CN103330936A - 一种磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗的方法。包括以下步骤：1）将三氯化铝溶液、水、氯化钠溶液、乙肝表面抗原原液依次加入反应器中搅拌混合；2）在步骤1）中加入磷酸氢二钠与氢氧化钠的混合溶液，并搅拌。本发明方法制备的疫苗粒径为45nm左右的多分散性体系，疫苗的颗粒均匀、细腻，疫苗的体内、体外相对效力及疫苗的稳定性好；本方法生产工艺周期短、工艺操作简单、制造成本低，利于大规模生产。

Description

一种磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗的方法

技术领域

本发明涉及疫苗的制备方法，具体地，涉及一种磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗的方法。

背景技术

全球约有三亿多乙肝病毒（HBV）携带者，每年约有60万人死于与乙肝有关的疾病，估计其中93%的人死于慢性肝炎。我国是“肝炎大国”，乙肝病毒感染者超过1亿，约占总人口的10％。乙肝已经严重威胁我国乃至世界人们的健康和生存质量。为降低和消除乙肝给人类健康带来的威胁，扩大免疫规划和生产更为安全有效的疫苗，成为当前和未来从事疫苗产品研发、生产和免疫工作最为迫切和神圣的事业。

铝佐剂是生物制品中应用最多、最广泛的一种佐剂，已经应用人用疫苗80多年，也是唯一被FDA批准用于人类疫苗的佐剂。它能够显著提高疫苗的免疫效果，是安全、有效的疫苗佐剂。目前铝盐佐剂主要有氢氧化铝和磷酸铝佐剂，现已上市乙肝疫苗的佐剂均为氢氧化铝佐剂，其制备方法有两种：一种为六水三氯化铝溶液与氢氧化钠溶液反应制备高浓度氢氧化铝佐剂；另一种为十二水硫酸钾铝溶液与氢氧化钠溶液反应生成氢氧化铝佐剂，此种方法在佐剂生成的同时吸附抗原蛋白制备疫苗半成品，即所谓的在线吸附法。新型的乙肝疫苗佐剂，如壳聚糖纳米粒、CpG脱氧寡核苷酸（CpG ODN）、氢氧化铝与IFN联合佐剂、脂质体等佐剂乙肝疫苗，试验证明这些佐剂有提高疫苗免疫效果的作用，但现多处于研究的不同阶段中，未经过产业化和市场应用的验证。

已经上市的乙肝疫苗的佐剂主要是氢氧化铝，其佐剂吸附抗原制备疫苗的工艺主要有两种。第一种是：先用三氯化铝溶液与氢氧化钠溶液，在高温条件下（60℃）反应制备高浓度氢氧化铝混悬液，经高压湿热灭菌后备用。配制疫苗时，可将高浓度氢氧化铝混悬液加入已经稀释至符合要求的抗原溶液中，或将抗原溶液加入已经稀释到符合要求的佐剂中；第二种是：在线吸附法制备疫苗，是先分别将磷酸盐缓冲溶液、硫酸钾铝溶液、一定量氯化钠溶液、抗原溶液、一定量氯化钠溶液经除菌过滤加入反应罐，另外以一定流速经除菌过滤流加氢氧化钠溶液入反应罐内至混悬液达到一定pH值范围内，停止流加氢氧化钠溶液。确认反应液pH值符合要求后，密封正压保压反应罐。沉淀24小时后，吸去上清液，加入氯化钠溶液至制备体积，搅拌洗涤沉淀一定时间后，密封正压保压反应器，继续沉淀12小时。重复上次操作2次。在重复第2次操作时，加入氯化钠溶液至制备体积后，搅拌均匀，取样、留样，分装于一定体积的容器内，密封，于2-8℃保存，疫苗半成品制备完成。

