KR20080089663A - 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신 - Google Patents

적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신 Download PDF

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노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 게엠베하 운트 콤파니 카게
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Abstract

인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함한 면역원성 조성물이다. 이들은 난이 아닌 인플루엔자 세포 배양액에서 성장한 바이러스에서 유래한 것이다. 기질 단백질은 전장 바이러스 기질 단백질의 절편일 수 있으며, 예컨대, 분자량이 2OkDa 이하인 기질 M1 절편을 함유할 수 있다. 조성물은 정제된 표면 글리코단백질을 포함하는 서브유닛 백신일 수 있다.
Figure 112008060235918-PCT00011
인플루엔자, 혈구응집소, 기질 단백질, 백신

Description

적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINES CONTAINING HEMAGGLUTININ AND MATRIX PROTEINS}
본 명세서에서 언급하는 모든 문서는 일체성을 가지고 참고자료로서 포함되어 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에서 보호하기 위한 백신에 관한 것이며, 특히 기질 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.
다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 시판되어 있다(예컨대, 참고자료 1의 17 및 18 장을 참고). 백신은 일반적으로 생 바이러스 또는 불활성 바이러스에 기초한다. 불활성 백신은 전 비리온, '분할' 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초할 수 있다.
혈구응집소(HA)는 불활성 인플루엔자 백신 내의 주 면역원이며, 백신 투여량은 일반적으로 단일 방사 면역확산(SRID) 측정법으로 측정된 HA 수준에 기초하여 표준화되어 있다. 현재의 백신은 일반적으로 약 15㎍의 HA/균주/투여량을 함유한다. 인플루엔자 HA를 포함함과 아울러, 백신은 추가로 인플루엔자 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 모든 현재의 백신은 뉴라미니다제(NA)를 포함한다. 참고자료 2에서는 유럽 인플루엔자 백신은 상당량의 다른 인플루엔자 바이러스 단 백질을 포함할 수 있음을 보고하였다. 예를 들면, 기질(M) 단백질은 분할 백신에서 발견되나 정제된 표면 항원 백신에서 발견되지 않는다.
인플루엔자 바이러스 항원과 함께, 참고자료 2는 백신이 난(卵)-유래 단백질, 예컨대, 난(卵)날부민을 함유할 수도 있음을 보고하였다. 이러한 단백질은 백신 제조시의 인플루엔자 바이러스 성장을 위한 표준 방법이 발육 계란과 난 함유물(요막액)에서 정제된 바이러스를 사용하기 때문에 발생한다.
백신 제조시 바이러스 성장을 위하여 란(卵)을 사용하는 대신에, 세포 배양액에서 바이러스를 성장시키는 방법이 제안되어 왔다. 이러한 기법을 연구하는 과정에서, 발명자들은 예기치 않게도 기질 서열을 검출하였다. 특히, 참고자료 2의 경우 난에서 성장한 비리온에서 제조된 정제된 표면 항원 백신 내에서는 기질 단백질이 발견되지 않았으나, 발명자들은 세포 배양액에서 성장한 비리온으로부터 제조된 정제된 표면 항원 백신 내에서 기질 단백질을 검출하였다.
따라서, 본 발명은 세포 배양액에서 성장한 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함한 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 난알부민을 포함하지 않는다. 조성물은 다른 난 단백질(예컨대, 난점질) 및 닭 DNA가 부재할 수 있다.
본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다: (i) 세포 배양액 내에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 성장된 바이러스로부터 항원 조성물을 제조하는 단계, 여기서 항원 조성물은 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하며; 및 (iii) 항원 조성물을 약학적 담체와 결합하여 면역원성 조성물을 생성하는 단계.
관찰된 특정 기질 단백질은 M1의 절편이다. 전장 M1 단백질은 27.8kDa의 단백질이나, 관찰된 절편은 저 분자량 SDS-PAGE 겔(하기 참조)상에서 분자량이 약 5kDa 이다. 이는 고도로 보존된 아미노산 서열 LSYSXGALA (SEQ ID NO:1)을 포함하며, 여기서, X는 A 또는 T이다. 따라서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함한 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서: 기질 단백질은 분자량이 20kDa 이하이며, SEQ ID NO:1과 최소한 50%가 일치하는 아미노산 서열 (예컨대, 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상)을 포함한다. 관찰된 또 다른 M1 절편은 약 75aa 길이이며, N-말단 메티오닌의 전체 M1 서열이 결핍되어 있다(예컨대, 이는 아미노산 서열 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29를 보유한다). 따라서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함한 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 기질 단백질은 중성 M1 서열의 N-말단 메티오닌이 부재한 M1 단백질이다. 기질 단백질은 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29과 최소한 50%가 일치하는 아미노산 서열 (예컨대, 최소한 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌의 부재와 아울러, 절편은 N-말단 메티오닌으로부터의 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 하방(downstream)이 부재일 수 있다.
이러한 조성물은 세포 배양액에서 성장한 바이러스로부터 제조되는 것이 바람직함에도, 이들은 예컨대, 기질 단백질을 난-유래 백신에 첨가하고, 기질 단백질의 생산 및 존재하게 하는 난-유래 비리온으로 정제 프로토콜을 사용하고, 기질 단백질과 재조합-발현 HA (및, 선택적으로, 다른 재조합-발현 단백질), 등을 결합하는 다른 방법으로 제조될 수도 있다.
항원 성분의 제조
본 발명은 전 비리온(WV) 항원을 사용하지 않는다. 즉, 생 바이러스 또는 전 불활성 비리온을 사용한 백신을 포괄하지 않는다. 그 대신에, 본 발명의 항원은 비-WV 항원, 예컨대, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원이다. 본 발명의 조성물은 최소한 두 개의 인플루엔자 바이러스 항원: 혈구응집소 및 기질을 포함한다. 이들은 또한 다른 인플루엔자 바이러스 항원(들), 예컨대, 뉴라미니다제(neuraminidase) 등을 포함한다. 항원은 일반적으로 인플루엔자 비리온(바람직하게는 세포 배양액에서 성장)으로부터 제조되나, 일 실시 상태에서, 항원은 재조합 숙주 (예컨대, 바큘로바이러스 벡터를 사용한 곤충 세포주)에서 발현될 수 있으며 정제된 형태로 사용될 수 있다 [3,4]. 그러나 일반적으로, 항원은 비리온의 것이다.
비리온으로부터 비-WV 항원을 제조시, 비리온은 불활성일 수 있다. 바이러스를 불활성화시키는 화학적 수단은 하나 또는 그 이상의 다음의 약제의 유효량으로 처리하는 것을 포함할 수 있다: 세정제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시플러렌(C60), 바이너리 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 바이러스 불활성화의 비-화학적 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 예를 들면 UV 광 또는 감마선 조사이다.
비리온은 다양한 방법을 통하여 바이러스-함유 유체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 방법은 비리온을 파괴하는 성분을 함유한 선형 슈크로스 성분 용액을 사용하는 구역원심분리가 관계될 수 있다. 그 다음 항원은 선택적인 희석 후에 정용여과에 의하여 정제될 수 있다.
분할 비리온은 비리온을 세척제(예컨대, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 인산, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9, 등)로 처리하여 획득하여 '트윈-에테르' 분할 방법에 포함하는 서브비리온 제조물을 생산할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 분할 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 참고자료 5-10, 등. 바이러스의 분할은 일반적으로 감염성 또는 비감염성인 전 바이러스의 분할제의 파괴 농도로 파괴 또는 절편화에 의하여 수행된다. 파괴에 의하여 바이러스 단백질의 전체 또는 일부 가용화가 되었으며, 바이러스의 통합성을 변화시켰다. 바람직한 분할제는 비이온성 및 이온성(예컨대, 양이온성) 계면활성제 예컨대, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실당, 설포베타인, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카마이드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 인산염, 세타브론, 미리스틸트리메틸암모늄염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대, 트리톤 계면활성제, 예컨대, 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르, 등이다. 유용한 하나의 분할 방법은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속 효과를 사용하며, 분할은 초기 비리온 분리정제시 발생할 수 있다(예컨대, 설탕 밀도 성분 용액 내에서). 따라서 분할 방법은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확된 비리온의 농도(예컨대, 흡착 방법, 예컨대, CaHPO4 흡착을 사용), 비-비리온 물질로부터 전 비리온의 분리, 밀도 성분 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온 분할(분할제 예컨대, 나트륨 데옥시콜레이트를 함유한 설탕 성분을 사용), 및 원치않는 물질을 제거하기 위한 후속적인 여과(예컨대, 초여과)가 관여될 수 있다. 분할 비리온은 나트륨 인산염-완충 등장성 염화 나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품은 분할 백신이다.
정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 적혈구응집소 및, 일반적으로, 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태의 이러한 단백질의 제조 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 서브유닛 백신이다.
인플루엔자 항원은 INFLEXAL V™ 및 INVAVAC™ 제품에서처럼 바이로좀(핵산 부재 바이러스-유사 리포좀 입자)의 형태로 제시될 수 있다 [11]. 그러나 본 발명에서는 바이로좀을 사용하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 일 실시 상태에서, 인플루엔자 항원은 바이로좀의 형태가 아니다.
인플루엔자 바이러스는 감독(減毒)될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성이 될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 저온-적응형이 될 수 있다. 항원으로서 생 바이러스를 사용하는 경우, 이러한 세 가지 특성이 특히 유용하다.
백신에 사용되는 인플루엔자 바이러스 균주는 계절별로 변화될 수 있다. 현재의 대유행기간 사이에서, 백신은 일반적으로 두 인플루엔자 A 균주(H1N1 및 H3N2) 및 하나의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 및 3가 백신이 일반적이다. 본 발명은 유행성 균주(즉, 백신 수용자 및 일반 인간 개체군이 면역학적으로 미경험인 균주)의 HA, 예컨대, H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주(특히 인플루엔자 A 바이러스의 균주)를 사용할 수도 있으며, 유행성 균주용 인플루엔자 백신은 1가가 되거나 또는 유행성 균주에 의하여 보충된 정상 3가 백신에 기초할 수 있다. 그러나, 계절 및 백신에 포함된 항원의 특성에 따라, 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대하여 보호될 수 있다. 본 발명은 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대하여 보호할 수 있다.
본 발명의 항원보강형 조성물은 유행성 균주에 대한 접종에 특히 유용하다. 유행성 발병을 유발할 수 있는 능력을 부여하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 이는 현재-순환되는 인간 균주 내의 적혈구응집소에 비하여 신규의 적혈구응집소를 함유하며, 즉, 10년 이상 인간 개체군에게 명백하지 않거나(예컨대, H2), 또는 이전에 인간 개체군에서 발견되지 않은 것(예컨대, H5, H6 또는 H9, 일반적으로 조류 개체군에서만 발견)으로서, 인간 개체군이 균주의 적혈구응집소에 면역학적으로 미경험인 것; (b) 인간 개체군에 수평적으로 감염될 수 있는 것; 및 (c) 인간에 병원성인 것. H5 적혈구응집소 타입을 보유한 바이러스는 유행성 인플루엔자, 예컨대, H5N1 균주에 대한 면역접종에 바람직하다. 그 밖의 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 기타 발생하는 잠재적인 유행성 균주를 포함한다. H5 서브타입 내에서, 바이러스는 HA 클레이드 1, HA 클레이드 1', HA 클레이드 2 또는 HA 클레이드 3 [12]에 해당될 수 있으며, 클레이드 1 및 3가 특히 관련되어 있다.
조성물 내에 유용하게 포함될 수 있는 항원의 그 밖의 균주는 저항성 유행성 균주를 포함하는 항바이러스 요법에 내성(예컨대, 오셀타미비르[13] 및/또는 자나미비르에 내성)인 균주이다[14].
본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 인플루엔자 바이러스 균주의 항원(들)을 포함할 수 있다. 1가 백신은 바람직하지 않으며, 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주는 일반적으로 분리하여 성장하며, 바이러스를 수확한 후에 혼합되고, 항원이 제조된다. 따라서 본 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주의 항원 혼합 단계를 포함할 수 있다. 3가 백신은 두 종의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시 상태에서, 조성물은 단일 인플루엔자 A 균주에서 유래한 항원을 포함할 수 있다. 일 실시 상태에서, 이러한 두 균주는 H1N1 및 H3N2가 아닌 경우, 조성물은 두 개의 인플루엔자 A 균주로부터의 항원을 포함할 수도 있다. 일 실시 상태에서, 조성물은 2 이상의 인플루엔자 A 균주로부터 유래한 항원을 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 재배열 균주일 수 있으며, 역 유전학 기법에 의하여 획득할 수 있다. 역 유전학 기법[예컨대, 15-19]에 의하여 소망하는 게놈 부분을 함유한 인플루엔자 바이러스를 플라스미드를 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 일반적으로, 이는 (a) 예컨대, polI 프로모터로부터 소망하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예컨대, polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 발현과 관련되어 있어, 세포 내에서 두 유형의 DNA의 발현에 의하여 완전 무손상 감염성 비리온의 조립을 유도한다. DNA는 바이러스 RNA 및 단백질 모두를 제공하는 것이 바람직하나, 또한 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하여 일부의 RNA 및 단백질을 제공하는 것도 가능하다. 각 바이러스 RNA를 생산하기 위한 별도의 플라스미드를 사용하는 플라스미드계 방법이 바람직하며[20-22], 이러한 방법은 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대, PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현하기 위하여 일부 방법에서 사용되는 12 플라스미드를 사용하는 것이다.
필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위하여, 최근의 연구[23]는 복수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트 (바이러스 RNA 합성용)를 동일한 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A vRNA 부분을 암호화하는 서열)상에서 결합하고, RNA 중합효소 II 프로모터를 보유한 복수의 단백질-암호화 영역을 다른 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A mRNA 전사체를 암호화하는 서열)상에서 결합한다. 참고자료 23의 방법의 바람직한 특징은: (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모든 8 vRNA-암호화 부분이다. 일 플라스미드 상의 NA 및 HA 부분 및 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 부분을 포함하는 것은 문제를 촉진시킬 수 있다.
