산화물 (BO)의 코폴리머, 예컨대 선형 EO/PO 블록 코폴리머; 반복 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 다를 수 있는 옥톡시놀로서, 옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 흥미롭다; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린 (레시틴)과 같은 인지질; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제로 공지되어 있음), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30); 및 소르비탄 에스터 (일반적으로 SPAN으로 공지되어 있음), 예컨대 소르비탄 트리올레이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되기에 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), Span 85 (소르비탄 트리올레에이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.
계면활성제의 혼합물, 예를 들어, Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80) 및 옥톡시놀, 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100)의 조합이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 라우레쓰 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
계면활성제의 바람직한 양 (중량%)은 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 (예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대 Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 라우레쓰 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%.
가장 바람직한 수중유 에멀젼은 수중 스쿠알렌 에멀젼, 바람직하게는 마이크론 미만의 수중 스쿠알렌 에멀젼이다.
본 발명과 함께 유용한 특이적 수중유 에멀젼은 다음을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 이것들로부터 유래된 스쿠알렌-함유 에멀젼이 바람직하다:
스쿠알렌, 폴리소르베이트 80, 및 소르비탄 트리올레에이트의 마이크론 미만의 에멀젼. 에멀젼은 시트레이트 이온을 포함할 수도 있다. 수상, 예를 들어, 10 mM 나트륨 시트레이트 버퍼에서 시트레이트 이온을 포함할 수도 있다. 에멀젼은 3.2-4.6 mg/ml 스쿠알렌, 4.1-5.3 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 4.1-5.3 mg/ml 소르비탄 트리올레에이트를 포함할 수도 있다. 에멀젼의 조성은 부피 기준으로 약 4.6% 스쿠알렌, 약 0.45% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% 소르비탄 트리올레에이트일 수 있다. "MF59"로 공지되어 있는 보조제 (참고문헌 83-85)는 참고문헌 86의 10장 및 참고문헌 87의 12장에서 더 상세히 기술된다. 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레에이트는 9750:1175:1175의 중량비로 존재할 수도 있다. 약 39 mg/mL 스쿠알렌, 약 4.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 4.7 mg/mL 소르비탄 트리올레에이트의 농도가 전형적이다. 155-185 nm의 Z-평균 방울 크기가 바람직하며, <0.2의 다분산성을 갖는다.
스쿠알렌, 토코페롤 (특히, DL-α-토코페롤), 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충된 식염수를 포함할 수도 있다. 이 에멀젼들은 부피 기준으로 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 폴리소르베이트 80을 가질 것이며, 스쿠알렌:토코페롤의 부피비는 바람직하게는 <1 (예를 들어, 0.90)인데 더 안정한 에멀젼을 제공할 수 있기 때문이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수도 있다. 따라서 세 개의 구성요소 (스쿠알렌, 토코페롤, 폴리소르베이트 80)는 1068:1186:485 또는 대략 55:61:25의 중량비로 존재할 수도 있다. 한 이러한 에멀젼 ("AS03")은 4.3 중량% 스쿠알렌, 4.8 중량% 토코페롤, 및 2 중량% 폴리소르베이트 80을 포함한다. 약 42.7 mg/mL 스쿠알렌, 약 47.4 mg/mL DL-α-토코페롤, 및 약 19.4 mg/mL 폴리소르베이트 80의 농도가 전형적이다. 140-170 nm의 Z-평균 방울 크기가 바람직하다. 에멀젼은 또한 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3d MPL)를 포함할 수도 있다. 이 유형의 또 다른 유용한 에멀젼은 인간 용량 당 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수도 있으며 (참고문헌 88), 예를 들어, 상기 논의된 비를 포함할 수도 있다.
스쿠알렌, 수용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스터 또는 만니드 에스터, 예컨대 소르비탄 모노올레에이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열 가역적이고 및/또는 200 nm 미만의 크기를 가진 오일 방울 (부피 기준)을 적어도 90%로 갖는다 (참고문헌 89). 에멀젼은 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수도 있다: 알디톨; 동결방지제 (예를 들어, 당, 예컨대 도데실말토시드 및/또는 수크로스); 및/또는 알킬폴리글리코시드. 에멀젼은 TLR4 아고니스트(agonist)를 포함할 수도 있다 (참고문헌 90). 이러한 에멀젼은 동결건조될 수도 있다. 바람직한 에멀젼은 스쿠알렌, 소르비탄 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 만니톨 (예를 들어, 32.5% 스쿠알렌, 4.82% 소르비탄 올레에이트, 6.18% 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 6% 만니톨; 중량%)을 포함하며, 평균 방울 크기는 150 nm 미만이다. 약 49.6 mg/mL 스쿠알렌, 약 7.6 mg/mL 소르비탄 올레에이트, 및 약 9.6 mg/mL 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르, 및 9.2 mg/mL 만니톨의 농도가 전형적이다.
스쿠알렌, 포스파티딜콜린, 폴록사머 188, 글리세롤 및 암모늄 포스페이트 버퍼를 포함하며, 선택적으로는 α-토코페롤 ('SE')도 포함하는 에멀젼 (참고문헌 91).
스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수도 있다 (하기 참조). 에멀젼은 포스페이트 버퍼를 함유할 수도 있다.
폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제 (예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 75:11:10의 질량비 (예를 들어, 750 μg/ml 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml Triton X-100 및 100 μg/ml α-토코페롤 숙시네이트)로 이 세 가지 구성요소들을 포함할 수도 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이 구성요소들의 임의의 기여를 포함해야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수도 있다. 수상은 포스페이트 버퍼를 함유할 수도 있다.
스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충된 식염수, pH 7.4에서 제형화될 수도 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩타이드에 대하여 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐-MDP과 함께 사용되었다 (참고문헌 92) (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 그것은 또한 "AF" 보조제에서와 같이, Thr-MDP 없이 사용될 수 있다 (참고문헌 93) (5% 스쿠알란, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동체화가 바람직하다.
스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼 (참고문헌 94). 보조제가 추가된 백신에서 이 구성요소들의 최종 농도 (중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 (pluronic polyol) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드)이다.
0.5-50% 오일, 0.1-10% 인지질, 및 0.05-5% 비-이온성 계면활성제를 가진 에멀젼. 참고문헌 95에서 기술된 바와 같이, 바람직한 인지질 구성요소들은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디오리핀이다. 마이크론 미만의 방울 크기가 유리하다.
비-대사 가능 오일 (예컨대 부드러운 미네랄 오일) 및 적어도 하나의 계면활성제 (예컨대 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 마이크론 미만의 수중유 에멀젼. QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성기 컨쥬게이트 (예컨대 GPI-0100, 참고문헌 96에서 기술되고, 글루쿠론산의 카르복실 기를 통해 데스아실사포닌으로 지방족 아민의 추가에 의해 생산됨), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판디아민과 같은 첨가제가 포함될 수도 있다.
사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀(micelle)로서 회합된 에멀젼 (참고문헌 97).
미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알콜, 및 비-이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화된 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) (참고문헌 98).
미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화된 지방 알콜, 및 비-이온성 친유성 계면활성제를 포함하는 에멀젼 (예를 들어, 에톡실화된 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머) (참고문헌 98).
주사용 백신을 만들기 위해서 이 에멀젼들은 일반적으로 수성 면역원 조제물과 혼합될 것이다. 이 혼합은 전형적으로 1:1 부피비로 수성 형태의 면역원과 함께 수성 형태의 에멀젼을 수반하며, 이 경우에 에멀젼의 구성요소의 비는 최종백신에서 반으로 줄어들 것이다. 예를 들어, 5 부피% 스쿠알렌을 가진 에멀젼은 항원 용액과 1:1 비로 혼합되어 2.5 부피%의 최종 농도를 가진 백신을 제공할 수 있다. 5:1 내지 1:5의 혼합되는 두 액체의 부피비를 사용한 다른 혼합 비가 물론 가능하다. 따라서 백신 조성물에서 상기 언급된 에멀젼의 구성요소의 농도는 희석에 의해 (예를 들어, 2 또는 3과 같은 정수에 의해) 변형될 수 있으며 그것들의 비는 동일하게 유지된다. 예를 들어, 소아 백신은 더 낮은 농도의 보조제, 예를 들어, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 또는 1 부피% 스쿠알렌을 함유할 수도 있다.
항원 및 보조제가 혼합된 후, 헤마글루티닌 항원은 일반적으로 수용액으로 유지될 것이지만 그 자체를 오일/물 계면 주위에 분포시킬 수도 있다. 일반적으로 임의의 헤마글루티닌이 에멀젼의 유상으로 들어가는 경우에 매우 적을 것이다.