第二种制备工艺制备的疫苗，在对抗原的吸附率、疫苗外观及疫苗的免疫效果方面都好于第一种。但是，第二种制备方法的工艺较为繁琐、洗涤工艺时间较长、污染风险增加、相对人力物力成本较高。另外，第二种方法制备疫苗的佐剂，已经不是纯粹意义上的氢氧化铝佐剂，因为在pH值低于7.0时优先形成的是Al-PO4，所以反应器内的佐剂实际有二种铝盐，包括磷酸铝和氢氧化铝，只不过氢氧化铝所占比例较大。

佐剂对抗原的吸附程度会直接影响疫苗的免疫效果，吸附率越高，单位疫苗游离抗原就越少，更多的抗原被吸附和包裹在佐剂内外，形成抗原库，抗原递呈的缓释效果就越好，疫苗的免疫效果也就越好。磷酸铝佐剂颗粒小、均匀、比表面积大，颗粒再凝聚又形成了第二层次的空间结构。原位法制备乙肝疫苗过程中，抗原被不断吸附佐剂表面和被包裹在空间结构中。因此，磷酸铝吸附效果比氢氧化铝的效果更好。

目前采用硫酸钾铝原位法制备的乙肝疫苗，由于存有钾离子、硫酸根等离子，佐剂颗粒较大，会在免疫注射时增加接种者注射部位的疼痛感和局部红肿。另外，制备过程中需要多次洗涤沉淀、抽取上清液，多次开启反应容器，污染机会增加，工艺操作繁琐，相对成本较高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗的方法。

本发明原位法制备疫苗的佐剂是磷酸铝，其生产工艺为：1）将三氯化铝溶液、水、氯化钠溶液、乙肝表面抗原原液依次加入反应器中搅拌混合；

2）在步骤1）中加入磷酸氢二钠与氢氧化钠的混合溶液，并搅拌。

本发明在反应生产磷酸铝佐剂的同时，抗原不断被吸附和包裹在佐剂表面和内部，我们称之为“磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗”。制备的疫苗样品呈乳白色凝胶状混悬液，磷酸铝佐剂颗粒和由颗粒聚集形成第二层结构能够有效地吸附抗原，形成“抗原库”，注射机体后可以逐渐释放抗原，能够有效地刺激机体的免疫系统产生高免疫应答。同时激活补体，并刺激巨噬细胞诱导淋巴和淋巴结活性和记忆力。它不诱导细胞免疫和T细胞应答，而是刺激Ⅱ型应答产生体液免疫产物IgE和IgG。

其中，所述三氯化铝溶液为9.0～11.0%六水三氯化铝溶液，所述氯化钠溶液浓度为3.8～4.2mol/L，所述磷酸氢二钠为4.5～5.5%十二水磷酸氢二钠溶液，所述氢氧化钠为0.45～0.55mol/L氢氧化钠溶液。

其中，所述六水三氯化铝溶液按Al离子终浓度为0.45～6.0mg/ml；所述氯化钠溶液按疫苗氯化钠终浓度为0.80～0.90%；所述乙肝表面抗原终浓度为20μg/ml。

其中，所述十二水磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液的体积比为3.1:1～3.3:1。

其中，步骤1）中各溶液的流速为80-120ml/min。步骤2）中混合溶液的最初流速为3.8ml/min～4.2ml/min。流加混合溶液至佐剂混悬液pH3.6+0.2时，降低流加速度为0.8ml/min～1.2ml/min;流加混合溶液至混悬液pH6.0+0.2时，停止流加混合溶液。

其中，步骤1）中各溶液依次以恒定的速度经过同一无菌滤器除菌过滤，其恒定过滤速度V=25V_h；步骤2）中混合溶液以恒定的速度经过另一个无菌滤器除菌过滤，其恒定过滤速度V_h=（十二水磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液混合溶液体积ml）/120min。

所述乙肝表面抗原为重组酵母乙肝表面抗原，优选地，所述乙肝表面抗原为重组汉逊酵母乙肝表面抗原。

本发明另一方面提供由上述制备方法制备的乙肝疫苗。

本发明优选的工艺技术方案如下：

先将三氯化铝溶液、灭菌注射用水、氯化钠溶液、乙肝表面抗原原液依次加入反应器，开启搅拌混合均匀，再将已混合均匀的磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液的混合溶液加入反应器，在反应生成磷酸铝佐剂的同时，乙肝表面抗原被吸附和包裹在佐剂表面和内部，其步骤是：