바이러스 RNA 부분을 암호화하기 위한 polI 프로모터를 사용의 대안으로서, 박테리오파아지 중합효소 프로모터를 사용할 수 있다 [24]. 예를 들면, SP6, T3 또는 T7 중합효소의 프로모터는 편리하게 사용할 수 있다. polI 프로모터의 종-특이성 때문에, 박테리오파아지 중합효소 프로모터는 외인성 중합효소를 암호화하는 플라스미드로 전달감염되어야 함에도 많은 세포 유형(예컨대, MDCK)에 대하여 더욱 편리할 수 있다.
다른 기법으로서, 2중 polI 및 polII 프로모터를 사용하여 바이러스 RNA 및 단일 주형으로부터 발현가능한 mRNA를 동시에 암호화할 수 있다[25, 26].
따라서, 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34 바이러스의 하나 이상의 RNA 부분(일반적으로 백신 균주의 HA 및 N 부분을 보유한 A/PR/8/34의 6 부분, 즉 6:2 재분류)을 포함할 수 있다. 이는 A/WSN/33 바이러스, 또는 백신 제조를 위하여 재분류 바이러스를 생산하기에 유용한 다른 바이러스 균주의 하나 이상의 RNA 부분을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 인간-대-인간 감염이 가능한 균주에 대하여 보호하며, 따라서 균주의 게놈은 일반적으로 포유류 (예컨대, 인간) 인플루엔자 바이러스에서 유래한 최소한 하나의 RNA 부분을 포함하게 된다. 이는 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래한 NS 부분을 포함할 수도 있다.
항원의 공급원으로 사용된 바이러스는 일반적으로 세포 배양액 상에서 성장하나, 일 실시 상태에서, 난 상에서 성장할 수 있다.
현재 인플루엔자 바이러스 성장용 표준 방법은 계란 함유물(요막액)으로부터 정제된 바이러스를 보유한 정전 무병원성(SPF) 수정 계란을 사용한다. 보다 근자에는, 그러나, 바이러스는 속도와 환자의 알러지의 이유로 동물 세포 배양물에서 성장되었으며, 이 성장 방법이 바람직하다. 난 기초 바이러스 성장이 사용되는 경우, 하나 이상의 아미노산이 바이러스와 함께 난 요막액으로 도입될 수 있다[10].
세포 기질은 일반적으로 포유류 세포주가 될 수 있다. 적합한 포유류 원 세포에는 햄스터, 가축류, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 세포 유형, 예컨대, 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포, 폐 세포, 등이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포는 BHK21 또는 HKCC로 명명된 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는 예컨대, 아프리카 그린 원숭이 세포로서, 예컨대, 신장 세포는 베로 세포주이다. 적합한 개 세포는 예컨대, 신장 세포로서 MDCK 세포주이다. 따라서 적합한 세포주는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등. 포유류 세포의 용도는 예컨대, 닭 DNA, 계란 단백질 (예컨대, 난알부민 및 난점질) 등의 물질이 부재할 수 있는 것을 의미하며, 따라서 알러지 유발성을 감소시킨다. 인플루엔자 바이러스 성장을 위한 바람직한 포유류 세포주는 다음을 포함한다: MDCK 세포[27-30], 메디안 더비 카닌 신장으로부터 유도; 베로 세포[31-33, 아프리칸 그린 원숭이(세르코피테쿠스 아에티오프스(Cercopithecus aethiops)) 신장로부터 유도; 또는 PER.C6 세포[34], 인간 배아성 망막모세포로부터 유도. 이러한 세포주는 예컨대, 아메리칸 타입 셀 컬쳐(ATCC) 콜렉션[35], 코리엘 셀 레포지토리(Coriell Cell Repositories)[36], 또는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC) 등으로부터 광범위하게 활용가능하다. 예를 들어, ATCC는 다양한 다른 베로 세포를 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587에서 공급하며, 이는 MDCK 세포를 카탈로그 번호 CCL-34에서 공급한다. PER.C6는 ECACC로부터 수탁 번호 96022940로서 활용가능하다. 포유류 세포주의 덜 바람직한 대안으로서, 바이러스는 조류 세포주[예컨대, 참고자료 37-39] 상에서 성장할 수 있으며, 오리로부터 유도된 세포(예컨대, 오리 망막) 또는 닭으로부터 유도된 세포주를 포함한다. 조류 세포주의 예로서는 조류 배아 줄기 세포[37, 40] 및 오리 망막 세포[38]를 포함한다. 적합한 조류 배아 줄기 세포는 닭 배아 줄기 세포, EB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유도된 EBx 세포주를 포함한다[41]. 닭 배아 섬유모세포(CEF)가 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 성장에 가장 바람직한 세포주는 MDCK 세포주이다. 원 MDCK 세포주는 ATCC에서 CCL-34로서 이용가능하나, 이 세포주의 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 참고자료 27은 현탁액 배양시 성장에 적응된 MDCK 세포주를 개시하였다('MDCK 33016', 수탁 번호 DSM ACC 2219). 이와 유사하게, 참고자료 42는 현탁액의 무혈청 배양시 성장하는 MDCK-유도성 세포주를 개시하였다('B-702', 수탁 번호 FERM BP-7449). 참고자료 43는 비-종양유발성 MDCK 세포로서, 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(PTA-6503)를 포함하는 세포를 개시하였다. 참고자료 44는 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL-12042)를 포함하는 감염에 대한 고 민감성 MDCK 세포주를 개시하였다. 모든 이러한 MDCK 세포주를 사용할 수 있다.
바이러스가 세포주 상에서 성장하는 경우, 성장용 배지, 및 배양 개시시 사용된 바이러스 접종물에는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 3(parainfluenza virus 3), SARS 코로나바이러스(SARS coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 레오바이러스(reovirus), 폴리오마바이러스(폴리mavirus), 비르나바이러스(birnavirus), 시르코바이러스(circovirus), 및/또는 파르보바이러스(parvovirus)가 부재(즉, 시험되어, 오염에 음성인)한 것이 바람직하다[45]. 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)의 부재가 특히 바람직하다.
바이러스는 현탁액 [46] 또는 고착 배양액에서 세포 상에서 성장할 수 있다. 일 실시 상태에서, 세포는 현탁액 내에서 성장하도록 적응될 수 있다. 현탁액 배양시 성장에 적응된 하나의 적합한 MDCK 세포주는 MDCK 33016(DSM ACC 2219로 기탁)이다. 대안으로서, 미소담체 배양이 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 배지는 본원에서 무혈청 배지라는 의미로 사용되며, 인간 또는 동물 기원의 혈청에 첨가제를 부가하지 않은 것이다. 무단백질은 세포를 조작하여 단백질, 성장 인자, 기타 단백질 첨가제 및 비혈청 단백질의 배제로 발생하며, 선택적으로 단백질 예컨대, 바이러스 성장에 필수적인 트립신 또는 기타 단백질분해효소를 포함할 수 있는 배양을 의미한다. 이러한 배양액 내에서의 세포 성장에 의하여 자연적으로 자신들의 단백질을 보유하게 된다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 예를 들어 바이러스 복제시 37℃ 이하(예컨대, 30-38℃)에서 성장하는 것이 바람직하다[47].
배양된 세포 내의 바이러스 증식 방법은 일반적으로 배양된 세포를 배양된 균주로 접종하는 단계, 예를 들어 바이러스 티터 또는 항원 발현에 의하여 측정하여 (예컨대, 접종 후 24 내지 168 시간) 바이러스 증식을 위한 소망하는 시간 동안 감염된 세포를 수확하는 단계, 및 증식된 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 바이러스(PFU 또는 TCID50로 측정)로, 세포비가 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더 바람직하게는 1:50 내지 1:10이 되도록 접종할 수 있다. 바이러스 세포의 현탁액에 첨가되거나 또는 세포의 단일층에 도포될 수 있으며, 바이러스는 세포에 최소한 60 분간 흡수되나 일반적으로 300 분 이하, 바람직하게는 90 내지 240 분으로, 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃이다. 감염된 세포 배양물(예컨대, 단일층)은 냉동-해동법 또는 수확된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키는 효소 반응 등에 의하여 제거될 수 있다. 수확된 유체를 불활성 또는 냉동 저장한다. 배양된 세포는 감염다중도("m.o.i.")가 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더 바람직하게는 0.001 내지 2로 감염될 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 m.o.i가 약 0.01로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60 시간 후 수확된다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간 후 수확된다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 감염 후 38 내지 40 시간 후 수확된다. 단백질분해효소(일반적으로 트립신)는 일반적으로 세포 배양 중에 첨가되어 바이러스 방출이 되도록 하며, 단백질분해효소는 배양 중 모든 적합한 단계에서 첨가될 수 있다.
HA는 현재의 불활성 인플루엔자 백신 내의 주 면역원이며, 백신 투여량은 일반적으로 SRID에 의하여 측정된 HA 수준으로 표준화되었다. 현존하는 백신은 일반적으로 약 15㎍의 HA를 균주당 함유하나, 예컨대, 아동용으로, 또는 유행성인 경우, 또는 보조제를 사용하는 경우에는 적은 투여량으로 사용될 수도 있다. 분할 투여량 예컨대, 1/2 (즉, 7.5 ㎍ HA/균주), 1/4 및 1/8가 고복용량(예컨대, 3x 또는 9x 투여량[48, 49])으로 사용될 수 있다[89, 90]. 따라서 백신은 0.1 내지 150 ㎍의 HA/인플루엔자 균주, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎍, 예컨대, 0.1-20 ㎍, 0.1-15 ㎍, 0.1-10 ㎍, 0.1-7.5 ㎍, 0.5-5 ㎍, 등을 포함할 수 있다. 특정 투여량은 예컨대, 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5, 등을 포함한다.
생백신의 경우, 투여량은 HA 함량보다는 정중 조직 배양 감염성 투여량(TCID50)에 의하여 측정되며, TCID50가 균주당 106 내지 108 (바람직하게는 106.5-107.5)인 것이 일반적이다.
본 발명에 사용되는 HA는 바이러스에서 발견되는 천연 HA일 수 있으며, 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, HA는 결정기(예컨대, HA1 및 HA2의 분할 부위 부근의 과염기성 영역)을 제거하여 바이러스가 조류 종에서 고병원성이 되도록 변형된다고 알려져 있으며, 이는 이러한 결정기가 난(egg) 내에서 성장된 바이러스를 예방할 수 있기 때문이다.
기질 단백질
혈구응집소에 포함될 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 기질 단백질을 포함한다. 인플루엔자 A 바이러스의 부분(Segment) 7은 M1 및 M2 폴리펩타이드를 암호화한다. M1는 바이러스 인지질 이중층 상에 존재하며, 반면에 M2는 아만타딘에 의하여 억제된 이온 채널을 제공하는 통합 멤브레인 단백질이다. M2는 스플라이싱된 mRNA로부터 발현된다. 인플루엔자 B 바이러스의 부분 7은 M1 및 BM2 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명의 조성물에 포함된 기질 단백질은 일반적으로 인플루엔자 A 바이러스에서 유래한 M1 단백질이다. PR/8/34 인플루엔자 A 바이러스에서 유래한 전장 252aa의 M1 서열은 GI: 138817 하의 데이터베이스에서 이용이 가능하며, 이는 본원의SEQ ID NO:2 이다:
MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTL
TVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEISLSYSAGALASCMGLIY
NRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQ
AAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK
본 발명의 조성물에 포함된 기질 단백질은 바람직하게는 최소한 m 아미노산 길이의 M1 아미노산 서열을 포함하며, 상기 m 아미노산은 SEQ ID NO:2와 최소한 n% 일치한다. m 아미노산은 일반적으로 SEQ ID NO:2의 최소한 p 개의 연속적인 아미노산 절편을 포함한다.
m의 값은, 예를 들면, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상일 수 있다. n 값은, 예를 들면, 70 (예컨대, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상)이다. p 값은, 예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상이다. 여기서 n < 100, p는 m 이하이다.
SEQ ID NO:2에 비하여, m 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 보존적 아미노산 치환 즉 아미노산이 유관 측쇄를 보유한 다른 것으로 치환되는 것을 보유한다. 유전적으로-암호화한 아미노산은 일반적으로 4 종류로 분류된다: (1) 산성 즉, 아스파르트산염, 글루탐산염; (2) 염기성 즉, 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 즉, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 무전하 극성 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 함께 분류되기도 한다. 일반적으로, 이러한 종류 내의 단일 아미노산의 치환은 생물학적 활성에 주된 영향을 주지 못한다. m 아미노산은 SEQ ID NO:2에 비하여 하나 또는 그 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등)의 단일 아미노산 결실(deletion)을 포함할 수 있다. m 아미노산은 SEQ ID NO:2에 비하여 하나 또는 그 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등) 삽입 (예컨대, 각각 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산)을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 바람직한 기질 단백질은 M1에서 유래한 에피토프를 포함한다. 에피토프는 T-세포 및/또는 B-세포 에피토프일 수 있다. T- 및 B-세포 에피토프는 경험적으로 확인될 수 있으며(예컨대, PEPSCAN [50,51] 또는 이와 유사한 방법을 사용), 또는 이들은 예측될 수 있다(예컨대, Jameson-Wolf 항원 지수 [52], 기질-기초 방법 [53], TEPITOPE [54], 중성 네트워크 [55], OptiMer & EpiMer [56, 57], ADEPT [58], Tsites [59], 친수성 [60], 항원지수 [61] 또는 참고자료 62에 개시된 방법 등). 이러한 방법에 의하여, T-세포 에피토프는 인플루엔자 A 바이러스 M1 단백질에서 확인되었으며, 다음을 포함한다 [63]:
MHC 서열 SEQ ID REF
HLA-A*0201 GILGFVFTL 3 64
HLA-A*0201 ILGFVFTLTV 4 64
HLA-A*1101 SIIPSGPLK 5 65
H-2Kb MGLIYNRM 6 66
HLA-B*3501 ASCMGLIY 7 67
HLA-CW*0102 ILSPLTKGI 8 68
HLA-CW*0102 ILSPLTKGIL 9 68
HLA-DQw1 AYQKRMGVQMQR 10 69
HLA-DQw3 LENLQAYQKR 11 69
HLA-DRB1*0101 GPLKAEIAQRLE 12 70
Saoe-G*02 RKLKREITF 13 71
Saoe-G*04 RKLKREITFH 14 71
M1 내의 다른 T 세포 에피토프는: SLLTEVETYV (SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:2의 잔기 2-11); IIPSGPLK (SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:2의 잔기 14-21); 및 LEDVFAGK (SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:2의 잔기 28-35).
