JP2017031225A - 血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含むインフルエンザウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含むインフルエンザウイルスワクチンの提供。
【解決手段】インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物。これらは卵よりもむしろ細胞培養において増殖させたインフルエンザウイルスからであってもよい。このマトリックスタンパク質は、全長ウイルスマトリックスタンパク質の断片（例えば２０ｋＤａ未満の分子量のマトリックスＭ１断片）であってもよい。この組成物は、精製された表面糖タンパク質を含むサブユニットワクチンであってもよい。
【選択図】図１

Description

本明細書において引用されたすべての書類は、それらの全体の参照により組み入れられる。

本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する防御のためのワクチン、および特にマトリックスタンパク質を含むワクチンの分野である。

インフルエンザウイルスワクチンの様々な形式が、現在利用可能である（例えば、参考文献１の１７および１８章を参照）。ワクチンは、一般に生ウイルスまたは非活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。

血球凝集素（ＨＡ）は不活性化されたインフルエンザワクチンの主要な免疫原であり、ワクチン用量は典型的には、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）分析により測定されて、ＨＡレベルへの参照により標準化される。現行ワクチンは典型的には、１用量あたり１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。インフルエンザＨＡの含有に加えて、ワクチンはさらにインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。例えば、現行ワクチンはすべてノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含んでいる。参考文献２（非特許文献１）は、ヨーロッパのインフルエンザワクチンが、かなりの量の他のインフルエンザウイルスタンパク質も含むことを報告する。例えば、マトリックス（Ｍ）タンパク質は、精製表面抗原ワクチンではなくスプリットワクチンで見出された。
参考文献２（非特許文献１）は、インフルエンザウイルス抗原に加えて、ワクチンがオボアルブミンのような卵由来タンパク質も含むことを報告する。ワクチン製造におけるインフルエンザウイルス増殖の標準的な方法が、ウイルスが卵内容物（尿膜腔液）から精製されている孵化鶏卵を使用するので、これらのタンパク質は生じる。

Ｃｈａｌｏｕｐｋａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（１９９６）１５：１２１−７

ワクチン製造においてウイルス増殖に卵を使用するよりはむしろ、細胞培養においてウイルスを増殖させることが提案された。この技法を調べている間に、本発明者は思いがけずマトリックス配列を検出した。特に、参考文献２では卵で増殖させたビリオンから調製された精製表面抗原ワクチン中でマトリックスタンパク質は見出されなかったが、本発明者は細胞培養において増殖させたビリオンから調製された精製表面抗原ワクチン中でマトリックスタンパク質を検出した。

したがって、本発明は、細胞培養において増殖させたウイルスから調製されるインフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。

本発明は、組成物がオボアルブミンを含まないことを特徴として、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物もまた提供する。この組成物は、他の卵タンパク質（例えばオボムコイド）およびニワトリＤＮＡ不含でもありえる。

本発明は、（ｉ）細胞培養においてインフルエンザウイルスを増殖させる工程と；（ｉｉ）抗原組成物が血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含むことを特徴として、工程（ｉ）で増殖させたウイルスから抗原組成物を調製する工程と；（ｉｉｉ）免疫原性組成物を生ずるために、薬学的担体に抗原組成物を組み合わせる工程とを含む免疫原性組成物調製の方法もまた提供する。

調べられた特定のマトリックスタンパク質は、Ｍ１の断片である。全長Ｍ１タンパク質は２７．８ｋＤａタンパク質であるが、観察された断片は低分子量ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約５ｋＤａの分子量である（以下を参照）。このタンパク質は高度に保存されたアミノ酸配列ＬＳＹＳＸＧＡＬＡ（配列番号１）、ここでＸはＡまたはＴ、を含む。したがって本発明は、マトリックスタンパク質が２０ｋｄＤａ未満の分子量を有しており、配列番号１に少なくとも５０％の同一性（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列を含むことを特徴として、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。観察された別のＭ１断片は約７５アミノ酸長であり、完全なＭ１配列のＮ末端メチオニンを欠く（例えばそれは、アミノ酸配列の配列番号２８または配列番号２９を有する）。したがって本発明は、マトリックスタンパク質が天然のＭ１配列のＮ末端メチオニンを欠くＭ１タンパク質である、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。マトリックスタンパク質は、配列番号２８または配列番号２９に少なくとも５０％の同一性（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。この断片は、Ｎ末端メチオニンの欠損に加えて、Ｎ末端メチオニンから下流の１つまたは複数のさらなるアミノ酸を欠いてもよい。

これらの組成物は好ましくは細胞培養において増殖させたウイルスから調製されるが、それらはあるいは他の手段で、例えば卵由来ワクチンにマトリックスタンパク質を追加することにより、マトリックスタンパク質の産生および存在をもたらす卵由来ビリオンの精製プロトコールの使用により、組換えにより発現されたＨＡ（および任意で他の組換えにより発現されたタンパク質）にマトリックスタンパク質を組み合わせることなどにより、調製することができる。

抗原成分の調製
本発明は全ビリオン（ＷＶ）抗原を使用せず、すなわち生ウイルスまたは不活性化全ビリオンを使用するワクチンを含まない。その代りに、本発明の抗原は、スプリットビリオンのような非ＷＶ抗原または精製表面抗原である。本発明の組成物は、少なくとも２つのインフルエンザウイルス抗原、すなわち血球凝集素およびマトリックスを含む。それらは、ノイラミニダーゼのような他のインフルエンザウイルス抗原も含んでもよい。抗原は典型的には、インフルエンザビリオン（好ましくは細胞培養において増殖させた）から調製されるだろうが、いくつかの実施形態において、抗原は組換え宿主において（例えばパキュロウイルスベクターを使用する昆虫株化細胞において）発現させることができ、精製された形式で使用することができる［３、４］。しかしながら一般に、抗原はビリオンからであるだろう。

ビリオンからの非ＷＶ抗原調製において、ビリオンは不活性化されてもよい。ウイルス不活性化のための化学的手段は、界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンまたはメチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、二成分エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはその組合せの薬剤のうちの１つまたは複数の効果的な量による処理を含む。ウイルス不活性化の非化学的な方法は、例えば紫外線またはガンマ線照射などが当技術分野において公知である。

ビリオンは、ウイルス含有液体から様々な方法によって採取することができる。例えば精製過程は、ビリオンを破壊するために界面活性剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用する、ゾーン遠心法を含んでもよい。次に抗原は、ダイアフィルトレーションによって、任意で希釈後に精製されてもよい。

スプリットビリオンは、サブビリオン調製品を産生するために、界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、トリトンＸ−１００、トリトンΝ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ΝＰ９など）により精製ビリオンを処理すること（「ツイーン−エーテル」スプリッティング過程を含む）によって得られる。インフルエンザウイルスのスプリッティング法は、当技術分野において周知であり、例えば参考文献５〜１０などを参照。ウイルスのスプリッティングは、スプリッティング剤の破壊にふさわしい濃度により、感染性か無感染性かにかかわらず、全ウイルスの破壊または断片化によって典型的には実行される。破壊により、ウイルスの構造全体性は変化し、ウイルスタンパク質の完全な可溶化または部分的な可溶化がもたらされる。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば陽イオン性）界面活性剤であり、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ヘカメグ（Ｈｅｃａｍｅｇ）、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばトリトンＸ−１００またはトリトンＮ１０１のような、トリトン界面活性剤）ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイーン界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。有益なスプリッティング手順の１つは、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続効果を使用し、スプリッティングは、ビリオン精製初期（例えばショ糖密度勾配溶液において）の間に起こる。したがって、スプリッティング過程は、ビリオン含有物質の清澄化（非ビリオン物質を除去するため）、採取されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着のような吸着方法を使用して）、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリッティング剤を使用するビリオンのスプリッティング（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリッティング剤を含むショ糖勾配を使用して）、および次に所望されない物質を取り出すための濾過（例えば限外濾過）を含むことができる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張食塩水中に有用に再懸濁することができる。ベグリバック（ＢＥＧＲＩＶＡＣ）（商標）、フルアリックス（ＦＬＵＡＲＩＸ）（商標）、フルゾーン（ＦＬＵＺＯＮＥ）（商標）およびフルシールド（ＦＬＵＳＨＩＥＬＤ）（商標）製品は、スプリットワクチンである。

精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の血球凝集素および典型的にはノイラミニダーゼもまた含む。精製された形式でこれらのタンパク質を調製する過程は、当技術分野において周知である。フルビリン（ＦＬＵＶＩＲＩＮ）（商標）、アグリッパル（ＡＧＲＩＰＰＡＬ）（商標）およびインフルバック（ＩＮＦＬＵＶＡＣ）（商標）製品はサブユニットワクチンである。

インフレキシアル（ＩＮＦＬＥＸＡＬ）Ｖ（商標）およびインババック（ＩＮＶＡＶＡＣ）（商標）製品でのように、インフルエンザ抗原は、ビロゾーム［１１］（核酸不含有ウイルス様リポソーム粒子）の形式でも提示することができるが、本発明と共にビロゾームを使用しないことが好まれる。したがっていくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原はビロゾームの形式で存在しない。

インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは温度感受性であってもよい。インフルエンザウイルスは低温適応性であってもよい。抗原として生ウイルスを使用するときには、これらの３つの特徴は特に有益である。

ワクチンで使用されるインフルエンザウイルス株はシーズンごとに変わる。現行の汎流行中間期において、ワクチンは典型的には２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ型株を含み、三価ワクチンが典型的である。本発明は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株（特にインフルエンザＡ型ウイルスの）のような汎流行株（すなわちワクチン接種者および一般的なヒト集団に対して免疫学的にナイーブである株）からのＨＡもまた使用してもよく、汎流行株のためのインフルエンザワクチンは単味ワクチンであってもよいか、または汎流行株によって補われた通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかしながらシーズンおよびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、１つまたは複数のインフルエンザＡ型ウイルスＨＡサブタイプのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６に対して防御してもよい。本発明は、１つまたは複数のインフルエンザＡ型ウイルスＮＡサブタイプのＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９に対して防御してもよい。

本発明の組成物は、汎流行中間期の株に対する予防接種に適切であることに加えて、汎流行株に対する予防接種に特に有用である。インフルエンザ株に汎流行の大発生をもたらす潜在能力を付与する特性は、（ａ）インフルエンザ株が現在流行しているヒト株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素、すなわち１０年間以上ヒト集団において明らかでない血球凝集素（例えばＨ２）、または今までにヒト集団で全く見られたことのない血球凝集素（例えばトリ集団中でのみ一般的には見出されるＨ５、Ｈ６またはＨ９）を含み、ヒト集団がインフルエンザ株の血球凝集素に免疫学的にナイーブであることと；（ｂ）インフルエンザ株がヒト集団において水平感染を起こしうることと；（ｃ）インフルエンザ株がヒトに対して病原性であることである。Ｈ５血球凝集素タイプを有するウイルスは、Ｈ５Ｎ１株のような汎流行インフルエンザに対する予防接種に好ましい。他の可能な株は、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに他の汎流行の可能性のある新興株を含む。Ｈ５サブタイプ内で、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され［１２］、特にクレード１および３は関連する。

抗原が組成物中に有用に含まれることが可能な他の株は、耐性汎流行株［１４］を含む、抗ウイルス薬の治療に対して耐性のある（例えば、オセルタミビル［１３］および／またはザナミビルに対して耐性のある）株である。

本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む、１つまたは複数の（例えば１、２、３または４以上の）インフルエンザウイルス株からの抗原を含んでいてもよい。単味ワクチンは好ましくなく、ワクチンがインフルエンザの１つ以上の株を含んでいる場合には、異なる株は典型的には別々に増殖させ、ウイルスが採取され抗原が調製された後に混合される。したがって、本発明の過程は、１つ以上のインフルエンザ株からの抗原を混合する工程を含んでもよい。三価ワクチンは、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株からの抗原を含んでおり、好ましい。

本発明のいくつかの実施形態において、組成物は単一のインフルエンザＡ型株からの抗原を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、Ａ型株からの２つの株がＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２でなければ、組成物は２つのインフルエンザＡ型株からの抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上のインフルエンザＡ型株からの抗原を含んでもよい。