1）配制溶液：

新鲜注射用水盛装于适当容器内，经121℃、30min湿热灭菌后备用。

用新鲜注射用水分别配制4mol/L氯化钠溶液、10%六水三氯化铝溶液（g/100ml），经0.22μm滤膜除菌过滤后备用。

用新鲜注射用水分别配制5%十二水磷酸氢二钠溶液（g/100ml）和0.5mol/L氢氧化钠溶液，并将5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液按体积比为3.22:1的比例进行配制混合均匀，经0.22μm滤膜除菌过滤后备用。

2）按抗原终浓度为20μg/ml制备乙肝疫苗半成品3.0L：

经过无菌除菌过滤器（0.22μm或0.45μm+0.22μm）依次过滤的10%六水三氯化铝溶液130.7ml（按Al离子终浓度为0.5mg/ml计算）、灭菌注射用水1000ml（按疫苗氯化钠终浓度0.85%配制）、4mol/L氯化钠溶液（按疫苗氯化钠终浓度0.85%配制）、乙肝表面抗原原液（按疫苗抗原终浓度为20μg/ml配制）加入反应罐内，开启搅拌200rpm。

以4.0ml/min流速，向反应罐内加入5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液混合溶液，即反应生成乳白色凝胶状磷酸铝佐剂混悬液的同时抗原被不断吸附、包裹和吸附在佐剂内部和表面。

流加混合溶液至佐剂混悬液pH3.6+0.2时，降低流加速度为1.0ml/min，流加混合溶液至混悬液pH6.0+0.2时，停止流加混合溶液，补加灭菌注射用水至3.0L。

继续搅拌1小时后取样检测，其混悬液pH值应稳定在6.0±0.2范围内。

取样、取样之后，将疫苗半成品分装于无菌容器内，密封，疫苗半成品制备完成。

将制备完成的疫苗半成品于室温（18～26℃）放置吸附24小时后，送2～8℃保存。

其中，制备疫苗的各种溶液加入反应罐时，依次以恒定的速度经过同一无菌滤器除菌过滤，其恒定过滤速度V=25V_h；混合溶液以恒定的速度经过另一个无菌滤器除菌过滤进入反应罐，其恒定过滤速度V_h=（5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液混合溶液体积ml）/120min，混合溶液进入反应罐时，与反应罐内六水三氯化铝溶液反应生成磷酸铝佐剂（混悬液），磷酸铝佐剂生成的同时乙肝表面抗原被不断地吸附、包裹和吸附在佐剂内部和表面。

其中，5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液混合溶液的体积比等于3.22:1。疫苗制备过程中以恒定速度流加混合溶液进入反应罐，生成佐剂的反应在弱酸性（pH3.6±0.2）条件下形成了大部分相同的固形物（磷酸铝佐剂）。

其中，所述乙肝表面抗原原液，是按照常规生成工艺技术制备。优选地，所述乙肝表面抗原为重组酵母乙肝表面抗原。更优选地，所述乙肝表面抗原为重组汉逊酵母乙肝表面抗原。

所述重组汉逊酵母乙肝表面抗原原液是由以下生产工艺制备而成：1）细胞发酵：取重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗工作种子批菌种接种于于200ml的YNB培养基中，于30℃培养20小时进行一级培养。将一级培养物移种至2L的YNB培养基中，于30℃培养20小时进行二级培养。将二级培养物移种至12L的甘油培养基中，于30℃培养88-95小时，离心收集表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞。

2）细胞破碎：将发酵后收获的培养物于4℃以每分钟4500转的转速离心20分钟，去上清液，之后加入PB缓冲液，使细胞浓度为30%，然后再加入其体积1%的聚山梨酯20，以高压匀浆机破碎细胞，使破碎率达95%以上。