세포 배양액에서 제조된 백신 내에서 최초로 검출된 특정 기질 단백질은 5kDa 단백질로서 N-말단 서열 EISLSYSAGALA (SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:2의 잔기 114-125)을 지닌다. 이 폴리펩타이드의 N-말단 잔기 및 크기는 트립신에 의한 M1의 절편과 일치한다. 이 경우 전장 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열 중의 하나를 보유한다:
SEQ ID NO:19 - EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHR
SEQ ID NO:20 - EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHR
SEQ ID NO:19는 전체 Cys-Cys-His-His 모티프(SEQ ID NO:2의 잔기 148-162)를 포함하며, 아연에 대한 친화도를 부여한다[72]. 따라서 본 발명에 사용된 기질 단백질은 추가적으로 아연 이온을 포함한다.
SEQ ID NO:18 서열은 서열 LSYSXGALA (SEQ ID NO:1)을 포함하며, 이는 인플루엔자 A 바이러스 균주 사이에 5 번째 잔기 'X'가 각각 Thr (LSYSTGALA, SEQ ID NO:21) 또는 Ala (LSYSAGALA, SEQ ID NO:22)가 되어 잘 보존된다. 이 보존된 9량체의 변형체는 공지되어 있다(예컨대, A/Swine/Ontario/01911-2/99 (H4N6)에서, 9량체는 LNYSTGALA [GI:10442678; SEQ ID NO:23]이고, 및 A/swine/England/191973/92 (H1N7)에서, 이는 LGYSTGALA [GI:1835734; SEQ ID NO:24]이고, A/Chicken/Pennsylvania/13609/93 (H5N2)에서, 이는 LSYSTGALT [GI:4584948; SEQ ID NO:25]이다, A/WSN/33에서, 이는 FSYSAGALA [GI:324407; SEQ ID NO:26]이다), 그러나 SEQ ID NO:1는 가장 일반적인 서열이다. 모든 이러한 서열 내의 중핵(core) YSXGAL (SEQ ID NO:27)에 특징이 있다. 인플루엔자 바이러스 내의 서열은 편의상 인플루엔자 서열 데이터베이스(ISD) www.flu.lanl.gov [73]에 존재한다. 추가의 서열은 참고자료 74에서 발견할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물에 포함된 바람직한 기질 단백질은 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및/또는 27을 포함한다. 반면에 전장 M1 단백질는 27.8kDa 단백질이나, 본 발명의 조성물에 포함된 기질 단백질은 분자량이 <20kDa 예컨대, ≤15kDa, ≤12kDa, ≤10kDa, ≤9kDa, ≤8kDa, ≤7kDa, ≤6kDa, ≤5.5kDa, 또는 약 5kDa이다. 기질 단백질의 분자량은 바람직하게는 2-8kDa, 예컨대, 3-7kDa, 4-6kDa의 범위에 있거나, 또는 약 5kDa이다. 기질 단백질의 N-말단은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 중의 하나가 Glu-Ile-Ser를 따르게 된다.
기질 단백질은 조성물 내에서 올리고머(예컨대, 이량체, 예컨대, 동종이량체)를 형성할 수 있다.
기질 단백질이 아미노산 137 (SEQ ID NO:2에서 계수)을 포함한다면, 이 아미노산은 Ala (SEQ ID NO:2) 또는 Thr (병원성 H5N1 인간 바이러스에서 발견)가 될 수 있다.
기질 단백질은 다양한 양으로 존재할 수 있으나, 일반적으로 1 ㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖ 예컨대, 2-14㎍/㎖ 사이, 3-13㎍/㎖ 사이, 4-12㎍/㎖ 사이, 5-11㎍/㎖ 사이, 6-10㎍/㎖ 사이, 7-9㎍/㎖ 사이 등으로 존재한다. 1㎍/㎖ 이하의 농도도 가능하다.
혈구응집소와 함께, 이러한 기질 단백질을 첨가함으로써, 본 발명의 조성물은 존재하는 모든 T 세포 에피토프로부터 이득을 얻으며, 이는 (동일한 HA 타입 내에서, 및 다른 HA 타입 사이에서) 백신에 의하여 유발된 상호-보호를 향상시키게 된다[75]. 기질 단백질은 조성물 제조의 결과로서 생래적으로 존재할 수 있거나 (예컨대, 이는 HA로 보조-정화된다), 또는 예컨대,난-유래 백신을 포함하는 기질 성분을 함유하지 않은 백신을 개선하기 위하여, 외래의 성분으로서 첨가될 수 있다.
이론에 따라 결합되도록 세척하지 않는다면, 발명자들은 백신 내에서 기질 단백질이 HA에 결합하여 안정적인 복합체를 형성한다고 생각하였다. 복합체가 HA 단독으로서 보다 더 안정적이라면 백신의 보존 기간이 개선될 것이며, 특히 냉장고 외부에서의 저장 능력이 개선될 것이다.
M1 내의 SEQ ID NO:1 주변의 영역은 지질-결합 도메인으로서 작용할 수 있다[76]. 기질 단백질에 이 영역을 포함함으로써, 단백질은 이하 상세하게 설명하는 바와 같이 지방 보조제와 유익하게 상호작용할 수 있다.
조성물이 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 균주로부터 유래한 HA를 포함하는 경우, 일반적으로 하나 이상의 균주에서 유래한 기질 단백질을 포함하게 된다. 균주에서 유래한 HA가 일반적으로 서로 다른 경우라면, 그러나, 기질 단백질은 동일할 수 있다. 이들이 최종 제품 내에서 동일한 것이라면, 두 개의 기질 단백질을 구별할 수 없을 것이나, 이들은 서로 다른 기원을 가진다.
HA 및 기질을 포함할 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 뉴라미니다제 및/또는 핵단백질을 포함할 수 있다.
조성물이 인플루엔자 B 바이러스에서 유래한 HA를 포함하는 경우, 이는 인플루엔자 B 바이러스에서 유래한 M1 단백질을 포함할 수 있다.
숙주 세포 DNA
바이러스가 세포주 상에서 성장하는 경우, 이는 DNA의 발암 활성을 최소화하기 위하여, 최종 백신 내의 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 표준 기술이다. 이 안전 수단은 기질 단백질이 핵산에 결합할 수 있는, 백신 내의 인플루엔자 바이러스 기질 단백질을 포함하는 경우 특히 중요하며(RNA 및 이중-나선 DNA를 포함) [77], HA-기초 백신에 존재하는 것보다 더 쉽게 DNA를 보유할 수 있게 된다.
따라서, 숙주 세포 DNA가 극소량으로 존재할 수 있음에도, 조성물은 바람직하게는 투여당 10ng 이하(바람직하게는 1ng 이하, 더 바람직하게는 100pg 이하)의 잔여 숙주 세포 DNA를 포함한다. 모든 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 이하, 예컨대, 400bp 이하, 300bp 이하, 200bp 이하, 100bp 이하, 등으로 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 본 발명의 조성물에서 배제되는 것이 바람직한 숙주 세포 DNA는 100bp 이상인 DNA 이다.
잔여 숙주 세포 DNA의 측정은 현재 생물학적으로 통상적인 조절 요건이며 당해 기술분야의 숙련자의 일반적인 능력의 범위 내에 존재한다. DNA 측정에 사용되는 측정법은 일반적으로 입증된 측정법이다 [78,79]. 입증된 측정법의 성능 특성은 수학적 및 정량적인 용어로 설명될 수 있으며, 이들의 에러(error)의 가능한 공급원은 이미 알려져 있다. 측정법은 일반적으로 예컨대, 정확성, 정밀도, 특이성의 특성에 대하여 시험되었다. 측정이 비교되는 경우(예컨대, 숙주 세포 DNA의 알려진 표준량과 비교) 및 시험되는 경우, 그 다음으로 정량적 DNA 측정을 통상적으로 수행할 수 있다. DNA 정량을 위한 3종의 기본 기법이 사용될 수 있다: 혼성화 방법, 예컨대, 서던 블롯 또는 슬롯 블롯 [80]; 면역분석 방법, 예컨대, Threshold™ 시스템 [81]; 및 정량적 PCR [82]. 이러한 방법들은 당해 기술 분야의 숙련자에게 익숙한 것이나, 각 방법의 정확한 특성은 숙주 세포 예컨대, 혼성화용 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택, 등의 문제에 달려있다. Molecular Devices사의 Threshold™ 시스템은 총 DNA의 피코그램 수준의 정량적 측정법이며, 생약학적 물질 내의 DNA 오염 수준을 모니터링하기 위하여 사용되어 왔다[81]. 일반적인 측정법은 바이오틴화 ssDNA 결합 단백질, 우레아제-컨쥬게이트 항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의 복합 반응의 비-서열-특이적 형성에 관련되어 있다. 모든 측정 성분은 제조자로부터 구입가능한 완전한 총 DNA 분석 키트 내에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들이 잔기 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적 PCR 측정법을 제공한다. 예컨대, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, 등. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 혼성화 측정법 및 총 DNA Threshold™ 시스템의 비교는 참고자료[83]에서 찾을 수 있다.
DNA의 오염은 예컨대, 크로마토그래피, 등의 전제 공정을 사용한 백신 제조시 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 예컨대, DNase를 사용한 핵산분해효소 처리에 의하여 증진될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 참고자료 84 및 85에 개시되어 있으며, 우선 바이러스 성장시에 사용할 수 있는 DNase (예컨대, 벤조나아제), 및 비리온 붕괴시 사용될 수 있는 양이온 세정제(예컨대, CTAB)의 두 단계 처리를 포함한다. 알킬화제 처리, 예컨대, β-프로피오락톤이 숙주 세포 DNA의 제거에 사용될 수 있으며, 비리온 불활성화에 사용되는 것이 유익하다[86].
15㎍의 혈구응집소 당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg)의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직하며, 따라서 백신은 0.25ml 부피당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg)의 숙주 세포 DNA를 함유한다. 50㎍의 혈구응집소당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유한 백신이 더 바람직하며, 따라서 백신은 0.5ml 부피당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유한다.
보조제
본 발명의 조성물은 보조제를 포함하는 것이 유익하며, 조성물을 투여한 환제에게서 유발되는 (체액성 및/또는 세포성) 면역 반응을 증진시키는 기능을 한다. 보조제와 함께 인플루엔자 백신을 사용하는 것은 전에 설명한 바 있다. 참고자료 87 및 88에서는 수산화 알루미늄을 사용하였으며, 참고자료 89에서는 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄의 혼합물을 사용하였다. 참고자료 90에서는 알루미늄 염 보조제의 사용을 기술하였다. Chiron Vaccines사의 FLUAD™는 수중유 에멀젼을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 보조제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
● 미네랄-함유 조성물, 칼슘 염 및 알루미늄 염(또는 이들의 혼합물)을 포함한다. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트(예컨대, "CAP" 입자, 참고자료 91)를 포함한다. 알루미늄 염은 수산화물, 인산염, 황산염 등과 가능한 적합한 모든 형태의 염(예컨대, 겔, 결정, 비결정형, 등)을 포함한다. 이러한 염의 흡착이 바람직하다. 조성물을 함유한 미네랄은 금속염 입자로서 제형화될 수 있다[92]. 알루미늄 염 보조제는 아래에서 상세하게 설명한다.
● 사이토카인-함유제 (하기 참조).
● 사포닌 [참고자료 128의 22장], 이종유래 그룹의 스테롤 글리코사이드 및 트리테르페노이드 글리코사이드로서 다양한 식물 종의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리, 및 잎에서 발견된다. 장미과 퀴라야(Quillaia saponaria Molina) 나무 수피의 사포닌은 항원보강제로서 많이 연구되어왔다. 사포닌은 시밀렉스 오르나타(Smilax ornata) (sarsaprilla), 집소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata) (brides veil), 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis) (soap root)에서 상업적으로 획득할 수 있다. 사포닌 보조제 제형은 정제된 제형, 예컨대, QS21, 및 지질 제형, 예컨대, ISCOMs을 포함한다. QS21은 Stimulon™으로 시판된다. 사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제된다. 이러한 기법을 사용하여 특이적으로 정제된 분획이 확인되었으며 QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함한다. 바람직한 사포닌은 QS21이다. QS21의 제조 방법은 참고자료 93에 포함되어 있다. 사포닌 제형은 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤을 포함할 수 있다 [94]. 사포닌 및 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(ISCOMs)로 지칭하는 독특한 입자를 형성하기 위하여 사용될 수 있다[참고자료 128의 23장]. ISCOMs은 일반적으로 포스포리피드 예컨대, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함할 수 있다. 모든 알려진 사포닌은 ISCOMs에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM는 하나 또는 그 이상의 QuilA, QHA & QHC를 포함한다. ISCOMs는 추가적으로 참고자료 94-96에 설명되어 있다. 선택적으로, ISCOMS는 추가적인 세정제를 회피할 수 있게 한다[97]. 사포닌 기초 보조제의 개발에 대한 연구는 참고자료 98 및 99에 있다.
● 지방 보조제 (하기 참조), 수중유 에멀젼을 포함.