インフルエンザウイルスはリアソータント株であってもよいし、リバースジェネティクス技術によって得られてもよい。リバースジェネティクス技術［例えば、１５〜１９］により、プラスミドを使用して、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスのインビトロでの調製を可能にする。典型的には、細胞中での両方のタイプのＤＮＡの発現が完全な状態の感染性ビリオンの集合を導くように、（ａ）例えばｐｏｌＩプロモーターから、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）例えばｐｏｌＩＩプロモーターから、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子の発現を含む。ＤＮＡは好ましくはウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質をすべて提供するが、ＲＮＡおよびタンパク質のうちのいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することも可能である。各ウイルスＲＮＡの産生に個別のプラスミドを使用するプラスミドに基づく方法が好ましく［２０〜２２］、これらの方法は、さらにウイルスタンパク質のすべてまたはいくつか（例えばＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質だけ）を発現するためにいくつかの方法において使用されている１２のプラスミドによる、プラスミドの使用も含むだろう。

必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［２３］は、同一のプラスミド上に（ウイルスＲＮＡ合成のための）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、および別のプラスミド上にＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質をコードする領域（例えば１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を組み合わせる。参考文献２３の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上に、ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡをコードする領域と；（ｂ）単一のプラスミド上にすべての８つのｖＲＮＡをコードするセグメントとを含む。１つのプラスミド上にＮＡおよびＨＡのセグメントおよび別のプラスミド上に６つの他のセグメントを含むことは、さらに問題を容易にするかもしれない。

ウイルスＲＮＡセグメントをコードするｐｏｌＩプロモーターの使用に対する代替物として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの使用が可能である［２４］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターは都合よく使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、外来性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクションしなければならないが、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは多くの細胞タイプ（例えばＭＤＣＫ）に、より都合よくなりえる。

他の技術において、同時に単一の鋳型からウイルスＲＮＡ、および発現可能なｍＲＮＡをコードする２のｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することは可能である［２５、２６］。

したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスからの１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでもよい（典型的には、ワクチン株からＨＡセグメントおよびＮセグメントと共に、Ａ／ＰＲ／８／３４からの６つのセグメント、すなわち６：２リアソータント）。それは、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスからの、またはワクチン調製のためのリアソータントウイルスを生じさせるために有用な他のウイルス株からの１つまたは複数のＲＮＡセグメントもまた含んでもよい。典型的には、本発明は、ヒトからヒトへの感染が可能な株に対して防御し、そのため通常は、株のゲノムは、哺乳類（例えばヒトにおいて）インフルエンザウイルスから生じた少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むだろう。それは、トリインフルエンザウイルスから生じたＮＳセグメントを含んでもよい。

抗原源として使用されるウイルスは、一般には細胞培養で増殖させるが、いくつかの実施形態において、卵で増殖させてもよい。インフルエンザウイルス増殖のための現行標準方法は、ウイルスが卵内容物（尿膜腔液）から精製される特定病原体未感染（ＳＰＦ）孵化鶏卵を使用する。しかしながらより最近では、ウイルスは動物細胞培養において増殖され、速さおよび患者アレルギーの理由のためにこの増殖方法は好ましい。卵に基づくウイルス増殖が使用されるならば、１つまたは複数のアミノ酸はウイルスと共に卵の尿膜腔液に導入されてもよい［１０］。

細胞基質は典型的には哺乳類起源の株化細胞になるだろう。適切な起源の哺乳類の細胞は、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類（ヒトおよびサルを含む）細胞およびイヌ細胞を含むが、これらに限定されない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような様々な細胞タイプが使用されてもよい。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣと呼ばれる株化細胞である。適切なサル細胞は、例えばベロ株化細胞のような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えばＭＤＣＫ株化細胞のような腎臓細胞である。したがって適切な株化細胞は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ベロ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などを含むが、これらに限定されない。哺乳類細胞の使用は、ワクチンが卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）をもたないことに加えて、ニワトリＤＮＡをもたないことを意味し、その結果としてアレルゲン性を減少させる。インフルエンザウイルスの増殖のための好ましい哺乳類株化細胞は、マディン−ダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２７〜３０］；アフリカミドリザル（セルコピテカス・エチオプス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ））腎臓に由来するベロ細胞［３１〜３３］；またはヒト胚網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［３４］を含む。これらの株化細胞は、例えばアメリカン・タイプ・セル・カルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（ＡＴＣＣ）コレクション［３５］、コリエル細胞貯蔵所（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）［３６］、またはヨーロッパ細胞培養コレクション （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ）（ＥＣＡＣＣ）から広く利用可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるベロ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから利用可能である。哺乳類株化細胞に対して好ましさの劣る代替物として、ウイルスは、アヒル（例えばアヒル網膜）またはニワトリに由来した株化細胞を含む、トリ株化細胞で増殖することができる［例えば参考文献３７〜３９］。トリ株化細胞の例はトリ胚性幹細胞［３７、４０］およびアヒル網膜細胞［３８］を含む。適切なトリ胚性幹細胞は、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ株化細胞のＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４を含む［４１］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた使用されてよい。

インフルエンザウイルスの増殖のための最も好ましい株化細胞は、ＭＤＣＫ株化細胞である。もとのＭＤＣＫ株化細胞はＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから利用可能であるが、この株化細胞の派生細胞もまた使用されてよい。例えば参考文献２７は、懸濁培養での増殖に適合したＭＤＣＫ株化細胞を開示する（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）。同様に、参考文献４２は、無血清培養において懸濁状態で増殖する、ＭＤＣＫに由来する株化細胞を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。参考文献４３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献４４は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染への高感受性を有するＭＤＣＫ株化細胞を開示する。これらのＭＤＣＫ株化細胞のうちのいずれかを使用することができる。

細胞増殖のための培養、およびさらに培養を始めるために使用されるウイルス接種物には、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、シルコウイルス、および／またはパルボウイルスが存在しない（すなわち検査され、混入について陰性の結果が与えられる）ことが好ましい［４５］。単純ヘルペスウイルスが存在しないことは特に好ましい。

ウイルスは懸濁培養［４６］、または接着培養の細胞で増殖されてもよい。１つの実施形態において、細胞は懸濁での増殖に適合しているかもしれない。懸濁培養での増殖に適合した適切なＭＤＣＫ株化細胞の１つは、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養を使用することができる。

インフルエンザウイルス複製を支持する株化細胞は、好ましくは無血清培地および／または無タンパク質培地で増殖される。本明細書の文脈では、ヒトまたは動物由来の血清からの添加物がない培地は無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質の除外により細胞の増殖が起こるが、任意でトリプシンまたはウイルス増殖に必要かもしれない他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる培養を意味すると理解される。そのような培養中で自然に増殖する細胞は細胞自体のタンパク質を含む。

インフルエンザウイルス複製を支持する株化細胞は、好ましくはウイルス複製の間に３７℃以下［４７］（例えば３０〜３６℃）で増殖される。

培養された細胞においてウイルスを増殖させる方法は、一般に培養されるべき株で培養された細胞に接種する工程と、例えばウイルス力価または抗原発現により決定されるようなウイルス増殖のために、所望の期間感染細胞を培養する工程と（例えば接種後２４〜１６８時間）、増殖させたウイルスを回収する工程とを含む。培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の細胞比率までのウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ_５０により測定された）で接種される。ウイルスは懸濁細胞へ追加されるか単層細胞へ適用され、ウイルスは少なくとも６０分間、しかし通常は３００分未満、好ましくは９０〜２４０分で、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で、細胞上で吸収される。採取された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、感染細胞培養（例えば単層）は、凍結融解または酵素作用により取り出されてもよい。採取された液体は、次に不活性化または凍結保存する。培養される細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させてもよい。さらに好ましくは、細胞は約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で採取されてもよい。好ましくは、細胞は感染後３４〜４８時間で採取される。さらに好ましくは、細胞は感染後３８〜４０時間で採取される。プロテアーゼ（典型的にはトリプシン）は、一般にウイルス放出を可能にするために細胞培養の間に追加され、プロテアーゼは培養の間に任意の適切な段階で追加することができる。

ＨＡは、現行の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤにより測定されるＨＡレベルへの参照により標準化される。既存のワクチンは典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、例えば子供に対して、または汎流行状況において、またはアジュバントを使用するときにはより低い用量を使用することができる。より高用量（例えば３×または９×用量［４８および４９］）であるので、１／２（すなわち１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの分割量が使用される［８９および９０］。したがってワクチンは、１インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含んでもよい。特定の用量は、１株あたり例えば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５、などを含む。

生菌ワクチンについては、用量はＨＡ含有量よりもむしろ中央値組織培養感染用量（ＴＣＩＤ_５０）により測定され、１株あたり１０^６〜１０^８（好ましくは１０^６．５〜１０^７．５）のＴＣＩＤ_５０が典型的である。

本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然ＨＡまたは修飾されたものでもよい。例えば、トリ種においてウイルスを高病原性にする決定基（例えばＨＡ１とＨＡ２間の切断部位のまわりの超塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾すること（除去しない場合にはこれらの決定基がウイルスの卵中での増殖を阻害するので）が公知である。

マトリックスタンパク質
血球凝集素を含むことに加えて、本発明の組成物はマトリックスタンパク質を含む。インフルエンザＡ型ウイルスのセグメント７はＭ１ポリペプチドおよびＭ２ポリペプチドをコードする。Ｍ１はウイルス脂質二重層の下にあるが、Ｍ２はアマンタジンにより阻害されるイオンチャネルを呈する膜内在型タンパク質である。Ｍ２はスプライシングされたｍＲＮＡから発現される。インフルエンザＢ型ウイルスのセグメント７は、Ｍ１およびＢＭ２のポリペプチドをコードする。

本発明の組成物中に含まれるマトリックスタンパク質は、典型的にはインフルエンザＡ型ウイルスからのＭ１タンパク質である。ＰＲ／８／３４インフルエンザＡ型ウイルスからの全長２５２アミノ酸のＭ１配列は、ＧＩ：１３８８１７でデータベースにおいて利用可能であり、それは本明細書において配列番号２で以下の配列である。

本発明の組成物中に含まれるマトリックスタンパク質は、好ましくは前記ｍアミノ酸が、配列番号２に少なくともｎ％同一性を有し、少なくともｍアミノ酸長であるＭ１アミノ酸配列を含む。ｍアミノ酸は、典型的には配列番号２からの少なくともｐ連続アミノ酸断片を含むだろう。

ｍの値は、例えば７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上でありえる。ｎの値は、例えば７０（例えば７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上）でありえる。ｐの値は、例えば５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上でありえる。ｎが＜１００である場合には、ｐはｍ未満であるだろう。

ｍアミノ酸の配列は、配列番号２と比較して、１つまたは複数の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）保存的アミノ酸置換（すなわち関連した側鎖を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換）を含んでもよい。遺伝子にコードされるアミノ酸は一般に、（１）酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸と；（２）塩基性アミノ酸、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジンと；（３）非極性アミノ酸、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンと；（４）非荷電極性アミノ酸、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンの４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として時には併用して分類される。一般に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は生物活性に重大な影響を持たない。ｍアミノ酸は、配列番号２と比較して、１つまたは複数の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）単一アミノ酸欠失もまた含んでもよい。ｍアミノ酸は、配列番号２と比較して、１つまたは複数の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）挿入（例えば各々１、２、３、４または５アミノ酸）もまた含んでもよい。

本発明の組成物への含有のために好ましいマトリックスタンパク質は、Ｍ１からのエピトープを含む。エピトープは、Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープであってもよい。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、経験的に同定することができるか（例えばペプスキャン（ＰＥＰＳＣＡＮ）［５０、５１］または類似した方法を使用して）、またはそれらは予測することができる（例えば ジェームソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）抗原性指標［５２］、マトリクスに基づくアプローチ［５３］、テピトープ（ＴＥＰＩＴＯＰＥ）［５４］、ニューラルネットワーク［５５］、オプティマー＆エピマー（ＯｐｔｉＭｅｒ＆ ＥｐｉＭｅｒ）［５６および５７］、ＡＤＥＰＴ［５８］、Ｔサイツ（Ｔｓｉｔｅｓ）［５９］、親水性［６０］、抗原性指標［６１］または参考文献６２に開示された方法などを使用して）。そのような方法により、Ｔ細胞エピトープは、以下を含むインフルエンザＡ型ウイルスＭ１タンパク質中で既に同定されている［６３］。

