EA015271B1 - Противогриппозные вакцины, содержащие гемагглютинин и белки матрикса - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа. Они могут быть из вирусов гриппа, выращенных в клеточной культуре, а не в яйцах. Белок матрикса может быть фрагментом полноразмерного вирусного белка матрикса, например фрагментом M1 матрикса с молекулярной массой менее 20 кДа. Композиция может быть субъединичной вакциной, содержащей очищенные поверхностные гликопротеины.

Description

Данное изобретение относится к вакцинам для защиты от инфекции вируса гриппа, особенно к вакцинам, включающим белки матрикса.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время доступны различные формы противогриппозной вакцины (например, см. главы 17 и 18 ссылки [1]). Вакцины обычно основаны либо на живом вирусе, либо на инактивированном вирусе. Инактивированные вакцины могут основываться на целых вирионах, расщепленных вирионах либо на очищенных поверхностных антигенах.

Гемагглютинин (НА) является главным иммуногеном в инактивированных противогриппозных вакцинах, и дозы вакцин стандартизованы по уровням НА, обычно определяемым методом одиночной радиальной иммунодиффузии (8Κ.ΙΌ). Современные вакцины обычно содержат около 15 мкг НА на штамм на дозу. В добавление к содержанию НА гриппа вакцины могут включать другие белки вируса гриппа. Например, все современные вакцины включают нейраминидазу (ΝΑ). В ссылке [2] доложено, что европейские противогриппозные вакцины также могут включать значительные количества других белков вируса гриппа. Например, белок матрикса (М) был обнаружен в субъединичных вакцинах, но не в вакцинах очищенных поверхностных антигенов.

В добавление к антигенам вируса гриппа ссылка [2] сообщает, что вакцины также содержат белки из яйца, такие как яичный альбумин. Эти белки появились, поскольку стандартный способ выращивания вируса гриппа в производстве вакцин применяет куриные яйца с зародышем, причем вирус очищается от содержимого яйца (аллантоисной жидкости).

Раскрытие изобретения

Вместо применения яиц для выращивания вирусов в производстве вакцин было предложено выращивать вирусы в клеточной культуре. При исследовании этого метода изобретатели неожиданно обнаружили матричные последовательности. В частности, тогда как по ссылке [2] в вакцинах очищенных поверхностных антигенов, полученных из вирионов, выращенных в яйцах, не было обнаружено белков матрикса, изобретатели обнаружили белок матрикса в вакцинах очищенных поверхностных антигенов, полученных из вирионов, выращенных в клеточной культуре.

Таким образом, изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, полученные из вирусов, выращенных в клеточной культуре.

Изобретение также обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, при этом композиция не содержит яичный альбумин. Композиция может также не содержать другие яичные белки (например, овомукоид) и ДНК цыпленка.

Изобретение также обеспечивает способ получения иммуногенной композиции, предусматривающий следующие стадии:

(ί) выращивание вируса гриппа в клеточной культуре;

(й) получение антигенной композиции из вирусов, выращенных на стадии (1), где антигенная композиция содержит гемагглютинин и белки матрикса; и (ΐϊϊ) комбинирование антигенной композиции с фармацевтическим носителем для получения иммуногенной композиции.

Определенным белком матрикса, который был обнаружен, является фрагмент М1. Полноразмерный белок М1 - это белок 27,8 кДа, но обнаруженный фрагмент имеет молекулярную массу около 5 кДа на низкомолекулярном 8Э8-РАОЕ геле (см. ниже). Он включает высококонсервативную аминокислотную последовательность Б8У8ХСАБА (8ЕО ΙΌ N0: 1), где X - это А или Т. Следовательно, изобретение обеспечивает иммуногенный состав, содержащий гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где белок матрикса имеет молекулярную массу менее 20 кДа и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичности (например, по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95% или более) 8ЕО ΙΌ N0: 1. Другой обнаруженный фрагмент М1 длиной около 75 аминокислот не содержит Ν-концевой метионин целой последовательности М1 (например, он имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 28 или 8Е0 ΙΌ N0: 29). Следовательно, изобретение обеспечивает иммуногенный состав, содержащий гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где белок матрикса - это белок М1, не содержащий ^концевой метионин природной последовательности М1. Белок матрикса может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичности (например, по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95% или более) 8Е0 ΙΌ N0: 28 или 8Е0 ΙΌ N0: 29. В добавление к отсутствию ^концевого метионина фрагмент может не содержать одну или более аминокислот ниже ^концевого метионина.

Несмотря на то что эти композиции предпочтительно получают из вируса, выращенного на клеточной культуре, их также альтернативно можно получать другими способами, например с помощью добавления белка матрикса к вакцине, полученной из яйца, с использованием протокола очистки для вирионов, полученных из яйца, что приводит к продуцированию и присутствию белка матрикса, с помощью комбинирования белка матрикса с рекомбинантно-экспрессированным НА (и, при необходимости, другими рекомбинантно-экспрессированными белками) и т.д.

- 1 015271

Получение антигенных компонентов

Изобретение не использует антиген в виде целого вириона (^У), т.е. оно не включает вакцины, использующие живой вирус или целый инактивированный вирион. Вместо этого антигены изобретения являются не-\УУ антигенами, такими как субъединичные вирионы или очищенные поверхностные антигены. Композиции изобретения содержат по меньшей мере два антигена вируса гриппа: гемагглютининовый и матричный. Они также могут включать другой(ие) антиген(ы) вируса гриппа, такой как нейраминидаза. Антигены обычно получают из вирионов гриппа (предпочтительно выращенных на клеточной культуре), но в некоторых вариантах осуществления изобретения антигены могут экспрессироваться в рекомбинантном хозяине (например, в клеточной линии насекомых при помощи бакуловирусного вектора) и применяться в очищенном виде [3, 4]. В основном, однако, антигены получают из вирионов.

При получении не-\УУ антигенов из вирионов вирионы могут быть инактивированы. Химические способы инактивации вируса включают обработку эффективным количеством одного или более из следующих агентов: детергенты, формальдегид, β-пропиолактон, метиленовый синий, псорален, карбоксифуллерен (С60), бинарный этиламин, ацетилэтиленимин или их комбинации. Нехимические методы инактивации вирусов известны в этой области, например, такие как УФ-свет или гамма-облучение.

Вирионы могут быть получены из жидкостей, содержащих вирус, различными способами. Например, процесс очистки может включать зональное центрифугирование при помощи раствора линейного градиента сахарозы, который включает детергент для разрушения вирионов. Антигены также могут быть очищены, после необязательного разбавления, путем диафильтрации.

Расщепленные вирионы получают обработкой очищенных вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-Ы-бутилфосфатом, Тритон Х-100, Тритон N101, цетилтриметиламмоний бромидом, Тетдйо1 ΝΡ9 и т.д.) для производства субвирионных составов, включая процесс расщепления твин-эфиром. Способы расщепления вирусов гриппа хорошо известны в этой области, например, см. [5-10]. Расщепление вируса обычно проводится путем разрушения или фрагментирования целого вируса, инфекционного или неинфекционного, разрушающей концентрацией расщепляющего агента. Разрушение приводит к полной или частичной солюбилизации вирусных белков, изменению целостности вируса. Предпочтительными расщепляющими агентами являются неионогенные или ионогенные (например, катионогенные) поверхностно-активные вещества (ПАВ), например алкилгликозиды, алкилтиогликозиды, ацильные сахара, сульфобетаины, бетаины, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, Ν,Ν-диалкилглюкамиды, Несатед, алкилфеноксиполиэтоксиэтанолы, соединения четвертичного аммония, саркозил, СТАВ (цетилтриметиламмонийбромиды), три-Ы-бутилфосфат, цетавлон, соли миристилтриметиламмония, липофектин, липофектамин и ИОТ-МА, октил- или нонилфенокси полиоксиэтанолы (например, Тритон ПАВ, такие как Тритон Х-100 или Тритон N101), полиоксиэтиленовые сложные эфиры сорбита (Твин ПАВ), простые полиоксиэтиленовые эфиры, сложные полиоксиэтиленовые эфиры и т.д. Одна полезная процедура расщепления использует последовательные эффекты дезоксихолата натрия и формальдегида, и расщепление может происходить во время первоначальной очистки вириона (например, в растворе градиента плотности сахарозы). Таким образом, процесс расщепления может включать очистку вирионсодержащего материала (для удаления невирионного материала); концентрирование собранных вирионов (например, при помощи метода адсорбции, такого как адсорбция СаНРО₄); отделение целых вирионов из невирионного материала; расщепление вирионов при помощи расщепляющего агента на стадии центрифугирования в градиенте плотности (например, при помощи градиента сахарозы, содержащего расщепляющий агент, такой как дезоксихолат натрия) и затем фильтрацию (например, ультрафильтрацию) для удаления ненужных материалов. Расщепленные вирионы можно с пользой ресуспендировать в забуференном фосфатом натрия изотоническом растворе хлорида натрия. Продукты ВЕОК1УАС™, ЕЬиАШХ™, ΕΕυΖΟΝΕ™ и ЕЬиЗШЕЬИ™ являются расщепленными вакцинами.

Вакцины очищенных поверхностных антигенов содержат гемагглютинин поверхностных антигенов гриппа и обычно также нейраминидазу. Процессы получения этих белков в очищенной форме хорошо известны в этой области. Продукты ЕЬиУ1К1Ы™, АСР1РРАЬ™ и ЮТЬиУАС™ являются субъединичными вакцинами.

Антигены гриппа также могут присутствовать в форме виросом [11] (не содержащие нуклеиновую кислоту вирусоподобные липосомные частицы), как в продуктах ЮТЬЕХАЕ У™ и 1ЫУАУАС™, однако в настоящем изобретении предпочтительно не использовать виросомы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения антиген гриппа не находится в форме виросомы.

Вирус гриппа может быть ослабленным; чувствительным к температуре и адаптированным к холоду. Эти три характеристики являются особенно полезными при использовании живого вируса в качестве антигена.

Штаммы вируса гриппа для использования в вакцинах меняются от сезона к сезону. В настоящий период между пандемиями вакцины обычно включают два штамма гриппа А (Η1Ν1 и Η3Ν2) и один штамм гриппа В, а также типичны трехвалентные вакцины. Изобретение также может использовать НА из пандемичных штаммов (т. е. штаммы, к которым реципиент вакцины и основная человеческая популяция являются иммунологически интактными), такие как штаммы подтипов Н2, Н5, Н7 или Н9 (в частно

- 2 015271 сти, вируса гриппа А), вакцины гриппа для пандемичных штаммов могут быть моновалентными или могут быть основаны на обычной трехвалентной вакцине, дополненной пандемичным штаммом. Однако в зависимости от сезона и природы антигена, включенного в вакцину, изобретение может защищать против одного или более подтипов НА вируса гриппа А - Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16. Изобретение может защищать против одного или более подтипов ΝΑ вируса гриппа А - N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 или N9.

Наряду с тем что составы изобретения полезны для иммунизации против межпандемичных штаммов, они особенно полезны для иммунизации против пандемичных штаммов. Характеристики штамма гриппа, дающие ему потенциал вызывать вспышку пандемии, следующие:

(a) он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютининами в штаммах, циркулирующих в настоящее время в человеке, т.е. штамм, не появлявшийся в человеческой популяции более 10 лет (например, Н2) или вообще ранее не наблюдавшийся в человеческой популяции (например, Н5, Н6 или Н9, которые в основном были обнаружены только в популяциях птиц), так что человеческая популяция будет иммунологически интактна к гемагглютинину штамма;

(b) он способен передаваться горизонтально в человеческой популяции и (c) он является патогенным к человеку.

Вирус с гемагглютинином типа Н5 предпочтителен для иммунизации против пандемичного гриппа, такого как штамм Н5Ш. Другие возможные штаммы включают Н5Н3. Н9№, №N2, Н7Ш и Н7Ю, а также любые другие появляющиеся потенциально пандемичные штаммы. В пределах подтипа Н5 вирус может попасть в таксон НА 1, таксон НА 1', таксон НА 2 или таксон НА 3 [12], причем таксоны 1 и 3 являются особенно значимыми.

Другими штаммами, чьи антигены могут быть с пользой включены в составы, являются штаммы, устойчивые к антивирусной терапии (например, устойчивые к озельтамивиру [13] и/или занамивиру), включая устойчивые пандемичные штаммы [14].

Композиции изобретения могут включать антиген(ы) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В. Одновалентные вакцины не являются предпочтительными, и, если вакцина включает более одного штамма гриппа, различные штаммы обычно выращивают отдельно и смешивают после сбора вирусов и получения антигенов. Таким образом, процесс изобретения может включать стадию смешивания антигенов из более чем одного штамма гриппа. Предпочтительной является трехвалентная вакцина, включающая антигены из двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции могут включать антиген из одного штамма гриппа А. В некоторых вариантах осуществления изобретения составы могут включать антиген из двух штаммов гриппа А при условии, что эти два штамма не являются Н1М и №N2. В некоторых вариантах осуществления изобретения составы могут включать антиген более чем из двух штаммов гриппа А.

Вирус гриппа может быть штаммом реассортантом и может быть получен методами обратной генетики. Методы обратной генетики (например, [15-19]) позволяют получать вирусы гриппа с желаемыми геномными сегментами ίη νίίτο при помощи плазмид. Обычно она включает экспрессию (а) молекул ДНК, кодирующих желаемые вирусные молекулы РНК, например из ροϊΐ промоторов, и (Ь) молекул ДНК, кодирующих вирусные белки, например из ροϊΐΐ промоторов, так что экспрессия обоих типов ДНК в клетке приводит к сборке полностью интактного инфекционного вириона. ДНК предпочтительно обеспечивает все вирусные РНК и белки, но также возможно использование вируса-помощника для обеспечения некоторых РНК и белков. Предпочтительны методы, основанные на плазмидах, с использованием отдельных плазмид для продуцирования каждой вирусной РНК [20-22], и эти методы также включают применение плазмид для экспрессии всех или некоторых (например, только РВ1, РВ2, РА и NΡ белков) вирусных белков, причем в некоторых методах используется 12 плазмид.

Для уменьшения числа необходимых плазмид недавний подход [23] комбинирует множество транскрипционных кассет РНК полимеразы ΐ (для синтеза вирусной РНК) в одной плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 сегментов вирусной РНК гриппа А) и множество белок-кодирующих областей с промоторами РНК-полимеразы ΐΐ на другой плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 мРНК транскрипты гриппа А). Предпочтительные особенности метода ссылки [23] включают:

(a) РВ1, РВ2 и РА мРНК-кодирующие области на одной плазмиде и (b) все 8 сегментов, кодирующих вирусную РНК, на одной плазмиде.

Включение NΑ и НА сегментов в одну плазмиду и шесть других сегментов в другую плазмиду также может способствовать делу.

- 3 015271

В качестве альтернативы использованию промоторов ро11 для кодирования вирусных сегментов РНК возможно использовать промоторы полимеразы бактериофага [24]. Например, могут быть использованы промоторы для 8Р6, Т3 или Т7 полимераз. Вследствие видовой специфичности промоторов ροϊΐ промоторы полимеразы бактериофага могут быть более удобны для многих типов клеток (например, МОСК), хотя клетка также должна быть трансфицирована плазмидой, кодирующей фермент экзогенной полимеразы.

В других методах возможно использовать двойные промоторы ροϊΐ и ροϊΐΐ, чтобы одновременно кодировать вирусные РНК и экспрессируемые мРНК с одной матрицы [25,26].

Таким образом, вирус гриппа А может включать один или более РНК сегментов из вируса А/РЕ/8/34 (обычно 6 сегментов из А/РЕ/8/34, при этом НА и N сегменты из штамма вакцины, т.е. 6:2 реассортант). Он может также включать один или более РНК сегментов из вируса А/\У8Ж33 или из любого другого вирусного штамма, полезного для получения вирусов реассортантов для приготовления вакцины. Обычно изобретение защищает против штамма, способного к передаче от человека к человеку, и, таким образом, геном штамма обычно будет включать по меньшей мере один РНК сегмент, произошедший от вируса гриппа млекопитающих (например, от человека). Он может включать N8 сегмент, произошедший от вируса птичьего гриппа.