조성물이 토코페롤을 포함하는 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중 어느 것도 사용될 수 있지만, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태, 예를 들어, 상이한 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기염, 예컨대 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트, 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤은 둘 다 사용될 수 있다. 토코페롤은 유리하게는 고령의 환자 (예를 들어, 60살 이상)에게 사용을 위해 백신에 포함되는데, 비타민 E가 이 환자 군의 면역 반응에 대하여 양의 효과를 갖는 것으로 보고되었기 때문이다 (참고문헌 99). 그것들은 또한 에멀젼을 안정화시키는 것을 도울 수도 있는 항산화 성질을 갖는다 (참고문헌 100). 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이고, 이 토코페롤의 바람직한 염은 숙시네이트이다. 숙시네이트 염은 생체 내에서 TNF-관련 리간드와 협력한다는 것이 발견되었다. 더욱이, α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신과 호환 가능하고 수은 화합물에 대한 대안으로서 유용한 보존제인 것으로 알려져 있다 (참고문헌 20). 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.
일반
용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", 뿐만 아니라 "~로 구성된"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 구성될 수도 있거나 또는 추가적인 어떤 것, 예를 들어, X + Y를 포함할 수도 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 제외될 수도 있다.
수치 x에 관하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, x+10%를 의미한다.
달리 진술되지 않는 한, 둘 이상의 구성요소를 혼합하는 단계를 포함하는 공정이 혼합의 임의의 특이적 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 구성요소들은 어떤 순서로도 혼합될 수 있다. 세 개의 구성요소가 존재하는 경우 두 개의 구성요소가 서로 조합된 다음, 상기 조합이 제3 의 구성요소, 등과 조합될 수도 있다.
동물성 (및 특히 소) 재료가 세포 배양에 사용된 경우, 그것들은 전염성 해면양뇌증 (transmissible spongiform encaphalopathy; TSE)이 없고, 특히 광우병 (bovine spongiform encephalopathy; BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 종합적으로, 동물 유래 재료의 전체 부재 하에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명은 단지 예시의 방법에 의해 기술되었고 본 발명의 범위 및 사상 내에서 이루어질 수도 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 본 발명은 다음 비-제한적 구체예를 포함한다:
1) (a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계; (c) 샘플에서 분해된 비활성 HA를 분해되지 않은 면역원성 HA로부터 분리하는 단계; (d) 분해되지 않은 면역원성 HA를 분석적 단백질 가수분해시켜서 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계; 및, (e) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
2) (a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 프로테아제에 의해 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계; (c) 분해되지 않은 면역원성 HA 및 분해된 비활성 HA의 혼합물을, 생물학적 단백질 가수분해 동안에 비활성 HA에서 절단될 수 있는 하나 이상의 절단 부위(들)에서 면역원성 HA를 절단할 수 없는 하나 이상의 프로테아제를 사용하는 분석적 단백질 가수분해시켜서, 비활성 HA-유래 펩타이드와 구별 가능한 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)을 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계; 및, (d) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
3) 구체예 1에서, 단계 (d)의 분해되지 않은 면역원성 HA는 스트레스트 형태로 되어 있는 방법.
4) 구체예 3에서, 분해되지 않은 면역원성 HA의 스트레스트 형태는 6.5 미만의 pH, 7.5 초과의 pH, 50℃ 초과의 온도에 노출; 또는 동결해동에 의해 얻어지는 방법.
5) 구체예 4에서, 저 pH는 pH 6.0 미만인 방법.
6) 구체예 5에서, 저 pH는 pH 4.0 내지 6.0인 방법.
7) 구체예 1 내지 구체예 6 중 어느 것에서, 분석적 단백질 가수분해 단계는 면역원성 HA의 단편을 생성하기에 충분한 조건 하에서 세린 프로테아제로의 분해를 포함하는 방법.
8) 구체예 7에서, 분석적 단백질 가수분해는 약 37℃에서 최대 18시간 동안 수행되는 방법.
9) 구체예 1 내지 구체예 8 중 어느 것에서, 구체예 1에 따라, 단계 (b)의 프로테아제 및 단계 (d)의 프로테아제는 같거나, 또는 다르다.
10) 샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법으로서, 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계; 샘플에서 면역원성 HA를 다른 구성요소로부터 분리하는 단계; 및, 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
11) 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 것에서, 구체예 1에 따라, 생물학적 단백질 가수분해는 프로테아제로의 단백질 가수분해를 포함하는 방법.
12) 구체예 11에서, 프로테아제는 세린 프로테아제인 방법.
13) 구체예 12에서, 세린 프로테아제는 트립신인 방법.
14) 구체예 1 내지 구체예 13 중 어느 것에서, 생물학적 단백질 가수분해는 37℃에서 수행되는 방법.
15) 구체예 10-14 중 어느 것에서, 생물학적 단백질 가수분해는 30분, 60분, 90분 또는 120분 동안 수행되는 방법.
16) 구체예 10-15 중 어느 것에서, 면역원성 HA는 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)에 의해 정량화되는 방법.
17) 구체예 10-16 중 어느 것에서, 구체예 1 또는 10에 따라, 면역원성 HA를 분리하는 단계는 단백질 침전을 포함하는 방법.
18) 구체예 17에서, 단백질 침전은 유기 용매를 추가하는 단계를 포함하는 방법.
19) 구체예 18에서, 유기 용매는 케톤 또는 알콜인 방법.
20) 구체예 19에서, 유기 용매는 아세톤, 에탄올 또는 메탄올인 방법.
21) 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것에서, 구체예 1 또는 10에 따라, 방법은 알콜로 침전된 단백질을 세척하는 단계를 포함하는 방법.
22) 구체예 21에서, 알콜은 에탄올인 방법.
23) 구체예 1 또는 22에 따라, 샘플은 전체 비리온 인플루엔자 백신, 분할 인플루엔자 백신, 서브유닛 인플루엔자 백신, 및 재조합 인플루엔자 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
24) 구체예 23에서, 샘플은 보조제를 포함하는 방법.
25) 구체예 24에서, 보조제는 수중유 에멀젼 보조제인 방법.
26) 구체예 1 또는 25에 따라, 샘플은 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 인플루엔자 균주의 HA를 포함하는 방법.
27) 구체예 1 또는 26에 따라, 샘플은 1가 벌크 조제물, 다원자가 벌크 조제물, 1가 생성물, 또는 다원자가 생성물로부터 취해지는 방법.
28) 구체예 1-9 또는 16-27에서, LC-ESI-MS는 동위원소 희석 질량 분석법 (IDMS)인 방법.
29) 구체예 1 또는 28에 따라, 라벨링된 참조 HA 펩타이드는 동위원소 라벨을 포함하는 방법.
30) 구체예 29에서, 동위원소 라벨은 15N 및 13C로 구성된 목록으로부터 선택되는 방법.
31) 샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법으로서, (a) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계; 및, (b) SRID 검정에 의해 (a)의 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
32) 구체예 31에서, 단계 (b)는 항혈청, 예컨대 다클론성 항혈청 (예를 들어, 양 항혈청) 및/또는 적합한 단클론성 항체의 사용으로 수행되는 방법.
33) 구체예 32에서, 생물학적 단백질 가수분해는 프로테아제 (예를 들어, 세린 프로테아제, 예컨대 트립신)로의 단백질 가수분해를 포함하는 방법.
34) 구체예 31-33 중 어느 것에서, 생물학적 단백질 가수분해는 37℃에서 수행되는 방법.
35) 구체예 31-34 중 어느 것에서, 샘플은 전체 비리온 인플루엔자 백신, 분할 인플루엔자 백신, 서브유닛 인플루엔자 백신, 및 재조합 인플루엔자 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
36) 구체예 1 내지 구체예 35 중 어느 것에서, 샘플은 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 그 이상의 인플루엔자 균주의 HA를 포함하는 방법.
37) 구체예 1 내지 구체예 36 중 어느 것에서, 샘플은 1가 벌크 조제물, 다원자가 벌크 조제물, 1가 생성물, 또는 다원자가 생성물로부터 취해지는 방법.
38) 구체예 1 내지 구체예 37 중 어느 것에서, 샘플/백신에서 적어도 60%의 HA는 활성/면역원성 형태로 되어 있고; 및/또는, 샘플/백신에서 적어도 20%의 HA는 비활성 형태로 되어 있고; 및/또는, 샘플에서 활성:비활성 HA의 비는 적어도 4:1인 방법.
39) 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서, 인플루엔자 HA를 포함하는 벌크 조제물의 샘플을 제공하는 단계; 구체예 1 내지 구체예 38 중 어느 것의 방법에 따라 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계; 및, 샘플에서 면역원성 HA의 양에 따라 벌크 조제물의 단일 투약 형태를 포장하는 단계를 포함하는 방법.
40) 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서, 구체예 1 내지 구체예 38 중 오느 것의 방법에 의해 벌크 백신에서 HA의 양을 정량화하는 단계; 및 벌크로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
41) 구체예 39 또는 40에서, 멸균 조제물을 제공하기 위해 여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
42) 구체예 39-41 중 어느 것에서, 보조제와 조합하는 단계를 더 포함하는 방법.
43) 구체예 39-42 중 어느 것에서, 단위 투약은 액체, 동결건조된 고체, 동결건조된 분말, 또는 비강 에어로졸의 형태로 되어 있는 방법.