Ｍ１中の他のＴ細胞エピトープは、ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶ（配列番号１５；配列番号２の残基２〜１１）と；ＩＩＰＳＧＰＬＫ（配列番号１６；配列番号２の残基１４〜２１）と；ＬＥＤＶＦＡＧＫ（配列番号１７；配列番号２の残基２８〜３５）とを含む。

細胞培養において調製されたワクチンで最初に検出された特定のマトリックスタンパク質は、Ｎ末端配列ＥＩＳＬＳＹＳＡＧＡＬＡ（配列番号１８；配列番号２の残基１１４〜１２５）を有する５ｋＤａタンパク質である。このポリペプチドのＮ末端およびサイズはＭ１のトリプシン断片に一致しており、その場合には、全長ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有しているかもしれない。

配列番号１９は、亜鉛に対する親和性を付与する完全なＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓモチーフ（配列番号２の残基１４８−１６２）を含む［７２］。したがって、本発明で使用されるマトリックスタンパク質はさらに亜鉛イオンを含んでもよい。

配列番号１８配列は、５番目の残基「Ｘ」がＴｈｒ（ＬＳＹＳＴＧＡＬＡ、配列番号２１）またはＡｌａ（ＬＳＹＳＡＧＡＬＡ、配列番号２２）のいずれかで、配列ＬＳＹＳＸＧＡＬＡ（配列番号１）（それらはインフルエンザＡ型ウイルス株間で非常によく保存されている）を含む。この保存された９量体の変異は知られている（例えば、Ａ／ブタ／オンタリオ／０１９１１−２／９９（Ｈ４Ｎ６）において、９量体はＬＮＹＳＴＧＡＬＡ［ＧＩ１０４４２６７８；配列番号２３］であり、Ａ／ブタ／イギリス／１９１９７３／９２（Ｈ１Ｎ７）において、９量体はＬＧＹＳＴＧＡＬＡ［ＧＩ１８３５７３４；配列番号２４］であり、Ａ／ニワトリ／ペンシルバニア／１３６０９／９３（Ｈ５Ｎ２）において、９量体はＬＳＹＳＴＧＡＬＴ［ＧＩ：４５８４９４８；配列番号２５］であり、Ａ／ＷＳＮ／３３において、９量体はＦＳＹＳＡＧＡＬＡ［ＧＩ：３２４４０７；配列番号２６］である）が、配列番号１は最も共通する配列である。コアＹＳＸＧＡＬ（配列番号２７）はこれらの配列のすべてにおいて重要な役割を演じる。インフルエンザウイルスの配列は、www.flu.lanl.govでインフルエンザ配列データベース（ＩＳＤ）で便利に捜し出すことができる［７３］。さらなる配列は参考文献７４において見出すことができる。

したがって本発明の組成物中に含まれる好ましいマトリックスタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸配列の配列番号１、２１、２２、２３、２４、２５、２６および／または２７を含む。しかしながら、全長Ｍ１タンパク質は２７．８ｋＤａタンパク質であるが、本発明の組成物中に含まれるマトリックスタンパク質は、２０ｋＤａ、例えば≦１５ｋＤａ、≦１２ｋＤａ、≦１０ｋＤａ、≦９ｋＤａ、≦８ｋＤａ、≦７ｋＤａ、≦６ｋＤａ、≦５．５ｋＤａ、または約５ｋＤａである。マトリックスタンパク質の分子量は、好ましくは２〜８ｋＤａ、例えば３〜７ｋＤａ、４〜６ｋＤａ、または約５ｋＤａの範囲以内にある。マトリックスタンパク質のＮ末端は、アミノ酸配列の配列番号１、１９、２０、２１、２２、２３または２４のうちの１つが後に続くＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒであってもよい。

マトリックスタンパク質は、組成物内でオリゴマー（例えばホモダイマーなどの二量体）を形成してもよい。マトリックスタンパク質がアミノ酸１３７（配列番号２中での番号付け）を含むならば、このアミノ酸は、Ａｌａ（配列番号２中でのように）またはＴｈｒ（病原性Ｈ５Ｎ１ヒトウイルスにおいて見られたように）であるだろう。マトリックスタンパク質は様々な量で存在してもよいが、典型的には１μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌ、例えば２〜１４μｇ／ｍｌ、３〜１３μｇ／ｍｌ、４〜１２μｇ／ｍｌ、５〜１１μｇ／ｍｌ、６〜１０μｇ／ｍｌ、７〜９μｇ／ｍｌなどで存在してもよい。１未満μｇ／ｍｌの濃縮もまた可能である。

血球凝集素に加えてこれらのマトリックスタンパク質を含むことにより、次に本発明の組成物は、存在する任意のＴ細胞エピトープから利益を得て、それらはワクチンにより誘発された交差防御（同一ＨＡタイプ内の、および異なるＨＡタイプ間も）を改善してもよい［７５］。マトリックスタンパク質は、組成物調製（例えば、それはＨＡと共に共精製してもよい）の結果として、内在的に存在してもよいか、またはマトリックスタンパク質は、例えば卵由来ワクチンを含むマトリックス成分不含ワクチンを改善するために、外来性の成分として追加されてもよい。

理論に束縛されることを意図せずに、本発明者は、安定した複合体を形成するためにワクチンのＨＡへマトリックスタンパク質が結合するだろうと考える。複合体がＨＡ単独よりも安定しているならば、ワクチン保管期間および特に冷蔵庫に入れない保存に耐える能力は改善されてもよい。

Ｍ１中の配列番号１の周囲の領域は脂質結合ドメインとして働くことができる［７６］。より詳細に以下に記述されるように、マトリックスタンパク質中にこの領域を含むことにより、したがって、タンパク質は脂質アジュバントと有利に相互作用することができる。

組成物が１つ以上のインフルエンザＡ型ウイルス株からのＨＡを含む場合には、組成物は一般に１つ以上の株からのマトリックスタンパク質もまた含むだろう。しかしながらこれらの株からのＨＡは互いとは通常異なっているだろうが、マトリックスタンパク質は同じであってもよい。マトリックスタンパク質が同一ならば、最終産物において２つのマトリックスタンパク質を区別することは可能でいかもしれないが、それらは異なる起源を有するだろう。

ＨＡおよびマトリックスを含むことに加えて、本発明の組成物はノイラミニダーゼおよび／または核タンパク質を含んでもよい。

組成物がインフルエンザＢ型ウイルスからのＨＡを含んでいる場合には、この組成物はインフルエンザＢ型ウイルスからのＭ１タンパク質もまた含んでよい。

宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスを株化細胞で増殖させた場合には、ＤＮＡの任意の腫瘍形成活性を最小限にするために、最終的なワクチン中の株化細胞ＤＮＡの残余量を最小限にすることが標準的技法である。マトリックスタンパク質は核酸（ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む）へ結合することができ［７７］、したがって既存のＨＡに基づくワクチンよりも容易にＤＮＡを保持するので、ワクチン中にインフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質を含んでいる場合、この安全対策は特に重要である。

したがって微量の宿主細胞ＤＮＡは存在してもよいが、組成物は好ましくは１用量あたり１０ｎｇ未満の（好ましくは１ｎｇ、およびより好ましくは１００ｐｇ未満の）宿主細胞残余ＤＮＡを含む。任意の宿主細胞残余ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満で存在していることが好ましい。一般に、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。

宿主細胞残余ＤＮＡの測定は、現在では生物製剤のための所定の規制基準であり、当業者には通常可能である。ＤＮＡを測定するために使用される分析は典型的には検証分析になるだろう［７８、７９］。検証分析の性能特性は、数学的かつ定量化可能な用語で記述することができ、可能性のある誤差源が同定されるだろう。この分析は、正確性、精度、特異性などの特性について一般に検査されるだろう。一旦分析が検定され（例えば既知の基準量の宿主細胞ＤＮＡに対して）検査されれば、次に定量的ＤＮＡ測定は慣例的に実行できる。ＤＮＡ定量化のための以下の３つの原理技術を使用することができる。サザンブロットまたはスロットブロットなどハイブリダイゼーション法［８０］；スレッショルド（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（商標）システムなど免疫測定方法［８１］；および定量的ＰＣＲ［８２］。各方法の正確な特性は、当該宿主細胞（例えばハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）に依存してもよいが、これらの方法はすべて当業者によく知られている。モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）社からのスレッショルド（商標）システムは、総ＤＮＡのピコグラムレベルのための定量的分析で、バイオ製剤［８１］中の混入ＤＮＡレベルのモニタリングのために使用された。典型的な分析は、ビオチン化されたｓｓＤＮＡ結合タンパク質とウレアーゼ結合抗ｓｓＤＮＡ抗体とＤＮＡ間の反応複合体の配列非特異的な形成を含む。分析成分はすべて、製造業者から利用可能な、完全な総ＤＮＡ分析キットに含まれる。様々な市販の製造業者は、宿主細胞残余ＤＮＡ検出のために定量的ＰＣＲ分析を提示する（例えばアペテック（ＡｐｐＴｅｃ）（商標）、ラボラトリー・サービス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）社、バイオリライアンス（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ）（商標）、アルセア・テクノロジーズ（Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社など）。ヒトのウイルス性ワクチンの、宿主細胞ＤＮＡ混入の測定のための化学発光ハイブリダイゼーション分析と全ＤＮＡスレッショルド（商標）システムの比較は、参考文献８３で見出すことができる。

ＤＮＡ混入は、標準的精製法（例えばクロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製間に除去できる。宿主細胞残余ＤＮＡの除去はヌクレアーゼ処理により、例えばＤＮａｓｅの使用により促進することができる。宿主細胞ＤＮＡ混入減少のために好都合な方法は、参考文献８４および８５に開示され、２工程の処理を含んでおり、最初はＤＮａｓｅ（例えばベンゾナーゼ）の使用であり、これはウイルス増殖の間に使用されてもよく、次に陽イオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）であり、これはビリオン破壊の間に使用されてもよい。β−プロピオラクトンなどアルキル化剤による処理もまた宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用することができ、ビリオンを不活性化するために都合よく使用されてもよい［８６］。

容量０．２５ｍｌあたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンなので、１５μｇの血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含んでいるワクチンが好ましい。ワクチンが容量０．５ｍｌあたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むので、５０μｇの血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンはさらに好ましい。

アジュバント
本発明の組成物は、都合よくアジュバントを含んでもよく、それは組成物を投与される患者に誘発される免疫反応（液性および／または細胞性）を促進するために機能することができる。インフルエンザワクチンとのアジュバントの使用は以前に記述されている。参考文献８７および８８において、水酸化アルミニウムが使用され、参考文献８９において、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの混合物が使用された。参考文献９０は、アルミニウム塩アジュバントの使用についても記述した。カイロン・ワクチン（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）社からのフルアド（ＦＬＵＡＤ）（商標）製品は、水中油滴型エマルジョンを含む。

本発明で使用することができるアジュバントは以下のものを含むが、これらに限定されない。

・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）を含むミネラル含有組成物。カルシウム塩はリン酸カルシウム（例えば参考文献９１に開示された「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は、任意の適切な形式をとる塩（例えばゲル、結晶質、非結晶質など）で、水酸化物、リン酸塩および硫酸塩などを含んでいる。これらの塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物は金属塩の粒子としても製剤化されてよい［９２］。アルミニウム塩アジュバントはより詳細に以下に記述される。

・サイトカイン誘導剤（より詳細に以下に参照）。

・樹皮、葉、茎、根および広範囲の植物種の花などで見出されるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異種グループである、サポニン［参考文献１２８の２２章］。バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは、スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびサポナリア・オフィシアナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（サボンソウ根）からもまた商業的に得ることができる。サポニンアジュバント製剤は、ＩＳＣＯＭのような脂質製剤に加えて、ＱＳ２１のような精製製剤も含んでいる。ＱＳ２１はスティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（商標）として市場へ出される。サポニン組成物はＨＰＬＣおよび逆相ＨＰＬＣを使用して精製されてきた。これらの技術を使用する特異的精製画分は、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含んで、同定された。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１産生方法は参考文献９３に開示される。サポニン製剤は、さらにコレステロールのようなステロールを含んでもよい［９４］。サポニンおよびコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成するために使用することができる［参考文献１２８の２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的にはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質もまた含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは１つまたは複数のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣを含んでいる。ＩＳＣＯＭはさらに参考文献９４〜９６に記載されている。任意で、ＩＳＣＯＭＳは付加的な界面活性剤がなくてもよい［９７］。サポニンに基づくアジュバントの開発の総説は、参考文献９８および９９に見出すことができる。