Вирусы, используемые как источники антигенов, обычно выращивают в клеточной культуре, но в некоторых вариантах осуществления изобретения они могут выращиваться в яйцах. Стандартный сейчас метод для выращивания вируса гриппа использует специфичные, не содержащие патогенов (8РР) оплодотворенные куриные яйца, причем вирус выделяют из содержимого яйца (аллантоисная жидкость). С недавних пор, однако, вирусы выращивают в культурах животных клеток, и, учитывая скорость и аллергии у пациентов, этот метод выращивания является предпочтительным. Если используется выращивание вируса в яйцах, то в аллантоисную жидкость яйца вместе с вирусом может быть добавлена одна или две аминокислоты [10].

Клеточным субстратом обычно является клеточная линия, происходящая от млекопитающих. Подходящие клетки млекопитающих включают, но не ограничены, клетки хомяков, крупного рогатого скота, приматов (включая человека и обезьян) и клетки собак. Могут быть использованы различные типы клеток, такие как клетки почки, фибробласты, клетки сетчатки, клетки легкого и т.д. Примеры подходящих клеток хомяков - это клеточные линии, имеющие названия ВНК21 или НКСС. Подходящими клетками обезьян являются, например, клетки африканской зеленой мартышки, такие как клетки почки, как в клеточной линии Уего. Подходящими клетками собак являются, например, клетки почки, такие как клеточная линия МОСК. Таким образом, подходящие клеточные линии включают, но не ограничены, МОСК; СНО; 293Т; ВНК; Уего; МЕС-5; РЕЕ.С6; 1-38 и т д. Использование клеток млекопитающих означает, что вакцины не будут содержать куриную ДНК, так же как и яичные белки (такие как яичный альбумин и овомукоид), таким образом снижая аллергенность. Предпочтительные клеточные линии млекопитающих для выращивания вирусов гриппа включают МОСК клетки [27-30], полученные из собачьей почки Мабш-ОагЬу; клетки Уего [31-33], полученные из почки африканской зеленой мартышки (Сегсорййесик аеШюрк); или РЕЕ.С6 клетки [34], полученные от зародышевых ретинобластов человека. Эти клеточные линии широкодоступны, например, из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС) [35], из клеточных репозиториев Сопе11 [36] или из Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС). Например, АТСС поставляет множество различных клеток Уего под каталожными номерами ССЬ-81, ССЬ-81.2, СЕЬ-1586 и СЕЬ-1587, и она поставляет клетки МОСК под каталожным номером ССЬ-34. РЕЕ.С6 доступен от ЕСАСС под депозитным номером 96022940. В качестве менее предпочтительной альтернативы клеточным линиям млекопитающих вирус может выращиваться на клеточных линиях птиц (например, ссылки [37-39]), включая клеточные линии уток (например, сетчатки уток) или кур. Примеры птичьих клеточных культур включают птичьи эмбриональные стволовые клетки [37, 40] и клетки сетчатки уток [38]. Подходящие птичьи эмбриональные стволовые клетки включают клеточную линию ЕВх, полученную из эмбриональных стволовых клеток цыплят, ЕВ45, ЕВ 14 и ЕВ 14-074 [41]. Также могут использоваться эмбриональные фибробласты цыплят.

Наиболее предпочтительными клеточными линиями для выращивания вирусов гриппа являются клеточные линии МОСК. Исходная клеточная линия МОСК доступна от АТСС как ССЬ-34, но также могут использоваться производные этой клеточной линии. Например, в ссылке [27] раскрыта клеточная линия МОСК, адаптированная для роста в суспензионной культуре (МОСК 33016, выложенная как О8М АСС 2219). Похожим образом, в ссылке [42] раскрыта клеточная линия МОСК происхождения, которая растет в суспензии в культуре, не содержащей сыворотку (В-702, депонированная как РЕЕМ ВР-7449). В ссылке [43] раскрыты неканцерогенные МОСК клетки, включая МОСК-8 (АТСС РТА-6500), МОСК-8Р101 (АТСС РТА-6501), МОСК-8Р102 (АТСС РТА-6502) и МОСК-8Р103 (АТСС РТА-6503). В ссылке [44] раскрыты клеточные линии МОСК с высокой подверженностью инфекции, включая МОСК.5Р1 клетки (АТСС СЕЬ-12042). Любые из этих клеточных линий могут быть использованы.

- 4 015271

Культура для клеточного роста, а также вирусный инокулят (посевной материал), используемый для начала роста культуры, предпочтительно не должны содержать (т.е. должны быть протестированы и дать отрицательный результат на заражение) вирус простого герпеса, респираторно-синцитиальный вирус, вирус 3 парагриппа, коронавирус атипичной пневмонии, аденовирус, риновирус, реовирусы, полиомавирусы, бирнавирусы, цирковирусы и/или парвовирусы [45]. Отсутствие вируса простого герпеса особенно предпочтительно.

Вирус может выращиваться на клетках в суспензии [46] или в вязкой культуре. В одном варианте осуществления изобретения клетки могут быть адаптированы для роста в суспензии. Одной из подходящих МОСК клеточных линий, адаптированных для роста в суспензионной культуре, является МОСК 33016 (депонированная как Ό8Μ АСС 2219). В качестве альтернативы может использоваться культура микроносителя.

Клеточные линии, поддерживающие репликацию вируса гриппа, предпочтительно растут в культуральной среде, не содержащей сыворотку и/или белок. Среда называется средой, не содержащей сыворотку, в контексте настоящего изобретения, в которой не содержится добавок из сыворотки человеческого или животного происхождения. Культуры, не содержащие белков, - это культуры, в которых размножение клеток происходит в отсутствие белков, факторов роста, других белковых добавок и несывороточных белков, но при необходимости они могут включать белки, такие как трипсин, и другие протеазы, которые могут быть необходимы для роста вирусов. Клетки, растущие в таких культурах, обычно сами содержат белки.

Клеточные линии, поддерживающие репликацию вируса гриппа, предпочтительно выращиваются ниже 37°С [47] (например, 30-36°С) в течение репликации вируса.

Способ размножения вируса в культуральных клетках в основном включает стадии заражения культуральных клеток штаммом, который нужно культивировать; культивирования инфицированных клеток в течение желаемого периода времени для размножения вируса, такого как, например, при определении по титру вируса или экспрессии антигена (например, между 24 и 168 ч после заражения); и сбора размноженного вируса. Культуральные клетки заражаются вирусом (измеренным РРИ или ТСГО₅₀) до соотношения клеток 1:500-1:1, предпочтительно 1:100-1:5, более предпочтительно 1:50-1:10. Вирус добавляется к суспензии клеток или наносится на монослой клеток, и вирус абсорбируется на клетках в течение по меньшей мере 60 мин, но обычно менее 300 мин, предпочтительно между 90 и 240 мин при 25-40°С, предпочтительно 28-37°С. Инфицированную клеточную культуру (например, монослои) можно удалить либо с помощью замораживания-оттаивания, либо с помощью ферментативного воздействия для увеличения вирусного содержимого полученных культуральных супернатантов. Полученные жидкости затем либо инактивируются, либо хранятся в замороженном виде. Культуральные клетки могут быть заражены при множественности заражения (т.о.1.) около 0,0001-10, предпочтительно 0,002-5, более предпочтительно 0,001-2. Также более предпочтительно, что клетки инфицируются при т.о.1. около 0,01. Инфицированные клетки могут выращиваться в течение 30-40 ч после заражения. Предпочтительно клетки выращиваются в течение 34-48 ч после заражения. Также более предпочтительно клетки выращиваются в течение 38-40 ч после заражения. Протеазы (обычно трипсин) в основном добавляются во время культивирования клеток для обеспечения выхода вируса, и протеазы могут добавляться на любой подходящей стадии во время культивирования.

НА - это главный иммуноген в инактивированных противогриппозных вакцинах в настоящее время, а дозы вакцин стандартизованы по отношению к уровням НА, обычно измеряемым 8Κ.ΙΌ. Существующие вакцины обычно содержат около 15 мкг НА на штамм, хотя более низкие дозы могут использоваться, например, для детей или в случаях пандемии, или при использовании адъюванта. Использовались дробные дозы, такие как ¹/2 (т.е. 7,5 мкг НА на штамм), ¹/4 и ¹/₈ [89, 90],также как и более высокие дозы (например, 3- или 9-кратные дозы [48, 49]). Таким образом, вакцины могут содержать от 0,1 до 150 мкг НА на штамм гриппа, предпочтительно от 0,1 до 50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.д. Определенные дозы включают, например, около 45, около 30, около 15, около 10, около 7,5, около 5, около 3,8, около 1,9, около 1,5 и т.д. на штамм.

Для живых вакцин доза измеряется средней инфекционной дозой в тканевой культуре (ТСГО5₀), а не содержанием НА, причем обычно ТСГО5₀ между 10⁶ и 10⁸ (предпочтительно между 10^6,5-10^7,5) на штамм.

НА, используемый в изобретении, может быть природным НА, обнаруженным в вирусе, или может быть модифицирован. Например, известен способ модификации НА для удаления детерминант (например, гиперосновных областей вокруг сайта расщепления между НА₁ и НА₂), которые делают вирус крайне патогенным среди видов птиц, поскольку эти детерминанты иначе могут предотвратить выращивание вируса в яйцах.

- 5 015271

Белок матрикса

Наряду с гемагглютинином составы изобретения включают белок матрикса. Сегмент 7 вируса гриппа А кодирует полипептиды М1 и М2. М1 лежит под вирусным липидным бислоем, тогда как М2 - это интегральный белок мембраны, обеспечивающий ионный канал, ингибируемый амантадином. М2 экспрессируется из сплайсированной мРНК. Сегмент 7 вируса гриппа В кодирует полипептиды М1 и ВМ2.

Белок матрикса, включенный в составы изобретения, - это обычно М1 белок из вируса гриппа А. Полноразмерная М1 252 аа последовательность из РК./8/34 вируса гриппа А, доступная в базах данных под номером С1: 138817, является 8Е0 ΙΌ N0: 2:

Μ3ΣΣΤΕνΕΤΥνΐι3ΙΙΡ50ΡΣΚΑΕΙΑΰΚΣΕϋνΓΑ6ΚΝΤ0ΣΕνΣΜΕίίΣΚΤΚΡΙΙ.5ΡΣΤΚβΙΣεΡνΕΤΣ ΤνΡΗΕΚεΣΟηΚΗΕνΟΚΑΣΝσΝεΟΡΝΝΜΟΚΆνΚΣΥΚΙΟ,ΚΒΕΙΤΡΗβΑΚΒΙδΣδΥΒΑεΑΙΑδΟΜσΜΥ ЫКМ6АУТТЕ7АЕеЬУСАТСЕ01А032НКЗНЕО№ТТТЫРЫЕНЕНКМУ]^ЗТТАКАМЕОМАС53ЕО ААЕАМЕУА50АЕ0№ЙАМКТ16ТНРЗЗЗАеЪКК0ЬЬЕЫЬрАУ0КВМ6У0М0КЕК

Белок матрикса, включенный в состав изобретения, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность М1 длиной по меньшей мере т аминокислот, где упомянутые т аминокислот имеют по меньшей мере η % идентичности 8ЕС ΙΌ N0: 2; т аминокислот обычно включают фрагмент по меньшей мере из р последовательных аминокислот из 8Е0 ΙΌ N0: 2.

Значение т может быть, например, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более. Значение η может быть, например, 70 (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более). Значение р может быть, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более, где η<100, р<т.

По сравнению с 8ЕО ΙΌ N0: 2 последовательность т аминокислот может включать одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) консервативных аминокислотных замен, т.е. замену одной аминокислоты другой, которая имеет родственную боковую цепь. Генетически кодируемые аминокислоты в основном делятся на 4 семейства:

(1) кислотные, т.е. аспартат, глутамат;

(2) основные, т. е. лизин, аргинин, гистидин;

(3) неполярные, т.е. аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан;

(4) незаряженные полярные, т. е. глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин.

Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют вместе как ароматические аминокислоты. В основном замена единичных аминокислот внутри этих семейств не влияет на биологическую активность; т аминокислот могут также включать одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) единичных делеций относительно 8ЕО ΙΌ N0: 2. т Аминокислот могут также включать одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) инсерций (например, каждой из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно 8ЕО ΙΌ N0: 2.

Предпочтительные матричные белки для включения в составы изобретения содержат эпитоп из М1. Эпитоп может быть эпитопом Т-клеток и/или В-клеток. Эпитопы Т- и В-клеток могут быть идентифицированы эмпирически (например, при помощи РЕР8САN [50, 51] или похожих методов) или они могут быть предсказаны (например, при помощи антигенного индекса Джемесона-Вольфа [52], матричных методов [53], ТЕР1Т0РЕ [54], нейронных сетей [55], 0рйМег и Ер1Мег [56, 57], АЭЕРТ [58], Тз11сз [59], гидрофобности [60], антигенного индекса [61] или способов, раскрытых в ссылке [62], и т.д.). С помощью таких методов эпитопы Т-клеток уже были обнаружены в белке М1 вируса гриппа А, включая следующие [63]:

МНС	Последовательность	8Е0ГО	Ссылка
НЬА-А*0201	егьсгурть	3	64
НЬА-А*0201	ГЬСГУЕТЬТУ	4	64
П1А-А*1101	ЗПРЗСРЬК	5	65
Н-2КЬ	мсыужм	6	бб
НЬА-В*3501	АЗСМЕЫУ	7	67
1ГЕА-СЛУ*0102	1ЬЗРЬТКС1	8	68
НЬА-С97*0102	1ЬЗРЬТКС1Ь	9	68
НЬАОСМ		10	69
НЬА-Осул'З	ΕΕΝΓΟΑΪβΚΗ	11	69
НСА-1ЖВ1*0101	СРЬКАЕГАОКЬЕ	12	70
8аое-О*02	ЙКЬКВЕГГЕ	13	71
8аое-С*04	ЕКЬККЕГТГН	14	71

Другие эпитопы Т-клеток в М1 включают 8ЬЬТЕУЕТ¥У (8Е0 ΙΌ N0: 15; остатки 2-11 8ЕС ΙΌ N0: 2); 11Р8ОРЬК (8ЕС ΙΌ N0: 16; остатки 14-21 8ЕЕ) ΙΌ N0: 2) и ЕЕЭСЕАОК (8ЕЕ) ΙΌ N0: 17; остатки 28-35 8Е0 ΙΌ N0: 2).

- 6 015271

Определенный белок матрикса, который был первым обнаружен в вакцинах, полученных в клеточных культурах, - это белок 5 кДа с Ν-концевой последовательностью ЕКЬ^У^ЛбЛЬА (8ЕО ГО N0: 18; остатки 114-125 8Е0 ГО N0: 2). Ν-концевой остаток и размер этого полипептида соответствуют тому, что он является трипсиновым фрагментом М1, и в этих случаях полный полипептид может иметь одну из следующих аминокислотных последовательностей:

ЗЕ2 Ю НО: 19 - ΕΙΕβΞΥΕΆΟΑΙΑΒΟΜΗΤΥΝΚΜΕΑνΤΤΕνΑΡΌΓνΟΑΤΟΕΟΙ.ΑΟβζϊΗΚΕΗΚ

ΒΕ2 ΪΏ ΝΟ: 20 - ΕΙ3ΕΞУЗАСАЬАЗСМЕЫУМКМСА\ГГТЕУАЕЕЬУСАТСЕ01А030НЦ

8Е0 ГО N0: 19 включает полный мотив Су8-Су8-Нщ-Нщ (остатки 148-162 8Е0 ГО N0: 2), которые могут дать сродство к цинку [72]. Таким образом, белок, используемый в изобретении, может дополнительно включать ион цинка.