● 박테리아 ADP-라이보실화 독소(예컨대, E.coli 열 불안정 엔테로톡신 "LT", 콜레라 독소 "CT", 또는 백일해 독소 "PT") 및 이들의 제독 유도체, 예컨대, 돌연변이 독소로 알려진 LT-K63 및 LT-R72 [10O]. 제독 ADP-라이보실화 독소를 점막 보조제로 사용하는 것이 참고자료 101에 설명되어 있으며, 비경구용 보조제는 참고자료 102에 설명되어 있다.
● 생체접착제 및 점막접착제, 예컨대, 에스테르화된 히알루론산 마이크로스피어 [103] 또는 키토산 및 이들의 유도체 [104].
● 미소입자 (즉 입경이 ~100nm 내지 ~150μm, 더 바람직하게는 ~200nm 내지 ~30μm, 또는 ~500nm 내지 ~10μm), 생분해성 및 무독성 물질 (예컨대, 폴리(α-히드록시산), 폴리하이드로부티르산, 폴리오르도에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리카프로락톤, 등)과 폴리(락타이드-코-글리코라이드)로부터 형성되는 것이 선호되며, 선택적으로 음성-대전 표면 (예컨대, SDS) 또는 양성-대전 표면 (예컨대, 양이온 세정제, 예컨대, CTAB)을 보유하도록 처리된다.
● 리포좀 (참고자료 128의 13 및 14장). 보조제에 적합한 리포좀 제형의 예는 참고자료 105-107에 설명되어 있다.
● 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 [108]. 이러한 제형은 추가로 옥트옥시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 [109] 및 최소한 하나의 추가의 비-이온성 계면활성제 예컨대, 옥트옥시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제를 포함한다[110]. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음의 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 (laureth 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테로일 에테르, 폴리옥시데일렌-8-스테로일 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.
● 뮤라밀 펩타이드, 예컨대, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 ("thr-MDP"), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-isoglu-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 ("DTP-DPP", 또는 "Theramide™), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(r-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 ("MTP-PE").
● 1차 그람-음성 박테리아로부터 제조된 외부 멤브레인 단백질 프로테오좀 조성물과 2차 그람-음성 박테리아로부터 유도된 리포사카라이드 조성물의 조합, 여기서, 외부 멤브레인 단백질 프로테오좀 및 리포사카라이드 조성물은 안정적인 비-공유결합성 보조제 복합체를 형성하게 된다. 이러한 복합체는 "IVX-908"를 포함하며, 복합체는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 외부 멤브레인 및 리포폴리사키라이드로 구성되어 있다. 이들은 인플루엔자 백신의 보조제로 사용되어 왔다 [111].
● 폴리옥시도니움 폴리머 [112,113] 또는 그 밖의 N-산화 폴리에틸렌-피페라진 유도체.
● 메틸 이노신 5'-모노포스페이트 ("MIMP") [114].
● 폴리히드록실화 파이롤리지딘 화합물 [115], 예컨대, 화학식은:
Figure 112008060235918-PCT00001
이며, 여기서 R은 수소, 선형 또는 가지형, 미치환 또는 치환, 포화 또는 불포화 아실, 알킬 (예컨대, 시클로알킬), 알케닐, 알키닐 및 아릴기, 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 그 예에는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 카수아린, 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-epi-카수아린, 7-epi-카수아린, 3,7-디epi-카수아린, 등.
● CD1d 리간드, 예컨대, α-글리코실세라마이드 [116-123] (예컨대, α-갈락토실세라마이드), 파이토스핀고신-함유 α-글리코실세라마이드, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데카니트리올], CRONY-101, 3"-O-설포-갈락토실세라마이드, 등
● 감마 이눌린 [124] 또는 이들의 유도체, 예컨대, 알가뮬린.
이러한 또는 다른 보조제-활성 물질은 참고자료 128 및 129에 상세하게 설명되어 있다.
조성물은 2 또는 그 이상의 상기 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들은 수중유 에멀젼 및 사이토카인-유도제 모두를 포함하는 것이 유익하며, 이로써 인플루엔자 백신, 예컨대, 인터페론-γ 반응에 의하여 유발되는 사이토카인 반응을 향상시키며, 에멀젼 또는 약제가 그 자체로 사용되는 경우에 관찰되는 경우보다 더 큰 개선이 있다. 조성물 내의 항원 및 보조제는 일반적으로 혼합되어 있다.
수중유 에멀젼 보조제
수중유 에멀젼은 특히 인플루엔자 바이러스 백신의 보조제용으로 사용되기 적합한 것으로 밝혀졌다. 다양한 이러한 에멀젼이 공지되어 있으며, 이들은 일반적으로 최소한 하나의 오일 및 최소한 하나의 계면활성제를 포함하며, 생분해성(대사가능한)이고 생체적합성인 오일(들) 및 계면활성제(들)을 포함한다. 에멀젼 내의 오일 액적은 일반적으로 직경이 5㎛ 이하이며, 서브-마이크론 직경을 보유할 수도 있고, 이러한 작은 크기는 극소액체화기에 의하여 달성되어 안정적인 에멀젼을 제공하게 된다. 220nm 이하 크기의 액적이 여과 멸균을 하기에 바람직하다.
본 발명은 오일이 사용될 수 있으며, 예컨대, 동물성 (예컨대, 생선) 또는 식물성 공급원에서 유래한 것이다. 식물성 오일의 공급원은 견과류, 종자, 및 곡식을 포함한다. 땅콩유, 대두유, 코코넛유, 및 올리브유, 가장 일반적으로 구득하기 쉬운 것이 견과류오일이다. 호호바(Jojoba) 오일이 사용될 수 있으며, 예컨대, 이는 호호바 빈(jojoba bean)으로부터 얻게된다. 종자 오일은 홍화씨유, 목화씨유, 해바라기씨유, 참깨 종자유 등을 포함한다. 곡식류에서는, 옥수수 오일이 가장 쉽게 구득할 수 있으나, 다른 시리얼 곡식의 오일, 예컨대, 밀, 오트, 귀리, 쌀, 테프, 라이밀 등이 사용될 수도 있다. 종자 오일 내에서 자연 발생하지 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개의 탄소 지방산 에스테르는 견과류 및 종자 오일에서 유래한 적합한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의하여 제조될 수 있다. 포유류 모유에서 유래한 지방 및 오일은 대사가 가능하며, 따라서, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물성 공급원에서 유래한 순수 오일로부터 획득하기 위하여 필수적인 분리, 정제, 비누화 공정 및 다른 수단은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류는 쉽게 회수할 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들면, 간유, 상어간유, 및 고래유, 예컨대, 경랍(spermaceti)은 본원에서 사용되는 일부 생선 오일의 예시이다. 다수의 가지 사슬 오일은 5-탄소 이소프렌 유닛에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드라고 한다. 상어간유는 가지형, 불포화 테르페노이드인 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔을 포함하며, 이는 특히 본원에서 선호된다. 스쿠알란, 스쿠알렌의 포화 유사체는 바람직한 오일이다. 어류 오일은, 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하여, 쉽게 구득할 수 있으며, 업계 공지의 방법에 의하여 획득할 수 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다(이하 참조). 혼합유도 사용 가능하다.
계면활성제는 이들의 'HLB' (친수/지수 수지)에 의하여 분류될 수 있다. 본 발명에 바람직한 계면활성제는 HLB가 최소한 10, 바람직하게는 최소한 15, 및 더 바람직하게는 최소한 16이다. 본 발명은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (상품명 Tweens), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 산화 에틸렌 (EO), 산화 프로필렌 (PO), 및/또는 산화 부틸렌 (BO)의 공중합체(DOWFAX™), 예컨대, 선형 EO/PO 블럭 공중합체; 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)기의 반복 수가 다양한 옥트옥시놀과 특정 대상 옥트옥시놀-9 (트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스포리피드, 예컨대, 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡시레이트, 예컨대, Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제), 예컨대, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르 (SPANs), 예컨대, 소르비탄 트리올레이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85 (소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 트리톤 X-100.
계면활성제의 혼합물, 예컨대, Tween 80/Span 85 혼합물을 사용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 80) 및 옥트옥시놀 예컨대, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)의 조합이 적합하다. 다른 유용한 조합은 laureth 9와 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥트옥시놀을 포함한다.
바람직한 계면활성제의 양(중량부%)은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대, Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대, 트리톤 X-100, 또는 트리톤 시리즈의 다른 세정제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대, laureth 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5%이다.
본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
● 서브마이크론 에멀젼의 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85.
부피부 에멀젼 조성물은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85가 될 수 있다. 중량부로서는, 이러한 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85. 이 보조제는 'MF59'로 알려져 있다 [125-127], 이는 참고자료 128의 10장 및 참고자료 129의 12장에 상세하게 설명되어 있다. MF59 에멀젼은 시트르산염 이온 예컨대, 1O mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 것이 유익하다.
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Tween 80의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충 염류를 포함할 수 있다. 이는 Span 85 (예컨대, 1%) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이러한 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80이고, 스쿠알렌 토코페롤의 중량비는 바람직하게는 <1 이며, 이로써 더욱 안정적인 에멀젼을 제공하게 된다. 스쿠알렌 및 Tween 80은 약 5:2의 부피비로 제공된다. 이러한 에멀젼은 Tween 80 을 PBS에 용해시켜 2% 용액으로 제조하고, 그 다음 90 ㎖의 이 용액을 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5㎖ 스쿠알렌) 혼합물과 혼합한 뒤, 이 혼합물을 극소액체화시킨다. 결과 에멀젼은 서브마이크론 오일 액적을 보유할 수 있으며, 예컨대, 평균 직경이 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm이다.
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세정제(예컨대, 트리톤 X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.
● 폴리소르베이트 (예컨대, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세정제(예컨대, 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예컨대, α-토코페롤 석시네이트염)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이러한 3 성분은 질량비가 약 75:11:10 (예컨대, 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 110㎍/㎖ 트리톤 X-100 및 100㎍/㎖ α-토코페롤 석시네이트염)로 포함될 수 있으며, 이러한 농도는 항원에서 유래한 이러한 성분의 모든 비율을 포함하여야 한다. 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수성상은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.
● 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401의 에멀젼("Pluronic™ L121"). 에멀젼은 pH 7.4의 포스페이트 완충 염류로 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 뮤라밀 디펩타이드의 유용한 전달 매체이며, "SAF-I" 보조제 내에서 트레오닐-MDP와 함께 사용될 수 있다 [130] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 "AF" 보조제 내에서 Thr-MDP없이 사용될 수도 있다 [131] (5% 스쿠알란, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 극소액체화가 바람직하다.
● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 포스포리피드, 및 0.05-5%의 비-이온성 계면활성제를 함유하는 에멀젼. 참고자료 132에서 설명한 바와 같이, 바람직한 포스포리피드 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 스핀고마이에린 및 카디오리핀이다. 서브마이크론 크기의 액적이 바람직하다.
● 대사가 불가능한 오일의 서브마이크론 수중유 에멀젼(예컨대, 라이트 미네랄 오일) 및 최소한 하나의 계면활성제(예컨대, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80). 첨가제, 예컨대, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친지성 컨쥬게이트 (예컨대, GPI-0100, 참고자료 133, 글루쿠론산의 카르복실기를 통하여 아디파틱 아민을 데사실사포닌에 첨가함으로써 제조), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-히드록시에틸) 프로판디아민을 포함할 수 있다.
● 사포닌 (예컨대, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예컨대, 콜레스테롤)이 나선형 마이셀로 결합된 에멀젼 [134].
에멀젼은 전달시 즉석에서 항원과 혼합할 수 있다. 따라서 보조제 및 항원은 사용시 최종 제형화를 위하여 포장 또는 분리된 백신 내에서 각각 보관할 수 있다. 항원은 일반적으로 수성형태로서, 백신은 두 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조된다. 혼합을 위한 두 액체의 부피비는 다양하나(예컨대, 5:1 내지 1:5), 일반적으로 약 1:1이다.
항원과 보조제가 혼합된 후, 혈구응집소 항원은 일반적으로 수성 용액에 잔존하나 오일/물 경계면 부근에서 스스로 분리된다. 일반적으로, 혈구응집소는 에멀젼의 오일상에 거의 침투할 수 없다.
조성물이 토코페롤을 포함하는 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중의 하나가 사용될 수 있으나, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 수종의 형태, 예컨대, 서로 다른 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기염, 예컨대, 석시네이트염, 아세트산염, 니코틴산염, 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤을 모두 사용할 수 있다. 토코페롤은 고령의 환자(예컨대, 60세 또는 그 이상의 연령)에 사용하기 위한 백신에 포함되는 것이 유리하며, 이는 환자군 내에서 면역 반응에 긍정적인 효과를 미친다고 알려져 있기 때문이다[135]. 이들은 에멀젼을 안정화하는데 도움이 되는 항산화 특성을 보유한다[136]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이며, 이 토코페롤의 바람직한 염은 석시네이트염이다. 석시네이트염은 생체 내에서 TNF-관련 리간드와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, α-토코페롤 석시네이트염은 인플루엔자 백신에 적합성이 있다고 알려져 있으며, 수은 화합물의 대용물로서 유용한 보존제가 된다 [9].
사이토카인- 유도제
본 발명의 조성물에 포함되는 사이토카인-유도제는 환자에 투여시 인터페론 및 인터류킨을 포함하는 사이토카인을 방출하는 면역 시스템을 유발할 수 있다. 사이토카인 반응은 인플루엔자 감염에 대한 숙주 방어의 초기의 결정적 단계에 관여하는 것으로 알려져 있다 [137]. 바람직한 약제는 하나 또는 그 이상의 다음의 것을 방출하도록 유발할 수 있다: 인터페론-γ; 인터류킨-1; 인터류킨-2; 인터류킨-12; TNF-α; TNF-β; 및 GM-CSF. 바람직한 약제는 Th1-타입 면역 반응 예컨대, 인터페론-γ, TNF-α, 인터류킨-2와 관련된 사이토카인의 방출을 유발시킨다. 인터페론-γ 및 인터류킨-2 둘 모두의 자극이 바람직하다.