・水中油滴型エマルジョンを含む脂質アジュバント（より詳細には以下を参照）。

・ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［１００］として公知の変異体毒素のような、細菌のＡＤＰリボシル化毒素（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその解毒された誘導体。粘膜アジュバントとしての解毒されたＡＤＰリボシル化毒素の使用は参考文献１０１に、および非経口アジュバントとしては参考文献１０２に記載される。

・エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア［１０３］またはキトサンおよびその誘導体［１０４］のような、生体接着物質および粘膜接着物質。

・負に荷電した表面（例えばＳＤＳにより）または正に荷電した表面（例えばＣＴＡＢのような陽イオン性界面活性剤により）を有するように任意で処理された、好ましいラクチド・グリコリドコポリマーと共に、生物分解性であり無毒な物質（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸およびポリオルトエステルおよびポリ無水物およびポリカプロラクトンなど）から形成されるミクロ粒子（すなわち直径で〜１００ｎｍから〜１５０μｍ、より好ましくは、直径で〜２００ｎｍから〜３０μｍ、または直径で〜５００ｎｍから〜１０μｍの粒子）。

・リポソーム（参考文献１２８の１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適切なリポソーム製剤の例は、参考文献１０５〜１０７に記載されている。

ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１０８］。さらなるそのような製剤は、オクトキシノールのような少なくとも１つの付加的な非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１１０］に加えて、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１０９］を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルの群から選択される。

Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「テラミド（Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ）（商標）」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホルイルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）のようなムラミルペプチド。

・外膜タンパク質プロテオソームおよびリポサッカライド調製品が安定した非共有結合のアジュバント複合体を形成することを特徴とする、第２のグラム陰性細菌に由来するリポサッカライド調製品と組み合わせた第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製品。そのような複合体は、「ＩＶＸ−９０８」、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）外膜およびリポポリサッカライドからなる複合体を含む。それらはアジュバントとしてインフルエンザワクチンに使用されてきた［１１１］。

・ポリオキシドオニウムポリマー［１１２，１１３］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体．
・メチルイノシン５’−１リン酸（「ＭＩＭＰ」）［１１４］。

・以下の式を持つような、ポリ水酸化ピロリジジン化合物［１１５］

式中Ｒは、水素、直鎖または分岐した、非置換または置換された、飽和または不飽和の、アシル基、アルキル基（例えばシクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、またはその薬学的に許容される塩または誘導体を含む群から選択される。例は、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ‐グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどを含むが、これらに限定されない。

・α−グリコシルセラミド［１１６−１２３］（例えばα−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルフォ−ガラクトシルセラミドなどのようなＣＤ１ｄリガンド．
・アルガムリンのような、γイヌリン［１２４］またはその誘導体。

これらおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１２８および１２９中で、より詳細に論じられる。組成物は、前記アジュバントの２つ以上を含んでもよい。例えば、水中油滴型エマルジョンおよびサイトカイン誘導剤の組合せが、エマルジョンまたは薬剤のいずれかがそのままで使用される場合に見られたよりもはるかに大きい改善で、インターフェロン−γ反応のようなインフルエンザワクチンにより誘発されるサイトカイン反応を改善するので、組成物は都合よく水中油滴型エマルジョンおよびサイトカイン誘導剤の両方を含んでもよい。

組成物中の抗原およびアジュバントは典型的には混合剤中にあるだろう。

水中油滴型エマルジョンアジュバント
水中油滴型エマルジョンはインフルエンザウイルスワクチンにアジュバント効果を与えるための使用のために特に適切であることが分かった。そのような様々なエマルジョンが公知であり、それらは典型的には少なくとも１つの油脂および少なくとも１つの界面活性剤を、生物分解性（代謝可能）、生体適合性のある油脂（複数可）および界面活性剤（複数可）の状態で含む。エマルジョン中の油滴は、一般に直径で５μｍ未満であり、安定したエマルジョンを提供するために微流動化装置により達成されている小さなサイズで、サブミクロン直径でさえあってもよい。濾過滅菌可能なように、２２０ｎｍ未満のサイズの液滴が好ましい。

本発明は、動物（魚類のような）または植物源からのもののような油脂を使用することができる。植物油のための源はナッツ、種子および穀類を含む。落花生油、大豆油、ココナッツオイルおよびオリーブオイルであり、最も一般的に利用可能な例は堅果油である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を使用できる。種子油は、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油および同種のものを含む。穀物群においてトウモロコシ油が最も容易に利用可能であるが、小麦、オートミール、ライ麦、コメ、テフ、ライ小麦および同種のもののような他の穀物の油脂も使用されてもよい。６〜１０炭素のグリセロール脂肪酸エステルおよび１，２−プロパンジオールは種子油において自然に存在しないが、堅果油および種子油からの適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製されていてもよい。哺乳類乳汁からの脂肪および油脂は代謝可能であり、したがって本発明の実行において使用されてもよい。分離、精製、鹸化、および動物源から純粋な油脂を得るために必要な他の手段のための手順は、当技術分野において周知である。大部分の魚類は、容易に回収される代謝可能な油脂を含む。例えば、鱈肝油、鮫肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において使用されてもよい、いくつかの魚油の例示である。多数の分枝鎖油脂は５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般にテルペノイドと呼ばれる。鮫肝油は、特に本明細書において好ましいスクワレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）として公知の分岐不飽和テルペノイドを含む。スクアラン（スクワレンの飽和類似化合物）はさらに好ましい油脂である。スクワレンおよびスクアランを含む魚油は、市販源から容易に利用可能であるか、または当技術分野において公知の方法により得られてもよい。他の好ましい油脂はトコフェロールである（以下を参照）。油脂の混合物を使用できる。

界面活性剤はそれらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性のバランス）により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にはツイーンと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０と；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどのＤＯＷＦＡＸ（商標）商品名で販売される、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマーと；特に興味深いオクトキシノール−９（トリトンＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）と共に、オクトキシノール（反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基数は変化可能）と；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）と；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質と；タージトール（商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレートと；トリエチレングリコールモノラウリル・エーテル（ブリジ３０）のような、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコール（ブリジ界面活性剤として知られている）に由来するポリオキシエチレン脂肪エーテルと；トリオレイン酸ソルビタン（スパン（Ｓｐａｎ ）８５）およびモノラウリン酸ソルビタンのような、ソルビタンエステル（一般にスパンとして公知である）とを含むが、これらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中の含有のために好ましい界面活性剤は、ツイーン８０（ツイーン８０）、スパン８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチンおよびトリトンＸ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えばツイーン８０／スパン８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン（ツイーン８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステル、およびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）のようなオクトキシノールの組合せもまた適切である。別の有益な組合せは、ラウレス９、とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールからなる。

好ましい量の界面活性剤（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイーン８０など）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ−１００、またはトリトンシリーズ中の他の界面活性剤など）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％および特に０．１〜１％または約０．５％である。

本発明で有益な具体的な水中油滴型エマルジョンアジュバントは以下を含むが、これらに限定されない。

・スクワレン、ツイーン８０およびスパン８５のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの組成物は、容量で約５％スクワレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％スパン８５でありえる。これらの比率は、重量で４．３％スクワレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％スパン８５である。参考文献１２８の１０章および参考文献１２９の１２章でより詳細に記載されているように、このアジュバントは「ＭＦ５９」［１２５〜１２７］として知られている。ＭＦ５９エマルジョンは、好都合なことにクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。

・スクワレン、αトコフェロールおよびツイーン８０のエマルジョン。エマルジョンはリン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。それはスパン８５（例えば１％で）および／またはレシチンもまた含んでもよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のツイーン８０を有していてもよく、より安定したエマルジョンを提供するので、スクワレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１である。スクワレンとツイーンの８０は、約５：２容量比で存在してもよい。そのようなエマルジョンの１つは、２％の溶液を生ずるようにＰＢＳ中にツイーン８０を溶解すること、次にこの９０ｍｌの溶液を混合物（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）に混合すること、および次に混合物を微流動化することによって作製することができる。結果として生じるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロン油滴を有してもよい。

・スクワレン、αトコフェロールおよびトリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは３ｄ−ＭＰＬもまた含んでもよい（以下を参照）。エマルジョンはリン酸緩衝剤を含んでもよい。

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００）およびαトコフェロール（例えばα−コハク酸トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００および１００μｇ／ｍｌα−コハク酸トコフェロール）の質量比でこれらの３つの成分を含んでいてもよく、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。エマルジョンはスクワレンもまた含んでもよい。エマルジョンは３ｄ−ＭＰＬもまた含んでもよい（以下を参照）。水相はリン酸緩衝剤を含んでもよい。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「プルロニック（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンはリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有益な送達賦形剤であり、「ＳＡＦ−Ｉ」アジュバント［１３０］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）中でスレオニル−ＭＤＰと共に使用されてきた。さらに、「ＡＦ」アジュバント［１３１］（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）でのように、このエマルジョンはＴｈｒ−ＭＤＰなしに使用することができる。微流動化が好ましい。

・０．５〜５０％油脂、０．１〜１０％リン脂質および０．０５〜５％非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１３２で記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、フォスファチド酸、スフィンゴミエリンおよびカルディオリピンである。サブミクロン液滴サイズは有利である。

・非代謝可能油脂（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、ツイーン８０またはスパン８０など）のサブミクロン水中油滴型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン脂溶性結合物（グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）への脂肪族アミンの付加により産生された、参考文献１３３で記載されるＧＰＩ−０１００のような）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウムおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような、添加物が含まれてもよい。

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）が、ヘリカルミセルとして結合されるエマルジョン［１３４］。

エマルジョンは、送達時に抗原にその場で混合されてもよい。したがってアジュバントおよび抗原は、パッケージにされたワクチンまたは分配されたワクチン（使用時で最終処方の準備ができている）中で別々に保存されてもよい。２つの液体の混合によってワクチンが最終的に調製されるように、抗原は一般に水溶性形式であるだろう。混合のための２つの液体の容量比は変化させることができる（例えば５：１〜１：５で）が、一般に約１：１である。

抗原およびアジュバントが混合された後、血球凝集素抗原は一般に水溶液中に留まるだろうが、油脂／水境界の近くに分布してもよい。一般に血球凝集素は、少しはエマルジョンの油相に入るだろう。

組成物がトコフェロールを含む場合には、α、β、γ、δ、εまたはξトコフェロールのいずれかを使用できるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールはいくつかの形式（例えば異なる塩および／または異性体）をとることができる。塩は、コハク酸塩および酢酸塩およびニコチン酸塩などのような有機塩を含む。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用できる。ビタミンＥが、高齢の患者（例えば、６０歳以上）の免疫反応に陽性効果を有すると報告されたので、トコフェロールは、この患者群で使用されるワクチンに有利に含まれる［１３５］。トコフェロールにはエマルジョンの安定化を支援する抗酸化特性もある［１３６］。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、ＴＮＦ関連リガンドとインビボで協調して働くことが見出されている。さらにα−コハク酸トコフェロールはインフルエンザワクチンと適合性があること、および水銀化合物に対する代替物として有益な防腐剤であることが公知である［９］。

サイトカイン誘導剤
インターフェロンおよびインターロイキンを含む放出サイトカインに対する免疫系を誘発するために患者に投与される場合、本発明の組成物への含有のためのサイトカイン誘導剤は可能である。サイトカイン反応はインフルエンザ感染に対する宿主防御の初期段階および決定的な段階に関与することが公知である［１３７］。好ましい薬剤は、インターフェロン−γ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数の放出を誘発できる。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型免疫反応に関連したサイトカイン（例えばインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２）の放出を誘発する。インターフェロン−γおよびインターロイキン−２の両方の刺激が好ましい。