Последовательность 8Е0 ГО N0: 18 включает последовательность Ε8Υ8Χ6ΑΕΑ (8Е0 ГО N0: 1), которая является очень консервативной среди штаммов вируса гриппа А, причем 5-й остаток X - это либо Тйг (Ε8Υ8Τ6ΑΕΑ. 8ЕО ΙΌ N0: 21), либо А1а (Ε8Υ8Α6ΑΕΑ, 8ЕО ГО N0: 22). Известны варианты этого консервативного 9-мера [например, в А/8\\ шс/Оп1апо/01911-2//99 (Η4Ν6) 9-мер - это ЕНТ8Т6АЬА (61: 10442678; 8Е0 ГО N0: 23), а в А/8\¥ше/Епд1апс1/191973/92 (Η1Ν7) - это ЬОУЗТОАЬА _(С1: 1835734; 8Εζ) ГО N0: 24), в А/СЫскеп/Репп8укаша/13609/93 (Η5Ν2) - Ε8Υ8Τ6ΑΕΤ . _{эт0 (С1:} 4584948; 8ЕО ГО N0: 25), в Α/Ψ8N/33 - это Ε8Υ8Α6ΑΕΑ (61:324407; 8ЕО ГО N0: 26)], но 8ЕО ГО N0: 1 является наиболее распространенной последовательностью. Ядро Υ8Χ6ΑΕ (8Е0 ГО N0: 27) встречается во всех этих последовательностях. Последовательности в вирусах гриппа могут быть для удобства помещены в базу данных последовательностей гриппа (Ι8Ό) на \ν\ν\ν.Πιι.1;·ιη1.§ον [73]. Другие последовательности могут быть обнаружены в ссылке [74].

Таким образом, предпочтительные белки матрикса, включенные в составы изобретения, включают одну или более из аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и/или 27. Несмотря на то что полноразмерный белок М1 является белком 27,8 кДа, белки матрикса, включенные в композиции изобретения, имеют молекулярную массу <20 кДа, например не более 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5,5 или около 5 кДа. Молекулярная масса белка матрикса предпочтительно находится в пределах 2-8 кДа, например 3-7 кДа, 4-6 кДа или около5 кДа. №конец белка матрикса может быть 61и-11е-8ег, за которым следует одна из аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 19, 20, 21, 22, 23 и/или 24.

Белок матрикса может образовывать олигомеры (например, димеры, такие как гомодимеры) внутри композиции.

Если матричный белок включает аминокислоту 137 (пронумерованную как в 8Е0 ГО N0: 2), то эта аминокислота может быть Αία (как в 8Е0 ГО N0: 2) или Т1п (как в патогенных человеческих вирусах Η5Μ).

Белок матрикса может присутствовать в различных количествах, но обычно в количестве от 1 до 15 мкг/мл, например между 2-14 мкг/мл, между 3-13 мкг/мл, между 4-12 мкг/мл, между 5-11 мкг/мл, между 6-10 мкг/мл, между 7-9 мкг/мл и т.д. Концентрации менее 1 мкг/мл также возможны.

При включении этих белков матрикса в добавление к гемагглютинину композиции изобретения выигрывают от любых присутствующих эпитопов Т-клеток, что может улучшить перекрестную защиту (внутри одного типа ΗΑ, а также между разными типами ΗΑ), обеспеченную вакциной [75]. Белки матрикса могут присутствовать эндогенно вследствие приготовления композиции (например, он может очиститься вместе с ΗΑ) или они могут быть добавлены как экзогенные компоненты, например, для улучшения вакцин, которые не содержат матричной компоненты, включая вакцины из яйца.

Не желая быть связанными теорией, исследователи полагают, что белок матрикса может связываться с ΗΑ в вакцине, образуя стабильный комплекс. Если комплекс более стабилен, чем сам ΗΑ, то может быть увеличен срок хранения вакцины и, в частности, ее способность выдерживать хранение вне холодильника.

Область вокруг 8Е0 ГО N0: 1 в М1 может действовать как липидсвязывающий домен [76]. Следовательно, при включении этой области в белок матрикса белок может преимущественно взаимодействовать с жирными адъювантами, как подробно описано ниже.

Если композиция включает ΗΑ из более чем одного штамма вируса гриппа Α, то он в основном также включает белок матрикса из более чем одного штамма. Несмотря на то что ΗΑ из штаммов обычно отличаются друг от друга, белки матрикса могут быть одинаковыми. Если они идентичны, то в конечном продукте будет невозможно разделить два белка матрикса, но они будут разного происхождения.

Наряду с тем что композиции изобретения включают ΗΑ и матрикс, они также могут включать нейраминидазу и/или нуклеопротеин.

Там, где композиция включает ΗΑ из вируса гриппа В, она может также включать белок М1 из вируса гриппа В.

- 7 015271

ДНК клетки-хозяина

Если вирус выращивали на клеточной культуре, то стандартной практикой является минимизация количества остаточной ДНК клеточной линии в конечной вакцине, для того чтобы минимизировать онкогенную активность ДНК. Эта мера безопасности особенно важна при включении белка матрикса вируса гриппа в вакцину, поскольку белок матрикса может связаться с нуклеиновыми кислотами (включая РНК и двухспиральную ДНК) [77] и, следовательно, может удерживать ДНК более охотно, чем существующие вакцины, основанные на НА.

Следовательно, композиция предпочтительно содержит менее 10 нг (предпочтительно менее 1 нг, а более предпочтительно менее 100 пг) остаточной ДНК клетки-хозяина на дозу, хотя могут присутствовать следовые количества ДНК клетки-хозяина. Предпочтительно, что средняя длина любой остаточной ДНК клетки-хозяина менее 500 пн, например менее 400 пн, менее 300 пн, менее 200 пн, менее 100 пн и т.д. В общем, ДНК клетки-хозяина, которую желательно исключить из композиций изобретения, - это ДНК длиннее 100 пн.

Измерение остаточной ДНК клетки-хозяина является теперь обычным регуляторным требованием для биопрепаратов, и это в пределах возможностей специалиста в данной области техники. Используемый для измерения ДНК-анализ - это обычно достоверный анализ. Рабочие характеристики достоверного анализа могут быть описаны математическими и количественными терминами и его возможные источники ошибок должны быть обнаружены. Анализ в основном должен быть протестирован на характеристики, такие как соответствие, точность, специфичность. Как только анализ откалиброван (например, по известным стандартным количествам ДНК клетки-хозяина) и протестирован, могут проводиться рутинные измерения ДНК. Для количественного определения ДНК могут использоваться три основные методики: методы гибридизации, такие как саузерн-блоттинг или слот-блоттинг [80]; методы иммунологического анализа, такие как система ТйтезМб™ [81]; и количественная ПЦР [82]. Эти методы знакомы специалисту в данной области техники, хотя точные характеристики каждого метода могут зависеть от рассматриваемой клетки-хозяина, например выбор проб для гибридизации, выбор праймеров и/или проб для амплификации и т.д. Система Т11гез1ю1б™ от Мо1еси1аг Эеуюез является количественным анализом на пикограммовые уровни общей ДНК и используется для мониторинга уровней загрязняющей ДНК в биофармацевтических препаратах [81]. Типичный анализ включает неспецифичное к последовательности образование реакционного комплекса между биотинилированным оцДНК-связывающим белком, антиоцДНК-антителом, конъюгированным с уреазой, и ДНК. Все компоненты анализа включены в полный набор для анализа общей ДНК, поставляемый производителем. Различные коммерческие производители предлагают количественные ПЦР анализы для определения остаточной ДНК клетки-хозяина, например АррТес™ ЬаЬотаГоту §ету1се8, ВюКейапсе™, АДйеа Тес1шо1ощез и т.д. Сравнение метода хемилюминесцентной гибридизации с системой Т11гез1ю1б™ общей ДНК для измерения загрязнения вирусной вакцины человека ДНК клетки-хозяина может быть обнаружено в ссылке [83].

Загрязняющая ДНК может быть удалена во время приготовления вакцины при помощи стандартных процедур очистки, например хроматографии и т.д. Удаление остаточной ДНК клетки-хозяина может быть улучшено обработкой нуклеазой, например, при помощи ДНКазы. Удобный метод снижения загрязнения ДНК клетки-хозяина, раскрытый в ссылках [84] и [85], включает двухстадийную обработку сначала при помощи ДНКазы (например, бензоназы), которая может применяться во время роста вируса, а затем при помощи катионного детергента (например, СТАВ), который может применяться во время разрушения вириона. Также для удаления ДНК клетки-хозяина может использоваться обработка алкилирующим агентом, таким как β-пропиолактон, который также преимущественно может использоваться для инактивации вирионов [86].

Вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 15 мкг гемагглютинина, являются предпочтительными, так же как и вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 0,25 мл объема. Вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 50 мкг гемагглютинина, являются более предпочтительными, так же как и вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 0,5 мл объема.

Адъюванты

Составы изобретения могут преимущественно включать адъювант, который может действовать для усиления иммунных ответов (гуморальных и/или клеточных), вызванных у пациента, получающего композицию. Использование адъювантов в противогриппозных вакцинах было описано ранее. В ссылках [87] и [88] использовали гидроксид алюминия, а в ссылке [89] - смесь гидроксида алюминия и фосфата алюминия. Ссылка [90] также описывает использование адъювантов на основе солей алюминия. Продукт ЕЬиАО™ от СЫтоп Уассшез включает водно-масляную эмульсию.

Адъюванты, которые можно использовать в изобретении, включают, но не ограничены этим.

Композицию, содержащую минеральные вещества, включая соли кальция и алюминия (или их смеси). Соли кальция включают фосфат кальция (например, частицы САР, раскрытые в ссылке [91]). Соли алюминия включают гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.д., причем соли могут быть в любой подходящей форме (например, гелевой, кристаллической, аморфной и т.д.). Предпочтительно адсорбирование на

- 8 015271 этих солях. Композиции, содержащие минеральные вещества, также могут быть в форме частиц соли металла [92]. Адъюванты из солей алюминия более подробно описаны ниже.

Цитокининдуцирующие агенты (см. более детально ниже).

Сапонины (глава 22 ссылки [128]), которые являются гетерологичной группой стероловых гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, обнаруживаемых в коре, листьях, стволах, корнях и даже цветках широкого ряда видов растений. Сапонин из коры дерева Οιιί11;·ιί;·ι каропала Мо1ша хорошо изучен в качестве адъювантов. Также сапонин может быть коммерчески получен из 8шйах огпа1а (сарсапарель), СурюрЫПа рашси1а!а (гипсофила ползучая) и 8аропапа оШааиаШ (мыльнянка лекарственная). Составы с адъювантом сапонина включают очищенные составы, такие как 0821. а также липидные составы, такие как 18СОМ. 0821 коммерчески доступен как 8йши1оп™. Сапониновые композиции очищали при помощи ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. Определенные очищенные фракции были определены при помощи этих методик, включая 087, 0817, 0818, 0821, ОН-А, ОН-В и ОН-С. Предпочтительно сапонин - это 0821. Способ получения 0821 раскрыт в [93]. Составы сапонина могут также содержать стерин, такой как холестерин [94]. Комбинации сапонинов и холестеринов могут использоваться для образования уникальных частиц, названных иммуностимулирующие комплексы (18СОМ) (глава 23 ссылки [128]). 18СОМ обычно также включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Любой известный сапонин может использоваться в 18СОМ. Предпочтительно 18СОМ включает один или более из ОийА, ОНА и ОНС. 18СОМ более подробно описаны в [94-96]. При необходимости, комплексы 18СОМ могут не содержать дополнительный детергент [97]. Обзор разработки адъювантов, основанных на сапонине, можно найти в [98] и [99].

Жирные адъюванты (см. более подробно ниже), включая водно-масляные эмульсии.

Бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины (например, термолабильный энтеротоксин ЬТ Е.со11, холерный токсин СТ или коклюшный токсин РТ) и их обезвреженные производные, такие как мутантные токсины, известные как ЬТ-К63 и БТ-Я72 [100]. Использование обезвреженных АДФрибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в [101], а в качестве парентеральных адъювантов - в [102].

Биоадгезивы и мукоадгезивы, такие как микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [103] или хитозан и его производные [104].

Микрочастицы (т.е. частицы диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, более предпочтительно диаметром от ~200 нм до ~30 мкм или диаметром от ~500 нм до ~10 мкм), образованные из биодеградируемых и нетоксичных материалов (например, поли(а-гидрокси)кислота), полигидроксимасляная кислота, полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон и т. д.), причем предпочтительным является поли(лактид-согликолид), при необходимости обработанный для получения отрицательно заряженной поверхности (например, 8Ό8) или положительно заряженной поверхности (например, катионным детергентом, таким как СТАВ).

Липосомы (главы 13 и 14 ссылки [128]). Примеры составов на основе липосом, подходящих для использования в качестве адъювантов, описаны в [105-107].

Простые полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [108]. Такие составы также включают ПАВ на основе полиоксиэтиленовых сложных эфиров сорбита в комбинации с октоксинолом [109], наряду с ПАВ на основе простых и сложных полиоксиэтиленовых алкилэфиров в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионогенным ПАВ, таким как октоксинол [110]. Предпочтительные простые полиоксиэтиленовые эфиры выбираются из следующей группы: полиоксиэтилен9-лауриловый эфир (лаурет 9),: полиоксиэтилен-9-стеориловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеориловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23лауриловый эфир.

Мурамилпептиды, такие как Ν-ацетилмурамил-Е-треонил-Э-изоглутамин (Шг-МОР), Ν-ацетилнормурамил-Е-аланин-Э-изоглутамин (пог-МЭР), №ацетилглюкозаминил-№ацетилмурамил-Ь-А1а-Оизоглю-Ь-А1а-дипальмитоксипропиламид (ИТР-ОРР, или Тйегашэбе™), Ν-ацетилмурамил-Ь-аланилП-изоглютаминил-Е-аланин-2-(1'-2'дипальмитоил-8п-глицеро-3-гидроксифосфарилокси)этиламин (МТРРЕ).

Препарат протеосомы белка внешней мембраны, полученный от одной грамотрицательной бактерии в комбинации с липополисахаридным составом, полученным от другой грамотрицательной бактерии, где препараты протеосомы белка внешней мембраны и липополисахарида образуют стабильный нековалентный адъювантный комплекс. Такие комплексы включают ΐνΧ-908, комплекс, содержащий внешнюю мембрану №188епа шешпдйгбщ и липополисахариды. Они использовались в качестве адъювантов для противогриппозных вакцин [111].

Полимер полиоксидония [112, 113] или другое Ν-оксидированное производное полиэтиленпиперазина.

Метилинозин 5'-монофосфат (М1МР) [114].

- 9 015271

Соединение полигидроксилированного пирролизидина [115], такое как соединение, имеющее формулу

СН₂ОН где Я выбирается из группы, содержащей водород, разветвленные или неразветвленные, замещенные или незамещенные, насыщенные или ненасыщенные группы: ацил, алкил (например, циклоалкил), алкенил, алкинил и арил, или его фармацевтически приемлемая соль или производное.

Примеры включают, но не ограничены, казуарин, казуарин-6-а-Б-глюкопираноза, 3-ер1-казуарин, 7-ер1-казуарин, 3,7-ди-ер1-казуарин и т.д.

Лиганд СБ 16. такой как а-гликозилцерамид [116-123] (например, α-галактозилцерамид), фитосфингозинсодержащие α-гликозилцерамиды, ОСН, ΚΚΝ7000 [(28,3§,48)-1-О-(а-Б-галактопиранозил)-2(Н-гексакозаноиламино)-1,3,4-октадеканетриол], ΟΚΟΝΥ-101, 3-О-сульфогалактозилцерамид и т.д.

Гамма-инулин [124] или его производное, такое как алгаммулин.

Эти и другие адъювант-активные вещества обсуждаются более подробно в [128] и [129].

Композиции могут включать два или более упомянутых адъювантов. Например, они могут преимущественно включать как водно-масляную эмульсию, так и цитокининдуцирующий агент, поскольку эта комбинация усиливает цитокинные ответы, вызванные противогриппозными вакцинами, такие как ответ интерферон-γ, причем усиление гораздо выше, чем в случае использования либо эмульсии, либо агента по отдельности.

Антигены и адъюванты в композиции обычно бывают в виде смеси.

Адъюванты на основе водно-масляной эмульсии

Было обнаружено, что водно-масляные эмульсии особенно удобны для применения в качестве адъювантов противогриппозных вакцин. Известно множество таких эмульсий, и они обычно включают по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно ПАВ, причем масло (масла) и ПАВ являются биодеградируемыми (трансформируемыми в ходе обмена веществ) и биосовместимыми. Капли масла в эмульсии в основном имеют диаметр менее 5 мкм, а могут даже иметь субмикронный диаметр, при этом такие маленькие размеры достигаются с помощью микрофлюидизатора для получения стабильных эмульсий. Капли размером менее 220 нм являются предпочтительными, поскольку они могут подвергаться стерилизации фильтрованием.