44) 구체예 39-43 중 어느 것에서, 단계 (c) 이후 구체예 1의 방법을 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
45) 구체예 39-44 중 어느 것에서, 벌크는 1가 또는 다원자가인 방법.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의해 더 예시되며, 이것들은 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 생물학적 트립신 처리에 의한 전처리
인플루엔자 바이러스 표면 HA는 주로 가장 면역학적으로 적절한 상태인 융합 전 상태에서 트라이머로서 존재한다. HA는 다양한 스트레스 조건 하에서 융합 후 상태로의 비가역적 전환을 거칠 수 있다. 융합 후 HA는 강력한 중화 면역 반응을 유도하지 않는다.
트립신 분해에 대한 융합 전 HA 및 융합 후 HA의 민감도를 신선하게 제조된 트립신 (1:20의 효소:기질 비)을 샘플에 추가하고 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 비교하였다.
환원성 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 나타난 바와 같이 (도 1A), 대조군 융합 전 HA (HA1 및 HA2)는 높은 프로테아제 농도 (HA:트립신 = 5:1)에서도 트립신 분해에 대하여 매우 저항성이다. 반대로, 저 pH는 융합 후 HA1을 유도하며, 이것은 입체구조 변화를 거쳐, 트립신에 대하여 매우 민감하게 된다. 하지만, 융합 후 HA2는 여전히 그것의 프로테아제 저항성을 가지고 있었다.
샘플을 또한 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 분석하였다. RP-HPLC에 대하여, DTT-환원된 샘플을 Pros R1/10 컬럼 (Applied Biosystems)및 30-35 % ACN (0.1 % TFA)의 구배를 사용하여 UV 검출을 동반한 Waters Alliance HPLC에 의해 분석하였다.
RP-HPLC는 HA1 피크가 대조군 조건 (융합 전 대조군, pH 4.0 처리 단독, 및 트립신 처리 단독)에서 변화되지 않은 채로 유지된다는 것을 분명하게 나타냈다. 하지만, HA1 피크는 저 pH 및 트립신 이중-처리된 샘플에서 크게 감소하였다.
전처리 단계 (생물학적 트립신 처리라고 부름)와 정량적 질량 분석법을 조합하여 효능 검정을 개발하였다. 생물학적 트립신 처리의 최적화는 짧은 기간에 짧은 펩타이드로의 융합 후 HA1의 분해의 최대 수준을 달성하는 한편, 융합전 HA1에 영향을 미치지 않는데 초점을 맞추었다.
실시예 2: 단백질 침전, 분석적 분해 및 IDMS
생물학적 트립신 처리 후, 분해된 융합 후 HA1 펩타이드를 온전한 융합 전 HA 분자로부터 분리한다. 단백질 침전 접근법을 개발하고 최적화하였다. 단백질 침전을 위해서, 1 mM HCl에서 신선하게 만들어진 10 mM Nα-토실-L-리신 클로로메틸 케톤 하이드로클로라이드 (TLCK)를 100 μM의 최종 농도로 생물학적 트립신 처리를 거친 샘플에 추가하였고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 4배 부피의 차가운 아세톤을 용액에 추가하였고 -20℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 그 이후 ~21k RCF에서 원심분리하여 침전제를 펠릿화하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 그 다음에 침전제를 1mL의 차가운 에탄올로 세 번 세척하였다. 침전제를 흩뜨리지 않도록 주의를 기울였다. 마지막으로, 침전제를 10분 동안 공기건조시켰다.
이 접근법의 이점은 샘플 조제물이 같은 튜브 내에 있어서, 샘플 손실을 최소화한다는 사실이다. 이것은 또한 다운스트림 샘플 조제물에 호환 가능한 버퍼의 원하는 부피로의 회수된 단백질 펠릿의 편리한 재현탁을 제공하였다. 이 접근법은 더 적은 인공물의 도입으로 이어졌다.
이 최적화된 프로토콜을 이용하여, 거의 100% 온전한 HA 분자를 대부분의 경우에 아세톤 단백질 침전으로 지속적으로 회수하였고, (도 6 참조) 에탄올 세척으로 분해된 펩타이드를 97-100% 제거하였다 (도 7 참조).
분리 후, 회수된 단백질 펠릿을 6 M 구아니딘 HCl (50 mM Tris, pH 8.0 중)에서 재현탁하고 완전한 재가용화를 위해 70℃에서 5분 동안 가열하였다. 분해 전, 구아니딘 버퍼를 100 mM Tris (pH 8.0)를 첨가하여 0.6 M로 희석하였다. 그 다음에 트립신/Lys-C 혼합물을 추가하였고 (1:5의 효소:기질 비) 37℃에서 인큐베이션하여, 직접적인 동위원소 희석 질량 분석법 (IDMS) 분석을 위한 펩타이드를 생성하는 분석적 분해를 시작하였다. 시간 경과 연구는 선택된 조건 하에서, 대부분의 경우 모든 표적화된 대리 펩타이드 신호가 4 h 후 플래토(plateau)에 도달하지 못 했다는 것을 보여주었다. 2%의 최종 농도로 20% TFA를 추가하여 분해를 퀸칭하였다.
라벨링된 대리 펩타이드의 칵테일을 반응 혼합물에 추가하였고 표준 보정 곡선을 생성하기 위해 일련의 농도를 표준 대리 펩타이드를 분해 버퍼에서 제조하였다. 액체 크로마토그래피 표준 반응 관찰 (LC-SRM)을 Electrospray Ionization Source (ESI)가 장착되고 Dionex Ultimate 3000 UHPLC에 결합된 Thermo TSQ Endura Triple Quadrupole MS를 사용하여 수행하였다. 50℃ 컬럼 온도에서 0.25 mL/분의 유속으로 Waters Acquity BEH C18 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자)를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. SRM을 근본적으로 문헌 (참고문헌 14)에서 기술된 바와 같이 수행하였으며 각 펩타이드에 대하여 3개의 전환을 관찰하였다. 데이터를 Skyline 소프트웨어 및 Thermo Qual Browser에 의해 분석하였다.
HA2 서브유닛이 단백질 가수분해에 대하여 저항성이기 때문에, 대리 펩타이드를 단지 HA1 서열로부터만 선택하였다. 검정의 목적에 따라, 대리 펩타이드에 대한 선택 기준은 다르다. 목적이 전체 HA를 정량화하기 위한 것이면, 균주 전체에 걸쳐 보존된 서열을 대리 펩타이드로서 선택하였다. 목적이 다원자가 샘플에서 특이적 균주를 정량화하기 위한 것이면, 관심있는 각 균주에 대하여 독특한 서열을 대리 펩타이드로서 선택하였다. 일반적으로 각 균주에 대하여 적어도 2개의 대리 펩타이드를 사용하였다.
전체 검정의 간략한 흐름도는 도 2에서 도시된다.
실시예 3: 보조제와의 검정 호환 가능성
보조제를 백신에서 효험을 증대시키기 위해 광범위하게 사용하였다. 수중유 에멀젼 보조제 MF59는 인플루엔자 백신에서 사용되었으며 면역결핍/면역손상 집단에서 크게 개선된 보호와 관련된 두 개의 보조제 중 하나였다 (참고문헌 101). 따라서, 대안의 효능 검정이 보조제와 호환 가능한 경우에 유리할 것이다.
검정이 보조제와 호환 가능한지를 결정하기 위해서 세 개의 다른 HA 모노벌크를 MF59 보조제의 존재 또는 부재 하에서 본 발명의 검정을 사용하여 테스트하였다. 데이터는 MF59의 존재가 검정을 방해하지 않는다는 것을 보여준다 (표 1).
효능 검정은 MF59와 호환 가능하다.
균주명 조건 단백질 농도 (μg/mL) 비율 (MF59/대조군)
A Brisbane MF59 있음 (n=3) 11.48 95%
MF59 없음 (n=3) 12.12
B Brisbane MF59 있음 (n=3) 20.38 103%
MF59 없음 (n=3) 19.79
A Victoria MF59 있음 (n=3) 11.13 109%
MF59 없음 (n=3) 10.16
실시예 4: 스트레스트 다원자가 백신에서 HA의 정량화
검정을 저 pH, 고 pH, 및 높아진 온도 하에서 스트레스가 가해진 인플루엔자 백신을 테스트하하여 검정의 안정성 표시 기능을 확인하는데 사용하였다. 매우 선택적이고 단일 실행 동안에 수천 개의 SRM 전환을 정량화할 수 있는 LC-SRM 기반 정량화의 특성으로 인해, 본 검정은 각 균주에 대하여 독특한 대리 펩타이드가 사용되는 한 다원자가 백신에서 상이한 균주를 동시에 정량화하는데 있어서 본질적인 이점을 갖는다. 따라서, 각각 30 μg (SRID 값 기준)의 A/Victoria/210/2009, A/Brisbane/59/2007, B/Brisbane/60/2008, 및 B/Wisconsin/1/2010을 포함하는 4가 백신을 이 검정에 사용하였다. 각각 전처리 (생물학적 트립신 처리)되거나 되지 않은 스트레스트 또는 비-스트레스트 대조군 샘플을 RP-HPLC, SRID, 및 본 검정으로 동시에 테스트하였다.