本発明の組成物の投与の結果として、したがって患者は、インフルエンザ抗原で刺激された場合、抗原特異的様式で所望のサイトカインを放出するＴ細胞を有するだろう。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素にインビトロで暴露された場合、患者の血液から精製されたＴ細胞はγ−インターフェロンを放出するだろう。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてそのような反応を測定する方法は、当技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリーおよびリアルタイムＰＣＲを含む。例えば参考文献１３８は、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞を介した免疫反応（特にγ−インターフェロン反応）がモニタリングされる研究を報告し、ＥＬＩＳＰＯＴが、抗原特異的ＴＴ誘導反応と自然な反応とを識別するのに最も敏感な方法であるが、フローサイトメトリーによる細胞質内のサイトカイン検出が再刺激的効果を検出する最も効率的な方法であることを見出した。

適切なサイトカイン誘導剤は、以下を含むが、これらに限定されない。

・ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によりグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含むもののような免疫刺激オリゴヌクレオチド。

・３−Ｏ−脱アシル化モノフォスフォリルリピドＡ（「ＭＰＬ（商標）」として公知の「３ｄＭＰＬ」）［１３９〜１４２］。

・イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１４３，１４４］、レジキモド（「Ｒ−８４８」）［１４５］およびそれらの類似化合物のような、イミダゾキノリン化合物；ならびにその塩（例えば塩酸塩）。免疫刺激イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は参考文献１４６〜１５０で見出すことができる。

・参考文献１５１に開示されたもののようなチオセミカルバゾン化合物。活性化合物のための製剤化法、製造法およびスクリーニング法も、参考文献１５１に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの産生のためにヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。

・参考文献１５２に開示されたもののようなトリプタントリン化合物。活性化合物のための製剤化法、製造法およびスクリーニング法も、参考文献１５２に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの産生のためにヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。

・以下のようなヌクレオシド類似体。（ａ）イサトラビン（ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１５３〜１５５に開示される化合物；（ｆ）次式を有する化合物であって、

式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して水素、ハロ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−ＯＨ、Ｃ_１−６アルコキシ、置換されたＣ_１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、Ｃ_６−１０アリール、置換されたＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキル、または置換されたＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ_３は、水素、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、Ｃ_６−１０アリール、置換されたＣ_６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルでなく；
Ｒ_４およびＲ_５は、それぞれ独立して水素、ハロ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄ、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキルであるか、またはＲ_４−５におけるような五員環をともに形成するように結合し、

結合は、

により示された結合で達せられ、Ｘ_１およびＸ_２は、それぞれ独立して窒素、炭素、酸素、または硫黄であり；
Ｒ_８は、水素、ハロ、−ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_ｃ、−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）_ｐＲ_ｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄであり；
Ｒ_９は、水素、Ｃ_１−６、アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリルまたはＲ_９ａであり、
ここで、Ｒ_９ａは次式であり、

結合は

により示された結合で達せられ、
Ｒ_１０およびＲ_１１は、それぞれ独立して水素、ハロ、Ｃ_１−６アルコキシ、置換されたＣ_１−６アルコキシ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、または−ＯＨであり；
それぞれＲ_ａおよびＲ_ｂは、独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、Ｃ_６−１０アリールであり；
それぞれのＲ_ｃは、独立して水素、リン酸、二リン酸、三リン酸、Ｃ^１−６アルキル、または置換されたＣ_１−６アルキルであり；
それぞれのＲ_ｄは、独立して水素、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、置換されたＣ_１−６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｃ_１−６アルキル）、−ＮＨ（置換されたＣ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（置換されたＣ_１−６アルキル）_２、Ｃ_６−１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
それぞれのＲ_ｅは、独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、Ｃ_６−１０アリール、置換されたＣ_６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルであり；
それぞれのＲ_ｆは、独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、置換されたＣ_１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、リン酸、二リン酸、または三リン酸であり；それぞれのｎは、独立して０、１、２、または３であり；それぞれのｐは、独立して０、１、または２であり；あるいは、
または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、または互変異性体の薬学的に許容される塩。

・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１５６］。

・アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリンオン（ＡＢＩＱ）化合物［１５８，１５９］、ヒドラサラマイド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン（Ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｏｎｅ）化合物、ピロール化合物［１６０］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、 ピラザロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［１６１］を含む参考文献１５７に開示される化合物。

・参考文献１６２に開示される化合物。

・ＲＣ−５２９のようなアミノアルキルグルコサミニドフォスフェート誘導体［１６３，１６４］。

・参考文献１６５および１６６に例えば記載される、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）のようなホスファゼン。

・以下のような低分子免疫強化物質（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロー−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オールＮ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。

本発明で使用されるサイトカイン誘導剤はトール様受容体（ＴＬＲ）の調節因子および／またはアゴニストであってもよい。例えば、それらは、１つまたは複数のヒトＴＬＲｌ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質のアゴニストであってもよい。好ましい薬剤はＴＬＲ７（例えばイミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）のアゴニストである。これらの薬剤は先天性免疫経路の活性化のために有用である。

サイトカイン誘導剤はその産生の間に様々な段階で組成物に追加することができる。例えば、サイトカイン誘導剤は抗原組成物中にあってもよく、この混合物は次に水中油滴型エマルジョンに追加することができる。代替としては、サイトカイン誘導剤が水中油滴型エマルジョン中にあってもよく、その場合には薬剤は乳化前のエマルジョン成分に追加することができるか、または薬剤を乳化後にエマルジョンに追加できる。同様に、薬剤はエマルジョン滴中でコアセルベート形成されてもよい。最終組成物内のサイトカイン誘導剤の所在および分布は、その親水性／疎水性の特性に依存するだろう。例えば、薬剤は水相中に、油相中に、および／または油水界面で位置することができる。

サイトカイン誘導剤は抗原のような個別の薬剤に結合させることができる（例えばＣＲＭ１９７）。低分子のために結合技術の一般的な総説は参考文献１６７中に提供される。代替としては、アジュバントは非共有結合で（疎水性相互作用またはイオン性相互作用経由などで）付加薬剤に結合させてもよい。

好ましい２つのサイトカイン誘導剤は、（ａ）免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬである。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチド修飾物／類似化合物を含むことができ、二本鎖または（ＲＮＡを除く）一本鎖でありえる。参考文献１６８、１６９および１７０は可能性のある類似化合物置換（例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに参考文献１７１〜１７６で論じられる。ＣｐＧ配列はモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴのようなＴＬＲ９に向けられてもよい［１７７］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）のように、Ｔｈ１免疫反応の誘導に特異的であってもよいし、またはＢ細胞応答の誘導により特異的であってもよい（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ
ＯＤＮは参考文献１７８〜１８０で論じられる。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために接近可能なように構築される。任意で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するためにそれらの３’末端で結合されてもよい。例えば、参考文献１７７および１８１〜１８３を参照。有益なＣｐＧアジュバントは、プロミューン（ＰｒｏＭｕｎｅ）（商標）（コーリー・ファーマシューティカル・グループ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ）社）として公知のＣｐＧ７９０９である。

代替として、または加えて、ＣｐＧ配列の使用に対して、ＴｐＧ配列を使用できる［１８４］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフがなくてもよい。

免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ピリミジン含量が多くてもよい。例えば、それは１つ以上の連続チミジンヌクレオチド（例えば参考文献１８４中に開示されるようなＴＴＴＴ）を含んでもよく、および／または＞２５％のチミジン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％、など）のヌクレオチド組成を有してもよい。例えば、それは１つ以上の連続シトシンヌクレオチド（例えば参考文献１８４中に開示されるようなＣＣＣＣ）を含んでもよく、および／または＞２５％のシトシン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフがなくてもよい。

免疫刺激オリゴヌクレオチドは典型的には少なくとも２０ヌクレオチドを含むだろう。それらは１００未満のヌクレオチドを含んでもよい。

３ｄＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノフォスフォリルリピドＡ、または３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホルイルリピドＡとしても公知）は、モノフォスフォリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が、脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬはサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のヘプトース欠損変異体から調製されており、リピドＡに化学的に類似しているが、酸に不安定なフォスフォリル基および塩基に不安定なアシル基を欠く。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの放出を刺激する（さらに参考文献１８５を参照）。３ｄＭＰＬの調製は、参考文献１８６中にもともと記載されていた。

３ｄＭＰＬは、アシル化により変化して（例えば異なる長さの３、４、５または６アシル鎖を有する）、関連分子の混合物の形式をとることができる。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知）単糖類は、それらの２位炭素で（すなわち２位および２’位で）Ｎ−アシル化され、３’位でもＯ−アシル化される。炭素２に結合される基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^１Ｒ^１’を有する。炭素２’に結合される基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^２Ｒ^２’を有する。炭素３’に結合される基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^３Ｒ^３’を有する。代表的な構造は次式のとおりである。

基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３である。ｎの値は好ましくは８〜１６、より好ましくは９〜１２、および最も好ましくは１０である。

基Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’は、それぞれ独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ^４でありえ、式中Ｒ^４は−Ｈまたは−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＨ_３のいずれかであり、ここでｍの値は好ましくは８〜１６、およびより好ましくは１０、１２または１４である。２位ではｍは好ましくは１４である。２’位ではｍは好ましくは１０である。３’位ではｍは好ましくは１２である。基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、したがって好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸からの−Ｏ−アシル基である。

Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’が、すべて−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは３アシル鎖のみを有する（１つは各々の２位、２’位および３’位に）。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のうちの２のみが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは４アシル鎖を有することができる。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のうちの１つのみが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬは５アシル鎖を有することができる。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のどれも−Ｈでない場合、３ｄＭＰＬは６アシル鎖を有することができる。本発明に従って使用される３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６アシル鎖でこれらの型の混合物になりえるが、混合物中に６つのアシル鎖の３ｄＭＰＬを含むこと、および特にヘキサアシル鎖型が全３ｄＭＰＬ重量で少なくとも１０％、例えば≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％またはそれ以上を構成することを保証することが好ましい。６アシル鎖の３ｄＭＰＬが、最も高いアジュバント活性型であることを見出した。

したがって、本発明の組成物への含有のための３ｄＭＰＬの最も好ましい型は、次式（ＩＶ）を有する。

３ｄＭＰＬが混合物の形式で使用される場合には、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に対する参照は、混合物中で組み合わされる３ｄＭＰＬ種を指す。

水溶性条件において、３ｄＭＰＬは、異なるサイズのミセル凝集体または粒子（例えば直径で＜１５０ｎｍ、または＞５００ｎｍ）を形成することができる。どちらか片方またはこれらの両方は、本発明で使用することができ、よい粒子を常用分析で選択することができる。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明水性懸濁液を生ずるのに十分に小さな）は、優れた活性のために本発明に記載の使用に好ましい［１８７］。好ましい粒子は、２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍまたは１５０ｎｍ未満もしくは１２０ｎｍ未満の平均径を有し、１００ｎｍ未満の平均径でさえ有することができる。しかしながらほとんどの場合には、平均径は５０ｎｍほどは小さくはないだろう。これらの粒子は濾過滅菌に適切でありうるほど十分に小さい。粒子直径は、動的光散乱の常用技術で評価することができ、それは平均粒子直径を示す。粒子がｘｎｍの直径を有すると表現する場合には、一般にこの平均ほどの粒子の分布があるだろうが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれ以上）は、ｘ±２５％以内の範囲の直径を有するだろう。

３ｄＭＰＬは、水中油滴型エマルジョンと組み合わせて有利に使用できる。実質的にすべての３ｄＭＰＬは、エマルジョンの水相中に位置してもよい。

３ｄＭＰＬは、そのままでまたは１つまたは複数のさらなる化合物と組み合わせて使用できる。例えば、ＱＳ２１サポニン［１８８］（水中油滴型エマルジョン中に含む［１８９］）と、免疫刺激オリゴヌクレオチドと、ＱＳ２１および免疫刺激オリゴヌクレオチドの両方と、リン酸アルミニウム［１９０］と、水酸化アルミニウム［１９１］と、またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と、組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することは公知である。