본 발명의 조성물을 투여한 결과로서, 따라서, 인플루엔자 항원을 자극하는 경우, 환자가 항원-특이적 방법으로 원하는 사이토카인(들)을 방출하는 T 세포를 보유할 수 있게 한다. 예를 들면, 시험관 내에서 인플루엔자 바이러스 혈구응집소에 노출되는 경우, 혈액으로부터 정제된 T 세포는 γ-인터페론을 방출하게 된다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 내에서 이러한 반응을 측정하기 위한 방법이 기술 분야에 공지되어 있으며, ELISA, ELISPOT, 흐름-세포측정 및 실시간 PCR을 포함한다. 예를 들면, 참고자료 138은 파상풍 톡소이드에 대한 항원-특이적 T 세포-매개 면역 반응, 특히 γ-인터페론 반응을 관찰하였으며, 자발적 반응으로부터 항원-특이적 TT-유도 반응을 구별해내는 가장 민감한 방법이라는 것을 밝혀내었으나, 흐름 세포측정에 의한 세포질내 사이토카인 검출이 재자극 효과를 검출하기 위한 가장 효율적인 방법이라는 사실도 연구하였다.
적합한 사이토카인-유도제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:
● 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, CpG 모티프(구아노신에 결합된 포스페이트에 링크된 비메틸화된 사이토신을 함유하는 디뉴클레오타이드 서열)를 함유하는 것, 또는 이중-나선 RNA, 또는 회문형 서열을 함유한 올리고뉴클레오타이드, 또는 폴리(dG) 서열을 함유한 올리고뉴클레오타이드.
● 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A ('3dMPL' 또는 'MPL™') [139-142].
● 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대, 이미퀴모드("R-837") [143,144], 레시퀴모드("R-848") [145], 및 이들의 유사체; 및 이들의 염(예컨대, 염화수소산염). 면역자극 이미다조퀴놀린에 대한 상세는 참고자료 146 내지 150에서 찾을 수 있다.
● 티오세미카바존 화합물, 예컨대, 참고자료 151에 개시된 것. 활성 화합물의 제형화, 생산 및 선별 방법은 참고자료 151에 설명되어 있다. 티오세미카바존은 사이토카인, 예컨대, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.
● 트립탄트린 화합물, 예컨대, 참고자료 152에 개시된 것. 활성 화합물의 제형화, 생산 및 선별 방법은 참고자료 152에 설명되어 있다. 티오세미카바존은 사이토카인, 예컨대, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.
● 뉴클리오사이드 유사체, 예컨대: (a) 이사토라빈 (ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신):
Figure 112008060235918-PCT00002
및 이들의 전구약물; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참고자료 153 내지 155에 개시된 화합물; (f) 다음의 화학식을 가진 화합물:
Figure 112008060235918-PCT00003
여기서: R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 할로겐, -NRaRb, -OH, C1 -6 알콕시, 치환 C1 -6 알콕시, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴, C6 -1O 아릴, 치환 C6 -10 아릴, C1 -6 알킬, 또는 치환 C1 -6 알킬이고;
R3 은 부재, H, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, C6 -10 아릴, 치환 C6 -10 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 치환 헤테로사이클릴이고;
R4 및 R5 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴, -C(O)-Rd, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, 또는 R4 -5 내에서 함께 결합한 5 원소 고리이다:
Figure 112008060235918-PCT00004
결합은 ~~로 나타낸 결합으로 달성,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 N, C, O, 또는 S이다;
R8 은 H, 할로겐, -OH, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, -OH, -NRaRb, -(CH2)n-O-Rc, -0-(C1 -6 알킬), -S(O)pRe, 또는 -C(O)-Rd 이며;
R9 는 H, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴 또는 R9a이고, 여기서, R9a 는:
Figure 112008060235918-PCT00005
결합은 ~~로 나타낸 결합으로 달성,
R10 및 R11은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1 -6 알콕시, 치환 C1 -6 알콕시, - NRaRb, 또는 -OH 이고;
각 Ra 및 Rb 는 독립적으로 H, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, -C(O)Rd, C6 -10 아릴이고;
각 Rc 는 독립적으로 H, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, C1 -6 알킬, 또는 치환 C1 -6 알킬이며;
각 Rd 는 독립적으로 H, 할로, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, 치환 C1-6 알콕시, -NH2, -NH(C1 -6 알킬), -NH(치환 C1 -6 알킬), -N(C1 -6 알킬)2, -N(치환 C1 -6 알킬)2, C6 -10 아릴, 또는 헤테로사이클릴이고;
각 Re 는 독립적으로 H, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, C6 -10 아릴, 치환C6 -10 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 치환 헤테로사이클릴이고;
각 Rf 는 독립적으로 H, C1 -6 알킬, 치환 C1 -6 알킬, -C(O)Rd, 포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트이고;
각 n 은 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3;
각 p 는 독립적으로 0, 1, 또는 2; 또는
또는 (g) (a) 내지 (f) 중의 하나의 약학적으로 허용가능한 염, (a) 내지 (f) 중의 하나의 토토머, 또는 이 토토머의 약학적으로 허용가능한 염이다.
● 록소리빈 (7-알릴-8-옥소구아노신) [156].
● 참고자료 157에서 개시된 화합물, 다음을 포함한다: 아실피페라진 화합물, 인돌디온 화합물, 테트라히드라이소퀴놀린 (THIQ) 화합물, 벤조시클로디온 화합물, 아미노아자비닐 화합물, 아미노벤즈이미다졸 퀴놀리논 (ABIQ) 화합물 [158,159], 히드라프탈라미드 화합물, 벤조페논 화합물, 이소옥사졸 화합물, 스테롤 화합물, 퀴나질리온 화합물, 파이롤 화합물 [160], 안트라퀴논 화합물, 퀴녹살린 화합물, 트리아진 화합물, 피라잘로피리미딘 화합물, 및 벤자졸 화합물 [161].
● 참고자료 162에서 개시된 화합물.
● 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예컨대, RC-529 [163,164].
● 포스파진, 예를 들면, 참고자료 165 및 166에 개시된 바와 같은 폴리[디(카복시락토페녹시)포스파진] ("PCPP").
● 소분자 면역강화제 (SMIPs) 예컨대:
N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-에틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-펜틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로프-2-에닐-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
1-(2-메틸프로필)-2-[(페닐메틸)티오]-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민
1-(2-메틸프로필)-2-(프로필티오)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민
2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에탄올
2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에틸 아세트산염
4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1,3-디하이드로-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온
N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5- c]퀴놀린-2,4-디아민
N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민
1-{4-아미노-2-[메틸(프로필)아미노]-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일}-2-메틸프로판-2-올
1-[4-아미노-2-(프로필아미노)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올
N4,N4-디벤질-1-(2-메톡시-2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민.
본 발명에서 사용되는 사이토카인-유도제는 Toll-유사 수용체(TLR)의 조절제 및/또는 작용제일 수 있다. 예를 들면, 이들은 하나 또는 그 이상의 인간 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및/또는 TLR9 단백질의 작용제가 될 수 있다. 바람직한 약제는 TLR7 (예컨대, 이미다조퀴놀린) 및/또는 TLR9 (예컨대, CpG 올리고뉴클레오타이드)의 작용제이다. 이러한 약제는 선천성 면역 경로를 활성화시키는데 유용하다.
사이토카인-유도제는 제조시 여러 단계에서 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 이는 항원 조성물 내에 존재할 수 있으며, 이 혼합물이 그 다음 수중유 에멀젼에 첨가될 수도 있다. 다른 실시상태에서, 이는 수중유 에멀젼상에 존재할 수 있으며, 이 경우 약제는 에멀젼화되기 전에 에멀젼 성분에 첨가될 수도 있거나, 또는 에멀젼화된 후에 에멀젼에 첨가될 수 있다. 이와 유사하게, 약제는 에멀젼 액적 내부에 코아세르베이트화될 수 있다. 최종 조성물 내의 사이토카인-유도제의 위치 및 분포는 이들의 친수성/친지성 특성에 의존하며, 예컨대, 약제는 수성상, 오일상, 및/또는 오일-물 경계면 강에 위치할 수 있다.
사이토카인-유도제는 별도 약제예컨대, 항원 (예컨대, CRM197)에 컨쥬게이트될 수 있다. 소분자의 컨쥬게이션 기법의 일반적인 연구결과는 참고자료 167에 제공되어 있다. 다른 실시상태에서, 보조제는 예컨대, 소수성 또는 이온 상호작용에 의하여 첨가 약제에 비공유적으로 결합될 수 있다.
두 종의 바람직한 사이토카인-유도제는 (a) 면역자극 올리고뉴클레오타이드와 (b) 3dMPL 이다.
면역자극 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 변형/유사체, 예컨대, 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있으며, 이중-나선 또는 (RNA 제외) 단일-가닥일 수 있다. 참고자료 168, 169 및 170에서는 가능한 유사체 치환 예컨대, 구아노신을 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로 대체하는 것을 개시하고 있다. CpG 올리고뉴클레오타이드 보조제 효과는 참고자료 171-176에 추가로 설명되어 있다. CpG 서열은 TLR9, 예컨대, 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT에 연결될 수 있다[177]. CpG 서열은 Th1 면역 반응, 예컨대, CpG-A ODN (올리고데옥시뉴클레오타이드)을 유도하는데 특이적일 수 있으며, B 세포 반응, 예컨대 CpG-B ODN을 유도하는데 더욱 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고자료 178-180에 설명되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오타이드가 구성되어 수용체 인식을 위하여 5` 말단부에 접근할 수 있게된다. 선택적으로, 두 CpG 올리고뉴클레오타이드 서열은 이들의 3' 말단에 결합하여 "이뮤노머(immunomers)"를 형성하게 된다. 예를 들면, 참고자료 177 및 181-183을 참고한다. 유용한 CpG 보조제는 CpG7909, (ProMune™, Coley Pharmaceutical Group, Inc.) 이다.
다른 실시상태에서, 또는 이에 추가하여, CpG 서열을 사용하기 위하여, TpG 서열이 사용될 수 있다[184]. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 비메틸화 CpG 모티프가 부재할 수 있다.
면역자극 올리고뉴클레오타이드는 피리미딘이 풍부할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 연속적인 티미딘 뉴클레오타이드(예컨대, TTTT, 참고자료 184)를 포함할 수 있으며, 및/또는 >25% 티미딘(예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등)을 보유한 뉴클레오타이드 조성물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 연속적인 사이토신 뉴클레오타이드 (예컨대, CCCC, 참고자료 184)를 포함할 수 있으며, 및/또는 >25% 사이토신(예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등)을 보유한 뉴클레오타이드 조성물을 함유할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 비메틸화 CpG 모티프가 부재할 수 있다.
면역자극 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 최소한 20 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 100 이하의 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다.
3dMPL (3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A, 또는 3-O-데사실-4'-모노포스포릴 지질 A)은 모노포스포릴 지질 A 내의 환원 말단 글루코사민의 위치 3이 데-아실화된 보조제이다. 3dMPL은 살모넬라 미네소타(Salmonella Minnesota)의 무헵토스 돌연변이로부터 제조되며, 지질 A와 화학적으로 유사하나, 산-불안정성 포스포릴기 및 염기-불안정성 아실기가 부재한다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 세포를 활성화시키고, IL-1, IL- 12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하는 수종의 사이토카인의 방출을 자극한다 (참고자료 185). 3dMPL의 제조는 참고자료 186에 설명되어 있다.
3dMPL은 이들의 아실화(예컨대, 3, 4, 5 또는 6 아실 사슬, 사로 다른 길이)에 의하여 다양해지는 관련 분자의 혼합물로서의 형태를 취할 수 있다. 두 글루코사민(2-데옥시-2-아미노-글루코스) 단당류는 이들의 2-위치 탄소 (즉, 위치 2 및 2')에서 N-아실화되며, 또한 3' 위치에서도 O-아실화될 수 있다. 탄소 2에 부착된 작용기는 화학식 -NH-CO-CH2-CR1R1'이다. 탄소 2'에 부착된 작용기는 화학식 -NH-CO-CH2-CR2R2'이다. 탄소 3'에 부착된 작용기는 화학식 -0-CO-CH2-CR3R3'이다. 대표적인 구조는:
Figure 112008060235918-PCT00006
작용기 R1, R2 및 R3 는 각각 독립적으로 -(CH2)n-CH3 이다. n 값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 9 내지 12이며, 가장 바람직하게는 10이다.
작용기 R1', R2' 및 R3'는 각각 독립적으로: (a) -H; (b) -OH; 또는 (c) -O-CO-R4로서, 여기서 R4 는 -H 또는 -(CH2)m-CH3이고 여기서 m 값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 10, 12 또는 14이다. 2 위치에서, m은 바람직하게는 14이다. 2' 위치에서, m은 바람직하게는 10이다. 3' 위치에서, m은 바람직하게는 12이다. 작용기 R1', R2' 및 R3' 은 따라서 바람직하게는 도데칸산, 테트라데칸산 또는 헥사데칸산의 -O-아실기이다.
모든 R1', R2' 및 R3'가 -H인 경우, 3dMPL은 오직 3 아실 사슬(각각 위치 2, 2' 및 3'상의 하나)만을 보유한다. R1', R2' 및 R3' 중 둘만 -H인 경우, 3dMPL은 4 아실 사슬을 보유할 수 있다. R1', R2' 및 R3' 중의 하나만 -H인 경우, 3dMPL은 5 아실 사슬을 보유할 수 있다. R1', R2' 및 R3' 중의 어느 하나도 -H 가 아닌 경우 3dMPL은 6 아실 사슬을 보유할 수 있다. 본 발명에 따르는 3dMPL 보조제는 3 내지 6 아실 사슬을 지닌 이러한 형태의 혼합물이 될 수 있으며, 혼합물 내에 6 아실 사슬을 보유한 3dMPL를 포함하는 것이 바람직하며, 헥사아실 사슬 형태가 총 3dMPL의 중량부로 최소한 10%, 예컨대, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% 또는 그 이상을 차지하도록 확보하는 것이 특히 바람직하다. 6 아실 사슬을 보유한 3dMPL 대부분의 보조제-활성 형태에서 나타난다.