3）初步提纯：加入50%聚乙二醇6000溶液和氯化钠溶液进行双水相萃取，于2-8℃作用16-18小时，然后于4℃以每分钟7000转的转速离心40分钟去除沉淀。于上清液中加入上清液体积40%的硅胶溶液吸附，于2-8℃作用10-16小时，再在4℃以每分钟6000转的转速离心20分钟去除上清液；在沉淀中加入硅胶脱吸附液，于57℃搅拌90分钟，然后以每分钟8000rpm的转速离心15分钟去除沉淀，留脱吸附上清液。初步纯化后的样品保存于2-8℃条件下。

4）精细提纯：将收集的脱吸附上清液用100KD超滤膜超滤换液。采用阴离子层析方法，上样量为1L，流速为40ml/min，监测波长UV280nm，收集吸光度值A_280nm大于0.5的洗脱峰。洗脱液为50mmol/L Tris-HCl与0.5mol/L氯化钠混合液。将洗脱液经超滤浓缩后再进行溴化钾等密度区带超速离心，于25000转速离心20小时，收集UV280nm吸收峰。经过等密度离心后的样品，采用Sepharose4FF分子筛层析，上样量为100-120ml，流速为20ml/min，洗脱液为PBS缓冲液，监测波长280nm，收集UV280nm蛋白峰。

5）除菌过滤：纯化后的收集液经0.22μm孔径的滤膜除菌过滤。抗原原液于2-8℃条件下保存。

其中，所述甘油培养基配方：每升溶液含甘油、磷酸二氢铵、氯化钾、氯化钙、氯化钠、硫酸镁、乙二胺四乙酸钠，其依次比例为：140:70:20:15:2:1，用新鲜注射用水配制，121℃、30min灭菌后使用。

本方法制备的乙肝疫苗半成品，按照常规技术分装于2ml西林瓶中。

本发明的有益效果为：

（1）本发明所述磷酸铝吸附法制备的疫苗其特征在于粒径为45nm左右的多分散性体系，疫苗的颗粒均匀、细腻，无钾离子和硫酸根离子，大大减轻了注射痛痛感和局部红肿的程度，疫苗的体内、体外相对效力及疫苗的稳定性好；

（2）磷酸铝佐剂对抗原吸附率高。疫苗制备过程中，绝大部分磷酸铝佐剂颗粒和由颗粒聚集形成第二层结构能够有效地吸附和包裹抗原，形成“抗原库”；

（3）磷酸铝佐剂原位法制备乙肝疫苗，使佐剂更为有效包裹和吸附抗原，可诱导机体产生更高的体液应答水平，能进一步提高了乙肝疫苗的免疫效果和阳转率；

（4）本发明无需沉淀洗涤，佐剂制备与抗原原位吸附同时进行一次完成，操作简单，容易控制，无菌保证程度高，生产成本相对低廉，利于大规模生产。

（5）本方法使用的溶液经过除菌或灭菌，合格后用于制备疫苗。在制备疫苗生产之前再次经过无菌过滤系统，确保了产品的无菌，降低了因多次洗涤佐剂沉淀所带来的污染风险。

附图说明

图1为应用动态光散射激光粒度电位分析仪测定氢氧化铝和磷酸铝吸附法制备疫苗的颗粒大小及分布情况；

图2为应用H-7650透射电子显微镜观察氢氧化铝和磷酸铝吸附法制备疫苗进行形态观察情况；

其中A为氢氧化铝吸附法制备的疫苗，B为磷酸铝吸附法制备的疫苗。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

菌种：重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的种子批菌种。

发酵培养基配方：每升溶液的含甘油、磷酸二氢铵、氯化钾、氯化钙、氯化钠、硫酸镁、乙二胺四乙酸钠，其依次比例为：140:70:20:15:2:1，用新鲜注射用水配制，121℃、30min灭菌后使用。

3mol/L氯化钠溶液：用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

50%PEG6000溶液：用新鲜注射用水配制，121℃、30min灭菌后使用，灭菌指示剂应符合要求。

7.5%硅胶溶液：用新鲜注射用水配制，121℃、30min灭菌后使用，灭菌指示剂应符合要求。

50mmol/L Tris-HCl+0.5mol/L氯化钠溶液：用新鲜注射用水配制，加HCl溶液调至pH8.0，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