Изобретение может использоваться с маслами, такими как масла из животного (такого как рыба) или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, как наиболее распространенные, представляют ореховые масла. Может применяться масло жожоба, полученное из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло и т. п. В зерновой группе кукурузное масло является самым доступным, но масла других злаковых, таких как пшеница, овес, рожь, рис, теф, тритикале и т. п., также могут использоваться. Поскольку сложные эфиры 6-10 углеродных жирных кислот и глицерина и 1,2-пропандиола не существуют в маслах из семян, они могут быть получены гидролизом, отделением и этерификацией соответствующих веществ, начиная с ореховых масел и масел из семян. Жиры и масла из молока млекопитающих трансформируются в ходе обмена веществ и, следовательно, могут использоваться в данном изобретении. Процедуры отделения, очистки, омыления и другие способы, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в этой области. Большинство рыб содержит трансформируемые в ходе обмена веществ масла, которые легко восстановить. Например, тресковый печеночный жир, жиры печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, представляют несколько рыбьих жиров, которые здесь можно использовать. Несколько масел с разветвленной цепью синтезированы биохимически в 5-углеродные изопреновые звенья и в основном называются терпеноидами. Жир печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22тетракозагексаен, который особенно предпочтителен здесь. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является предпочтительным маслом. Рыбьи жиры, включая сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников, либо могут быть получены известными в этой области способами. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Могут использоваться смеси масел.

Поверхностно-активные вещества (ПАВ) можно классифицировать по их НЬВ (гидрофильнолипофильный баланс). Предпочтительные ПАВ изобретения имеют НЬВ по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, а более предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может использоваться с ПАВ, включающими, но не ограничивающимися, ПАВ на основе сложных эфиров полиоксиэтилена и сорбита (обычно называются Тетееи), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), продаваемые под торговым наименованием БОМБАХ™, такие как линейные ЕО/РО блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут раз- 10 015271 личаться в количестве повторяющихся этокси(окси-1,2-этандиил) групп, при этом октоксинол-9 (Ττίΐοη Х-100 или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особый интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (ЮЕРАЬ СЕ-630/№-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенол этоксилаты, такие как ТегдйЫ™ № серия; полиоксиэтиленовые жирные эфиры, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как Вгу ПАВ), такие как триэтиленгликоль монолауриловый эфир (Вгу 30); и сложные эфиры сорбита (широко известные как 8ραη), такие как сорбитан триолеат (8ραη 85) и сорбитан монолаурат. Предпочтительны неионогенные ПАВ. Предпочтительными ПАВ для включения в эмульсию являются Тетееп 80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат), 8ραη 85 (сорбитан триолеат), лецитин и Τηΐοη Х-100.

Могут использоваться смеси ПАВ, например смеси Тетееп 80/8ραη 85. Комбинация сложного полиоксиэтиленового эфира сорбита, такого как полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (Тетееп 80), и октоксинола, такого как т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Τηΐοη Х-100), также возможна. Другая полезная комбинация включает лаурет 9 плюс сложный полиоксиэтиленовый эфир сорбита и/или октоксинол.

Предпочтительные количества ПАВ (мас.%): сложные полиоксиэтиленовые эфиры сорбита (такие как Т\уеен 80) 0,01-1%, в частности около 0,1%; октил- или нонилфенокси полиоксиэтанолы (такие как Τηΐοη Х-100 или другие детергенты серии Ττίΐοη) 0,001-0,1%, в частности 0,005-0,02%; полиоксиэтиленовые сложные эфиры (такие как лаурет 9) 0,1-20%, предпочтительно 0,1-10%, в частности 0,1-1% или около 0,5%.

Специфические адъюванты на основе водно-масляных эмульсий, пригодных в данном изобретении, включают, но не ограничены, следующие.

Субмикронная эмульсия сквалена, Т\уеен 80 и 8ραη 85. Состав эмульсии по объему может быть около 5% сквалена, около 0,5% полисорбата 80 и около 0,5% 8ραη 85. По массе эти соотношения становятся следующими: 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% 8ραη 85. Этот адъювант известен как МЕ59 [125-127] и более подробно описан в главе 10 ссылки [128] и главе 12 ссылки [129]. Эмульсия МЕ59 преимущественно включает цитрат-ионы, например 10 мМ буфера цитрата натрия.

Эмульсия сквалена, токоферола и Т\уеен 80. Эмульсия может включать фосфатный буфер. Она также может включать 8ραη 85 (например, 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Т\уеен 80, а соотношение по массе сквален:токоферол предпочтительно <1, так как это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален и Τуееη 80 могут присутствовать в объемном соотношении около 5:2. Одну из таких эмульсий можно получить растворением Τуееη 80 в РВ8, получая 2% раствор, затем перемешиванием 90 мл этого раствора со смесью (5 мг 1)1. -α-токоферола и 5 мл сквалена), микрофлуидизированием смеси. Результирующая эмульсия может содержать субмикронные масляные капли, например, со средним диаметром между 100 и 250 нм, предпочтительно около 180 нм.

Эмульсия сквалена, токоферола и детергента Ττίΐοη (например, Ττίΐοη Х-100). Эмульсия может также включать 36-МРЬ (см. ниже). Эмульсия может содержать фосфатный буфер.

Эмульсия, содержащая полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Ττίΐοη (например, Ττίΐοη Х-100) и токоферол (например, α-токоферола сукцинат). Эмульсия может включать эти три компонента в массовом соотношении около 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Ττίΐοη Х-100 и 100 мкг/мл α-токоферола сукцината), и эти концентрации должны включать любой вклад этих компонентов от антигенов. Эмульсия также может включать сквален. Эмульсия может также включать 36-МРЬ (см. ниже). Водная фаза может содержать фосфатный буфер.

Эмульсия сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 (Р1игошс™ Ь121). Эмульсия может быть приготовлена в фосфатном буфере, ρН 7,4. Эта эмульсия является удобным средством доставки мурамилдипептидов и используется с треонил-МЭР в адъюванте 8АЕ-1 [130] (0,05-1% Тйг-МЭР, 5% сквалана, 2,5% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Она также может использоваться без Тйг-МЭР, как в адъюванте АЕ [131] (5% сквалана, 1,25% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Предпочтительна микрофлюидизация.

Эмульсия, содержащая 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионогенного поверхностно-активного вещества. Как описано в [132], предпочтительные фосфолипидные компоненты - это фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Субмикронные размеры капель являются предпочтительными.

Субмикронная водно-масляная эмульсия нетрансформируемого при обмене веществ масла (такого как светлое минеральное масло) и по меньшей мере одного ПАВ (такого как лецитин, Τуееη 80 или 8ραη 80). Могут быть включены добавки, такие как 0ш1А сапонин, холестерин, конъюгат сапонинлипофил (такой как СР1-0100, описанный в [133], полученный присоединением алифатического амина к дезацилсапонину посредством карбоксильной группы глюкуроновой кислоты), диметилдиоктадециламмоний бромид и/или ^№диоктадецил-^№бис-(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

Эмульсия, в которой сапонин (например, 0ш1А или 0821) и стерин (например, холестерин) связаны как спиральные мицеллы [134].

- 11 015271

Эмульсии могут быть смешаны с антигеном непосредственно в момент доставки. Следовательно, адъювант и антиген могут храниться отдельно в упакованной или распределенной вакцине, готовой к конечному смешению в момент использования. Антиген в основном будет находиться в водной форме, так чтобы конечное приготовление вакцины заключалось в смешивании двух жидкостей. Объемное соотношение двух жидкостей для смешивания может различаться (например, между 5:1 и 1:5), но в основном около 1:1.

После того как антиген и адъювант смешаны, гемагглютининовый антиген в основном остается в водном растворе, но может распределиться на границе раздела фаз вода/масло. В основном очень небольшое количество гемагглютинина попадает в жировую фазу эмульсии, если вообще попадает. Если композиция включает токоферол, любой из α, β, γ, δ, ε или ξ токоферолов может использоваться, но α-токоферолы являются предпочтительными. Токоферол может принимать несколько форм, например различные соли и/или изомеры. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.д. И Ό-α-токоферол, и ЭЬ-а-токоферол могут использоваться. Токоферолы преимущественно включают в вакцины для использования у пожилых пациентов (например, 60 лет и более), поскольку сообщалось, что витамин Е имеет положительное влияние на иммунный ответ у этой группы пациентов [135] . Они также имеют антиоксидантные свойства, которые могут помочь в стабилизации эмульсий [136] . Предпочтительным α-токоферолом является ЭЬ-а-токоферол, а предпочтительной солью этого токоферола является сукцинат. Было обнаружено, что сукцинатная соль взаимодействует с ΤΝΡсвязанными лигандами ίη νίνο. Более того, известно, что сукцинат α-токоферола совместим с противогриппозными вакцинами и является пригодным консервантом как альтернатива соединениям ртути [9].

Цитокин-индуцирующие агенты

Цитокин-индуцирующие агенты для включения в композиции изобретения способны при введении пациенту заставлять иммунную систему высвобождать цитокины, включая интерфероны и интерлейкины. Известно, что цитокиновые ответы включены в ранние и решающие стадии защиты хозяина против инфекции гриппа [137]. Предпочтительные агенты могут вызывать высвобождение одного или более из: интерферон-γ; интерлейкин-1; интерлейкин-2; интерлейкин-12; ΤΝΡ-α; ΤΝΡ-β и ОМ-С8Б. Предпочтительные агенты вызывают высвобождение цитокинов, связанных с иммунным ответом ΤΜ-типа, например интерферон-γ, ΤΝΡ-α, интерлейкин-2. Предпочтительно стимулирование как интерферона-γ, так и интерлейкина-2.

Следовательно, в результате получения композиции изобретения пациент будет иметь Τ-клетки, которые при стимулировании антигеном гриппа будут высвобождать желаемый(ые) цитокин(ы) в антигенспецифичной манере. Например, Τ-клетки, очищенные от своей крови, будут высвобождать γ-интерферон при воздействии ίη νίΐΓο гемагглютинина вируса гриппа. Методы для измерения таких ответов в мононуклеарах периферийной крови (РВМС) известны в этой области и включают ЕЫ8Л, ΕΕΙ8ΡΟΤ, поточную цитометрию и ПЦР в режиме реального времени. Например, в ссылке [138] говорится об исследовании, в котором отслеживались антигенспецифичные иммунные ответы, опосредованные Τ-клетками, против столбнячного токсоида, в частности ответы γ-интерферона. Было обнаружено, что ΕΜδΡΟΤ является наиболее чувствительным методом для выделения антигенспецифичных ΤΤ-индуцированных ответов из спонтанных ответов, но что определение цитокинов внутри цитоплазмы с помощью поточной цитометрии является наиболее эффективным способом детекции рестимулирующих эффектов.

Подходящие цитокин-индуцирующие агенты включают, но не ограничены, следующие.

Иммуностимулирующий олигонуклеотид, такой как олигонуклеотид, содержащий СрО мотив (последовательность из двух нуклеотидов, содержащая неметилированный цитозин, соединенный посредством фосфатной связи с гуанозином), или двухспиральная РНК, или олигонуклеотид, содержащий палиндромную последовательность, или олигонуклеотид, содержащий поли(бО) последовательность.

3-О-дезацилированный монофосфорил липид А (3бМРЬ, также известный как МРЬ™) [139-142].

Соединение имидазохинолина, такое как имиквимод (П-837) [143, 144], резиквимод (Н-848) [145] и их аналоги; и их соли (например, гидрохлориды). Другие подробности об иммуностимулирующих имидазохинолинах можно обнаружить в ссылках [146-150].

Соединение тиосемикарбазона, такое как соединения, приведенные в ссылке [151]. Методы получения, производства и скрининга активных соединений также описаны в ссылке [151]. Тиосемикарбазоны особенно эффективны в стимулировании человеческих мононуклеаров периферийной крови на продуцирование цитокинов, таких как ΤΝΡ-α.

Соединение триптантрина, такое как соединения, приведенные в ссылке [152]. Методы получения, производства и скрининга активных соединений также описаны в ссылке [152]. Тиосемикарбазоны особенно эффективны в стимулировании человеческих мононуклеаров периферийной крови на продуцирование цитокинов, таких как ΤΝΡ-α.

- 12 015271

Аналог нуклеозидов, такой как:

(а) изаторабин (ΑΝΑ-245, 7-тиа-8-оксогуанозин)

о о и его пролекарства;

(b) ΑΝΑ975;

(c) ΑΝΑ-025-1;

(б) ΑΝΑ380;

(е) соединения, приведенные в ссылках [153-155]; (ί) соединение, имеющее формулу

«3 где В₁ и К₂, каждый независимо, означают Н, галоген, -ΝΚ.,,Κ.|_:ι. -ОН, С_1-6алкокси, замещенный С_1-6алкокси, гетероциклил, замещенный гетероциклил, С_6-10арил, замещенный С_6-10арил, С_1-6алкил или замещенный С_1-6алкил;

К₃ отсутствует или означает Н, С_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил, С_6-10арил, замещенный С_6-10арил, гетероциклил или замещенный гетероциклил;

В₄ и К₅, каждый независимо, означают Н, галоген, гетероциклил, замещенный гетероциклил, -С(О)-В_б, С_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил либо связаны вместе, образуя 5-членное кольцо, как в К_4-5:

связывание идет по связям, обозначенным ~—;

Х₁ и Х₂, каждый независимо, означают Ν, С, О или 8;

К.₈ означает Н, галоген, -ОН, С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкинил, -ОН, -ΝΚ_ΗΚ_|1, -(СН₂)_П-О-К_с, -О-С1_-6алкил), -8(О)_Р-К_е или -С(О)-К_б;

К.₉ означает Н, С1_-6алкил, замещенный С1_-6алкил, гетероциклил, замещенный гетероциклил или К_9а, где К_9а означает

связывание идет по связи, обозначенной —~;

Κι₀ и К_п, каждый независимо, означают Н, галоген, С_1-6алкокси, замещенный С_1-6алкокси, -ΝΚ,,Κ, или -ОН;

каждый из К_а и К_Ь независимо означает Н, галоген, С1_-6алкил, замещенный С1_-6алкил, -С(О)-К_б, С6-10арил;

каждый К_с независимо означает Н, фосфат, дифосфат, трифосфат, С_1-6алкил или замещенный С_1-6алкил;

каждый Κ,,ι независимо означает Н, галоген, С_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил, С_1-6алкокси, замещенный С_1-6алкокси, -ΝΉ₂, -МН(С_1-6алкил), -МН(замещенный С_1-6алкил), -Ы(С_1-6алкил)₂, Ы(замещенный С_1-6алкил)₂, С_6-10арил или гетероциклил;

каждый К_е независимо означает Н, С_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил, С_6-10арил, замещенный С6-10арил, гетероциклил, замещенный гетероциклил;

каждый К_£ независимо означает Н, С_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил, -С(О)-В_б, фосфат, дифосфат, трифосфат;

каждый η независимо означает 0, 1, 2 или 3;

каждый Р независимо означает 0, 1 или 2;

(д) фармацевтически приемлемая соль любого из (а)-(Г), таутомер любого из (а)-(Г) или фармацевти чески приемлемая соль таутомера.

Локсорибин (7-аллил-8-оксогуанозин) [156].

Соединения, приведенные в ссылке [157], включая соединения ацилпиперазина, соединения индолдиона, соединения тетрагидроизохинолина (ТН1О), соединения бензоциклодиона, соединения аминоазавинила, соединения аминобензимидазол хинолина (ΑΒΙ0) [158, 159], соединения гидрофталамида, соединения бензофенона, соединения изоксазола, соединения стерина, соединения хиназилинона, соединения пиррола [160], соединения антрахинона, соединения хиноксалина, соединения триазина, соединения пиразолпиримидина и соединения бензазола [161].

- 13 015271

Соединения, приведенные в ссылке [162].

Производное аминоалкил глюкозаминид фосфата, такое как КС-529 [163, 164].

Фосфазен, такой как поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] (РСРР), как описано, например, в ссылках [165] и [166].