저 pH 스트레스
저 pH는 융합 이전에서 융합 이후로 HA의 입체구조적 전환을 촉발한다 (참고문헌 9). 저 pH의 스트레스를 0.5 M 나트륨 아세테이트 (pH 4.0)를 QIV 샘플 (~120 μg/mL HA, 최종 pH ~4.1)에 추가함으로써 시작하였고, 샘플을 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 1 M Tris (pH 8.5)를 추가하여 pH를 ~7.1로 중화시킴으로써 스트레스를 퀸칭하였다. '저 pH 음성' 대조군 샘플을 나트륨 아세테이트 대신에 H2O를 사용하는 것을 제외하고 같은 방식으로 처리하였다.
저 pH 스트레스 실험에 대하여, RP-HPLC는 4개의 균주 모두에 상응하는 HA1 피크가 pH 4.0 및 생물학적 트립신 이중 처리된 샘플 (저 pH+/트립신+)에서 거의 사라졌음을 보여주었으며, 이것은 생물학적 트립신 처리가 융합 후 HA를 제거하였다는 것을 나타냈다. '저 pH-/트립신+' 샘플에 대하여, HA1 피크는 대체로 온전하였으며, 생물학적 트립신 처리가 융합 전 HA에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
생물학적 트립신 처리되지 않은 샘플에 대하여, HA1 피크는 또한 저 pH 스트레스의 존재 또는 부재에 상관없이 변화되지 않았으며, 이것은 RP-HPLC가 융합 전과 융합 후 HA를 구별할 수 없기 때문에 예상되었다 (도 3A 참조).
본 검정을 이용한 정량화 결과는 이중 처리된 샘플에서 4개의 균주 모두에 대하여 큰 하락을 보여주는 한편, '저 pH+/트립신-' 샘플에 대한 결과는 변화없이 유지되었으며, 이것은 생물학적 트립신 처리 단계의 필요성을 나타냈다.
'저 pH-/트립신+' 샘플에서 선택된 균주에 대하여 매우 적은 감소만을 검출하였는데, 아마도 대조군 샘플에서 기존의 융합 후 HA의 낮은 수준 때문일 것이다 (도 3B).
같은 세트의 샘플의 SRID 테스트는 생물학적 트립신 처리의 존재/부재에 관계없이 저 pH 처리된 샘플에서 큰 하락을 나타냈으며 (도 3B), 저 pH가 융합 후 전환을 유도하였음을 확인한다.
이 데이터 세트는 상이한 균주의 HA 단백질이 모두 저 pH 스트레스에 매우 민감하였다는 것을 나타낸다. 게다가, 생물학적 트립신 처리 단계를 이용할 때, 본 발명의 검정은 면역학적 활성 융합 전 HA와 면역학적 비활성 융합 후 HA를 쉽게 구별할 수 있다.
고 pH 및 열 스트레스
같은 실험 계획을 고 pH 스트레스 (탈아미드화) 및 열 스트레스 (56℃) 조건 하에서 수행하였다.
고 pH 스트레스를 0.2 M의 N-사이클론헥실-3-아미노프로판설폰산 (CAPS) 버퍼를 QIV 샘플 (최종 pH ~11)에 추가함으로써 시작하였고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였으며, 그 후 나트륨 아세테이트 (pH 4.0)를 추가하여 pH를 중화시켰다. CAPS 버퍼 대신에 H2O를 사용하는 '고 pH 음성' 대조군 샘플을 포함시켰다. 열 스트레스에 대하여, 샘플을 56 ℃에서 6시간 동안 처리하였다. '트립신 음성' 샘플에 대하여, 블랭크(blank) 버퍼를 트립신 대신에 추가하였다.
저 pH 스트레스에 대해 말하자면, 본 발명의 검정과 RP-HPLC/SRID 결과 간의 훌륭한 상관관계는 생물학적 트립신 처리 단계가 제안된 대안의 효능 검정에 안정성 표시 기능을 제공하였다는 것을 확인하였다 (도 4-5).
이 조건 하에서, 데이터는 HA 단백질이 고 pH 및 열 스트레스에 덜 민감하고, 민감도는 균주-특이적인 것으로 보인다고 제안하였다. 예를 들어, A/Victoria/210/2009 (H3N2)는 높아진 온도에 매우 민감한 한편, A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 효능은 56 ℃에서 6시간 가열하는 것에 크게 영향을 받지 않았다.
이에 더하여, 데이터 세트는 다원자가 백신에서 교차간섭 없이 특이적 균주를 정량화할 수 있는 본 검정의 능력을 확인하였다.
실시예 5: 혼합된 모노벌크의 측정
B/Brisbane, A/Brisbane 및 A/Vitoria 모노벌크 샘플을 본 발명의 검정을 사용하여 테스트하였고 1:1:1 비로 혼합된 같은 균주의 혼합된 모노벌크 샘플과 비교하였다.
혼합된 모노벌크 샘플에서 HA의 정량화는 단일 모노벌크 샘플에서와 같았다 (표 2 참조). 이것은 검정이 다원자가 샘플에서 특이적 균주를 정량화할 수 있다는 나타낸다.
단일 또는 혼합된 균주 분해물에서 시그내쳐(signature) 펩타이드의 비교
균주 펩타이드 단일에서의 비율
(고유/표준) 		혼합물에서의 비율
(고유/표준) 		비율 비교
(단일/혼합)
A/Brisbane YAFALSR 9.41 8.33 1.13
TLDFHDSNVK 0.34 0.30 1.13
B/Brisbane GILLPQK 0.38 0.38 1.00
NLNSLSELEVK 0.56 0.58 0.97
A/Victoria NSFFSR 0.77 0.79 0.97
실시예 6: 트립신 전처리는 혼합된 면역침강 고리에 의해 유발된 면역학적 활성 HA의 SRIL 과다추정를 교정한다.
이황화 결합된 HA1 및 HA2 단편으로 구성된 각각의 모노머 HA 서브유닛은 바이러스 외피 (또는 세포막) 외부에 노출된 두 개의 도메인을 갖는다: 전체가 HA1 잔기로 구성된 구형 "머리(head)", HA1 및 HA2의 잔기로 구성된 길쭉한 "줄기(stem)", 및 HA2 잔기로 구성된 막관통 및 세포질 도메인 (Wiley and Skehel 1977). HA는 일반적으로 중성 pH에서 "준안정한" 융합 전 입체구조를 유지한다. 에너지 장벽이 저 pH에 의해 극복되는 경우, HA는 더 안정한 융합 후 입체구조로 비가역적으로 리폴딩(refold)된다 (Ruigrok, Aitken et al. 1988, Bullough, Hughson et al. 1994, Skehel and Wiley 2000). 열이 또한 HA 재배열을 촉발할 수 있다 (Ruigrok, Martin et al. 1986, Wharton, Skehel et al. 1986). 융합 전 입체구조에서 HA로의 면역화는 인플루엔자에 대한 큰 면역력을 유도한다; 융합 후 입체구조에서 HA로의 면역화는 마우스에서 항체에 결합 및 중화를 유도하는데 실패한다 (Quan, Li et al. 2011).
비활성화된 인플루엔자 백신 ("IIV")의 보호적 효험 및 면역원성을, 원칙적으로는, 실험 동물을 면역화하여 평가할 수 있지만, 이러한 생체 내 효능 테스트는 시간 소모가 크고 부정확하다. 대신에, 면역학적 활성인 (중화 또는 적혈구 응집 억제 [HI] 항체 반응을 유도하는) IIV에서 HA의 양을 결정하기 위해 더 실용적인 시험관 내 효능 검정을 개발하였다. 인플루엔자 백신 항원 함량에 대한 대리 시험관 내 효능 테스트로서 일원 방사 면역확산법 (SRID)이 1970대에 개발되고 입증되었다 (Schild, Wood et al. 1975, Wood, Schild et al. 1977, Williams 1993). 이 변형된 오크털로니(Ouchterlony) 테스트는 백신 항원 (또는 백신에서 정확한 균주와 상동성인 항원 표준)이 원형 웰에서, 균주-특이적 양 항혈청의 균질한 농도로 캐스팅(cast)된 아가로스 겔로 방사상으로 확산될 때 형성되는 면역침강 고리의 직경에 기초하여 HA를 정량화한다. 유리 항원 및 항체를 여과지로 블롯팅하여 제거한 후, 면역침강 고리를 쿠마시 블루(쿠마시 blue) 염색에 의해 검출한다. IIV에서 HA는 로제트 및 다른 복합체를 형성하지만, 고리 크기가 HA 농도에 더 직접적으로 비례하도록 HA를 균질한 트라이머에 분산시키기 위해 쯔비터젠트(Zwittergent)를 항원에 추가한다 (Williams 1993).