따라서, 본 발명의 조성물 내에 포함되는 가장 바람직한 형태의 3dMPL는 하기하는 화학식 (IV)이다.
3dMPL이 혼합물의 형태로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물 내의 3dMPL 양 또는 농도에 대한 참고자료는 혼합물 내에 결합된 3dMPL 종류를 말한다.
수성 상태에서, 3dMPL은 마이셀 응집체 또는 서로 다른 크기의 입자, 예컨대, 입경이 <150nm 또는 >500nm인 입자를 형성할 수 있다. 이들 각각 또는 모두를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 더 나은 입자를 기존의 측정법에 의하여 선택할 수 있다. 더 작은 입자 (예컨대, 3dMPL 수성 현탁액에 투명성을 부여할 정도로 작은)가 본 발명에 바람직하며, 이는 이들의 월등한 활성 때문이다[187]. 바람직한 입자는 평균 입경이 220nm 이하, 더 바람직하게는 200nm 이하 또는 150nm 이하 또는 120nm 이하이며, 100nm 이하의 평균 입경을 보유할 수 있다. 대부분의 경우, 그러나, 평균 입경이 50nm보다 작지 않다. 이러한 입자는 여과 멸균에 적합할 정도로 작다. 입경은 평균 입경을 측정하는 동적 광 분산의 통상 기법으로 측정할 수 있다. 입자의 입경이 x nm라고하는 경우, 일반적으로 이 평균 부근에 입자의 분포가 있다는 것이고, 입자 수의 최소한 50% (예컨대, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, 또는 그 이상)가 x±25%의 입경 범위에 존재하게 된다.
3dMPL은 수중유 에멀젼과 조합하여 사용되는 것이 유익하다. 실질적으로 모든 3dMPL이 에멀젼의 수성상 내에 존재할 수 있다.
3dMPL은 그 자체로 사용되거나, 또는 하나 또는 그 이상의 추가의 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 3dMPL은 QS21 사포닌 [188] (수중유 에멀젼 내에 포함 [189]), 면역자극 올리고뉴클레오타이드, QS21와 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 인산 알루미늄 [190], 수산화 알루미늄 [191], 또는 인산 알루미늄와 수산화 알루미늄과 조합하여 사용된다고 알려져 있다.
Figure 112008060235918-PCT00007
지방 보조제
본 발명에 사용될 수 있는 지방 보조제는 상기 수중유 에멀젼을 포함할 수 있으며, 예를 들면 다음을 포함할 수 있다:
● 화학식 I, II 또는 III의 화합물, 또는 이들의 염:
Figure 112008060235918-PCT00008
참고자료 192에서 정의한 바와 같이, 예컨대, 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', 'ER 803022' 또는 'ER 804057' 예컨대:
Figure 112008060235918-PCT00009
● 에셔리시아 콜리(Escherichia coli)에서 유래한 지질 A의 유도체, 예컨대, OM-174 (참고자료 193 및 194).
● 양이온 지질 및(일반적으로 중성) 보조-지질의 제형, 예컨대, 아미노프로필-디메틸-미리스트올레일옥시-프로판아미니움 브로마이드-디피타노일포스파티딜-에탄올아민 ("Vaxfectin™") 또는 아미노프로필-디메틸-비스-도데실옥시-프로판아미니움 브로마이드-디올레오일포스파티딜-에탄올아민 ("GAP-DLRIE:DOPE"). (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(신-9-테트라데세닐옥시)-1-프로판아미니움 염을 함유한 제형이 바람직하다 [195].
● 3-0-데아실화 모노포스포릴 지질 A (전술).
● 포스페이트-함유 비환형 골격에 링크된 지질을 함유한 화합물, 예컨대, TLR4 길항제 E5564 [196,197]:
Figure 112008060235918-PCT00010
알루미늄 염 보조제
수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄으로 알려진 보조제가 사용된다. 이러한 명칭은 통상적인 것이나 제공된 실제 화학적 화합물의 정확한 상세가 아님에도 편의를 위하여 사용한다(예컨대, 참고자료 128의 9장). 본 발명은 일반적으로 보조제로서 사용되는 모든 "수산화" 또는 "인산" 보조제를 사용할 수 있다.
"수산화 알루미늄"으로 알려진 보조제는 일반적으로 알루미늄 옥시히드록사이드 염으로서, 일반적으로 최소한 부분적으로 결정체이다. 화학식 AlO(OH)로 나타내는 알루미늄 옥시히드록사이드는 적외선(IR) 분광법, 특히 1070cm-1의 흡수밴드 및 3090-3100cm-1에서의 스트롱 숄더(strong shoulder)의 존재에 의하여 다른 알루미늄 화합물, 예컨대, 수산화 알루미늄 Al(OH)3, 등과 구별될 수 있다[참고자료 128의 9장]. 수산화 알루미늄 보조제의 결정도는 절반 높이에서의 회절폭(WHH)에 의하여 나타나며, 불충분한-결정 입자는 더 넓은 폭을 나타내며, 이는 작은 결정크기에서 기인한다. 표면적은 WHH가 증가함에 따라 증가하며, 높은 WHH 값의 보조제는 큰 항원 흡수능을 가지게된다는 것이 알려졌다. 섬유 형태(예컨대, 전자 투과 현미경으로 관찰)가 수산화 알루미늄 보조제에 일반적이다. 수산화 알루미늄 보조제의 pI는 일반적으로 약 11 즉, 보조제 자체는 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 띤다. 수산화 알루미늄 보조제는 1.8-2.6 mg 단백질/ mg Al+++ (pH 7.4)의 흡수능을 보인다.
"인산 알루미늄"으로 알려진 보조제 일반적으로 수산화인산 알루미늄 염이며, 때로는 소량의 황산염(즉 수산화인산 알루미늄 황산염)을 함유한다. 이들은 침전에 의하여 획득할 수 있으며, 침전시의 반응 조건 및 농도는 염 내의 인산염과 히드록실기의 치환도에 영향을 미친다. 수산화인산은 일반적으로 PO4/Al 몰비가 0.3 내지 1.2이다. 수산화인산은 히드록실기의 존재에 의하여 AlPO4와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164cm-1에서의 IR 스펙트럼 밴드(예컨대, 200℃로 가열시)는 구조적 히드록실기의 존재를 나타낸다[참고자료 128의 9장].
인산 알루미늄 보조제 PO4/A13+ 몰비는 일반적으로 0.3 내지 1.2이며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게는 0.95±0.1이다. 인산 알루미늄은 일반적으로 무정형이며, 특히 수산화인산염에서 그러하다. 일반적인 보조제는 무정형 수산화인산 알루미늄으로서 PO4/Al 몰비가 0.84 내지 0.92이며, 0.6 ㎎의 Al3 +/㎖를 포함한다. 인산 알루미늄은 일반적으로 입자화된다(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰시 판-유사 형태). 일반적인 입자의 직경은 어떠한 항원 흡착 후 0.5 내지 20㎛ (예컨대, 약 5 내지 10㎛)이다. 인산 알루미늄 보조제는 pH 7.4에서 0.7 내지 1.5 ㎎ 단백질/㎎ Al+++의 흡착능을 나타낸다고 보고되었다.
인산 알루미늄의 0 전하점(PZC)은 인산염과 히드록실기의 치환도에 강하게 연관되어 있으며, 이 치환도는 침전에 의한 염 제조시 사용되는 반응물의 반응 조건 및 농도에 의존하여 달라질 수 있다. PZC는 용액 내의 유리 인산 이온의 농도 변화시키거나(인산 증가 = 산성 PZC 증가) 또는 완충제 예컨대 히스티딘 완충제를 첨가(PZC를 더욱 염기성화)함으로서 변화된다. 본 발명에 사용된 인산 알루미늄은 일반적으로 PZC가 4.0 내지 7.0, 더 바람직하게는 5.0 내지 6.5 예컨대, 약 5.7이다.
본 발명 조성물의 제조에 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 완충제(예컨대, 인산 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 포함하나, 항상 요구되는 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 무균 및 무발열원이다. 현탁액은 유리 수성 인산 이온을 포함할 수 있으며 예컨대, 1.0 내지 2O mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM, 및 더 바람직하게는 약 10 mM로 존재한다. 현탁액은 염화 나트륨을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 상태에서, 보조제 성분은 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄의 혼합물을 포함한다[89]. 이 경우 인산 알루미늄이 수산화기보다 더 함유되며, 예컨대, 중량비로 최소한 2:1 예컨대, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 그 이상이다.
환자 투여용 조성물 내의 Al+++의 농도는 바람직하게는 10㎎/㎖ 이하, 예컨대, 5 ㎎/㎖ 이하, 4 ㎎/㎖ 이하, 3 ㎎/㎖ 이하, 2 ㎎/㎖ 이하, 1 ㎎/㎖, 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 ㎎/㎖이다. 최대 0.85㎎/투여 이하가 바람직하다.
하나 이상의 알루미늄 염 보조제를 포함할 뿐만 아니라, 보조제 성분은 하나 이상의 추가의 보조제 또는 면역자극제를 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A 보조제('3d-MPL'); 및/또는 수중유 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 3d-MPL은 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-데아실-4'-모노포스포릴 지질 A를 의미한다. 이 이름은 모노포스포릴 지질 A 내의 환원 말단 글루코사민의 3 위치가 데-아실화되었다는 것을 의미한다. 3dMPL는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)의 무헵토스(heptoseless) 돌연변이로부터 제조되었으며, 지질 A와 화학적으로 유사하나, 산-불안정성 포스포릴기 및 염기-불안정성 아실기가 결핍되어 있다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 세포를 활성화하고, IL-1, IL-12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하는 수종의 사이토카인의 방출을 자극한다. 3d-MPL의 제조는 참고자료 186에 설명되어 있으며, 그 산물은 Corixa Corporation사의 상표 MPL™로 제조 판매된다. 더 자세한 사항은 참고자료 139 내지 142에서 찾을 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능하다. 이들은 일반적으로 항원을 첨가한 성분을 포함하며, 예컨대, 이들은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 이러한 성분에 대한 철저한 논의는 참고자료 198에서 찾을 수 있다.
조성물은 일반적으로 수성형태이다.
조성물은 하나 이상의 보존제, 예컨대 티오메살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 바람직한 것은, 그러나, 백신에 실질적으로 수은성 물질이 부재(즉 5㎍/㎖ 이하), 예컨대 무-티오메살이어야 한다[9, 199]. 수은을 함유하지 않은 백신이 더 바람직하다. 무-보존제 백신이 특히 바람직하다.
등장성을 조절하기 위하여 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다, 예컨대 등장성을 조절하기 위한 나트륨염이다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 ㎎/㎖ 사이에 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 기타 염은 염화 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 디나트륨 인산염 디하이드레이트, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 등을 포함한다.
조성물은 일반적으로 삼투압이 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg이며, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있다. 삼투압은 예방접종에 의하여 야기된 통증에 대한 영향이 사전에 보고된바 없다[200], 그럼에도 이 범위의 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일반적인 완충제는: 인산염 완충제; 트리스 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제(특히 수산화 알루미늄 보조제와 함께); 또는 시트르산 완충제를 포한다. 완충제는 일반적으로 5-2O mM의 범위로 포함된다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 일반적으로 6.0 및 8.0 예컨대 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이다. 본 발명의 방법은 따라서 포장 전에 충전 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함한다.
조성물은 바람직하게는 무균이다. 키트 성분은 바람직하게는 비-발열원성으로서, 예컨대 1 EU(내부독소 유닛, 표준 측정) 이하/복용량, 바람직하게는 0.1 EU 이하/복용량을 함유한다. 조성물은 바람직하게는 무 글루텐이다.
본 발명의 조성물은 세정제 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'), 옥트옥시놀 (예컨대, 옥트옥시놀-9 (트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 나트륨 디옥시콜레이트을 포함할 수 있으며, 특히 분할 또는 표면 항원 백신용이다. 세정제는 단지 소량으로만 존재한다. 따라서 백신은 1 mg/㎖의 각각 옥트옥시놀-10 및 폴리소르베이트 80 이하를 포함한다. 다른 소량의 잔여 성분은 항생제가 될 수 있다(예컨대, 네오마니신, 카나마이신, 폴리마이신 B).
조성물은 단일 예방접종용 물질을 포함할 수도 있으며, 다중 예방접종용 물질을 포함할 수도 있다(즉 '다중복용' 키트). 보존제의 함유는 다중복용 준비에 유용하다. 다중복용 조성물 내의 보존제 함유의 대안(또는 이와 함께)으로서, 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터를 보유한 용기에 함유될 수 있다.
백신은 일반적으로 약 0.5 ml의 복용부피로 투여되며, 그 절반 투여량(즉 약 0.25 ml)가 어린이에게 투여될 수 있다.
조성물 및 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃로 저장된다. 이들이 동결되어서는 아니된다. 이들은 직사광선을 피하여 보관되는 것이 이상적이다.
본 발명의 키트
본 발명의 조성물은 특히 보조제가 사용되는 경우, 전달시 즉석에서 제조될 수 있다. 따라서 본 발명은 혼합하기 쉬운 다양한 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 사용시까지 보조제와 항원을 별개로 유지되도록 한다. 이러한 배열은 수중유 에멀젼 보조제를 사용하는 경우 특히 유용하다.