溴化钾溶液：密度分别为1.04g/ml、1.28g/ml、1.34g/ml三种溴化钾溶液，用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

0.85%氯化钠溶液：用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

磷酸盐缓冲溶液（PBS）：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，浓度为3mmol/L，用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

10%十二水硫酸钾铝溶液：用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

10%六水三氯化铝溶液：用新鲜注射用水配制，经过0.22μm滤膜除菌过滤后，检验合格后使用。

4mol/L氯化钠溶液：用新鲜注射用水配制，0.22μm滤膜除菌过滤，检验合格后备用。

灭菌注射用水：适当容器（玻璃瓶），盛装其容器体积的80%新鲜注射用水，121℃、30min湿热灭菌，灭菌指示剂应合格，灭菌后冷却至室温后备用，灭菌注射用水应在灭菌后72小时内使用。

5%十二水磷酸氢二钠溶液：用新鲜注射用水配制，0.22μm滤膜除菌过滤，检验合格后备用。

0.5mol/L氢氧化钠溶液：用新鲜注射用水配制，0.22μm滤膜除菌过滤，检验合格后备用。

混合溶液（混合碱溶液）：将5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液按体积比为3.22:1混合均匀，0.22μm滤膜除菌过滤，检验合格后备用。

实施例1重组乙型肝炎表面抗原（汉逊酵母）原液制备

细胞发酵：取重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗工作种子批菌种接种于200ml的YNB培养基中，于30℃培养20小时进行一级培养。将一级培养物移种至2L的YNB培养基中，于30℃培养20小时进行二级培养。将二级培养物移种至12L的甘油培养基中，于30℃培养88-95小时，收集表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞发酵液24L。

细胞破碎：将发酵后收获的培养物于4℃以每分钟4500转的转速离心20分钟，去上清液，之后加入PB缓冲液，使细胞浓度为30%，然后再加入其体积1%的聚山梨酯20，以高压匀浆机破碎细胞，使破碎率达95%以上。

初步提纯：加入50%聚乙二醇6000溶液和氯化钠溶液进行双水相萃取，于2-8℃作用16-18小时，然后于4℃以每分钟7000转的转速离心40分钟去除沉淀。于上清液中加入上清液体积40%的硅胶溶液吸附，于2-8℃作用10-16小时，再在4℃以每分钟6000转的转速离心20分钟去除上清液；在沉淀中加入硅胶脱吸附液，于57℃搅拌90分钟，然后以每分钟8000rpm的转速离心15分钟去除沉淀，留脱吸附上清液。初步纯化后的样品保存于2-8℃条件下。

精细提纯：将收集的脱吸附上清液用100KD超滤膜超滤换液。采用阴离子层析方法，上样量为1L，流速为40ml/min，监测波长UV280nm，收集吸光度值A_280nm大于0.5的洗脱峰。洗脱液为50mmol/L Tris-HCl与0.5mol/L氯化钠混合液。将洗脱液经超滤浓缩后再进行溴化钾等密度区带超速离心，于25000转速离心20小时，收集UV280nm吸收峰。经过等密度离心后的样品，采用Sepharose4FF分子筛层析，上样量为100-120ml，流速为20ml/min，洗脱液为PBS缓冲液，监测波长280nm，收集UV280nm蛋白峰。