브로멜라인에 의해 전체 바이러스로부터 절단된 HA로 양을 여러 번 면역화하여 아가로스 SRID 겔에서 균주-특이적 항혈청을 생성하였다 (Brand and Skehel 1972). SRID는 고유한 형태의 HA로만 판독 가능한 면역침강 고리를 생산할 것으로 생각되는데, 항혈청이 비리온으로부터 절단되고 고유한 것으로 추정되는 HA에 대하여 발생하기 때문이다 (Minor 2015). 임상 시험에서 SRID-측정된 백신 효능과 백신 면역원성 간의 상관관계가 나타났지만, 상관관계는 상대적으로 약하다 (Ennis, Mayner et al. 1977, La Montagne, Noble et al. 1983, Rowlen 2015). SRID는 규제 관에 의해 승인되었고 40년 동안 IIV 제형화, 방출, 및 안정화 테스트를 위한 인플루엔자 백신에 사용되었다.
이에 반해, HA 양에 대한 생물물리학적 검정, 예컨대 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC), 동위원소 희석 질량 분석법 (IDMS), 및 SDS-PAGE는 정량화 전에 HA를 변성시켜, HA의 다른 입체구조적 상태를 구별할 수 없다. 상기 실시예는 트립신 분해가 사전 선택 단계로서 사용되어 균주-특이적 항체를 필요로 하지 않고 입체구조적으로 민감하지 않은 대안의 생물물리학적 인플루엔자 효능 검정에 입체구조적 특이성을 부여할 수 있다는 것을 보여주었다 (Wen, Han et al. 2015). 이 전처리에 대한 근거는 고유한 융합 전 HA의 트립신 저항성 및 융합 후 HA 및 다른 스트레스가 가해진 HA의 트립신 민감도이다 (Skehel, Bayley et al. 1982, Ruigrok, Martin et al. 1986). 트립신은 면역학적 비활성 HA를 선택적으로 분해한다.
이 실시예는 입체구조적으로 균질한 HA 조제물로, SRID가 실제로 비-스트레스트, 아마도 마우스에서 면역원성이고 저 pH-스트레스트을 검출할 수 없는 융합 전 HA, 아마도 마우스에서 면역원성이 아닌 융합 후 HA를 검출하고 정량화한다는 것을 더 입증한다. 융합 후 HA는 블롯팅 단계 동안에 SRID 겔로부터 선택적으로 제거된다. SRID에서 사용된 양 항혈청은 ELISA 포맷으로 사용될 때 두 가지 형태의 HA를 동등하게 검출하며, SRID의 입체구조적 선택성이 항혈청의 임의의 입체구조적 선택성이 아니라, SRID 포맷 때문이라고 제안한다. 저 pH 스트레스트 HA가 비-스트레스트 HA와 혼합될 때, SRID는 융합 전과 융합 후 형태를 구별할 수 없으며, 혼합된 면역침강 고리에서 두 개의 이형태체를 효율적으로 검출하고 샘플에서 면역학적 활성 HA의 함량을 과다추정한다. 트립신 전처리가 RP-HPLC가 면역학적 활성 HA를 특이적으로 정량화할 수 있게 하는 것처럼, 트립신 분해는 또한 SRID의 정확도를 개선하며, 면역학적 비활성 HA와 혼합될 때 검정이 면역학적 활성 HA를 정량화할 수 있게 한다.
결과
마우스에서 감소된 pH에 노출된 HA의 면역원성
융합 전 및 융합 후 입체구조에서 HA의 면역원성을 평가하기 위해서, 마우스를 pH 4.0 버퍼에서 인큐베이션된 다음 pH 7.2로 되돌아오거나 (융합 후 입체구조에 있는 것으로 가정됨) 또는 일정한 pH 7.2를 유지하는 (융합 전 입체구조에 있는 것으로 가정됨) 0.1 μg의 난-생산된 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA로 두 번 면역화한다. HI를 수행하여 A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스에 의해 칠면조 적혈구 세포의 적혈구 응집을 차단할 수 있는 마우스 면역 혈청에 존재하는 항체의 역가를 평가하였다. pH 7.2로 유지된 HA는 3x102의 GMT HI 역가를 유도하였고, pH 4.0에 일시적으로 노출된 HA는 <10의 GMT HI 역가를 유도하였다 (도 8A). 마이크로중화 검정을 사용하여 A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스로 마딘 다비 개 신장 (MDCK) 세포의 감염을 차단하는 중화 항체 역가를 정량화하였으며, 유사한 결과를 나타낸다 (도 8B). 저 pH에 의한 HA 스트레스트은 검출 가능한 중화 반응을 유도하지 않았고, 중성 pH로 유지된 HA는 큰 중화 항체 역가를 유도하였다. 따라서, 융합 전 입체구조의 HA는 마우스에서 융합 후 입체구조의 HA보다 훨씬 더 면역원성이었으며, 이전의 결과와 일치한다 (Quan, Li et al. 2011). HA 샘플을 고유한 조건 하에서 트립신으로 분해하여 마우스를 면역화하는데 사용하였다. HI 및 마이크로중화 검정 둘 다는 HI 및 HA에 대한 중화 항체 반응이 트립신 분해에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다 (도 8).
SDS-PAGE, RP- HPLC , ELISA 및 SRID에 의한 감소된 pH에 노출된 HA의 특성화
같은 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA 샘플을 비-환원성 및 환원성 조건 둘 다에서 SDS-PAGE에 의해 추가로 특성화하였다. pH 7.2로 유지된 HA 및 pH 4.0에 일시적으로 노출된 HA에 대한 SDS-PAGE 밴드 강도는 비슷하였다 (도 9A). 발명자들의 이전 결과와 일치한다 (Wen, Han et al. 2015). 고유한 조건 하에서 트립신 처리 후, 저 pH에 의해 HA (비-환원된 샘플) 및 HA1 (환원된 샘플) 스트레스트에 대한 SDS-PAGE 밴드는 사라졌지만 pH 7.2로 유지된 HA에 대한 것은 변하지 않았다. 유사하게, 저 pH 처리가 되거나 되지 않은, 분해되지 않은 HA의 RP-HPLC HA1 피크는 대부분 동일하였다 (도 9B). 하지만, 트립신 분해 이후, 저 pH에 의해 처리된 HA에 대한 HA1 피크만이 사라졌다. A/Texas/50/2012 (H3N2) HA에 대한 SRID 참조 항혈청으로의 ELISA를 이 HA 샘플들에서 수행하였다. 저 pH로 비-스트레스트 또는 스트레스트인, 분해되지 않은 HA는 유사하게 ELISA 포맷의 SRID 항혈청에 의해 인식되었다 (도 8C). 트립신 처리는 pH 7.2로 유지된 HA에 대해서는 ELISA 신호를 약간 감소시켰지만 (<15% 감소), 저 pH 스트레스트 HA에 대한 ELISA 신호는 크게 감소하였다 (>50% 감소). 이 결과들은 SDS-PAGE, RP-HPLC 및 ELISA가 저 pH 스트레스트 및 비-스트레스트 HA에 대하여 유사한 결과를 나타냈지만, 트립신 처리와 결합될 때, 이 검정들은 중성 pH로 유지된 HA와 저 pH에 의해 스트레스가 가해진 HA를 구별할 수 있으며, 면역원성 연구와 상관관계가 있는 결과를 수득한다고 제안하였다 (도 9E).
SRID를 이 HA 샘플들에서 수행하였다. 예상된 바와 같이, 트립신 처리가 되거나 되지 않은, 중성 pH로 유지된 HA에 대하여 별개의 SRID 고리를 검출하였ㄱ고, 샘플이 트립신 분해되었는지에 관계없이 저 pH에 노출된 HA에 대해서는 SRID 고리가 검출되지 않았다 (도 9D). 그러므로, SRID는 자족적으로(self-sufficiently) 마우스에서 면역원성인 비-스트레스트 HA와 훨씬 덜 면역원성인 저 pH 스트레스트 HA를 구별하였으며 (도 8), 트립신 처리 단계 (예를 들어, 생물학적 단백질 가수분해)와 조합되면 SDS-PAGE, RP-HPLC 및 ELISA도 마찬가지였다 (도 9E).
저 pH 스트레스트 HA가 첨가된 비- 스트레스트 HA의 SRID 정량화
난-생산된 A/Perth/16/2009 (H3N2) HA를 SRID에 의해 평가하였고, 같은 결과를 A/Texas/50/2102 (H3N2)에 대해서 얻었다: 비-스트레스트 HA를 양성 SRID 고리로 검출하였고, 저 pH 스트레스트 HA는 고리를 생산하지 않았다 (도 10A). 놀랍게도, 비-스트레스트 HA에 저 pH 스트레스트 HA를 첨가할 때, SRID 고리는 강도가 감소하였지만, 추가된 저 pH 처리된 HA의 양이 증가함에 따라 용량-반응 방식이 확대되었다 (도 10A). 고리 크기의 정량화는
검출된 HA 양이 비-스트레스트 HA에 추가된 저 pH 스트레스트 HA의 0.5- 내지 2배의 양으로 25% 내지 70% 증가하였다는 것을 확인하였다 (도 10B). 이 샘플 세트를 또한 트립신 처리 후 RP-HPLC로 정량화하였고, 상대적인 HA 양을 비-스트레스트 HA 단독과 비교하여 100%로 유지하였다 (도 10B). 이 결과들은 스트레스트 및 비-스트레스트 HA가 혼합될 때, SRID는 두 가지 형태의 HA 모두를 검출하며, 면역학적 활성 HA에 대한 특이성을 상실한다는 것을 보여주었다.