Низкомолекулярные иммунопотенциаторы (8МГР), такие как: №-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №,№-диметил-1 -(2-метилпропил)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-этил-№-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-метил-1-(2-метилпропил)-№-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

1-(2-метилпропил)-№-пропил-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-бутил-1-(2-метилпропил)-№-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-бутил-№-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-метил-1-(2-метилпропил)-№-пентил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-метил-1-(2-метилпропил)-№-проп-2-енил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; 1-(2-метилпропил)-2-[(фенилметил)тио]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин;

1- (2-метилпропил)-2-(пропилтио)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин;

2- [[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этанол; 2-[[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этилацетат; 4-амино-1-(2-метилпропил)-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он;

№-бутил-1-(2-метилпропил)-№,№-бис-(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-бутил-№-метил-1-(2-метилпропил)-№,№-бис-(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4диамин;

№-метил-1-(2-метилпропил)^4,№-бис-(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

№,№-диметил-1-(2-метилпропил)-№,№-бис-(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4диамин;

1-{4-амино-2-[метил(пропил)амино]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил}-2-метилпропан-2-ол; 1-[4-амино-2-(пропиламино)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-1-ил]-2-метилпропан-2-ол;

№,№-дибензил-1-(2-метокси-2-метилпропил)-№-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин.

Цитокин-индуцирующие агенты для использования в настоящем изобретении могут быть модуляторами и/или агонистами То11-подобных рецепторов (ТЕК). Например, они могут быть агонистами одного или более из человеческих белков ТЬК1, ТБК2. ТБК3. ТБК4, ТБК7. ТБК8 и/или ТБК9. Предпочтительные агенты являются агонистами ТБК7 (например, имидазохинолины) и/или ТБК9 (например, СрС олигонуклеотиды). Эти агенты пригодны для активации путей генетически предетерминированного иммунитета.

Цитокин-индуцирующий агент может быть добавлен к композиции на различных стадиях производства. Например, он может быть в композиции антигена, и эта смесь затем может быть добавлена к водно-масляной эмульсии. Альтернативно, он может быть в водно-масляной эмульсии, в этом случае агент может быть добавлен либо к компонентам эмульсии до эмульсификации, либо он может быть добавлен к эмульсии после эмульсификации. Похожим образом, агент может быть в виде коацервата внутри капель эмульсии. Локализация и распределение цитокин-индуцирующего агента в конечном составе будет зависеть от его гидрофильных/липофильных свойств, например агент может находиться в водной фазе, в жировой фазе и/или на поверхности раздела водной и жировой фаз.

Цитокин-индуцирующий агент может быть конъюгирован с отдельным агентом, таким как антиген (например, СКМ197). Общий обзор методов конъюгации низкомолекулярных молекул приведен в ссылке [167]. Альтернативно, адъюванты могут быть нековалентно связаны с дополнительными агентами, например, посредством гидрофобных или ионных взаимодействий.

Два предпочтительных цитокин-индуцирующих агента представляют собой (а) иммуностимулирующие олигонуклеотиды и (Ь) 36МРБ. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут включать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухспиральными или (за исключением РНК) односпиральными. Ссылки [168-170] приводят возможные аналоговые замещения, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-деазагуанозином. Эффект СрС олигонуклеотидов как адъювантов также обсужден в ссылках [171-176]. Последовательность СрС может быть направлена на !ЪК9, например мотив СТССТТ или ТТССТТ [177]. Последовательность СрС может быть специфична к индуцированию Т111 иммунного ответа, как, например, СрС-А 0^N (олигодезоксинуклеотид), или она может быть более специфичной для индуцирования В клеточного ответа, как, например, СрС-В 0ΩΚ СрС-А и СрС-В 0^N обсуждаются в ссылках [178-180]. Предпочтительно СрС представляет собой СрС-А 0ΩΚ Предпочтительно СрС олигонуклеотид сконструирован так, что 5'-конец доступен для узнавания рецептором. При необходимости, две СрС олигонуклеотидные последовательности могут быть соединены своими 3'-концами, образуя иммуномеры. См., например, ссылки [177] и [181-183]. Полезным СрС адъювантом является СрС7909, также известный, как РгоМипе™ (Со1еу Рйаттасеийса1 Сгоир, !пс.).

- 14 015271

Альтернативно или дополнительно к использованию СрС последовательностей могут использоваться ТрС последовательности [184]. Эти олигонуклеотиды могут не содержать неметилированных СрС мотивов.

Иммуностимулирующий олигонуклеотид может быть богатым пиримидинами. Например, он может содержать более одного последовательного тимидинового нуклеотида (например, ТТТТ, описанный в ссылке [184]) и/или он может иметь нуклеотидный состав с >25% тимидина (например, более 35, 40, 50, 60, 80% и т.д.). Например, он может содержать более одного последовательного цитозинового нуклеотида (например, СССС, описанный в ссылке [184]) и/или он может иметь нуклеотидный состав с >25% цитозина (например, более 35, 40, 50, 60, >80% и т.д.). Эти олигонуклеотиды могут не содержать неметилированных СрС мотивов.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут обычно содержать по меньшей мере 20 нуклеотидов. Они могут содержать менее 100 нуклеотидов.

ЗйМРЬ (также известный как 3-де-О-ацилированный монофосфорил липид А или 3-О-дезацил-4'монофосфорил липид А) представляет собой адъювант, у которого 3 положение восстанавливающего концевого глюкозамина в монофосфорил липиде А деацилировано. 3йМРЬ был получен из мутанта 8а1топе11а ттпсюЮ. не содержащего гептозы, и химически близок липиду А, но не содержит кислотолабильной фосфорильной группы и лабильной по отношению к основаниям ацильной группы. Он активирует клетки линии дифференцировки моноцит/макрофаг и стимулирует высвобождение нескольких цитокинов, включая 1Ь-1, 1Б-12, ТИР-α и СМ-С8Р (см. также ссылку [185]). Получение 3йМРЬ первоначально было описано в ссылке [186].

3йМРЬ может принимать форму смеси родственных молекул, различающихся по своему ацилированию (например, имея 3, 4, 5 или 6 ацильных цепей, которые могут быть разной длины). Два глюкозамин (также известный как 2-дезокси-2-аминоглюкоза) моносахарида являются Ν-ацилированными по своим углеродам во 2-м положении (т.е. в положениях 2 и 2'), а также есть Оацилирование в 3' положении. Группа, присоединенная к углероду 2, имеет формулу -ИН-СО-СН₂СК/К¹'. Группа, присоединенная к углероду 2', имеет формулу -ИН-СО-СН2-СК²К²'. Группа, присоединенная к углероду 3', имеет формулу -О-СО-СН2-СК³К³. Типичная структура представляет собой

и¹

Группы К¹, К² и К³, каждая независимо, означают -(СН₂)_п-СН₃. Значение п предпочтительно означает между 8 и 16, более предпочтительно между 9 и 12, а наиболее предпочтительно 10.

Группы К¹', К²' и К³', каждая независимо, могут быть: (а) -Н; (Ь) -ОН или (с) -О-СО-К⁴, где К⁴ - либо -Н, либо -(СН2)т-СН3, где значение т предпочтительно означает между 8 и 16, более предпочтительно 10, 12 или 14. В положении 2 т предпочтительно означает 14. В положении 2' т предпочтительно означает 10. В положении 3' т предпочтительно означает 12. Группы К¹, К² и К³, таким образом, предпочтительно являются -О-ацильными группами додекановой кислоты, тетрадекановой кислоты или гексадекановой кислоты.

Когда все К¹, К² и К³ означают -Н, тогда 3йМРЬ имеет только 3 ацильные цепи (по одной в каждом из положений 2, 2' и 3'). Когда только две из К¹, К² и К³ означают -Н, тогда 3йМРЬ может иметь 4 ацильные цепи. Когда только одна из К¹, К² и К³ означает -Н, тогда 3йМРЬ может иметь 5 ацильных цепей. Когда ни одна из К¹, К² и К³ не означает -Н, тогда 3йМРЬ может иметь 6 ацильных цепей. Адъювант 3йМРЬ, используемый по изобретению, может быть смесью этих форм с 3-6 ацильными цепями, но предпочтительно включать 3йМРЬ с 6 ацильными цепями в смесь и, в частности, гарантировать, что гексаацильная цепь составляет по меньшей мере 10 мас.% от общего 3йМРЬ, например, не менее 20, 30, 40, 50 мас.% или более. Было обнаружено, что 3йМРЬ с 6 ацильными цепями является наиболее активной формой адъюванта.

Таким образом, наиболее предпочтительная форма 3йМРЬ для включения в композиции изобретения имеет формулу (IV), показанную ниже.

Если 3йМРЬ используется в форме смеси, ссылки на количества или концентрации 3йМРЬ в композициях изобретения относятся к комбинации видов 3йМРЬ в смеси.

- 15 015271

В водных условиях ЗбМРЬ может образовывать мицеллярные агрегаты частиц различного размера, например, диаметром <150 нм или >500 нм. Любой из двух или оба вместе могут использоваться в изобретении, а наилучшие частицы могут быть отобраны стандартным методом. Более мелкие частицы (например, достаточно мелкие для получения прозрачной водной суспензии ЗбМРЬ) являются предпочтительными для использования по изобретению вследствие их наибольшей активности [187]. Предпочтительные частицы имеют размер менее 220 нм, более предпочтительные менее 200 нм, или менее 150 нм, или менее 120 нм и даже могут иметь средний диаметр менее 100 нм. Однако в большинстве случаев средний диаметр не будет ниже 50 нм. Эти частицы достаточно мелкие, чтобы подходить для стерилизации фильтрованием. Диаметр частиц можно оценить стандартным методом динамического светорассеяния, который оценивает средний диаметр частиц. Если говорится, что частица имеет диаметр х нм, то имеет место распределение частиц около этой средней величины, но по меньшей мере 50% от количества (например, не менее 60, 70, 80, 90%, или более) частиц имеют диаметр в пределах интервала х±25%.

ЗбМРЬ может преимущественно использоваться в комбинации с водно-масляными эмульсиями. По существу, все три ЗбМРЬ могут находиться в водной фазе эмульсии.

ЗбМРЬ может использоваться самостоятельно или в комбинации с одним или более других соединений. Например, известно об использовании ЗбМРЬ в комбинации с сапонином 0821 [188] (в том числе и в водно-масляной эмульсии [189]), с иммуностимулирующим олигонуклеотидом, одновременно с 0821 и иммуностимулирующим олигонуклеотидом, с фосфатом алюминия [190], с гидроксидом алюминия [191] или одновременно с фосфатом алюминия и гидроксидом алюминия.

Жирные адъюванты, которые могут использоваться с изобретением, включают водно-масляные эмульсии, описанные выше, а также включают, например, следующее.

- 16 015271 как определено в ссылке [192], такие как ЕК 803058, ЕК 803732, ЕК 804053, ЕК 804058, ЕК 804059, ЕК 804442, ЕК 804680, ЕК 804764, ЕК 803022 или ЕК 804057, например:

Производные липида А из ЕбсНспеЫа со11, такие как ОМ-174 (описанные в ссылках [193] и [194]).

Состав катионного липида и (обычно нейтрального) со-липида, такого как аминопропилдиметилмиристолеилоксипропанаминий бромид-дифитаноилфосфатидилэтаноламин (УахГесЕп™) или аминопропилдиметил-бис-додецилоксипропанаминий бромид-диолеоилфосфатидилэтаноламин (бАР-ОЬКШГООРЕ). Составы, содержащие соли (±)-Ы-(3-аминопропил)-Х,М-диметил-2,3-бис-(8уп-9тетрадеценилокси)-1-пропанаминия, являются предпочтительными [195].

3-О-дезацилированный монофосфорил липид А (см. выше).

Соединения, содержащие липиды, пришитые к фосфатсодержащему ацикличному скелету, как у ТЬК4 антагониста Е5564 [196, 197]:

Могут использоваться адъюванты, известные как гидроксид алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются стандартными, но используются только для удобства, поскольку ни одно из названий не представляет собой точное описание присутствующего химического соединения (например, см. главу 9 ссылки [128]). Изобретение может использовать любой из гидроксидных или фосфатных адъювантов, которые в основном используются в качестве адъювантов.

Адъюванты, известные как гидроксид алюминия, являются в основном солями оксигидроксида алюминия, которые обычно, по меньшей мере частично, кристалличны. Оксигидроксид алюминия, который можно представить формулой А1О(ОН), можно отличить от других соединений алюминия, таких как гидроксид алюминия А1(ОН)₃, с помощью инфракрасной (ИК) спектроскопии, в частности по наличию полосы поглощения на 1070 см^-1 и сильного плеча на 3090-3100 см^-1 [(глава 9 ссылки [128]). Степень кристалличности адъюванта гидроксида алюминия характеризуется шириной дифракционной полосы на

- 17 015271 половине высоты (ЛУНН), при этом слабокристалличные частицы проявляют большее расширение линии вследствие малого размера кристаллов. Площадь поверхности увеличивается с ростом УНН, и отмечено, что адъюванты с большими значениями УНН имеют большую способность к адсорбции антигенов. Волокнистая морфология (например, наблюдаемая на просвечивающих электронных микрофотографиях) является типичной для адъювантов гидроксида алюминия, р1 адъювантов гидроксида алюминия обычно составляет около 11, т.е. сам адъювант имеет положительный поверхностный заряд при физиологическом рН. Для адъювантов гидроксида алюминия приводятся адсорбционные емкости между 1,8 и 2,6 мг белка на 1 мг А1⁺⁺⁺ при рН 7,4.

Адъюванты, известные как фосфат алюминия, обычно являются гидроксифосфатами алюминия, часто также содержащими небольшое количество сульфата (т.е. алюминия гидроксифосфат-сульфата). Они могут быть получены осаждением, и условия реакции, а также концентрации во время осаждения влияют на степень замещения фосфата гидроксилом в соли. Гидроксифосфаты обычно имеют молярное соотношение РО₄/А1 между 0,3 и 1,2. Гидроксифосфаты можно отличить от просто А1РО₄ по наличию гидроксильных групп. Например, полоса ИК-спектра на 3164 см^-1 (например, при нагревании до 200°С) указывает на присутствие в структуре гидроксилов (глава 9 ссылки [128]).

Молярное соотношение РО₄/А1³⁺ адъюванта фосфата алюминия обычно находится между 0,3 и 1,2, предпочтительно между 0,8 и 1,2, а более предпочтительно 0,95±0,1. Фосфат алюминия в основном может быть аморфным, в частности гидроксифосфатные соли. Типичным адъювантом является аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением РО₄/А1 между 0,84 и 0,92, включенный при концентрации 0,6 мг А1³⁺/мл. Фосфат алюминия обычно имеет зернистую структуру (например, пластинчатую морфологию, наблюдаемую на снимках, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа). Типичные диаметры частиц находятся в пределах 0,5-20 мкм (например, около 5-10 мкм) после адсорбции антигена. Для адъювантов фосфата алюминия приводятся адсорбционные емкости между 0,7 и 1,5 мг белка на 1мг А1⁺⁺⁺ при рН 7,4.

Точка нулевого заряда (ΡΖ0) фосфата алюминия обратно связана со степенью замещения фосфата на гидроксил, и эта степень замещения может варьировать в зависимости от условий реакции и концентрации реагентов, используемых для получения соли осаждением. ΡΖС также меняется при изменении концентрации свободных фосфат-ионов в растворе (больше фосфата = более кислотная ΡΖί.’) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает ΡΖС более основной). Фосфаты алюминия, используемые по изобретению, обычно имеют ΡΖС между 4,0 и 7,0, более предпочтительно между 5,0 и 6,5, например 5,7.

Суспензии солей алюминия, используемые для получения составов изобретения, могут содержать буфер (например, фосфатный, или гистидиновый, или Трис буфер), но это не всегда обязательно. Суспензии предпочтительно стерильны и апирогенны. Суспензия может включать свободные водные фосфат-ионы, например, присутствующие в концентрации между 1,0 и 20 мМ, предпочтительно между 5 и 15 мМ, а более предпочтительно около 10 мМ. Суспензии могут также содержать хлорид натрия.