脂質アジュバント
本発明で使用することができる脂質アジュバントは、上で記述された水中油滴型エマルジョンを含み、例えば以下もまた含む。

・次式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、またはその塩であって、

参考文献１９２において定義されたように、「ＥＲ ８０３０５８」，「ＥＲ ８０３７３２」，「ＥＲ、８０４０５３」ＥＲ ８０４０５８」，「ＥＲ ８０４０５９」，「ＥＲ、８０４４４２」，「ＥＲ ８０４６８０」，「ＥＲ８０４７６」ＥＲ ８０３０２２または「ＥＲ ８０４０５７」などで、例えば次式。

・ＯＭ−１７４（参考文献１９３および１９４中に記載される）のような、大腸菌からのリピドＡの誘導体。

・アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイロキシ（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｙｌｏｘｙ）−プロパナミニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（商標）」）、またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシロキシ−プロパナミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）のような、陽イオン性脂質および（通常中性）共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）の製剤。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデケニルオキシ）−１−プロパナミニウム塩を含む製剤が好ましい［１９５］。

・３−Ｏ−脱アシル化モノフォスフォリルリピドＡ（上記を参照）。

ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４のような、リン酸塩を含む非環式骨格に結合された脂質を含む以下の化合物［１９６、１９７］。

アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用されてもよい。これらの名称は、どちらも存在する実際の化学化合物の正確な記述でないので、慣習的であるが、便宜的にのみ使用される（例えば、参考文献１２８の９章を参照）。本発明は、アジュバントとしての一般使用において「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸」アジュバントのうちのいずれかを使用できる。

「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは通常部分的に結晶状である。オキシ水酸化アルミニウム（それらは式ＡｌＯ（ＯＨ）により表わすことができる）は、赤外線（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ^−１での吸着バンドの存在および３０９０〜３１００ｃｍ^−１での強い段差によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３のような他のアルミニウム化合物から区別することができる［参考文献１２８の９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、より小さな結晶子サイズのために、より大きな線広がりを示す低結晶状粒子で、２分の１高さでの回折バンド（ＷＨＨ）の幅に反映される。ＷＨＨが増加するにつれて表面領域は増加し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、より高い抗原吸着のための能力を有すると考えられた。線維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真において見られるように）は、水酸化アルミニウムアジュバントには典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは典型的には約１１で、すなわちアジュバントはそれ自体生理的なｐＨで正の表面電荷を有している。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で１ｍｇ Ａｌ^＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇタンパク質の吸着能が、報告されている。

「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には少量の硫酸塩（すなわち水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）もまた含む水酸化リン酸アルミニウムである。それらは沈殿によって得られてもよく、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩における水酸基に対するリン酸塩による置換度に影響を及ぼす。水酸化リン酸塩は、一般に０．３〜１．２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。水酸化リン酸塩は、水酸基の存在によって狭義のＡｌＰＯ_４から区別することができる。例えば、３１６４ｃｍ^−１（例えば２００℃に加熱した場合）でのＩＲスペクトル帯は、構造的な水酸基の存在を示す［参考文献１２８の９章］。

リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ_４／Ａｌ^３＋モル比は、一般に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、およびより好ましくは０．９５±０．１であるだろう。一般にリン酸アルミニウム、特に水酸化リン酸塩については、非晶質になるだろう。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比で、Ａｌ^３＋を０．６ｍｇ／ｍｌで含む、非晶質水酸化リン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは一般に微粒子である（例えば透過型電子顕微鏡写真において見られるようなプレート様形態）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に０．５〜２０μｍの範囲（例えば約５〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で１ｍｇ Ａｌ^＋＋＋あたり０．７〜１．５ｍｇタンパク質の吸着能は、報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、水酸基に対するリン酸塩による置換度に反比例し、この置換度は、沈殿による塩の調製のために用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変化しうる。ＰＺＣは、溶液中で遊離リン酸イオンの濃度を変化させること（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）によって、またはヒスチジン緩衝剤（ＰＺＣをより塩基性にする）のような緩衝剤の追加によってもまた変化させることができる。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有するだろう。

本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝剤、ヒスチジントリス緩衝剤、トリス緩衝剤）を含んでもよいが、これは常に必要だとは限らない。その懸濁物は好ましくは無菌で発熱物質不含有である。懸濁物は、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離水溶性リン酸イオンを含んでもよい。その懸濁物はさらに塩化ナトリウムを含んでもよい。

本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることができる［８９］。この場合には、水酸化物よりもリン酸アルミニウムが多く、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１、などの重量比で存在してもよい。

患者に対する投与のための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ、などである。好ましい範囲は０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量までが好ましい。

アジュバント成分は、１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバントを含むことに加えて、１つまたは複数のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含んでもよい。そのような追加成分は、３−Ｏ脱アシル化モノフォスフォリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／または水中油滴型エマルジョンを含むが、これらに限定されない。３ｄ−ＭＰＬは、３デ−Ｏアシル化モノフォスフォリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホルイルリピドＡとも呼ばれた。この名称は、モノフォスフォリルリピドＡにおける還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されていることを示す。３ｄ−ＭＰＬはサルモネラ・ミネソタのヘプトース欠損変異体から調製されており、リピドＡに化学的に類似しているが、酸に不安定なフォスフォリル基および塩基に不安定なアシル基を欠く。３ｄ−ＭＰＬは、単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの放出を刺激する。３ｄ−ＭＰＬの調製は、参考文献１８６中にもともと記載されており、製品は名称ＭＰＬ（商標）でコリザ社（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造され、販売された。さらなる詳細は、参考文献１３９〜１４２において見出すことができる。

医薬組成物
本発明の組成物は薬学的に許容できる。この組成物は、通常抗原に加えて成分を含んでおり、例えばこの組成物は典型的には１つまたは複数の薬学的担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。そのような成分の詳細な考察は、参考文献１９８において利用可能である。

組成物は、一般に水溶性形式であるだろう。

組成物は、チオマーサルまたは２−フェノキシエタノールのような防腐剤を含んでもよい。しかしながら、ワクチンは実質的に水銀物質を不含有（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオマーサル不含有であるべきことが好ましい［９、１９９］。水銀を含まないワクチンがより好ましい。防腐剤不含有ワクチンが特に好ましい。

等張性を制御するために、ナトリウム塩のような生理的な塩を含むことは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それらは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩は塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。

組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲以内にあるだろう。浸透圧はワクチン接種により引き起こされる痛みに影響を及ぼさないことが今までに報告されたが［２００］、それにもかかわらずこの範囲で浸透圧を保つことは好ましい。

組成物は１つまたは複数の緩衝剤を含んでもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤；トリス緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に）；またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には５〜２０ｍＭ範囲で含まれるだろう。

組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１、およびより典型的には６．０〜８．０例えば６．５〜７．５、または７．０〜７．８であるだろう。したがって、本発明の過程は、パッケージングの前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含んでもよい。

組成物は好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば１用量あたり＜１ＥＵ（菌体内毒素ユニット、標準測定値）および好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む。組成物には好ましくはグルテン不含有である。

本発明の組成物は、界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「ツイーン」として公知）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールのような）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、または特にスプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンに対するデオキシコール酸ナトリウムを含んでもよい。界面活性剤は微量でのみ存在してもよい。したがってワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々を含んでもよい。微量での他の残余成分は、抗生物質でありえる（例えばネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）。

組成物は、単一の予防接種のための物質を含んでもよいし、または複数の予防接種のための物質を含んでもよい（すなわち「マルチ用量」キット）。防腐剤の含有はマルチ用量のアレンジにおいて好ましい。マルチ用量組成物中での防腐剤含有に対する代替として（またはそれに加えて）、組成物は物質除去のための無菌アダプターを有する容器中に含まれてもよい。

インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、２分の１用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を子供に投与してもよい。

組成物およびキットは、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは凍結するべきでない。それらは、理想的には直射日光から遠ざけておくべきである。

本発明のキット
特にアジュバントが用いられている場合、本発明の組成物は送達時にその場で調製されていてもよい。したがって、本発明は、混合のために準備済みの様々な成分を含むキットを提供する。キットは、アジュバントおよび抗原が使用時まで別々に保たれることを可能にする。水中油滴型エマルジョンアジュバントを用いる場合、このアレンジは特に有益である。

この成分は、キット中で互いから物理学的に分離しており、この分離は様々な手段で達することができる。例えば、２つの成分はバイアルのような２つの個別の容器中にあってもよい。次に２つのバイアルの内容物は、例えば、１つのバイアルの内容物を取り出し他のバイアルにそれらを追加することにより、または別々に両方のバイアルの内容物を取り出し第３の容器でそれらを混合することにより、混合することができる。

好ましいアレンジにおいて、キット成分のうちの１つはシリンジ中にあり、他方はバイアルのような容器中にある。シリンジは、混合のための第２の容器にその内容物を注入するために用いる（例えば針により）ことができ、次に混合物はシリンジの中へ回収することができる。次にシリンジの混合された内容物は、典型的には新しい無菌の針を通して患者に投与することができる。シリンジ中に１つの成分をパックすることは、個別のシリンジを患者投与に用いる必要性を除く。

別の好ましいアレンジにおいて、２つのキット成分は、同一のシリンジ（例えば参考文献２０１−２０８などで開示されたもののようなデュアルチャンバーのシリンジ）で一緒にされるが、分離されている。次にシリンジを（例えば患者に対する投与の間に）動かす場合、２つのチャンバーの内容物が混合される。このアレンジにより、使用時で個別の混合ステップへの必要性が回避される。

キット成分は、一般に水溶性形式であるだろう。いくつかのアレンジにおいて、成分（典型的にはアジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、水溶性形式である他の成分と共に、乾燥形式（例えば凍結乾燥された形式で）である。２つの成分は、乾燥成分を再活性化し、患者に対する投与のための水溶性組成物を生ずるために混合することができる。凍結乾燥成分は、典型的にはシリンジよりもむしろバイアル内にあるだろう。乾燥した成分は、ラクトース、ショ糖またはマンニトールのような安定剤を、その混合物（例えばラクトース／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合液など）とともに、含んでもよい。１つ可能なアレンジは、プレフィルドシリンジ中の水溶性のアジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を用いる。

組成物またはキット成分のパッケージング
本発明の組成物（またはキット成分）に適切な容器は、バイアル、シリンジ（例えば使い捨てシリンジ）および鼻内噴霧器などを含む。これらの容器は、無菌であるべきである。

組成物／成分がバイアル中にある場合、バイアルは好ましくはガラスまたはプラスチック材料で作製されている。組成物がそれに追加される前に、バイアルは好ましくは滅菌される。ラテックスに過敏な患者に関する問題を回避するために、バイアルは好ましくはラテックス不含有栓により密閉され、すべての包装材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでもよいか、または１用量以上の（「マルチ用量」バイアル）、例えば１０用量を含んでもよい。好ましいバイアルは無色のガラスで作製されている。

バイアルは、プレフィルドシリンジをキャップの中へ挿入することができ、シリンジの内容物はバイアルの中へ放出することができ（例えば凍結乾燥された物質をその中で再構成する）、バイアルの内容物をシリンジの中へ戻すことができるように、適合するキャップ（例えばルアーロック）を有することができる。バイアルからのシリンジの除去後に、次に針を結合することができ、組成物を患者に投与することができる。キャップに接近する前にシールまたはカバーを除去しなければならないように、キャップは好ましくはシールまたはカバーの内部に位置する。バイアルは、特にマルチ用量バイアルのために、内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有していてもよい。

成分がシリンジの中へパッケージにされる場合には、シリンジに針を添付してもよい。針が添付されないならば、組み立ておよび使用のために、個別の針をシリンジと共に供給してもよい。そのような針は鞘に納められてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージ針が典型的である。シリンジは、記録管理を容易にするロット番号、インフルエンザシーズンおよび内容物の使用期限が印刷されたはぎとり式の標識と共に提供されてもよい。シリンジ中のプランジャーは、吸引の間に偶然に除去されるのを防止するために好ましくは栓を有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。使い捨てシリンジは、ワクチンの単一用量を含む。シリンジは一般に、針装着以前に先端をふさぐために先端キャップを有し、先端キャップは好ましくはブチルゴムで作製される。シリンジおよび針が別々にパッケージにされるならば、針には好ましくはブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましいシリンジは商品名「チップ−ロック（Ｔｉｐ−Ｌｏｋ）」（商標）で、市場で売買されるものである。