두 성분은 따라서 키트 내에서 서로 물리적으로 분리되며, 이 분리는 다양한 방법에 의하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 두 성분은 바이알 등의 두 개의 분리된 용기 내에 존재할 수 있다. 두 바이알의 성분은 예컨대 하나의 바이알 성분을 제거하여 바이알에 첨가하여 혼합될 수 있거나, 또는 양 바이알의 성분을 별도로 분리하여 이들을 제3의 용기에서 혼합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시상태에서, 키트 성분 중의 하나는 주사기 내에, 다른 성분은 용기 예컨대 바이알에 존재할 수 있다. 사전-충전 주사기가 사용되어(예컨대,바늘 포함) 혼합을 위하여 제2의 용기로 성분을 주입하게 되며, 그 뒤 혼합물은 주사기로 회수될 수도 있다. 주사기의 혼합 성분은 이후 환자에 투여될 수 있으며, 일반적으로 멸균 바늘을 사용한다. 사전-충전 주사기에 일 성분을 포장함으로써 환자 투여용 별도의 주사기가 필요하지 않게 된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 두 키트 성분은 동일 주사기 내에서 별도로 보유될 수 있다. 예컨대, 이중-격실 주사기이며, 예컨대 이들은 참고자료 201-208 등에 상세하게 설명되어 있다. 주사기를 작동시키는 경우(예컨대, 환자 투여시) 두 격실의 성분이 혼합된다. 이러한 배열은 사용시 별도의 혼합 단계를 회피하게 된다.
키트 성분은 일반적으로 수성 형태이다. 본 발명의 일 배치에서, 일 성분(일반적으로 보조제 성분보다는 항원 성분)은 건조 형태(예컨대, 동결건조형)이며, 다른 성분은 수성 형태이다. 두 성분은 건조 성분을 활성화시키기 위하여 혼합될 수 있으며, 환자 투여를 위하여 수성 조성물이 주어질 수 있다. 동결건조 성분은 일반적으로 주사기보다는 바이알 내에 위치된다. 건조 성분은 안정화제 예컨대 락토오스, 슈크로스 또는 만니톨, 및 이들의 혼합물 예컨대, 락토오스/슈크로스 혼합물, 슈크로스/만니톨 혼합물, 등을 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시 상태에서는 사전-충전 주사기 내의 수성 보조제 성분 및 바이알 내의 동결건조 항원 성분을 사용한다.
조성물 또는 키트 성분의 패키징
본 발명의 조성물 (또는 키트 성분)에 적합한 용기는 바이알, 주사기(예컨대, 1회용 주사기), 비강 스프레이, 등을 포함한다. 이러한 용기는 멸균되어 있어야 한다.
조성물/성분이 바이알 내에 존재하는 경우, 바이알은 유리 또는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물이 첨가되기 전에 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 회피하기 위하여, 바이알은 무-라텍스 마개(stopper)로 밀봉되는 것이 바람직하며, 모든 포장 물질 내에 라텍스가 부재하는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 투여용 백신을 포함할 수 있으며, 또는 일 투여량 이상('다중투여' 바이알) 예컨대, 10회 투여량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다.
바이알은 캡(cap)(예컨대, Luer lock)을 구비하여 사전-충전 주사기가 캡에 삽입되어 주사기의 함유물이 바이알로부터 배제될 수 있으며(예컨대, 내부의 동결건조 물질의 재배치), 바이알의 함유물이 주사기에서 제거될 수 있다. 바이알로부터 주사기 제거 후, 바늘이 부착되고, 조성물이 환자에 투여될 수 있다. 캡은 밀봉부 또는 덮개 내부에 위치하여, 밀봉부 또는 덮개가 캡이 접촉하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 이들의 함유물의 항균 제거를 허용하는 캡, 특히 다중투여 바이알용 캡을 구비할 수 있다.
성분이 주사기 내로 포장되는 경우, 주사기는 이에 부착된 바늘을 구비할 수 있다. 바늘이 부착된 경우, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위하여 주사기와 함께 제공될 수 있다. 이러한 바늘은 내장될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 일반적이다. 주사기는 기록 유지를 위하여 함유물의 생산 번호 및 사용 기간이 인쇄된, 접착식(peel-off) 라벨이 제공될 수 있다. 주사기의 플런저(plunger)는 호흡중 플런저가 사고로 제거되는 것을 예방하기 위하여 정지기가 구비된 것이 바람직하다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 구비할 수 있다. 1회용 주사기는 단일 투여용 백신을 함유할 수 있다. 주사기는 바늘이 부착 전에 팁을 밀봉하기 위하여 팁 캡(tip cap)을 구비하는 것이 일반적이며, 팁 캡은 부틸 고무로 제조되는 것이 바람직하다. 주사기 및 바늘이 별도로 포장되는 경우, 이 후 바늘을 부틸 고무 차단재로 막는 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 상표 "Tip-Lok"™로 판매되는 것이다.
용기는 절반투여 부피를 표시할 수 있다. 예컨대, 어린이에 대한 투여를 용이하게하기 위함이다. 예를 들면, 0.5㎖를 함유한 주사기는 0.25㎖ 부피를 나타내는 표시를 한다.
유리 용기 (예컨대, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 라임 유리보다는 규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
키트 또는 조성물은 백신의 상세 예컨대, 투여 설명서, 백신 내의 항원의 상세, 등을 포함하는 인쇄물을 포함(예컨대, 동일 포장 내에)할 수 있다. 설명서에는 경고문 예컨대, 예방접종 후의 과민성 반응의 경우 아드레날린 용액을 사용하라는 등의 경고문을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 상태에서, 인쇄물에는 백신이 기질 단백질을 포함한다는 사실을 언급한다.
백신의 치료 및 투여 방법
본 발명의 조성물은 인간 투여에 적합하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자 내에서 면역 반응을 유발시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 키트 또는 치료제로 사용되는 본 발명의 조성물을 제공한다.
본 발명은 (i) 환자 내에서 면역 반응을 유발시키는 치료제의 제조시, 세포 배양액에서 성장한 바이러스로부터 제조된, 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원 제제의 용도를 제공한다.
이러한 방법 및 용도에 의하여 증진된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함한다. 항체 반응의 사정, 능력의 중화 및 바이러스 예방접종 후 보호 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 인플루엔자 바이러스에 대하여, 예를 들면, 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 적혈구응집소에 대한 항체 티터는 보호와 연관되어 있다는 것을 보여주었다(약 30-40의 혈청 시료 적혈구응집-억제 티터는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호한다)[209]. 항체 반응은 일반적으로 적혈구응집소화 억제, 마이크로중성화, 단일 반경 면역확산(SRID), 및/또는 단일 반경 용혈(SRH)에 의하여 측정된다. 이러한 측정 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 예방접종 경로는 근육내 주입(예컨대 팔 또는 다리)에 의한 것이나, 다른 활용할 수 있는 경로에는 피하조직 주입, 비강내[210-212], 구강[213], 진피내[214,215], 경피성, 경피[216], 등을 포함한다.
본 발명에 따라 제조된 백신은 성인 및 어린이 모두의 치료에 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6 개월령 이상의 소아 및 성인에 사용되도록 제안되고 있다. 따라서, 환자는 1 세 이하, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 최소한 55 세일 수 있다. 환자는 고령(예컨대 50 세 이상, 60 세 이상, 및 바람직하게는 65 세 이상), 유아(예컨대 5 세 이하), 입원 환자, 요양중인 작업자, 군인 및 군사 요원, 임산부, 만성 환자, 면역결핍 환자, 백신 투여 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예컨대 인플루엔자용 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 복용한 환자, 계란 알러지가 있는 사람 및 국외 여행중인 환자일 수 있다. 백신은 이러한 그룹에 단독으로 적합하지는 않다, 그러나, 일반적으로 집단적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주에 있어서는, 모든 연령의 집단의 투여에 바람직하다.
바람직한 본 발명의 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준 1, 2 또는 3을 만족한다. 성인의 경우(18-60세), 이러한 기준은: (1) ≥70% 혈청방어율; (2) ≥40% 혈청전환; 및/또는 (3) GMT의 ≥2.5배 증가이다. 고령자의 경우 (>60세), 이러한 기준은: (1) ≥60% 혈청방어율; (2) ≥30% 혈청전환; 및/또는 (3) GMT의 ≥2배 증가이다. 이러한 기준은 최소한 50 명의 환자를 대상으로 한 라벨 개방 시험에 기초한다.
치료는 단일 투여 계획 또는 다중 투여 계획에 의할 수 있다. 다중 투여는 1차 예방접종 계획 및/또는 추가 예방접종 계획에 사용될 수 있다. 일 복용량 이상의 투여(일반적으로 2 복용량)은 특히 면역학적으로 미경험 환자에 유용하다. 예컨대, 인플루엔자 백신을 전에 투여받은 경험이 없는 사람, 또는 신규의 HA 서브타입에 대한 접종(유행성 발병)에 유용하다. 다중 투여는 일반적으로 최소한 1 주 간격(예컨대 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 10 주, 약 12 주, 약 16 주, 등.)으로 투여될 수 있다.
본 발명에 의하여 생산되는 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 또는 예방접종 센터에 방문시에)에 환자에 투여될 수 있으며, 예컨대, 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 컨쥬게이트된 H.인플루엔자 타입 b 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 컨쥬게이트 백신 (예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 컨쥬게이트 백신, 등과 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 또는 수막구균 백신이 실질적으로 동시에 투여되는 것이 특히 노령의 환자에 유용하다.
이와 유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물과 실질적으로 동시(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 방문시에)에 투여될 수 있다. 특히, 항바이러스 화합물이 인플루엔자 바이러스(예컨대, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)일 수 있다. 이러한 항바이러스는 뉴라미다아제 억제제, 예컨대, (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산 및 이들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 이들의 염(예컨대 인산염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스제는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스테르, 인산염(1:1)이며, 이는 오셀타미비르 인산염(TAMIFLU™)으로 알려져 있다.
측정법
인플루엔자 백신을 특성화하기 위하여, 존재하는 기질 단백질의 양을 결정하는 것이 유용하다. 따라서 본 발명은 인플루엔자 백신을 분석하는 측정법을 제공하며, 여기서 백신 시료는 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석된다. 측정법은 M1 단백질의 절편의 시험에 특히 유용하다.
인플루엔자 백신은 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에서 유래한 항원을 포함할 수 있다. 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스에서 유래한 항원을 포함하는 백신의 측정법을 제공하며, 여기서 백신 시료는 인플루엔자 B 바이러스 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석된다.
인플루엔자 백신은 다양한 HA 서브타입의 항원을 포함할 수 있다. 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스에서 유래한 항원을 포함하는 백신의 측정법을 제공하며, 여기서 백신 시료는 인플루엔자 A 바이러스 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석된다. 또한 여기서 인플루엔자 A 바이러스는 다음에서 선택된 적혈구응집소 서브타입을 보유한다: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16.
인플루엔자 백신은 세포 배양액에서 성장한 항원을 포함한다. 본 발명은 세포 배양액에서 성장한 백신을 분석하는 측정법을 제공하며, 여기서 백신의 시료는 인플루엔자 바이러스 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석된다.
인플루엔자 백신은 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명은 보조제함유 인플루엔자 백신을 분석하는 측정법을 제공하며, 여기서 백신의 시료는 인플루엔자 바이러스 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석된다. 본 발명은 보조제미함유 인플루엔자 백신을 분석하는 측정법을 제공하며, 여기서 보조제미함유 백신의 시료는 인플루엔자 바이러스 기질 단백질의 존재를 측정하도록 분석되며, 여기서 보조제는 이후 백신에 첨가된다.
이러한 측정법은 일반적으로 면역측정법, 예컨대, 웨스턴 블롯 또는 ELISA이다. 면역측정법은 폴리클론 또는 모노클론 항체를 사용할 수 있다. 모노클론 항체이 사용되는 경우, 일 실시 상태에서, 이는 뮤린 항체, 예컨대, 뮤린 IgG1 항체가 아니다. 본원이 개시한 M1 절편 예컨대, 분자량 1OkDa 이하(예컨대, ≤5kDa)의 절편, N 말단 메티오닌이 결핍된 절편, SEQ ID NO:15 N의 말단 서열의 절편, SEQ ID NO:28 및/또는 29, SEQ ID NO:30을 포함하는 절편, 공유-변형 N-말단 잔기의 절편, 등을 인식 하는 항체를 포함하는 M1 절편을 인식하는 항체가 측정에 사용될 수 있다,
측정법은 특히 M1 단백질의 절편의 검출에 유용하며, 이러한 절편은 분자량 1OkDa 이하(예컨대, ≤5kDa), 및/또는 본원에서 개시한 절편(예컨대, 전체 M1 서열의 N 말단 메티오닌의 결핍)이다. 바람직한 측정법은 전장 M1 단백질 및 M1 단백질의 절편의 존재를 구별할 수 있으며, 서로 다른 절편을 구별할 수도 있다.
측정법은 정성적, 준정량적 또는 정량적일 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 방법으로 측정된 백신을 제공한다.
본 발명의 추가적인 특징
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질, 및 (ii) 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 인플루엔자 바이러스 단백질은 세포 배양액에서 성장, 또는 난에서 성장한 바이러스로부터 제조된다. 전술한 바와 같이, 조성물은 추가의 성분 예컨대, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 단백질, 약학적 담체/부형제, 등을 포함할 수도 있다.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 상장한 바이러스로부터 항원 조성물을 제조하는 단계, 여기서, 항원 조성물은 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하고; 및 (iii) 항원 조성물과 보조제를 결합하여 면역원성 조성물을 생성하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서, 혈구응집소는 다음의 서브타입으로부터 선택된다: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii)단계 (i)에서 상장한 바이러스로부터 항원 조성물을 제조하는 단계, 여기서 항원 조성물은 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하며, 혈구응집소는 다음의 서브타입으로부터 선택된다: H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16; 및 (iii) 항원 조성물과 보조제를 결합하여 면역원성 조성물을 생성하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 조성물 내의 혈구응집소의 농도는 29㎍/㎖ 이하(예컨대, ≤28㎍/㎖, ≤27㎍/㎖, ≤26㎍/㎖, ≤25㎍/㎖, ≤24㎍/㎖, ≤23㎍/㎖, ≤22㎍/㎖, ≤21㎍/㎖, ≤20㎍/㎖, ≤19㎍/㎖, ≤18㎍/㎖, ≤17㎍/㎖, ≤16㎍/㎖, ≤15㎍/㎖, ≤14㎍/㎖, ≤13㎍/㎖, ≤12㎍/㎖, ≤11㎍/㎖, ≤10㎍/㎖, ≤9㎍/㎖, ≤8㎍/㎖, ≤7㎍/㎖, ≤6㎍/㎖, ≤5㎍/㎖, ≤4㎍/㎖, ≤3㎍/㎖, ≤2㎍/㎖)이다. 조성물은 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주에서 유래한 혈구응집소를 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 농도는 균주당이다(즉, 균주당 ≤29㎍/㎖).