Изобретение может использовать смесь как гидроксида алюминия, так и фосфата алюминия [89]. В данном случае должно быть больше фосфата алюминия, чем гидроксида, например, при массовом соотношении по меньшей мере 2:1, например, не менее 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 и т.д.

Концентрация А1⁺⁺⁺ в составе для введения пациенту предпочтительно менее 10 мг/мл, например не более 5, 4, 3, 2, 1 мг/мл и т.д. Предпочтительный интервал между 0,3 и 1 мг/мл. Предпочтителен максимум 0,85 мг/доза.

Наряду с включением одного или более адъювантов солей алюминия, компонент адъюванта может включать один или более других адъювантов или иммуностимулирующих агентов. Такие дополнительные компоненты включают, но не ограничены, адъювант 3-О-деацилированный монофосфорил липид А (3й-МРЬ) и/или водно-масляную эмульсию. 3бМРЬ также называется 3-де-О-ацилированный монофосфорил липид А или 3-О-дезацил-4'-монофосфорил липид А. Название означает, что в 3-м положении восстанавливающего концевого глюкозамина в монофосфорил липиде А деацилирован. Он был получен из мутанта За1топе11а т1ппе8оГа, не содержащего гептозы, и химически близок липиду А, но не содержит кислотолабильной фосфорильной группы и лабильной по отношению к основаниям ацильной группы. Он активирует клетки линии дифференцировки моноцит/макрофаг и стимулирует высвобождение нескольких цитокинов, включая 1Ь-1, 1Ь-12, ΤΝΕ-α, и СМ-СЗЕ. Получение 3бМРЬ первоначально было описано в ссылке [186], а продукт производится и продается Сопха СотротаДоп под названием МРЬ™. Другие детали можно найти в ссылках [139-142].

- 18 015271

Фармацевтические композиции

Композиции изобретения являются фармацевтически приемлемыми. Они обычно включают компоненты в дополнение к антигенам, например они обычно включают один фармацевтический носитель или более и/или наполнитель (наполнители). Подробное обсуждение таких компонентов доступно в ссылке [198].

Композиции в основном могут быть в водной форме.

Композиции могут включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительно, однако, чтобы вакцины, по существу, не содержали (т.е. менее 5 мкг/мл) ртутных соединений, например тиомерсал [9, 199]. Вакцины, не содержащие ртуть, являются более предпочтительными. Вакцины, не содержащие консервантов, являются особенно предпочтительными.

Для контроля тоничности предпочтительно включать физиологическую соль, такую как соль натрия. Хлорид натрия (№1С1) предпочтителен, он может присутствовать в концентрациях 1-20 мг/мл. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидрофосфат калия, дегидрат фосфата динатрия, хлорид магния, хлорид кальция и т.д.

Композиции в основном имеют осмоляльность от 200 до 400 мОсм/кг, предпочтительно 240-360 мОсм/кг, более предпочтительно 290-310 мОсм/кг. Ранее сообщалось, что осмоляльность не влияет на болевые ощущения, вызываемые вакцинацией [200], но тем не менее поддерживание осмоляльности в этих пределах предпочтительно.

Композиции могут включать один или более буферов. Типичные буферы включают фосфатный буфер; Трис буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (особенно с адъювантом гидроксидом алюминия) или цитратный буфер. Буферы обычно включаются в пределах 5-20 мМ.

рН композиции обычно лежит в пределах от 5,0 до 8,1, а более типично от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5 или от 7,0 до 7,8. Процесс изобретения, следовательно, может включать стадию регулирования рН нефасованной вакцины перед упаковкой.

Композиция предпочтительно является стерильной. Композиция предпочтительно является апирогенной, например содержит <1 ЕЙ (эндотоксиновая единица, стандартная мера) на дозу, а предпочтительно <0,1 ЕЙ на дозу. Состав предпочтительно не содержит глютен.

Композиции изобретения могут содержать детергент, например поверхностно-активное вещество на основе сложного полиоксиэтиленового эфира сорбита (известный как Тетееи), октоксинол (такой как октоксинол-9 (Тп1оп-Х100) или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), цетил триметил аммоний бромид (СТАВ) или дезоксихолат натрия, в частности, для расщепленной вакцины или вакцины поверхностного антигена. Детергент может присутствовать только в следовых количествах. Таким образом, вакцина может включать менее 1 мг/мл каждого из октоксинола 10 и полисорбата 80. Другими остаточными компонентами в следовых количествах могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин В).

Композиция может включать материал для однократной иммунизации или же может включать материал для многократных иммунизаций (т.е. набор для многократного приема). В наборы для многократного приема предпочтительно включать консервант. Альтернативно (или дополнительно) включению консерванта в составы для многократного приема, составы могут быть помещены в контейнеры, имеющие асептический адаптер для выведения материала.

Противовирусные вакцины обычно вводятся в объеме дозы около 0,5 мл, хотя половина дозы (т.е. около 0,25 мл) может вводиться детям.

Композиции и наборы предпочтительно хранятся от 2 до 8°С. Они не должны замораживаться. В идеале они должны храниться вдали от прямого освещения.

Наборы изобретения

Составы изобретения могут готовиться непосредственно в момент доставки, особенно в случае использования адъюванта. Следовательно, изобретение обеспечивает наборы, включающие различные компоненты, готовые к смешению. Набор позволяет хранить адъювант и антиген отдельно до момента использования. Такой набор особенно полезен при использовании адъюванта на основе водно-масляной эмульсии.

Компоненты внутри набора физически отделены друг от друга, и это отделение достигается различными способами. Например, два компонента могут быть в двух отдельных контейнерах, таких как ампулы. Содержимое двух ампул затем может смешиваться, например путем переливания содержимого одной ампулы в другую либо путем отдельного выливания содержимых обеих ампул в третий контейнер и смешивания в нем.

В предпочтительном наборе один из компонентов находится в шприце, а другой - в контейнере, таком как ампула. Шприц может использоваться (например, с иглой) для введения своего содержимого во второй контейнер для смешения, а затем смесь может отбираться в шприц. Смешанные компоненты шприца затем могут вводиться пациенту обычно через новую стерильную иглу. Помещение одного компонента в шприц позволяет избежать необходимости применения отдельного шприца для введения пациенту.

- 19 015271

В другом предпочтительном наборе два компонента набора находятся вместе в несмешанном состоянии в одном шприце, например в двухкамерном шприце, таком как шприц, описанный в ссылках [201-208]. Когда шприц приводится в действие (например, во время введения пациенту), содержимое двух камер смешивеются. Этот набор позволяет избежать отдельной стадии смешения в момент использования.

Компоненты набора в основном находятся в водной форме. В некоторых наборах компонент (обычно антигенный компонент, а не адъювант) находится в сухом виде (например, в лиофилизованном виде), при этом другой компонент находится в водной форме. Два компонента можно смешать для восстановления сухого компонента и получения водного состава для введения пациенту. Лиофилизованный компонент обычно находится в ампуле, а не в шприце. Высушенные компоненты могут включать стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннит, а также их смеси, например смеси лактозы и сахарозы, смеси сахарозы и маннита и т.д. Один возможный набор использует компонент водного адъюванта в заранее заполненном шприце и компонент лиофилизованного антигена в ампуле.

Упаковка составов или компонентов набора

Подходящие контейнеры для составов изобретения (или компонентов набора) включают ампулы, шприцы (например, шприцы одноразового применения), назальные спреи и т. д. Эти контейнеры должны быть стерильными.

Если состав/компонент помещается в ампулу, ампула предпочтительно производится из стекла или пластика. Ампула предпочтительно стерилизуется перед добавлением в нее состава. Чтобы избежать проблем с пациентами, чувствительными к латексу, ампулы предпочтительно герметично закрываются несодержащей латекса пробкой, и отсутствие латекса во всех упаковочных материалах является предпочтительным. Ампула может включать одну дозу вакцины либо она может включать более одной дозы (ампула для многократного применения), например 10 доз. Предпочтительные ампулы выполнены из бесцветного стекла.

Ампула может иметь крышку (наконечник Люэра), выполненный таким образом, что заранее наполненный шприц можно ввести в крышку, содержимое шприца можно выдавить в ампулу (например, для восстановления лиофилизованного вещества, находящегося в ней), а содержимое ампулы можно вернуть обратно в шприц. После отсоединения шприца от ампулы можно присоединить иглу и ввести состав пациенту. Предпочтительно крышка расположена под пленкой или покрытием, чтобы пленку или покрытие нужно было удалить для получения доступа к крышке. Сосуд может иметь крышку, позволяющую асептический забор содержимого, особенно в случае ампул для многократного применения.

Если компонент помещен в шприц, к шприцу может быть присоединена игла. Если игла не присоединена, то отдельная игла может поставляться со шприцем для соединения и использования. Такая игла может иметь защитный колпачок. Предпочтительны безопасные иглы. Типичными иглами являются: 1 дюйм 23 О, 1 дюйм 25 О и 5/8 дюйма 25 О. Шприцы могут быть снабжены отрывной этикеткой, на которой могут быть напечатаны номер партии, сезон гриппа и срок годности содержимого, для обеспечения хранения записей. Поршень шприца предпочтительно имеет ограничитель для предотвращения случайного извлечения поршня во время всасывания. Шприцы могут иметь крышку и/или поршень из латексного каучука. Шприцы одноразового использования содержат одну дозу вакцины. Шприцы могут иметь крышку для наконечника для закрывания наконечника перед присоединением иглы, крышка для наконечника предпочтительно выполнена из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы отдельно, то игла предпочтительно снабжена бутилкаучуковым защитным колпачком. Предпочтительными являются шприцы под торговым наименованием Т1р-Ьок™.

Контейнеры могут быть промаркированы, чтобы показывать объем половины дозы, например, для облегчения введения детям. Например, шприц, содержащий дозу 0,5 мл, может иметь отметку, показывающую объем 0,25 мл.

Если используется стеклянный контейнер (например шприц или ампула), то предпочтительно использовать контейнер из боросиликатного стекла, а не из известково-натриевого стекла.

Набор или композиция могут быть упакованы (например, в одну и ту же коробку) с аннотацией, включающей детали вакцины, например инструкции по введению, детали антигенов в вакцине и т.д. Инструкции также могут содержать предупреждения, например, иметь наготове раствор адреналина на случай анафилактической реакции после вакцинации и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения в аннотации будет сказано о том, что вакцина содержит белок матрикса.

- 20 015271

Методы лечения и введение вакцины

Композиции изобретения подходят для введения пациентам-людям, и изобретение обеспечивает способ повышения иммунного ответа у пациента, включающий введение состава изобретения пациенту.

Изобретение также обеспечивает набор или композицию изобретения для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение также обеспечивает применение препарата антигена вируса гриппа, включающего гемагглютинин и белки матрикса, полученные из вируса, выращенного на клеточной культуре, в производстве лекарственного средства для повышения иммунного ответа у пациента.

Иммунный ответ, повышенный такими способами и средствами, в основном включает гуморальный иммунный ответ, предпочтительно защитный гуморальный иммунный ответ. Способы оценки гуморальных иммунных ответов, нейтрализующей способности и защиты после вакцинации вирусом гриппа хорошо известны в этой области. Исследования на людях показали, что титры антител против гемагглютинина вируса гриппа человека соотносятся с защитой (образец сыворотки с титром ингибирования гемагглютинации около З0-40 дает около 50% защиты от инфекции гомологичного вируса) [209]. Гуморальные иммунные ответы обычно измеряются ингибированием гемагглютинации, микронейтрализацией, одномерной радиальной иммунодиффузией (8ΚΙΌ) и/или одномерным радиальным гемолизом (8ΚΉ). Эти методы анализа хорошо известны в этой области.

Составы изобретения могут вводиться различными способами. Наиболее предпочтительный путь иммунизации - внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), но другие доступные пути включают подкожную инъекцию, интраназальный [210-212], пероральный [21З], интрадермальный [214, 215], чрескожный, трансдермальный [216] пути введения и т.д.

Вакцины, полученные по изобретению, могут использоваться для лечения как детей, так и взрослых. Противогриппозные вакцины в настоящее время рекомендуются для использования в педиатрической и взрослой иммунизации, начиная от возраста 6 месяцев. Следовательно, пациент может быть младше 1 года, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами для получения вакцин являются пожилые (например, >50 лет, >60 лет, предпочтительно >65 лет), детского возраста (например, <5 лет), госпитализированные пациенты, работники здравоохранения, вооруженные силы и военнослужащие, беременные женщины, пациенты с хроническими заболеваниями, с иммунодефицитом, пациенты, принимавшие противовирусный препарат (например, озельтамивир или занамивир; см. ниже) за 7 дней до получения вакцины, люди с аллергией на яйца и люди, путешествующие за границу. Однако вакцины подходят не только для этих групп и могут использоваться более широко у населения. Для пандемичных штаммов предпочтительно введение всем возрастным группам.

Предпочтительные композиции изобретения удовлетворяют 1, 2 или З критериям эффективности СРМР. У взрослых (18-60 лет) эти критерии таковы: (1) серопротекция >70%; (2) сероконверсия >40%; и/или (З) увеличение СМТ в 2,5 раза или более. У пожилых (>60 лет) эти критерии таковы:

(1) серопротекция >60%;

(2) сероконверсия >З0% и/или (3) увеличение СМТ в 2 раза или более.

Эти критерии основаны на открытых исследованиях с участием по меньшей мере 50 пациентов.

Лечение может проводиться в режиме однократной дозы или в режиме многократной дозы. Многократные дозы могут использоваться в режиме первичной иммунизации и/или в режиме бустериммунизации. В режиме многократной дозы различные дозы могут вводиться одинаковыми или разными путями, например парентерально первичная и через слизистую повторная, через слизистую первичная и парентерально повторная и т.д. Введение более одной дозы (обычно двух доз) особенно полезно для иммунологически интактных пациентов, например для людей, никогда не получавших противогриппозной вакцины ранее, или при вакцинации против нового подтипа НА (как в случае пандемичной вспышки). Многократные дозы обычно вводятся по меньшей мере с недельным интервалом (например, с интервалом около 2, З, 4, 6, 8, 10, 12, 16 недель и т.д.).

Вакцины, полученные по изобретению, могут вводиться пациентам, по существу, одновременно (например, во время одной медицинской консультации или одного визита к врачу или в центр вакцинации) с другими вакцинами, например, по существу, одновременно с противокоревой вакциной, противопаротитной вакциной, живой вакциной против корьевой краснухи, тривакциной против кори, эпидемического паротита и коревой краснухи (ММВ), вакциной против ветряной оспы, вакциной против кори, эпидемического паротита, коревой краснухи и ветряной оспы, противодифтерийной вакциной, противостолбнячной вакциной, противококлюшной вакциной, тривакциной против коклюша, дифтерии и столбняка (КДС), конъюгированной вакциной против Η.ίηΠιιοηζα тип Ь, инактивированной полиовирусной вакциной, вакциной против вируса гепатита В, противоменингококковой конъюгатной вакциной (такой как тетравалентная вакцина А-С-^1З5-У), вакциной против респираторно-синцитиального вируса (РСВ), противопневмококковой конъюгатной вакциной и т.д. Введение, по существу, одновременно с противопневмококковой вакциной и/или противоменингококковой вакциной особенно полезно у пожилых пациентов.

- 21 015271

Похожим образом, вакцины изобретения могут вводиться пациентам, по существу, одновременно (например, во время одной медицинской консультации или одного визита к врачу) с антивирусным препаратом, в частности с антивирусным препаратом, активным против вируса гриппа (например, озельтамивир и/или занамивир). Эти антивирусные препараты содержат ингибиторы нейраминидазы, такие как (3Я,4Я,58)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота или 5-(ацетиламино)-4-[(аминоиминометил)амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-О-глицеро-О-галактонон-2еноновая кислота, включая их сложные эфиры (например, этиловые эфиры) и их соли (например, фосфатные соли). Предпочтительным антивирусным препаратом является (3Я,4Я,5§)-4-ацетиламино-5амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота, этиловый эфир, фосфат (1:1), также известный как озельтамивир фосфат (ТАМ1БЬИ™).

Анализы

Для характеристики противогриппозной вакцины может быть полезно определить количество присутствующего белка матрикса. Следовательно, изобретение обеспечивает методы анализа противогриппозных вакцин, где образец вакцины анализируется для определения наличия белка матрикса. Анализы особенно полезны для тестирования фрагментов белка М1.