그 다음에 발명자들은 스트레스트 및 비-스트레스트 HA의 혼합물에서 면역학적 활성 HA의 이 SRID 과다추정이 상이한 인플루엔자 균주의 추가적인 HA 샘플로 재현 가능한지를 조사하였다. 난-생산된 B/Brisbane/60/2008 HA를 SRID로 평가하였고, 비-스트레스트 및 스트레스트 HA 조제물이 별도로 분석될 때 비-스트레스트 HA에 대하여 양성 SRID 고리 및 저 pH 스트레스트 HA에 대하여 음성 고리를 생산하였다 (도 11A). 하지만, 비-스트레스트 B/Brisbane/60/2008 HA가 동량의 저 pH 스트레스트 HA와 혼합될 때, SRID 고리가 확대되었으며, 비-스트레스트 HA 단독과 비교하여 150%의 상대적으로 측정된 HA 양으로 이어진다 (도 11B). SRID 전에 트립신 처리는 비-스트레스트 HA 및 스트레스트 HA 단독에 대하여 상대적인 HA 양을 변화시키지 않았지만, 비-스트레스트 및 스트레스트 HA의 혼합물에 대하여 측정된 HA 함량을 비-스트레스트 HA 단독의 양으로 감소시켰고 면역침강 고리를 더 뚜렷하게 만들었다 (도 11A). 예상된 바와 같이, RP-HPLC는 비-스트레스트 양 단독의 200%에서 혼합물 내 전체 HA 함량을 정량화하였으며; 트립신 전처리로, RP-HPLC에 의한 혼합물의 정량화는 비-스트레스트 HA 단독의 양으로 감소하였다.
추가적인 HA 샘플, 난-생산된 A/California/07/2009 (H1N1), A/Texas/50/2012 (H3N2), B/Massachusetts/02/2012를 또한 SRID 및 RP-HPLC로 정량화하였다 (도 11C, 11D 및 11E). 각각의 경우에, 비-스트레스트 HA로의 동량의 저 pH 스트레스트 HA의 추가는 SRID에 의해 측정된 HA 양의 30 내지 50% 증가로 이어졌다. 이전 단계로서 트립신 분해는 상대적 SRID 정량화를 비-스트레스트 샘플의 100%까지 되돌려놓았다. RP-HPLC 단독은 비-스트레스트 샘플의 상대량을 200%로 하여 혼합물 내 전체 HA를 정량화하였다. 트립신 처리는 또한 RP-HPLC에 의해 양을 100%까지 감소시켰다. 이 결과들은 저 pH 스트레스트 HA가 비-스트레스트 HA와 혼합될 때, SRID는 0% 대신에 20-50%의 비-스트레스트 HA에서 스트레스트 HA를 정량화하였다는 것을 확인하였다. 이에 반해, 생체 내 효능 테스트는 저 pH 스트레스트 HA가 면역학적 비활성이라는 것을 나타냈다 (도 8). 트립신 처리는 RP-HPLC가 비-스트레스트 HA를 선택적으로 정량화하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 면역학적 활성 HA의 SRID 과다추정을 교정하였다.
HA의 SRID 정량화의 메커니즘
SRID의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서, 발명자들은 HA를 라벨링하였고 그것이 SRID 겔로 확산됨에 따라 그것을 추적하였다. 난-생산된 A/Texas/50/2012 (H3N2) HA를 일시적으로 저 pH에 노출시키거나 pH 7.2로 유지한 다음, 각각의 HA2에 위치한 하나의 유리 시스테인을 통해 IRDye 800CW 말레이미드와 컨쥬게이션하였다. 적외선 형광 스캐닝(scanning)으로의 SDS-PAGE는 HA2-특이적 라벨 및 비-스트레스트과 스트레스트 HA에 대하여 동일한 라벨링 효율을 확인하였다 (데이터 미도시). IRDye-라벨링된 HA 및 비-라벨링된 HA를 SRID 검정으로 평가하였다. HA 샘플을 SRID 겔의 웰에 로딩하였고 16시간 동안 실온에서 겔로 확산시켰다. 비-스트레스트이든 저 pH 스트레스트이든, IRDye-라벨링된 HA는 겔에서 웰로부터 비슷한 거리까지 확산되었다 (도 12A). 여과지 대신에, 나이트로셀룰로스 막을 사용하여 유리 항원 및 항체를 블롯팅하였다. 막에서 저 pH 스트레스트 HA에 대한 형광 신호가 비-스트레스트 HA에 대한 것보다 더 강력하였다. 비-라벨링된 HA에 대한 블롯팅 막에 대하여 항-H3 항체로의 웨스턴 블롯팅은 비-스트레스트 HA보다 더 많은 저 pH 스트레스트 HA가 블롯팅 막으로 제거되었음을 확인하였다. 블롯팅 후 SRID 겔의 형광 신호는 비-스트레스트 HA 샘플에 대한 별개의 면역침전 고리를 나타냈고, 저 pH 스트레스트 HA에 대해서는 약하고 얼룩진 신호를 나타냈다. 같은 SRID 겔의 쿠마시 블루 염색은 비-스트레스트 HA에 대하여 예상된 SRID 고리를 확인하였고 저 pH 스트레스트 HA에 대해서는 고리를 확인하지 못 했다. 이 결과들은 저 pH 스트레스트 HA에 대한 음성 SRID 신호가 SRID 검정 동안에 블롯팅에 의한 제거에 의해 유발되었다고 제안하였다. 라벨링된 및 비-라벨링된 HA에 대한 SRID 겔의 쿠마시 블루 염색은 동일한 SRID 고리 프로파일을 나타냈으며, HA의 라벨링이 SRID에 의한 HA 정량화에 대하여 검출 가능한 영향을 미치지 않는다는 것을 확인한다.
발명자들은 다음에 비-스트레스트 HA를 녹색 형광 신호를 갖는 IRDye800SW로 라벨링하였고, 저 pH 스트레스트 HA를 빨간색 형광 신호를 갖는 IRDye680CT로 라벨링하였으며, 샘플을 SRID로 분석하였다 (도 12B). 녹색 신호는 비-스트레스트 HA를 함유하는 면역 복합체에 의해 형성된 SRID 고리를 나타냈지만, 저 pH 스트레스트 HA를 함유한 면역 복합체에 상응하는 빨간색 고리를 볼 수 없었다. 쿠마시 블루 염색은 동등한 결과를 나타냈다. 1 대 1의 비로 비-스트레스트 및 스트레스트 HA를 함유하는 혼합된 샘플에 대하여, 비-스트레스트 HA는 저 pH 스트레스트 HA의 부재시 관찰된 것보다 더 큰 녹색 고리를 형성하였다. 혼합물 중 저 pH 스트레스트 HA는 또한 명확한 큰 빨간색 고리를 형성하였다. 중첩된 영상은 중첩된 비-스트레스트 HA 및 저-스트레스트 HA에 대한 고리를 나타냈으며, 비-스트레스트 및 스트레스트 HA가 혼합된 면역침강 고리에서 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연관성이 있음을 제안한다. 쿠마시 블루 염색에 의해 더 큰 고리를 검출하였는데 더 많은 전체 HA가 웰로부터 더 멀리 확산되었다는 것을 나타내며, 스트레스트 및 비-스트레스트 HA의 조합된 양을 반영한다. 혼합된 샘플이 트립신에 의해 분해될 때, 비-스트레스트 HA에 의해 형성된 녹색 고리는 원래의 크기로 되돌아가고, 스트레스트 HA에 의해 형성된 빨간색 고리는 사라졌다. 쿠마시-염색된 고리는 또한 비-스트레스트 HA 단독에 의해 형성된 것의 크기로 되돌아갔다. 이 결과들은 트립신이 비-스트레스트 HA와 혼합된 면역침강 고리를 형성할 수 있는 스트레스트 HA를 분해하였다고 제안하였다.
논의
HA의 온전함은 백신 생산 및 저장 동안에 생물학적 생성물에 흔히 영향을 미치는 많은 스트레스 조건에 의해 손상될 수 있다. 이에 더하여, HA가 적당히 낮은 pH에서 재배열되도록 프라이밍(prime)되기 때문에 (세포로의 바이러스 진입 동안에 막 융합 기능을 수행하기 위해서), 인플루엔자 백신에서 HA는 저 pH 노출에 특히 민감하다. 전방위 스트레스트 HA의 면역원성이 완전히 조사되지는 않았지만, 이 연구 (도 8) 및 다른 연구 (Quan, Li et al. 2011)에서 융합 전 상태의 HA가 저 pH에 의해 융합 후 상태로 재배열되도록 촉발된 HA보다 마우스에서 더 강력하게 중화 항체를 유도한다는 것을 보여주었다. 따라서, HA-기반 백신 효능 검정은 HA 입체구조에 민감성이어야 한다.