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 조성물 내의 혈구응집소의 농도는 31㎍/㎖ 이상(예컨대, ≥32㎍/㎖, ≥33㎍/㎖, ≥34㎍/㎖, ≥35㎍/㎖, ≥40㎍/㎖, ≥45㎍/㎖, ≥50㎍/㎖, ≥55㎍/㎖, ≥60㎍/㎖, ≥70㎍/㎖, ≥80㎍/㎖, ≥90㎍/㎖, ≥100㎍/㎖, 그러나, 일반적으로 <200㎍)이다. 조성물은 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주에서 유래한 혈구응집소를 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 농도는 균주당이다(즉, 균주당 ≥31㎍/㎖).
본 발명은 인플루엔자 바이러스 M2 기질 단백질을 포함하나, 정의된 바와 같은 인플루엔자 바이러스 기질 단백질 M1이 실질적으로 부재한 면역원성 조성물을 제공한다. M2-함유 백신은 현재 개발중이다[217]. M2는 M1을 암호화한 바이러스 일부에 의하여 자연적으로 암호화되었다. 재조합 발현 시스템에서, M1 단백질은 따라서 부산물로서 발현될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 부-발현을 회피하거나 또는, 또는 M1 기질 단백질을 M2-함유 조성물로부터 제거할 수 있다. M2 단백질은 전장 단백질이거나 또는, 예를 들면, M2 절편, 예컨대, M2 세포외 도메인('M2e'로 공지). M2 단백질은 다른 항원 예컨대, B형 간염 바이러스 항원과 컨쥬게이션될 수 있다. 백신은 HA 및/또는 NA가 부재할 수 있다.
일반
용어 "포함하는(comprising)"은 "포함(including)" 및 "구성(consisting)"을 포괄하며 예컨대 X를 "포함하는" 조성물 배타적으로 X로 구성되거나 또는 추가적인 무엇인가를 포함할 수 있으며, 예컨대 X + Y 이다.
단어 "실질적으로(substantially)"는 "완전히(completely)"를 배제하지 않는다. 예컨대 Y가 "실질적으로 부재하는" 조성물은 Y가 완전히 부재할 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
용어 "약"은 수치 X에 관하여, 예를 들어, x+10%를 의미한다.
특별한 언급이 없다면, 이 이상의 성분이 혼합되는 단계를 포함하는 방법은 특이적 혼합 순서를 요하는 것이 아니다. 따라서 성분들은 어떠한 순서로 혼합될 수도 있다. 세 성분이 존재하는 경우, 두 성분이 서로 결합될 수 있고, 그 후 제3 성분 등과 결합하여 조합될 수 있다.
동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 감염성 해면상뇌증(TSE), 및 특히 소 해면상뇌증(BSE)이 없는 공급원으로부터 획득하여야한다. 전반적으로, 동물-유도성 물질이 전부 부재한 배양 세포가 바람직하다.
화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되는 경우, 화합물은 적합한 전구약물로 대체될 수 있다.
세포 기질이 재배열 또는 역 유전학 절차에 사용되는 경우, 인간 백신 생산에 승인된 것이 바람직하며, 예컨대 Ph Eur general chapter 5.2.3이다.
폴리펩타이드 서열간의 일치성은 스미스-워터맨 상동 조사 알고리즘에 의하여 측정되는 것이 바람직하다. 이는 MPSRCH 프로그램(Oxford Molecular) 내에서 수행되며, 갭 개방 페널티=12 및 갭 확장 페널티=1의 변수로 근친 갭 조사를 사용한다.
도 1은 다양한 백신 제제의 SDS-PAGE이다. 'M' 레인은 분자량 마커(kDa)이 다. 레인 1은 MDCK-성장 백신이다. 레인 2-6은 현존하는 시판 백신이다. 화살표는 본 발명의 (a) HAi (b) HA2 (c) M1 절편을 나타낸다.
도 2는 ~5kD기질 단백질 절편으로 면역된 토끼의 항혈청을 사용한 분할 인플루엔자 비리온의 웨스턴 블롯 분석의 결과이다. 왼쪽 패널은 사전-면역 혈청을 사용한 블롯이고, 오른쪽 패널은 사후-면역 혈청을 사용하였다.
인플루엔자 바이러스에 대한 정제된 표면 항원 백신의 실험에서, 비리온은 MDCK 세포 상에서 성장하는 경우, 상대적으로 다량의 저 분자량 폴리펩타이드가 CTAB을 보유한 인플루엔자 A 바이러스의 분할 후 SDS PAGE에서 검출될 수 있음을 관찰하였다. 이 저 분자량 폴리펩타이드는 추가의 항원 정제시에도 존재할 수 있으며, 표면 항원의 최종 제제 내에도 존재할 수 있다. 이 폴리펩타이드를 조사하기 위하여, 2 kDa의 작은 폴리펩타이드의 확인을 가능하게 하는 완충액 시스템을 사용하였다. (NuPAGE™ Novex Bis-Tris Gels, Invitrogen). 이 시스텀을 사용하여, ~5 kDa의 식별가능한 분자량의 폴리펩타이드 밴드를 확인하였다. 이 폴리펩타이드 밴드는 현재의 INFLEXAL V™, INFLUSPLIT™, MUTAGRIP™, VAXIGRIP™, BEGRIVAC™, FLUARIX™, INFLUVAC™ 또는 FLUVIRIN™ 백신에서는 나타나지 않으며, 이들 모두는 난-성장 비리온으로부터 제조된 것이다. 놀랍게도, 폴리펩타이드 밴드는 AGRIPPAL™의 일부 배치(batch)에서도 검출되었으나, 이들의 존재 또는 현존은 이전에 인식되지 않았다.
~5 kDa 밴드에 의한 토기의 면역화에 의하여 선천 M1 단백질을 검출할 수 있 는 항체가 유도되었다. 도 2는 비리온 M1 단백질에 대한 강한 반응성을 지닌, 토끼의 항혈청을 사용한 분할 인플루엔자 비리온의 웨스턴 블롯 분석의 결과이다. 따라서, ~5 kDa 밴드 내의 폴리펩타이드는 면역원성인 에피토프를 수반하며, 선천성 대응 M1 단백질에 결합하는 항체의 생산을 야기할 수 있다.
두 종의 서로 다른 바이러스 (H1N1 바이러스 및 H3N2 바이러스)에서 유도한 ~5 kDa 밴드의 N-말단 아미노산 서열 분석에서 N-말단 서열 EISLSYSAGALA (SEQ ID NO:15)를 보유한 펩타이드를 검출하였다. 이 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 114 내지 125와 일치하는 인플루엔자 바이러스 M1 단백질의 절편이다.
트립신에 의한 절편의 MS 분석을 사용한 추가의 조사에서, SEQ ID NO:1의 N-말단 메티오닌이 부재한 N-말단 아미노산 서열 SEQ ID NO:28을 보유한 더욱 풍부한 절편을 검출하였다:
SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLT
VPSERGLQR (SEQ ID NO:28)
이 절편의 C-말단은 추가의 Arg 잔기를 보유할 수 있다 (즉 SLL...QRR, SEQ ID NO:29). N-말단 세린은 예컨대, 아세틸화 등의 공유결합에 의하여 변형될 수 있다. 이 절편의 N-말단 12량체 (SLLTEVETYVLS; SEQ ID NO:30)은 균주 간에 잘 보존되어있다.
본 발명의 조성물은 이러한 절편 모두를 함유할 수 있으며, 더 풍부한 N-말단 부근의 절편(예컨대, SEQ ID NO:28)을 함유한다.
본 발명은 실시예에 의하여 설명되었으며, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나 지 않고 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
참고자료 (이들의 내용은 참고자료로서 본원에 포함됨)
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Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu lIe Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu GIn lIe Ala Asp Ser GIn His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg GIn Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu lIe Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu GIn Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu GIn Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser GIn 195 200 205 Ala Arg GIn Met Val GIn Ala Met Arg Thr lIe Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu GIn Ala Tyr 225 230 235 240 GIn Lys Arg Met Gly Val GIn Met GIn Arg Phe Lys 245 250 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 3 Gly lIe Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 4 lIe Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 5 Ser lIe lIe Pro Ser Gly Pro Leu Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 6 Met Gly Leu lIe Tyr Asn Arg Met 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 7 Ala Ser Cys Met Gly Leu lIe Tyr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 8 lIe Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lIe 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 9 lIe Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lIe Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 10 Ala Tyr GIn Lys Arg Met Gly Val GIn Met GIn Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 11 Leu Glu Asn Leu GIn Ala Tyr GIn Lys Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 12 Gly Pro Leu Lys Ala Glu lIe Ala GIn Arg Leu Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 13 Arg Lys Leu Lys Arg Glu lIe Thr Phe 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 14 Arg Lys Leu Lys Arg Glu lIe Thr Phe His 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 15 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 16 lIe lIe Pro Ser Gly Pro Leu Lys 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 17 Leu Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys 1 5 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 18 Glu lIe Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 50 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 19 Glu lIe Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly 1 5 10 15 Leu lIe Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe Gly 20 25 30 Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu GIn lIe Ala Asp Ser GIn His Arg Ser 35 40 45 His Arg 50 <210> 20 <211> 47 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 20 Glu lIe Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly 1 5 10 15 Leu lIe Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe Gly 20 25 30 Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu GIn lIe Ala Asp Ser GIn His Arg 35 40 45 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 21 Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 22 Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 23 Leu Asn Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 24 Leu Gly Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 25 Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 26 Phe Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> mise_feature <222> 3 <223> Xaa is Ala or Thr <400> 27 Tyr Ser Xaa Gly Ala Leu 1 5 <210> 28 <211> 75 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 28 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser lIe lIe Pro Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Lys Ala Glu lIe Ala GIn Arg Leu Glu Asp Val Phe Ala 20 25 30 Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg 35 40 45 Pro lIe Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lIe Leu Gly Phe Val Phe Thr 50 55 60 Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu GIn Arg 65 70 75 <210> 29 <211> 76 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 29 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser lIe lIe Pro Ser 1 5 10 15 Gly Pro Leu Lys Ala Glu lIe Ala GIn Arg Leu Glu Asp Val Phe Ala 20 25 30 Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg 35 40 45 Pro lIe Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lIe Leu Gly Phe Val Phe Thr 50 55 60 Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu GIn Arg Arg 65 70 75 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 30 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser 1 5 10

Claims (26)

  1. 세포 배양액에서 성장한 바이러스로부터 제조되며, 전 비리온으로서가 아닌 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 난알부민을 함유하지 않으며, 전 비리온으로서가 아닌 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  3. 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 기질 단백질은 분자량이 2OkDa 이하이며, SEQ ID NO:1와 최소한 50%가 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  4. 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 기질 단백질은 분자량이 2OkDa 이하이며, SEQ ID NO:28와 최소한 75%가 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  5. (i) 세포 배양액 내에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 성장한 바이러스로부터 항원 조성물을 제조하는 단계, 여기서, 항원 조성물은 전 비리온으로서가 아닌 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하며; 및
    (iii) 항원 조성물과 약학적 담체를 결합하여 면역원성 조성물을 생성하는 단계
    를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  6. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 SEQ ID NO:2와 최소한 80% 일치하는 20 개의 아미노산의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  7. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 인플루엔자 바이러스 M1 단백질에서 유래한 T 세포 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  8. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27 중의 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  9. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 전장 M1 기질 단백질 아미노산 서열의 절편인 아미노산 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  10. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 천연 M1 서열의 N-말단 메티오닌이 결핍된 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 기질 단백질은 N-말단 서열 SLLTEVETYVLS (SEQ ID NO:30)를 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  12. 제11항에 있어서, SEQ ID NO:30의 N-말단 세린은 예컨대, 아세틸화 등으로 공유결합적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 N-말단 서열 EISLSYSAGALA (SEQ ID NO:18)을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  14. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물은 (i) N-말단 서열 SLLTEVETYVLS (SEQ ID NO:30)를 보유한 제1 기질 단백질; 및 (ii) N-말단 서열 EISLSYSAGALA (SEQ ID NO:18)를 보유한 제2 기질 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  15. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 기질 단백질은 1㎍/㎖ 내지 15㎍/㎖ 사이의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  16. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 분할 인플루엔자 바이러스 또는 정제된 인플루엔자 표면 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  17. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈구응집소는 H1, H2, H3, H5, H7 또는 H9 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  18. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 단백질은 숙주 세포의 배양액 상에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조되며, 조성물은 숙주 세포에서 유래한 10ng 이하의 세포성 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  19. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물은 바이러스 균주당 0.1 내지 20㎍의 혈구응집소를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  20. 전술한 청구항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 보조제는 하나 또는 그 이상의 알루미늄 염을 포함하는 것 을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 보조제는 수중유 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 방법.
  23. (i) 전 비리온으로서가 아닌, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질, 및 (ii) 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 전 비리온으로서가 아닌, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 혈구응집소는 H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16으로부터 선택된 서브타입인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  25. 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 및 기질 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 조성물 내의 혈구응집소의 농도는 균주당 29㎍/㎖ 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  26. 인플루엔자 백신을 분석하기 위한 면역학적 분석법으로서, 백신의 시료를 분석하여 M1의 기질 단백질의 절편의 존재를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석법.
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