Противогриппозная вакцина может содержать антигены вирусов гриппа А и/или В. Изобретение обеспечивает методы анализа вакцин, содержащих антигены вируса гриппа В, где образец вакцины анализируется для определения наличия белка матрикса вируса гриппа В.

Противогриппозная вакцина может содержать антигены различных подтипов НА. Изобретение обеспечивает методы анализа вакцин, содержащих антигены вируса гриппа А, где образец вакцины анализируется для определения наличия белка матрикса вируса гриппа А и где вирус гриппа А имеет подтип гемагглютинина, выбранный из Н2, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16.

Противогриппозная вакцина может содержать антигены, выращенные на клеточной культуре. Изобретение обеспечивает методы анализа вакцин, выращенных на клеточной культуре, где образец вакцины анализируется для определения наличия белка матрикса вируса гриппа.

Противогриппозная вакцина может включать адъювант. Изобретение обеспечивает методы анализа противогриппозных вакцин с адъювантом, где образец вакцины анализируется для определения наличия белка матрикса вируса гриппа. Изобретение также обеспечивает методы анализа противогриппозных вакцин без адъюванта, где образец вакцины без адъюванта анализируется для определения наличия белка матрикса вируса гриппа и где затем к вакцине добавляется адъювант.

Эти анализы обычно являются иммунологическими анализами, такими как вестерн-блоттинг или ЕЫ8А. Иммунологический анализ может использовать поликлональные или моноклональные антитела. Если использовать моноклональные антитела, в некоторых варианта осуществления изобретения это не мышиные антитела, такие как мышиное антитело 1дС1. В анализах могут использоваться антитела, которые распознают фрагменты М1, включая антитела, распознающие фрагменты М1, раскрытые здесь, например антитела, распознающие фрагменты молекулярной массой 10 кДа или менее (например, <5 кДа), распознающие фрагменты без Ν-концевого метионина, распознающие фрагменты с Ν-концевой последовательностью 8ЕО Ш NΟ: 15, распознающие 8ЕО Ш NΟ: 28 и/или 29, распознающие фрагменты, включающие 8ЕО Ш NΟ: 30, распознающие фрагменты с ковалентно модифицированным Ν-концевым остатком и т.д.

Анализы особенно полезны для определения фрагментов белка М1, таких фрагментов с молекулярной массой 10 кДа или менее (например, <5 кДа), и/или фрагментов, раскрытых здесь (например, не имеющих Ν-концевого метионина полноразмерной последовательности М1). Предпочтительные анализы могут различаться между присутствием полноразмерного белка М1и фрагментов белка М1, а также могут различаться между различными фрагментами.

Анализы могут быть качественными, полуколичественными или количественными. Изобретение также обеспечивает вакцины, проанализированные таким образом.

Другие аспекты изобретения

Изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую (ί) гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, а также (ίί) адъювант. Белки вируса гриппа могут быть получены из вируса, выращенного на клеточной культуре или выращенного в яйце. Как описано выше, состав может также включать другие компоненты, например белок нейраминидазы вируса гриппа, фармацевтические носители/наполнители и т. д.

Изобретение также обеспечивает способ получения иммуногенной композиции, предусматривающий следующие стадии:

(ί) выращивание вируса гриппа;

(ίί) получение антигенной композиции из вирусов, выращенных на стадии (ί), где антигенная композиция содержит гемагглютинин и белки матрикса; и (ΐϊϊ) комбинирование антигенной композиции с адъювантом для получения иммуногенной композиции.

- 22 015271

Изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую (1) гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где гемагглютинин имеет подтип, выбранный из Н2, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16.

Изобретение также обеспечивает способ получения иммуногенной композиции, предусматривающий следующие стадии:

(ί) выращивание вируса гриппа;

(ίί) получение антигенной композиции из вирусов, выращенных на стадии (1), где антигенная композиция содержит гемагглютинин и белки матрикса и где гемагглютинин имеет подтип, выбранный из Н2, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16; и (ΐϊϊ) комбинирование антигенной композиции с адъювантом для получения иммуногенной композиции.

Изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую (1) гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где концентрация гемагглютинина в композиции составляет 29 мкг/мл или менее (например, не более 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 мкг/мл). Композиция может включать гемагглютинин более чем из одного штамма вируса гриппа, в данном случае упомянутая концентрация дана на штамм (т.е. <29 мкг/мл на штамм).

Изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую (1) гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где концентрация гемагглютинина в композиции составляет 31 мкг/мл или более (например, не менее 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 мкг/мл и т.д., но обычно <200 мкг). Состав может включать гемагглютинин более чем из одного штамма вируса гриппа, в данном случае упомянутая концентрация дана на штамм (т.е. >31 мкг/мл на штамм).

Изобретение также обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую белок матрикса М2 вируса гриппа, но по существу не содержащую белок матрикса М1 вируса гриппа, как определено выше. М2-содержащие вакцины разрабатываются в настоящее время [217]. М2 в природе кодируется вирусным сегментом, также кодирующим М1. Таким образом, в системе рекомбинантной экспрессии белок М1 может экспрессироваться как побочный продукт. По изобретению можно избежать любой такой побочной экспрессии или же белки матрикса М1 можно удалить из М2-содержащей композиции. Белок М2 может быть полноразмерным белком или, например, может быть М2 фрагментом, таким как внеклеточный домен М2 (известный в этой области как М2е). Белок М2 может быть конъюгирован с другим антигеном, например с антигеном вируса гепатита В. Вакцина может также не содержать НА и/или ΝΑ.

Общая информация

Термин содержащий охватывает включающий, а также состоящий, например, композиция, содержащая X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительно, например Χ+Υ.

Выражение по существу не исключает полностью, например состав, который по существу не содержит Υ, может полностью не содержать Υ. Где необходимо, выражение по существу может опускаться из определения изобретения.

Термин около относительно численного значениях означает, например, х±10%.

Если не указано особо, процесс, содержащий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует какого-либо определенного порядка смешивания. Следовательно, компоненты могут смешиваться в любом порядке. В случае трех компонентов два компонента могут соединяться друг с другом, а затем смесь может объединяться с третьим компонентом и т. д.

Если в культуре клеток используются животные материалы (особенно бычьи), они должны быть получены из источников, не содержащих трансмиссионной губчатой энцефалопатии (Τ8Ε) и, в частности, губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (В8Е). Вообще предпочтительно выращивать клетки в культуре, абсолютно не содержащей материалы животного происхождения.

Если соединение вводится в тело как часть композиции, то это соединение может быть альтернативно заменено подходящим пролекарством.

Если клеточный субстрат используется для рекомбинации или процедур обратной генетики, это предпочтительно субстрат, одобренный для использования в производстве человеческих вакцин, например, как в основной статье Европейской Фармакопеи 5.2.3.

Идентичность полипептидных последовательностей предпочтительно определяется с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Уотермана, применяемого в программе МР8ПСН (ОхГогб Мо1еси1аг), использующей поиск аффинного гэпа с параметрами штраф за открытие гэпа = 12 и штраф за продолжение гэпа = 1.

- 23 015271

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой 8О8-РАСЕ различных препаратов вакцины:

дорожки М - это маркеры молекулярной массы (кДа);

дорожка 1 - это вакцина, выращенная на МОСК;

дорожки 2-6 - это существующие коммерческие вакцины;

стрелки показывают (а) НА_Ь (Ь) НА₂, (с) фрагмент М1 изобретения.

Фиг. 2 показывает результаты вестерн-блот анализа фракционированных вирионов гриппа с использованием антисыворотки кроликов, иммунизированных фрагментом белка матрикса ~5 кДа. Панель слева - это блот, использующий преиммунную сыворотку, а панель справа использует сыворотку после иммунизации.

Варианты осуществления изобретения

При работе с противогриппозной вакциной на очищенных поверхностных антигенах, где вирионы выращивали на МОСК-клетках, было отмечено, что относительно большое количество низкомолекулярного полипептида может быть обнаружено с помощью 8О8-РАСЕ после расщепления вируса гриппа А с помощью СТАВ. Этот низкомолекулярный полипептид также присутствовал во время дальнейшей очистки антигена и присутствовал в конечном препарате поверхностных антигенов. Для исследования этого полипептида использовалась буферная система, позволяющая идентифицировать полипептиды вплоть до 2 кДа (ЫиРАСЕ™ Νονβχ Вщ-Тпк Гели от 1пуйгодеп). При помощи этой системы была идентифицирована полипептидная полоса с наблюдаемой молекулярной массой ~5 кДа. Эта полипептидная полоса не наблюдалась в доступных в настоящее время вакцинах ЮТЬЕХАЬ V™, ЮТЬИЗРЫТ™, МИТАСМР™, УАХЮК1Р™, ВЕСК^АС™, РЬиАК1Х™, ШРЬ^АС™ или ΡΕΕ\ΊΡΙ\¹которые все получены из вирионов, выращенных в яйце. Неожиданно, полипептидная полоса была обнаружена в некоторых партиях АСКРРРАЬ™, но ее существование или присутствие ранее не обнаруживалось.

Иммунизация кроликов полосой ~5 кДа индуцировала антитела, которые были способны обнаружить нативный белок М1. Фиг. 2 показывает результаты вестерн-блот анализа фракционированных вирионов гриппа при помощи кроличьей антисыворотки с сильной реактивностью к белку М1 вириона. Следовательно, полипептид в полосе ~5 кДа несет эпитопы, которые являются иммуногенными и могут вызывать продуцирование антител, связывающихся с соответствующим нативным белком М1.

Анализ Ν-концевой последовательности полос ~5 кДа, полученных из двух различных вирусов (вирус Н1М и вирус №N2) выявил пептид с Ν-концевой последовательностью Е18Ь8У8АСАЬА (8Еф ГО N0: 18). Эта аминокислотная последовательность является фрагментом белка М1 ируса гриппа, идентичным с аминокислотными положениями 114-125 8Еф ГО N0: 1.

Дальнейшее исследование при помощи М8 анализа трипсиновых фрагментов выявило более распространенный фрагмент с Ν-концевой аминокислотной последовательностью 8Еф ГО N0: 28, которая не содержит ^концевой метионин 8Еф ГО N0: 1:

7Р5ЕЯСБ0Й ДОС ХР Ю; 28)

С-конец этого фрагмента может иметь дополнительный остаток Агд (т.е. 8ЬЬ...рКК, 8Е0 ГО N0: 29). ^концевой серин может быть ковалентно модифицирован, например ацетилирован. ^концевой 12-мер этого фрагмента (δΕΠΈνΈΙΎνΕδ; 8Еф ГО N0: 30) высококонсервативен среди штаммов.

Композиции изобретения могут содержать оба таких фрагмента, при этом фрагмент, ближний к Оконцу (например, 8Еф ГО N0: 28), является более распространенным.

Следует понимать, что изобретение описано только посредством примера и могут быть осуществлены модификации, остающиеся в пределах сущности и объема изобретения.

- 24 015271

Ссылки

Ссылки, содержания которых включены в описание посредством ссылки.

1. Уассшек (ебк. ΓΙοίΚίη & О^еηкΐе^η). 4(Н ебНю!!, 2004, 18ВК 0-7216-9688-0.

2. Скак^ка еΐ а1. (1996), Еиг 1. С1ш М1сгоЬю1 ΙηίεΛ Όίκ 15:121-7.

3. АО 96/37624.

4. АО 98/46262.

5. АО 02/28422.

6. АО 02/067983.

7. АО 02/074336.

8. АО 01/21151.

9. АО 02/097072.

10. АО 2005/113756.

11. Нискпебе еΐ а1. (2003), Мебюбк Еηζутο1. 373:74-91.

12. \νοιΊ6 Неа1111 О^даη^κаΐ^οη (2005), Етегдшд Ιηίο^ίοιικ Э1кеакек, 11(10):1515-21.

13. НегЬсЬег е1 а1. (2004), 1. ΙηίεΛ Όίκ. 190(9):1627-30.

14. Ье е1 а1. (2005), №^е, 437(7062):1108.

15. ^ί^ηη е1 а1. (2002), Уассше, 20:3165-3170.

16. ΞιΛόπηο е1 а1. (2003), Утокду 305:192-200.

17. Ьш е1 а1. (2003), Утокду, 314:580-590.

18. СУак1 е1 а1. (2004), 1. У1го1. 78:1851-1857.

19. АеЬЬу е1 а1. (2004), Ьа^ей 363:1099-1103.

20. АО 00/60050.

21. АО 01/04333.

22. И8 ρаΐеηΐ 6649372.

23. Nеитаηη еΐ а1. (2005), Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 102:16825-9.

24. АО 2006/067211.

25. АО 01/83794.

26. ΙΙοί'ίίιιιιιιιι е1 а1. (2000), Уток^у, 267(2):310-7.

27. АО 97/37000.

28. Вганбк еΐ а1. (1999), Эет. Вю1. 81анб. 98:93-100.

29. Нафегт еΐ а1. (2002), Уассше, 20:1240-7.

30. Тгее еΐ а1. (2001), Уассше, 19:3444-50.

31. КдкШег е1 а1. (1998), Уассше, 16:960-8.

32. КдкШег еΐ а1. (1999), Эеу Вю1. 81анб. 98:101-110.

33. ВгиЫ е1 а1. (2000), Уассше, 19:1149-58.

34. Раи е1 а1. (2001), Уассше, 19:2716-21.

35. ΙιΙΙρ/Λνλνλν.ηΙ^.οΓβ/

36. Ηΐίρ://1ο^κ итбщ.еби/

37. АО 03/076601.

38. АО 2005/042728.

39. АО 03/043415.

40. АО 01/85938.

41. АО 2006/Ι08846.

42. ЕР-А-1260581 (АО 01/64846).

43. АО 2006/071563.

44. АО 2005/113758.

45. АО 2006/027698.

46. АО 97/37000

47. АО 97/37001.

48. Τιόππογ еΐ а1. (1996), 1. МгсБ Όίκ. 173:1467-70.

49. Кебе1 еΐ а1. (1996), С1ш. Οίη^η. ЬаЬ. Iттиηο1. 3:507-10.

50. Сеукеη е1 а1. (1984), Р№8 И8А, 81:3998-4002.

51. Сайег (1994), Ме^бк Мс1. Вю1. 36:207-23.

52. ^атекοη, В.А. е1 а1. 1988, САВ1О8, 4(1):181-186.

53. Ваббл77аш & Наттег (2000), ВпеГ Вюшйгт, 1(2):179-89.

54. Эе Ьа11а е1 а1. (1999), 1. Iттиηο1. 163:1725-29.

55. Вгик1с еΐ а1. (1998), В^ο^ηίο^таΐ^ск, 14(2):121-30.

56. Мекбег е1 а1. (1995), Уассше, 13(6):581-91.

57. ИдЬейк еΐ а1. (1996), АГО8 Век Нит ВеЦ^иикек, 12(7):593-610.

58. МаккуиЮ\' & 2адгеЬе1науа (1993), Сοтρиΐ Αρρ1. Вюкск 9(3):291-7.

59. Ее11ег & бе 1а (ηιζ. (1991), Уинге, 349(631 1):720-1.

60. Βορρ (1993), Реρΐ^бе Векеагск, 6:183-190.

- 25 015271

61. АеШпд е! а1. (1985), РЕВ8 Ье«. 188:215-218.

62. ЭауепроП е! а1. (1995), 1ттиподепебс8, 42:392-297.

63. ТеХЬоок оГ 1пГ1иепха (Каг1 Мсйокоп, КоЬей АеЬ§!ег, А1ап Нау апб М-тсу Сох, еб§).

64. Со!сй е! а1. (1988), 1. Ехр. Меб. 168(6):2045-57.

65. 61апГгат е! а1. (2000), Нитап 1ттипо1. 61:438-452.

66. УШе11о е! а1. (1996), 1. 1ттипо1. 157(12):5555-62.

67. Оопд е! а1. (1996), Еиг. 1. 1ттипо1. 26(2):335-339.

68. Апбегзеп е! а1. (1999), Т188ие Апбдепз, 54(2):185-190.

69. Аб1ег е! а1. (1994), РЕВ8 Ье!!. 352(2):167-170.