SRID, IIV 효능에 대한 "금 표준" 대리 검정 (Williams 1993)은 효능 결정을 위해 양 항혈청에 의존한다 (Wood, Schild et al. 1977). 양 항혈청은 정제된 전체 바이러스로부터 추출된 HA로 증가되며, 이것은 전적으로 고유한 융합 전 입체구조이거나 아닐 수도 있다. 발명자들의 연구에서, SRID에 사용된 양 다클론성 항혈청은 ELISA 포맷에서 융합 전 및 융합 후 입체구조 둘 다에서 동등하게 HA에 결합되었으며 (도 9C), 항체의 대부분이 고유한, 융합 전 HA에 특이적이지 않다고 제안한다. 그러므로, SRID에 의한, 융합 후 HA가 아니라 융합 전 HA의 선택적 검출은 양 항혈청 단독의 특이성에 의해서가 아니라, SRID 포맷에 의해 결정되어야 한다.
SRID의 기본 전제는 검정이 단지 면역침강 고리의 크기 (직경)만을 기반으로 HA를 정량화한다는 것이며, 고리가 클 수록 할당된 HA 농도가 더 높다 (Williams 1993). 고리의 강도 및 날카로움은 검정 해석에서 고려되지 않는다. IIV의 HA는 로제트 및 HA-HA, HA-다른 바이러스 단백질, 및 HA-세포막 상호작용을 통한 다른 응집체를 형성한다 (Tay, Agius et al. 2015). SRID 분석을 위해 쯔비터젠트로 백신 항원의 전처리는 HA를 더 작은 올리고머로 분산시키지만 완전히 균질한 HA 트라이머로는 분산시키지 않는다 (데이터 미도시). 그러므로, SRID 겔에서, 불균질 형태의 HA는 웰로부터 다양한 거리까지 확산되며, 이로써 추정된 HA 양은 단순히 HA 농도 단독에는 상관관계가 없다.
저 pH 스트레스트 또는 비-스트레스트 HA의 순수한 조제물로, SRID는 면역학적 활성, 비-스트레스트 형태에 대한 특이성을 나타냈다. 추가의 조사는 융합 후 HA가 융합 전 HA와 유사한 SRID 겔로 확산되었지만 쿠마시 염색에 의한 검출 전에 블롯팅 단계에 의해 겔로부터 선택적으로 제거된다는 것을 나타냈다. 융합 후 HA의 선택적 블롯팅에 대한 이유는 완전히 명확한 것은 아니다. 양 항혈청은 융합 전 HA의 순수한 조제물보다 덜 광범위하게 융합 후 HA의 순수한 조제물과 교차결합하는 것이 가능하다 (ELISA 포맷의 형태의 유사한 검출에도 불구하고).
백신 제조물에서, 더 작거나 더 큰 비율의 변성되거나, 손상되거나, 또는 융합 후 HA가 고유하고 온전한 융합 전 HA와 함께 존재할 것으로 예상된다. 발명자들의 실험에서, SRID는 고유한 HA와 혼합될 때 저 pH 스트레스트 HA를 검출하지만, 검정은 저 pH 스트레스트 HA 단독을 검출할 수 없다. 이 관찰을 많은 균주의 HA로 재현하였다. 대안의 형광 신호로 비-스트레스트 및 저 pH-스트레스트 HA의 차등적 라벨링는 저 pH 스트레스트, 융합 후 HA가 고유한 융합 전 HA와의 혼합된 면역침강 고리를 형성한다는 것을 나타냈으며, HA의 두 종이 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연관성이 있다는 것을 제안한다. 양 항혈청은 ELISA에서 두 가지 형태의 HA에 똑같이 결합하고, 그것들은 또한 분명히 HA 이형태체 둘 다와 교차결합하고 SRID에서 검출 가능한 3원 복합체를 형성할 수 있다. 혼합된 고리는 쿠마시 염색 이후 순수한 융합 전 고리보다 덜 뚜렷하며, 아마도 양 항혈청에 의해 HA 혼합물의 손상된 교차결합을 반영한다. 그럼에도 불구하고, 복합체에서 HA 농도가 높을수록, 고유한 HA 및 항혈청 단독에 의해 형성된 것들보다 더 큰 고리 크기가 생성되며, 면역학적 활성 HA 함량의 과다추정을 초래한다.
고유한 조건 하에서, 트립신은 저 pH, 높아진 온도 및 탈아미드화에 의해 영향을 받아 HA를 선택적으로 분해한다 (Wen, Han et al. 2015). 면역학적 비활성 HA를 제거함으로써, 트립신 분해는 HA를 변성시키는 효율적이고 정확한 생물물리학적 HA 정량화 기술 전의 전처리로서 사용될 수 있으며, 검정에 입체구조적 민감도를 추가한다. 본원에서, 발명자들은 트립신 전처리가 확대되고, 혼합된 SRID 고리를 고유한 HA 단독의 농도에 상응하는 크기로 되돌렸다는 것을 보여주었다. 융합 후 HA에 대한 형광 신호는 SRID에서 검출 불가능하였고 트립신의 혼합물에 의해 형성된 고리는 낮은 pH-스트레스트 및 비-스트레스트 HA를 분해하였으며, 분해는 검출 가능한 3원 면역침강 고리를 형성할 수 있는 융합 후 HA를 제거한다는 것을 제안한다. SRID는 인플루엔자 백신 효능의 정량화에 대하여 WHO 및 국제 규제기관에 의해 공식적으로 승인되고 HA 정량화에 대한 "금 표준"으로서 인플루엔자 백신 제조사에 의해 광범위하게 사용된다. 실제로, HA 정량화에서 SRID를 일치시켜야 할 필요성은 잠재적으로 더 정확하고, 정밀하고, 효율적인 인플루엔자 백신 효능 검정의 도입에 대한 장벽이다. 발명자들은 본원에서 SRID가 면역학적 활성 HA가 융합 후 HA와 혼합될 때 면역학적 활성 HA를 체계적으로 과다추정한다는 것을 보여주었다. 트립신 전처리가 각 균주 변화에 대한 양 항혈청의 생성을 필요로 하지 않는 생물물리학적 HA 정량화 검정에서 입체구조적 선택성을 부여할 수 있는 것처럼, 트립신 전처리는 또한 SRID에 의한 면역학적 활성의 과다추정을 교정할 수 있다. 이 교정은 SRID에 의한 백신 제형화 및 방출을 개선할 수 있고 또한 어울리는 더 "순수한 금" 표준을 제공함으로써 더 개선된 효능 검정의 도입을 용이하게 할 수 있다.
방법
인플루엔자 참조 시약
A/California/07/2009 (H1N1), A/Texas/50/2012 (H3N2), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Massachusetts/02/2012 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 양 다클론성 참조 항혈청 및 보정된 참조 항원을 미국 식품의약국의 생물제제 평가 및 연구 센터 (FDA CBER, Silver Spring, MD) 및 국립 생물 표준 통제 연구원 (NIBSC, London, UK)에 의해 제공받았다.
인플루엔자 백신
A/California/07/2009 (H1N1), A/Texas/50/2012 (H3N2), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Massachusetts/02/2012 및 B/Brisbane/60/2008 모노벌크 (서브유닛 백신 항원의 블렌딩되지 않은(unblended) 제품군)를 Novartis Vaccines에 의해 생산하였다. 난-생산된 모노벌크를 예비 또는 조작 배치로부터 Agrippal® 서브유닛 인플루엔자 백신 가공에 의해 배양된 계란으로부터 생산하였다.
저 pH에 의한 샘플 스트레스
인플루엔자 모노벌크를 pH 4.0에서 실온에서 30분 동안 50 mM 시트레이트로 처리하였다. pH 8.5에서 1 M Tris를 10% (부피/부피)만큼 추가하여 pH를 7.2로 중화하였다. 샘플을 분석할 때까지 4℃에서 저장하였다.
트립신 분해
샘플을 PBS 중의 트립신 (50 U/100 μg HA, Sigma, St. Louis, MO)과 함께 37℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 0.1 mM N-α-토실-L-리시닐-클로로메틸케톤 (TLCK; Sigma)을 추가하여 트립신 분해를 중단시켰다. 샘플을 분석할 때까지 4℃에서 저장하였다.
SDS-PAGE, RP- HPLC , ELISA 및 SRID
SDS-PAGE, RP-HPLC 및 SRID는 (Wen, Han et al. 2015)에서 기술되어 있다. 직접적 ELISA를 위해, 플레이트를 실온에서 PBS 중의 1 μg/ml A/Texas/50/2012 (H3N2) HA로 밤새도록 코팅하였고 PBS 중의 0.05% Tween-20 (PBST)로 네 번 세척하였고 PBS 중의 1% BSA (PBSB)로 60분 동안 차단하였다. 그 다음에 PBSB에서 양 혈청의 단계 희석액을 플레이트 상에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 네 번 세척하였고 캡쳐된 IgG를 홀스 래디쉬(horse radish) 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-양 IgG (Invitrogen)로 60분 동안 검출한 후 이어서, PBST로 네 번 세척하였고 테트라메틸벤지딘 기질과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Infinite M200 NanoQuant (Tecan)로 판독하였다.