容器は、例えば子供に対する送達を容易にするために、２分の１用量の容量を示すように印を付けられてもよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容量を示す印を有してもよい。

ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）が用いられる場合には、ソーダ石灰ガラスからよりもむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器の使用が好ましい。

キットまたは組成物は、ワクチンの詳細を含む小冊子（例えば投与、ワクチン内の抗原などの詳細についての説明書）と共に、パッケージ（例えば同一ボックス中に）されてもよい。説明書は警告（例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応に備えて、ただちに利用可能なアドレナリンの溶液を保持すること）なども含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、小冊子はワクチンがマトリックスタンパク質を含むことを明示するだろう。

治療法、およびワクチンの投与
本発明の組成物はヒト患者に対する投与に適切であり、本発明は患者に対して本発明の組成物を投与する工程を含む、患者における免疫反応を誘導する方法を提供する。

本発明は、医薬品として使用のための本発明のキットまたは組成物もまた提供する。

本発明は、（ｉ）患者における免疫反応を誘導するための医薬品の製造において、細胞培養において増殖させたウイルスから調製される、血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含むインフルエンザウイルス抗原調製品の使用もまた提供する。

これらの方法および使用により誘導される免疫反応は、一般に抗体反応、好ましくは防御抗体反応を含むだろう。インフルエンザウイルスワクチン接種後の、抗体反応、中和能力、および防御の評価方法は、当技術分野において周知である。ヒトでの研究は、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体価が防御と関連していることを示した（約３０〜４０の血清試料赤血球凝集阻害力価は、相同なウイルスによる感染からの約５０％防御を与える）［２０９］。抗体反応は典型的には、赤血球凝集阻害により、マイクロ中和法（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）により、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）により、および／または一元放射溶血法（ＳＲＨ）により測定される。これらの検定技法は当技術分野において周知である。

本発明の組成物は様々な手段で投与することができる。最も好ましい予防接種経路は、筋肉注射（例えば腕または脚の中への）によるものであるが、他の利用可能な経路は、皮下注射、鼻内投与［２１０〜２１２］、経口投与［２１３］、真皮内投与［２１４，２１５］、経皮投与、経真皮投与［２１６］などを含む。

本発明に従って調製されたワクチンは子供および成人の両方を治療するために使用されてもよい。インフルエンザワクチンは、６か月から、小児および成人の予防接種における使用に現在推奨される。したがって、患者は１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチン投与に好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、幼児（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍関係者、妊婦、慢性病患者、免疫不全患者、ワクチン投与７日前に抗ウイルス性化合物（例えばオセルタミビル化合物またはザナミビル化合物；以下参照）を投与された患者、卵アレルギーのある人、および外国へ旅行する人である。しかしながらワクチンはこれらの群に適切なだけではなく、集団においてより一般に使用されてもよい。汎流行株については、すべての年齢群に対する投与が好ましい。

本発明の好ましい組成物は、有効性のためのＣＰＭＰ基準のうちの１、２または３を満足する。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）≧７０％のセロプロテクション；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの基準は、（１）≧６０％のセロプロテクション；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの基準は少なくとも５０人の患者による非盲検試験に基づく。

投与は単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによることができる。複数用量は一次予防接種スケジュールにおいておよび／または追加予防接種スケジュールにおいて使用されてもよい。複数用量スケジュールにおいて、様々な用量は、同一経路または異なる経路、例えば非経口で一次および粘膜で追加、粘膜で一次および非経口で追加などにより与えられてもよい。１用量以上（典型的には２用量）の投与は、特に免疫学的にナイーブな患者において、例えばインフルエンザワクチンを以前に投与されていない人のために、または新しいＨＡサブタイプ（汎流行大発生でのように）に対するワクチン接種のために有用である。複数用量は典型的には少なくとも１週間（例えば約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１０週、約１２週、約１６週など）間隔で投与されるだろう。

本発明によって産生されたワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば医療相談、または医療従事者もしくはワクチン接種のセンターへの訪問と同時期に）、例えば、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型インフルエンザ桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンのような）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなどと実質的に同時に、患者に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンとしての、実質的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。

同様に本発明のワクチンは、抗ウイルス性化合物、および特にインフルエンザウイルスに対する活性のある抗ウイルス性化合物（例えばオセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば医療相談、または医療従事者もしくはワクチン接種のセンターへの訪問と同時期に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス薬は、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎ）−２−エノン酸のようなノイラミニダーゼ阻害剤を含む。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（タミフル（商標））として知られている（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，リン酸（１：１）である。

分析
インフルエンザワクチンの特性を明らかにするために、存在するマトリックスタンパク質の量を決定することは有益であってもよい。したがって、マトリックスタンパク質の存在を決定するためにワクチンのサンプルが解析される場合には、本発明はインフルエンザワクチンを解析するための分析を提供する。この分析は、Ｍ１タンパク質の断片のための検査に特に有用である。

インフルエンザワクチンは、インフルエンザＡ型および／またはインフルエンザＢ型ウイルスからの抗原を含んでもよい。本発明は、ワクチンのサンプルがインフルエンザＢ型ウイルスマトリックスタンパク質の存在を決定するために解析される場合には、インフルエンザＢ型ウイルスからの抗原を含むワクチンを解析するための分析を提供する。

インフルエンザワクチンは、様々なＨＡサブタイプからの抗原を含んでもよい。本発明は、ワクチンのサンプルがインフルエンザＡ型ウイルスマトリックスタンパク質の存在を決定するために解析される場合には、およびインフルエンザＡ型ウイルスがＨ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６から選択される血球凝集素サブタイプを有する場合には、インフルエンザＡ型ウイルスからの抗原を含むワクチンを解析するための分析を提供する。

インフルエンザワクチンは、細胞培養で増殖させた抗原を含んでもよい。ワクチンのサンプルがインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質の存在を決定するために解析される場合、本発明は細胞培養で増殖させたワクチンの解析ための分析を提供する。

インフルエンザワクチンはアジュバントを含んでもよい。ワクチンのサンプルがインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質の存在を決定するために解析される場合、本発明はアジュバント効果を与えられたインフルエンザワクチンの解析ための分析を提供する。アジュバント効果を与えられていないワクチンのサンプルがインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質の存在を決定するために解析され、次にアジュバントがワクチンに追加される場合、本発明はアジュバント効果を与えられていないインフルエンザワクチンの解析ための分析もまた提供する。

これらの分析は典型的にはウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような免疫測定法になるだろう。免疫測定法はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してもよい。モノクローナル抗体が使用される場合、いくつかの実施形態において、それはマウスＩｇＧｌ抗体のようなマウス抗体ではない。本明細書において開示されるＭ１断片を認識する抗体、例えば、１０ｋＤａまたはより低い（例えば＜５ｋＤａ）の分子量の断片を認識する抗体、Ｎ末端メチオニンを欠く断片を認識する抗体、配列番号１５のＮ末端配列の断片を認識する抗体、配列番号２８および／または配列番号２９を認識する抗体、配列番号３０を含む断片を認識する抗体、共有結合で修飾されたＮ末端の断片を認識する抗体、などを含む、Ｍ１断片を認識する抗体は、この分析において使用することができる。

この分析は、１０ｋＤａの分子量の断片またはより小さい（例えば＜５ｋＤａ）断片および／または本明細書において開示される断片（例えば全Ｍ１配列のＮ末端メチオニンを欠く）のような、Ｍ１タンパク質の断片の検出のために特に有用である。好ましい分析は、全長Ｍ１タンパク質の存在とＭ１タンパク質断片の存在を区別することができ、さらに異なる断片を区別してもよい。

分析は、定性的、半定量的、または定量的であってもよい。

本発明は、この方法で分析されるワクチンも提供する。

本発明のさらなる態様
本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質と、（ｉｉ）アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。インフルエンザウイルスタンパク質は、細胞培養において増殖させるか、または卵において増殖させたウイルスから調製されていてもよい。上で記述されるように、組成物はさらなる成分（例えばインフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質、薬学的担体／賦形剤など）もまた含んでもよい。

本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスを増殖させる工程と；（ｉｉ）抗原組成物が血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含むことを特徴として、工程（ｉ）で増殖させたウイルスから抗原組成物を調製する工程と；（ｉｉｉ）アジュバントにより免疫原性組成物を生ずるために抗原組成物を組み合わせる工程とを含む免疫原性組成物を調製する方法もまた提供する。

本発明は、（ｉ）血球凝集素がＨ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６から選択されるサブタイプを有することを特徴として、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。

本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスを増殖させる工程と；（ｉｉ）抗原組成物が血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含み、血球凝集素がＨ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６から選択されるサブタイプを有することを特徴として、工程（ｉ）で増殖させたウイルスから抗原組成物を調製する工程と；（ｉｉｉ）アジュバントにより免疫原性組成物を生ずるために抗原組成物を組み合わせる工程とを含む免疫原性組成物を調製する方法もまた提供する。

本発明は、（ｉ）組成物中の血球凝集素の濃度が２９μｇ／ｍｌまたはそれ以下（例えば≦２８μｇ／ｍｌ、≦２７μｇ／ｍｌ、≦２６μｇ／ｍｌ、≦２５μｇ／ｍｌ、≦２４μｇ／ｍｌ、≦２３μｇ／ｍｌ、≦２２μｇ／ｍｌ、≦２１μｇ／ｍｌ、≦２０μｇ／ｍｌ、≦１９μｇ／ｍｌ、≦１８μｇ／ｍｌ、≦１７μｇ／ｍｌ、≦１６μｇ／ｍｌ、≦１５μｇ／ｍｌ、≦１４μｇ／ｍｌ、≦１３μｇ／ｍｌ、≦１２μｇ／ｍｌ、≦１１μｇ／ｍｌ、≦１０μｇ／ｍｌ、≦９μｇ／ｍｌ、≦８μｇ／ｍｌ、≦７μｇ／ｍｌ、≦６μｇ／ｍｌ、≦５μｇ／ｍｌ、≦４μｇ／ｍｌ、≦３μｇ／ｍｌ、≦２μｇ／ｍｌ）であることを特徴として、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。この組成物は、インフルエンザウイルスの１つ以上の株からの血球凝集素を含んでいてもよく、その場合には前記濃度は１つの株あたりである（すなわち１株あたり≦２９μｇ／ｍｌ）。

本発明は、（ｉ）組成物中の血球凝集素の濃度が３１μｇ／ｍｌまたはそれ以上（例えば、≧３２μｇ／ｍｌ、≧３３μｇ／ｍｌ、≧３４μｇ／ｍｌ、≧３５μｇ／ｍｌ、≧４０μｇ／ｍｌ、≧４５μｇ／ｍｌ、≧５０μｇ／ｍｌ、≧５５μｇ／ｍｌ、≧６０μｇ／ｍｌ、≧７０μｇ／ｍｌ、≧８０μｇ／ｍｌ、≧９０μｇ／ｍｌ、≧１００μｇ／ｍｌなど、しかし典型的には＜２００μｇ）であることを特徴として、インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。組成物は、インフルエンザウイルスの１つ以上の株からの血球凝集素を含んでいてもよく、その場合には前記濃度は１つの株あたりである（すなわち１株あたり≧３１μｇ／ｍｌ）。

本発明は、インフルエンザウイルスＭ２マトリックスタンパク質を含むが、上で定義されるようなインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質Ｍ１を実質的に不含有の免疫原性組成物もまた提供する。Ｍ２含有ワクチンは現在開発されている［２１７］。Ｍ２は、Ｍ１もコードするウイルスセグメントによって天然にコードされる。組み換え発現システムにおいて、したがってＭ１タンパク質は、副産物として発現されるかもしれない。本発明に従って、このどちらかの副発現は回避することができ、そうでなければＭ１マトリックスタンパク質はＭ２含有組成物から除去することができる。Ｍ２タンパク質は全長タンパク質であってもよいし、または例えばＭ２細胞外ドメイン（「Ｍ２ｅ」として当技術分野において公知の）のようなＭ２断片であってもよい。Ｍ２タンパク質は別の抗原、例えばＢ型肝炎ウイルス抗原に結合してもよい。ワクチンは、ＨＡおよび／またはＮＡを不含有でもよい。