70. Ко!йЬагб е! а1. (1988), Се11, 52(4):515-523.

71. Еуапз е! а1. (1999), 1. 1ттипо1. 162(7):3970-3977.

72. ЕМег е! а1. (1994), 1. Сеп. У1го1. 75:37-42.

73. Маскеп е! а1. (2001), т Орбопз Гог !йе Соп!го1 оГ 1п1иепха 1Р (еб§. Ойегйаиз е! а1.).

74. 8рабетап е! а1. (2005), У1ги§. Ке§. 114(1-2):89-100.

75. АеЬ§!ег & Нт5Йа\у (1977), 1пГес!. 1ттип. 17:561-6.

76. Нш е! а1. (2003), 1. Сеп. У1го1. 84:3105-13.

77. ЕМег е! а1. (1991), 1. Сеп. У1го1. 78:1589-96.

78. ЬипбЫаб (2001), Вю!есйпо1оду апб Аррйеб ВюсйетНбу, 34:195-197.

79. Сшбапсе Гог 1пби§!1у: В1оапа1убса1 Ме!йоб Уайбабоп. и.8. Эераг1теп1 оГ Неа1!й апб Нитап 8егу1се§ Рооб апб Эгад АбтбийгаЕоп Сеп!ег Гог Эгид Еуа1иабоп апб Кезеагсй (СОЕК) Сеп!ег Гог Уе!ебпагу Мебкше (СУМ). Мау 2001.

80. Л е! а1. (2002), В|о1есйпк|ие5. 32:1162-7.

81. Вбддз (1991), 1. Рагеп!ег 8ск Тесйпо1. 45:7-12.

82. Ьайуат е! а1. (1998), Нит. Сепе. Тйег. 9:1173-80.

83. Ьок!еГГ е! а1. (2001), Вю1од1саК 29:123-32.

84. ЕР-В-0870508.

85. И8 5948410.

86. 1п!етабопа1 ра!еп! аррбсабоп епб!1еб СЕЬЬ-ОЕКбУЕО У1КАЙ УАССШЕ8 А1ТН ЬОА ЬЕУЕЬ8 ОР КЕ8ЮЕАЕ СЕЬЬ ^NΑ, Й1еб 1βΐ МметЬег 2006 сШтшд рпопо И8-60/732786.

87. И8 ра!еп! 6,372,223.

88. АО 00/15251.

89. АО 01/22992.

90. Нейте е! а1. (2004), Уйия Ке§. 103(1-2):163-71.

91. И8 ра!еп! 6355271.

92. АО 00/23105.

93. и8 5,057,540.

94. АО 96/33739.

95. ЕР-А-0109942.

96. АО 96/11711.

97. АО 00/07621.

98. Вагг е! а1. (1998), Абуапсеб Эгид Оебуегу Кеу1ете, 32:247-271.

99. 8)о1апбеге1 е! а1. (1998), Абуапсеб Эгид Оебуегу Кеу1ете, 32:321-338.

100. Р|/ха е! а1. (2000), 1п!. 1. Меб. М1сгоЫо1. 290:455-461.

101. АО 95/17211.

102. АО 98/42375.

103. 8тдй е! а1. (2001), 1. Соп!. Ке1еа§е, 70:267-276.

104. АО 99/27960.

105. И8 6,090,406.

106. И8 5,916,588.

107. ЕР-А-0626169.

108. АО 99/52549.

109. АО 01/21207.

110. АО 01/21152.

111. АО 02/072012.

112. Эуакопоуа е! а1. (2004), 1п!. 1ттипорйагтасо1. 4(13):1615-23.

113. РК-2859633.

114. 81дпоге1й & Наббеп (2003), 1п!. 1ттипорйагтасо1. 3(8):1177-86.

115. АО 2004/064715.

116. Эе ЫЬего е! а1., №11иге Кеу1ете 1ттипо1оду, 2005, 5:485-496.

117. И8 ра!еп! 5,936,076.

118. Ок1 е! а1., 1. С1т. 1пуеШд., 113:1631-1640.

119. И82005/0192248.

- 26 015271

120. Уапде! а1., СЕет. 1п!. Еб., 2004, 43:3818-3822.

121. АО 2005/102049.

122. Оо8 е! а1., 1. Αω. СЕет., 8ос., 2004, 126:13602-13603.

123. АО 03/105769.

124. Соорег (1995), РЕагт. Вю1есЕпо1. 6:559-80.

125. АО 90/14837.

126. Робба & Эе1 Ошбке (2003), Ехрей. Веу. Уассшек, 2:197-203.

127. Робба (2001), Уассше, 19: 2673-2680.

128. Уассше ЭеНдп: ТЕе 8иЬиш! апб Αб^иνаη! Αρριό,^ι (ебк. Ро\уе11 & Ые^тап), Р1епит Ргекк 1995 (Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х).

129. Уассше Αб^иνаη!к: Ргерагабоп Ме!Еобк апб ВекеагсЕ Рго!осо1к (Уо1ите 42 оГ Ме!Еобк ш Мо1еси1аг Мебкше кепек). Ι8ΒΝ: 1-59259-083-7. Еб. О'Надап.

130. ΑШкоη & Вуагк (1992), Век. 1ттипо1. 143:519-25.

131. НапЕагап е! а1. (1995), Сапсег Век. 55:3486-9.

132. АО 95/11700.

133. И8 ра!еп! 6,080,725.

134. АО 2005/097181.

135. Нап е! а1. (2005), 1трас! оГ Убатш Е оп 1ттипе Еипсбоп апб 1пГесбоик Э|кеакек ш !Ее Αдеб а! Nиίπ!^оη, 1ттипе Гипсбопк апб Неа1!Е ЕигоСопГегепсе, Рапк, 9-10 1ипе 2005.

136. И8-6630161.

137. Наубеп е! а1. (1998), 1. С1ш. 1пуек!. 101(3):643-9.

138. Такыдпоп е! а1. (2005), 1. 1ттипо1. Ме!Е. 305:188-98.

139. Муегк е! а1. (1990), радек 145-156 оГ Се11и1аг апб то1еси1аг акреак оГ епбо!охш геасбопк.

140. И1г1сЕ (2000), СЕар!ег 16 (радек 273-282) оГ геГегепсе 129.

141. 1оЕпкоп е! а1. (1999), 1. Меб. СЕет. 42:4640-9.

142. Ва1бпск е! а1. (2002), Веди1а!огу Тох1со1 РЕагтасо1. 35:398-413.

143. И8 4,680,338.

144. И8 4,988,815.

145. АО 92/15582.

146. 8!ап1еу (2002), С1ш. Ехр. Оегта!о1. 27:571-577.

147. Аи е! а1. (2004), Αη!^ν^^а1 Век. 64(2):79-83.

148. Уакбакок е! а1. (2000), Се11 1ттипо1. 204(1):64-74.

149. И8 ра!еп!к 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 и 6924293.

150. 1опек (2003), Сигг. Орт. 1пуекбд. Эгидк. 4:214-218.

151. АО 2004/060308.

152. АО 2004/064759.

153. И8 6,924,271.

154. И82005/0070556.

155. И8 5,658,731.

156. И8 ра!еп! 5,011,828.

157. АО 2004/87153.

158. И8 6,605,617.

159. АО 02/18383.

160. АО 2004/018455.

161. АО 03/082272.

162. АО 2006/002422.

163. 1оЕпкоп е! а1. (1999), Вшогд. Меб. СЕет. Ье!!. 9:2273-2278.

164. Еуапк е! а1. (2003), Ехрег! Веу. Уассшек, 2:219-229.

165. Αηб^^аηоν е! а1. (1998), Вюта!епа1к, 19:109-115.

166. Раупе е! а1. (1998), Α6υ Эгид ОеНуегу Веу1ете, 31:185-196.

167. ТЕотркоп е! а1. (2003), Мебюбк ш Мо1еси1аг Мебсше, 94:255-266.

168. Капб1та11а е! а1. (2003), М1с1е1с Αс^бк ВекеагсЕ, 31:2393-2400.

169. АО 02/26757.

170. АО 99/62923.

171. Кпед (2003), №11иге Мебшше, 9:831-835.

172. МсС1икк1е е! а1. (2002), ЕЕМ8 1ттипо1оду апб Меб1са1 М1сгоЫо1оду, 32:179-185.

173. АО 98/40100.

174. И8 ра!еп! 6,207,646.

175. И8 ра!еп! 6,239,116.

- 27 015271

176. И8 ра!еп! 6,429,199.

177. Капй1та11а е! а1. (2003), ВюскетЧса1 ЗосЧеЧу Тгапзасйопз, 31 (рай 3):654-658.

178. В1аск\\е11 е! а1. (2003), к 1ттипо1. 170:4061-4068.

179. Кпед (2002), Тгепйз 1ттипо1. 23:64-65.

180. АО 01/95935.

181. КапйппаПа е! а1. (2003), ВВКС, 306:948-953.

182. Вкада! е! а1. (2003), ВВКС, 300:853-861.

183. АО 03/035836.

184. АО 01/22972.

185. Ткотрзоп е! а1. (2005), Ч. Ьеикос Вю1. 78: 'Тке 1о^-!охЧсйу уегзЧопз ой ЬР8, МРЬ® айщуап! апй КС529, аге еййсЧеп! айщуапй йог СЭ4+ Т се11з'.

186. ЭК ра!еп! аррйсайоп СВ-А-2220211.

187. АО 94/21292.

188. АО 94/00153.

189. АО 95/17210.

190. АО 96/26741.

191. АО 93/19780.

192. АО 03/011223.

193. Мега1йЧ е! а1. (2003), Vасс^пе, 21:2485-2491.

194. Ра.)ак е! а1. (2003), Vасс^пе, 21:836-842.

195. И8-6586409.

196. Аопд е! а1. (2003), Ч. Скп. Ркагтасо1. 43(7):735-42.

197. И82005/0215517.

198. Сеппаго (2000), КетЧпд!оп: Тке 8сЧепсе апй Ргасйсе ой Ркагтасу. 20!к ейЧйоп, Ι8ΕΝ: 0683306472.

199. Вапхкойй (2000), 1ттипо1оду Ьейегз, 71:91-96.

200. Иопу е! а1. (2001), Vасс^пе, 27:3645-51.

201. АО 2005/089837.

202. И8 ра!еп! 6,692,468.

203. АО 00/07647.

204. АО 99/17820.

205. И8 ра!еп! 5,971,953.

206. И8 ра!еп! 4,060,082.

207. ЕР-А-0520618.

208. АО 98/01174.

209. Ройег & Охйогй (1979), Вг. Мей. Ви11. 35: 69-75.

210. СгеепЬаит е! а1. (2004), νη^ηκ, 22:2566-77.

211. 2игЬпддеп е! а1. (2003), Ехрей Кеу. Vасс^пе8, 2:295-304.

212. РЧазсЧк (2003), к Ат Ркагт Аззос (Аазк ЭС). 43:728-30.

213. Мапп е! а1. (2004), Vасс^пе, 22:2425-9.

214. На1репп е! а1. (1979), Ат. к РиЬкс. Неа1!к, 69:1247-50.

215. НегЬей е! а1. (1979), к 1пйес!. ϋΐδ. 140:234-8.

216. Скеп е! а1. (2003), Vасс^пе, 21:2830-6.

217. Эе Ейе!!е е! а1. (2005), ^то1оду, 337(1):149-61.

- 28 015271

Claims (33)

1. Иммуногенная композиция, содержащая гемагглютинин и фрагмент с молекулярной массой менее чем 20 кДа М1 белка матрикса М1 не в виде целого вириона, полученные из вируса, выращенного в клеточной культуре.

2. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что фрагмент белка матрикса М1 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичности 8ЕО ΙΌ NО: 1.

3. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что фрагмент белка матрикса М1 содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичности 8ЕО ΙΌ NО: 28.

4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса М1 имеет молекулярную массу менее чем 10 кДа.

5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция удовлетворяет 1, 2 или 3 критериям эффективности СРМР.

6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где гемагглютинин и фрагмент белка матрикса М1 очищаются вместе.

7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где молекулярная масса фрагмента белка матрикса попадает в диапазон 2-8 кДа, предпочтительно фрагмент белка матрикса имеет молекулярную массу около 5 кДа.

8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЬЕО^АСК (8Е0 ΙΌ NО: 17) и У8ХСАЬ (8ЕО ΙΌ ^: 27).

9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса содержит последовательность из 20 аминокислот, имеющую по меньшей мере 80% идентичности 8ЕО ΙΌ NО: 2.

10. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса содержит Т-клеточный эпитоп белка М1 вируса гриппа.

11. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса содержит одну или более из следующих аминокислотных последовательностей: 8ЕО ΙΌ NО: 1; 8ЕО ΙΌ NО: 21; 8ЕО ΙΌ ^: 22; 8ЕО ΙΌ 23; 8ЕО ΙΌ 24; 8ЕО ΙΌ 25; 8ЕО ΙΌ 26; 8ЕО ΙΌ 27.

12. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса не содержит Ν-концевого метионина природной последовательности М1.

13. Композиция по п.1, где фрагмент белка матрикса имеет Ν-концевую последовательность 8^^ТЕVЕТΥV^8 (8ЕО ΙΌ ^: 30).

14. Композиция по п.12, где Ν-концевой серин 8ЕО ΙΌ NО: 30 ковалентно модифицирован, например ацетилирован.

15. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса имеет Ν-концевую последовательность Е[8Е8У8ЛСЛЕА (8ЕО ΙΌ NО: 18).

16. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит (1) фрагмент первого белка матрикса, имеющий Ν-концевую последовательность 8^^ТЕVЕТΥV^8 (8ЕО ΙΌ NО: 30); и (ίί) фрагмент второго белка матрикса, имеющий Ν-концевую последовательность ЕI8^8Υ8АСА^А (8ЕО ΙΌ ^: 18).

17. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент белка матрикса присутствует в концентрации между 1 и 15 мкг/мл.

18. Композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая расщепленный вирус гриппа или очищенные поверхностные антигены гриппа.

19. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где гемагглютинин из подтипа вируса гриппа А Н1, Н2, Н3, Н5, Н7 или Н9.

20. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где белки вируса гриппа получают из вируса гриппа, выращенного на культуре клетки-хозяина, и композиция содержит менее 10 нг клеточной ДНК клетки-хозяина.

21. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит от 0,1 до 20 мкг гемагглютинина на вирусный штамм.

22. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающая адъювант.

23. Композиция по п.22, где адъювант содержит одну или более солей алюминия.

24. Композиция по п.22, где адъювант содержит водно-масляную эмульсию.

25. Иммуногенная композиция, содержащая (1) гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа не в виде целого вириона и (ίί) адъювант.

26. Иммуногенная композиция, содержащая гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа не в виде целого вириона, где гемагглютинин имеет подтип, выбранный из Н2, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16.

27. Иммуногенная композиция, содержащая гемагглютинин и белки матрикса вируса гриппа, где концентрация гемагглютинина в композиции составляет 29 мкг/мл на штамм или ниже.

- 29 015271

28. Способ получения иммуногенной композиции, предусматривающий следующие стадии:

(ΐ) выращивание вируса гриппа в клеточной культуре;

(ίί) получение антигенной композиции из вирусов, выращенных на стадии (1), где антигенная композиция содержит гемагглютинин и белки матрикса не в виде целого вириона; и (ΐϊϊ) комбинирование антигенной композиции с фармацевтическим носителем для получения иммуногенной композиции.

29. Способ по п.28, где молекулярная масса белка матрикса попадает в диапазон 2-8 кДа, предпочтительно белок матрикса имеет молекулярную массу около 5 кДа.

30. Способ по любому из пп.28 или 29, где белок матрикса содержит Т-клеточный эпитоп белка М1 вируса гриппа.

31. Способ по п.30, где белок матрикса содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЬЕПУЕАОК (8Еф ГО N0: 17) и УЗХОАЬ (8Еф ГО N0: 27).

32. Способ по любому из пп.28-31, где белок матрикса содержит последовательность из 20 аминокислот, имеющую по меньшей мере 80% идентичности 8Еф ГО N0: 2.

33. Способ контроля качества иммуногенной композиции по любому из предшествующих пунктов, включающий определение в составе вакцины уровня присутствия фрагмента белка матрикса М1.