면역원성 연구
8 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Labs, Wilmington, MA, USA)를 제0 일 및 제21 일에 후방 사두근에 0.1 μg의 HA로의 양측 50 μl 근육 내 주사에 의해 면역화하였다 (10마리의 마우스/군). 혈청 샘플을 제20 일에 안구 뒤 부비강 채혈에 의해 및 제42 일에 안락사한 동물의 흡출(bleed-out)로부터 얻었다. 모든 연구는 Novartis Institutes for Biomedical Research Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
혈청학적 분석
혈청 샘플을 HI 및 인플루엔자 미세중화 검정에 의해 중화 항체에 대하여 테스트하였다.
HI에 대하여, 수용체 파괴 효소 (RDE)와 함께 56℃에서 30분 동안 열-비활성화된 혈청 샘플을 단계 희석한 다음, 96웰에서 2-8℃에서 60분 동안 A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스와 함께 인큐베이션하였다. 칠면조 적혈구 세포 (Lampire Biological labs)를 추가하였고 각 웰에서 혼합한 다음, 혼합물을 2-8℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다.
미세중화에 대하여, 비활성화된 혈청 샘플을 단계 희석한 다음, 37℃에서 2 시간 동안 A/Texas/50/2012 (H3N2) 바이러스와 함께 인큐베이션하였다. 이 혈청과 바이러스 혼합물을 96-웰 플레이트에서 제조된 MDCK 세포에 추가하였고 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 매우 차가운 1:1 아세톤:메탄올 용액으로 고정하였고, PBSB로 차단하였고, 1차 항-인플루엔자 A 항체 (Millipore)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, Alexa Fluor 488 (Invitrogen)와 컨쥬게이션된 2차 염소 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션 후, 형광 세포를 Immunospot S5 UV Analyzer (CTL)를 사용하여 계수하였다.
HA의 IRDye -라벨링
PBS 중의 HA를 물에 복원된 IRDye 800CW 말레이미드 또는 IRDye 680CT (LI-COR)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 유리 IRDye를 판매사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 Zeba 탈염 스핀 컬럼 (Pierce)에 의해 제거하였다. IRDye를 Odyssey CLx imager (Licor)에 의해 검출하였다.
실시예 7: RP - HPLC 및 SRID 효능 검정 결과와 스트레스 조건의 패널에 노출된 인플루엔자 항원 샘플을 사용한 면역원성 연구 간의 상관관계
본 발명의 인플루엔자 백신 효능 검정은 다양한 스트레스 조건에 노출된 다양한 A 및 B 바이러스 서브타입의 항원을 사용하여 SRID 및 면역원성 연구 (헤마글루티닌 억제 (HI) 검정 및 마이크로중화 (MN) 역가)와의 훌륭한 상관관계를 갖는 결과를 제공할 수 있다.
발명자들은 H3N2 및 H1N1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 균주의 항원을 사용하여 추가의 연구를 수행하였다. 항원 모노벌크를 동일한 군으로 분할한 다음, 이것들 각각을 저 pH (30분 동안 pH 4.0), 동결/해동 (Tris 버퍼 중 5x), 탈아미드화 (37℃에서 24시간 동안 pH 11.0), 및 보텍스 스트레스 (실온에서 30분 동안 보텍스)를 포함한 상이한 스트레스 조건, 또는 스트레스 없음 (대조군)에 노출시켰다. HA 양을, 트립신 전처리가 되든지 되지 않든지, RP-HPLC 및 SRID를 사용하여 각 군의 샘플에서 측정하였다. 발명자들은 트립신 전처리 없이 RP-HPLC에 의해 측정된 상대적 HA 양 (예를 들어, 트립신 전처리 없이, 대조군에 대한 SRID 결과에 비해)은 테스트된 모든 스트레스 조건에 대하여 SRID 결과 (트립신 전처리가 있든 없든)와 상관관계를 갖지 않는다는 것을 발견하였다. 이에 반해, 트립신 전처리된 RP-HPLC에 의해 측정된 상대적 HA 양은, 특히 트립신 전처리와 함께 수행된 SRID에 대하여, SRID 결과와 상관관계가 있다. 예를 들어, 저 pH (매우) 및 탈아미드화 (약간)는 SRID (트립신 처리되든 되지 않든), 및 트립신 전처리된 RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 HA 양을 감소시켰다. 동결/해동 및 보텍스 스트레스는 SRID (트립신 처리되든 되지 않든), 또는 트립신 전처리된 RP-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 HA 양을 크게 감소시키지 않았다.
같은 스트레스트 및 대조군 H3N2 항원 샘플 군의 면역원성을 HI 및 MN 검정을 사용하여 추가로 테스트하였다. 각 군에 대한 항혈청을 제0 일 및 제21 일에 각 군의 항원 (0.1μg HA 용량)을 군 당 8마리의 BALB/c 암컷 마우스에 투여함으로써 제42 일 (2차 면역화 후 3주) 출혈을 사용하여 생성하였다. 그 다음에 항혈청을 HI 및 MN 검정에 사용하였다. 예비 결과들은 HI 및 MN에 의해 측정된 면역원성이 RP-HPLC 및 SRID에 의해 결정된 바와 같이 상대적 HA 양과 상관관계가 있으며, 적어도 저 pH, 동결/해동 및 보텍스 스트레스 군에 대하여 트립신 전처리되었다는 것을 확인하였다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명은 단지 예의 방법에 의해 기술되었고 본 발명의 범위 및 사상 내에서 변형이 이루어질 수도 있다.

Claims (17)

  1. a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계;
    c) 샘플에서 분해된 비활성 HA를 분해되지 않은 면역원성 HA로부터 분리하는 단계;
    d) 분해되지 않은 면역원성 HA를 분석적 단백질 가수분해시켜서 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계;
    e) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 수행하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. a) 면역원성 HA, 비활성 HA, 또는 이것들의 조합을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 하나 이상의 프로테아제에 의해 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계로서, 비활성 HA는 분해되고 면역원성 HA는 분해되지 않은 채로 유지되는 단계;
    c) 분해되지 않은 면역원성 HA 및 분해된 비활성 HA의 혼합물을, 생물학적 단백질 가수분해 동안에 비활성 HA에서 절단될 수 있는 하나 이상의 절단 부위(들)에서 면역원성 HA를 절단할 수 없는 하나 이상의 프로테아제를 사용하는 분석적 단백질 가수분해시켜서, 비활성 HA-유래 펩타이드와 구별 가능한 면역원성 HA-유래 펩타이드(들)을 포함하는 분해된 면역원성 HA의 단편을 제공하도록 하는 단계; 및
    d) 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하기 위해 적어도 하나의 라벨링된 참조 HA 펩타이드의 존재 하에 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)을 수행하는 단계
    를 포함하는 방법.
  3. 샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법으로서,
    a) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계;
    b) 샘플에서 면역원성 HA를 다른 구성요소로부터 분리하는 단계;
    c) 샘플에서 면역원성 HA를 정량화하는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제1 항 또는 제3 항에 있어서, 생물학적 단백질 가수분해는 프로테아제로의 단백질 가수분해를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4 항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 예컨대 트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 HA는 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS)에 의해 정량화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 및 제3 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 HA를 분리하는 단계는 단백질 침전을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7 항에 있어서, 단백질 침전은 유기 용매를 추가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8 항에 있어서, 유기 용매는 아세톤, 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 알콜, 예를 들어 에탄올로 침전된 단백질을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 전체 비리온 인플루엔자 백신, 분할 인플루엔자 백신, 서브유닛 인플루엔자 백신, 및 재조합 인플루엔자 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 샘플은 보조제, 예를 들어 수중유 에멀젼 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항, 제2 항 및 제6 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, LC-ESI-MS는 동위원소 희석 질량 분석법 (IDMS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 라벨링된 참조 HA 펩타이드는 동위원소 라벨을 포함하며, 예를 들어, 동위원소 라벨은 15N 및 13C로 구성된 목록으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 샘플에서 면역원성 인플루엔자 HA를 정량화하는 방법으로서,
    a) 샘플을 생물학적 단백질 가수분해시키는 단계; 및
    b) SRID 검정에 의해 (a)의 샘플에서 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서,
    a) 인플루엔자 HA를 포함하는 벌크 조제물로부터 샘플을 제공하는 단계;
    b) 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 면역원성 HA의 양을 정량화하는 단계,
    c) 샘플에서 면역원성 HA의 양에 따라 벌크 조제물의 단일 투약 형태를 포장하는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서,
    a) 제1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 벌크 백신에서 HA의 양을 정량화하는 단계; 및
    b) 벌크로부터 백신을 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.






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