一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」とともに「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」も包含する。例えば組成物が、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ことは、もっぱらＸからなって（ｃｏｎｓｉｓｔ）もよいし、または付加的なもの、例えばＸ＋Ｙを含ん（ｉｎｃｌｕｄｅ）でもよい。

単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば「実質的にＹ不含有の」組成物は、Ｙを完全に不含有でもよい。必要な場合には、単語「実質的に」は本発明の定義から省略されてもよい。

数値ｘに関して用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

特に明言されない場合、２つまたは複数の成分を混合する工程を含む過程は、任意の特異的な混合順序を必要としない。したがって成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次にその組合せは第３の成分と組み合わせるなどしてもよい。

動物の（および特にウシの）物質が細胞の培養において使用される場合、それらは伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）のないソースから得られるべきである、全面的に、動物由来物質の完全な非存在下において細胞を培養することが好ましい。

化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は適切なプロドラッグにより代わりに置換されてもよい。

細胞基質が再集合またはリバースジェネティクスの手順に使用される場合、それは好ましくはヒトワクチン産生における使用のために承認された例えばヨーロッパ薬局方（Ｐｈ Ｅｕｒ）概略章５．２．３におけるようなものである。

ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくはパラメーターのギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１でアファインギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社）において実行されるようなスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）ホモロジー検索アルゴリズムによって決定される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞培養で増殖させたウイルスから調製される、全ビリオンとしてではないインフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物。
（項目２）
全ビリオンとしてではないインフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組成物がオボアルブミンを含まない、免疫原性組成物。
（項目３）
インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該マトリックスタンパク質が２０ｋＤａ未満の分子量を有し、配列番号１に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
（項目４）
インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該マトリックスタンパク質が２０ｋＤａ未満の分子量を有し、配列番号２８に少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
（項目５）
免疫原性組成物を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞培養においてインフルエンザウイルスを増殖させる工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）で増殖させた該ウイルスから抗原組成物を調製する工程であって、該抗原組成物が、全ビリオンとしてではない血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む、工程と；
（ｉｉｉ）薬学的担体に該抗原組成物を組み合わせ、該免疫原性組成物を生ずる工程とを包含する、方法。
（項目６）
前記マトリックスタンパク質が、配列番号２に少なくとも８０％の同一性を有する２０アミノ酸の配列を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目７）
前記マトリックスタンパク質がインフルエンザウイルスＭ１タンパク質由来のＴ細胞エピトープを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目８）
前記マトリックスタンパク質が、１つまたは配列番号１；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７のアミノ酸配列を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目９）
前記マトリックスタンパク質が、全長Ｍ１マトリックスタンパク質アミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列を有する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１０）
前記マトリックスタンパク質が、天然のＭ１配列のＮ末端メチオニンを欠く、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１１）
前記マトリックスタンパク質が、Ｎ末端配列ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬＳ（配列番号３０）を有する、項目１０に記載の組成物または方法。
（項目１２）
前記配列番号３０のＮ末端セリンが、共有結合で修飾、例えばアセチル化される、項目１１に記載の組成物または方法。
（項目１３）
前記マトリックスタンパク質がＮ末端配列ＥＩＳＬＳＹＳＡＧＡＬＡ（配列番号１８）を有する、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１４）
前記組成物が、（ｉ）Ｎ末端配列ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬＳ（配列番号３０）を有する第１のマトリックスタンパク質と；（ｉｉ）Ｎ末端配列ＥＩＳＬＳＹＳＡＧＡＬＡ（配列番号１８）を有する第２のマトリックスタンパク質とを含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１５）
マトリックスタンパク質が、１μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１６）
スプリットインフルエンザウイルスまたは精製されたインフルエンザ表面抗原を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１７）
前記血球凝集素が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１８）
前記インフルエンザウイルスタンパク質が宿主細胞の培養で増殖させたインフルエンザウイルスから調製されており、前記組成物が該宿主細胞由来の１０ｎｇ未満の細胞性ＤＮＡを含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目１９）
前記組成物が、１ウイルス株あたり０．１〜２０μｇの血球凝集素を含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目２０）
前記組成物がアジュバントを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目２１）
前記アジュバントが１つまたは複数のアルミニウム塩を含む、項目２０に記載の組成物または方法。
（項目２２）
前記アジュバントが水中油滴型エマルジョンを含む、項目２０に記載の組成物または方法。
（項目２３）
（ｉ）全ビリオンとしてではないインフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質と、（ｉｉ）アジュバントとを含む免疫原性組成物。
（項目２４）
全ビリオンとしてではないインフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該血球凝集素が、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６から選択されるサブタイプを有する、免疫原性組成物。
（項目２５）
インフルエンザウイルス血球凝集素およびマトリックスタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組成物中の血球凝集素の濃度が１株あたり２９μｇ／ｍｌまたはそれ以下である、免疫原性組成物。
（項目２６）
インフルエンザワクチンを分析するための免疫学的アッセイであって、該ワクチンのサンプルが、Ｍ１マトリックスタンパク質の断片の存在を決定するために分析される、免疫学的アッセイ。

図１は様々なワクチン調製品のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。「Ｍ」レーンは分子量マーカー（ｋＤａ）である。レーン１はＭＤＣＫで増殖させたワクチンである。レーン２〜６は既存の市販のワクチン。矢印は（ａ）ＨＡ_１（ｂ）ＨＡ_２（ｃ）本発明のＭ１断片を示す。 図２は、〜５ｋＤａマトリックスタンパク質断片により予防接種されたウサギからの抗血清を使用して、分画されたインフルエンザビリオンのウエスタンブロット解析の結果を示す。左手パネルは免疫前血清を使用、および右側のパネルは免疫後血清を使用するブロットである。

（実施例）
インフルエンザウイルスのための精製された表面抗原ワクチンについて調べている間に、ビリオンをＭＤＣＫ細胞で増殖させた場合、ＣＴＡＢでインフルエンザＡ型ウイルスのスプリッティング後のＳＤＳ ＰＡＧＥによって、比較的大量の低分子量ポリペプチドを検出することができることが観察された。この低分子量ポリペプチドはさらなる抗原精製間にも存在し、表面抗原の最終的な調製品中に存在した。このポリペプチドを調べるために、２ｋＤａという小さなポリペプチドの識別を可能にする緩衝系を使用した（インビトロゲンからのニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）（商標）ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ビス−トリスゲル）。この系を使用して、〜５ｋＤａの明瞭な分子量のポリペプチドバンドが同定された。このポリペプチドバンドは、現行ワクチンのインフレキシアルＶ（商標）、インフルスプリット（ＩＮＦＬＵＳＰＬＩＴ）（商標）、ミュータグリップ（ＭＵＴＡＧＲＩＰ）（商標）、バキシグリップ（ＶＡＸＩＧＲＩＰ）（商標）、ベグリバック（商標）、フルアリックス（商標）、インフルバック（商標）またはフルビリン（商標）中に見られず、それらのすべては卵で増殖させたビリオンから調製されている。意外にも、このポリペプチドバンドは、アグリッパル（商標）のいくつかのバッチで検出されたが、その実在または存在は今までに認識されなかった。

〜５ｋＤａバンドによるウサギの予防接種は、未変性Ｍ１タンパク質を検出できる抗体を誘導した。図２は、ウサギからの抗血清を使用する分画されたインフルエンザビリオンのウエスタンブロット解析の結果であり、ビリオンＭ１タンパク質への強い反応性を示す。したがって〜５ｋＤａバンド中のポリペプチドは、免疫原性であり、未変性の対応するＭ１タンパク質に結合する抗体の産生を引き起こすエピトープを保有する。

２つの異なるウイルス（Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルス）に由来する〜５ｋＤａバンドのＮ−末端アミノ酸配列分析は、ＥＩＳＬＳＹＳＡＧＡＬＡ（配列番号１８）のＮ末端配列を有するペプチドを示した。このアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸の位置１１４〜１２５と同一のインフルエンザウイルスＭ１タンパク質の断片である。

トリプシン消化断片のＭＳ分析を使用するさらなる研究により、以下のＮ−末端アミノ酸配列の配列番号２８を有する（配列番号１のＮ末端メチオニンを欠いている）がより多くある断片であることを示した。

この断片のＣ末端には付加的なアルギニン残基（すなわちＳＬＬ．．．ＱＲＲ、配列番号２９）があってもよい。この断片（ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬＳ；配列番号３０）のＮ末端１２−ｍｅｒは、株間で高く保存される。

本発明の組成物はそのような両方の断片を含んでもよく、Ｎ末端の付近からの断片（例えば配列番号２８）がより多い。

本発明が例としてのみ記述されることは理解されるだろうし、本発明の範囲および趣旨内にあるならば、変更は行われてもよい。

参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）

Claims (24)

1. トリプシン存在下で細胞培養中で増殖したインフルエンザビリオンから調製した、精製された表面抗原インフルエンザワクチンであって、該ワクチンは、複合体として共精製されるインフルエンザウイルス血球凝集素および内在的Ｍ１マトリックスタンパク質の１０ｋＤａ以下の分子量のフラグメントを含み、ここで、該ワクチンは、オボアルブミンを含まず、ここで、該Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントは、配列ＬＥＤＶＦＡＧＫ（配列番号１７）を含む、ワクチン。
2. 請求項１に記載のワクチンであって、ここで、前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントの分子量が２〜８ｋＤａの範囲内である、ワクチン。
3. 請求項２に記載のワクチンであって、ここで、前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントの分子量が５ｋＤａである、ワクチン。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチンであって、前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントが、天然のＭ１配列のＮ末端メチオニンを欠く、ワクチン。
5. 前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントがＮ末端配列ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬＳ（配列番号３０）を有する、請求項４に記載のワクチン。
6. 前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントが、１μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
7. 前記血球凝集素が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
8. 前記ワクチンが、１ウイルス株あたり０．１〜２０μｇの血球凝集素を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
9. アジュバントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン。
10. 前記アジュバントが水中油滴型エマルジョンを含む、請求項９に記載のワクチン。
11. 複合体として共精製されるインフルエンザウイルス血球凝集素および内在的Ｍ１マトリックスタンパク質の１０ｋＤａ以下の分子量のフラグメントを含む免疫学的組成物の調製方法であって、ここで、該Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントは、配列ＬＥＤＶＦＡＧＫ（配列番号１７）を含み、該方法は、以下の工程：
    （ｉ）トリプシン存在下において細胞培養中でインフルエンザウイルスを増殖させる工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）において増殖させたウイルスから抗原組成物を調製する工程であって、ここで、該抗原組成物は、血球凝集素、および、全ビリオンではないマトリックスタンパク質を含む、工程；ならびに、
    （ｉｉｉ）該抗原組成物を薬学的担体と組み合わせて、免疫学的組成物を生成する工程；
    を包含する方法。
12. 前記インフルエンザウイルスが、ＭＤＣＫ細胞において増殖する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＭＤＣＫ細胞が、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記インフルエンザウイルスが、懸濁培養での増殖に適合した細胞株において増殖する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記工程（ｉｉ）における抗原組成物は、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いてインフルエンザウイルスをスプリットすることによって調製される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントが、（ａ）全長Ｍ１マトリックスタンパク質アミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列を有する、および／または、（ｂ）前記マトリックスタンパク質が、天然のＭ１配列のＮ末端メチオニンを欠く、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントがＮ末端配列ＳＬＬＴＥＶＥＴＹＶＬＳ（配列番号３０）を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントが、１μｇ／ｍｌ〜１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. スプリットインフルエンザウイルスまたは精製されたインフルエンザ表面抗原を含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記血球凝集素が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９インフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 複合体として共精製される前記血球凝集素および前記内在的Ｍ１マトリックスタンパク質フラグメントが宿主細胞の培養で増殖させたインフルエンザウイルスから調製されており、前記組成物が該宿主細胞由来の１０ｎｇ未満の細胞性ＤＮＡを含む、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記組成物が、１ウイルス株あたり０．１〜２０μｇの血球凝集素を含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記組成物がアジュバント、または、１つ以上のアルミニウム塩を含む、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記アジュバントが、水中油滴型エマルジョンである、請求項２３に記載の方法。

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