除菌过滤：纯化后的收集液经0.22μm孔径的滤膜除菌过滤。抗原原液于2-8℃条件下保存。

采用上述生产工艺制备4批重组乙型肝炎表面抗原（汉逊酵母）原液，应用Lowry法进行原液蛋白含量测定，测定结果如表1所示：

表1重组乙型肝炎表面抗原（汉逊酵母）原液蛋白含量测定结果

批号	B201101	B201102	B201103	B201104
					蛋白含量（μg/ml）	220	206	213	189

实施例2氢氧化铝原位吸附法制备乙肝疫苗

开启5.0L反应器搅拌，转速200rpm。加入PBS溶液1000ml，加入乙肝表面抗原溶液（由实施例1制备的抗原原液批号为：B201101、B201102，抗原终浓度为20μg/ml），再加入PBS溶液300ml，再加入10%十二水硫酸钾铝溶液250ml，之后加入0.85%氯化钠溶液至体积2500ml。以流速为50ml/min向反应罐中加入0.5mol/L氢氧化钠溶液，当pH6.8±0.2时，停止流加0.5mol/L氢氧化钠溶液。补加0.85%氯化钠溶液至体积3000ml，继续搅拌30min，密封反应罐，沉淀。

第一次洗涤沉淀：沉淀24小时后，吸取上清液废弃。加入0.85%氯化钠溶液至体积3000ml，开启搅拌，转速50rpm，搅拌30min后停止，密封反应罐，沉淀。第二次洗涤沉淀：沉淀12小时后，吸取上清液废弃。加入0.85%氯化钠溶液至体积3000ml，开启搅拌，转速50rpm，搅拌30min后停止，密封反应罐，沉淀。第三次洗涤沉淀：沉淀12小时后，吸取上清液废弃。加入0.85%氯化钠溶液至体积3000ml，开启搅拌，转速50rpm，搅拌30min后停止，密封反应罐，沉淀。半成品配制：沉淀12小时后，吸取上清液废弃。加入0.85%氯化钠溶液至体积3000ml，开启搅拌，转速50rpm，搅拌30min后取样、留样，分装于5.0L玻璃瓶中（带有封闭系统）密封，即为乙肝疫苗半成品。于2-8℃条件下保存。

采用上述方法制备2批乙肝疫苗情况如表2所示：

表2氢氧化铝原位法制备乙肝疫苗情况

半成品批号	原液批号	原液体积	滴定终点pH值	疫苗半成品pH值
					B20110101	B201101	273ml	6.96	6.42
B20110201	B201102	291ml	6.84	6.32

实施例3磷酸铝原位吸附法制备乙肝疫苗（本发明）

将无菌除菌过滤系统与5.0L反应器进料口连接，经过除菌过滤器，以100ml/min流速，依次过滤10%六水氯化铝溶液130.7ml、灭菌注射用水1000ml、4mol氯化钠溶液51.9ml、乙肝表面抗原溶液（由实施例1制备的抗原原液批号为：B201101、B201102、B201103、B201104，抗原终浓度为20μg/ml）、灭菌注射用水500ml加入反器内，开启搅拌200rpm。经过除菌过滤器，以4.0ml/min流速，向反应罐内加入5%十二水磷酸氢二钠溶液和0.5mol/L氢氧化钠溶液混合溶液，流加混合溶液至混悬液pH3.6时，降低流加速度为1.0ml/min，流加混合溶液至混悬液pH6.0±0.2时，停止流加混合溶液，补加灭菌注射用水至3.0L。继续搅拌1小时后取样检测，其佐剂混悬液pH值应稳定在6.0±0.2范围内。取样。取样之后，将疫苗半成品分装于无菌容器内，密封，疫苗半成品制备完成。并将疫苗半成品于室温（18～26℃）放置吸附24小时后，送于2～8℃保存。

采用上述方法制备4批乙肝疫苗情况如表3所示：

表3磷酸铝原位法制备乙肝疫苗情况

半成品批号	原液批号	原液体积	滴定终点pH值	疫苗半成品pH值
					B20110102	B201101	273ml	5.84	5.82
B20110202	B201102	291ml	5.83	5.83
					B20110302	B201103	282ml	5.85	5.86
B20110402	B201104	318ml	5.82	5.80

实施例4两种佐剂原位吸附法制备乙肝疫苗物理性状比较

分别取实施例2、3制备的疫苗半成品（批号为：B20110101、B20110102）进行粒径分析及颗粒形态分析。粒径分析：应用动态光散射激光粒度电位分析仪测定氢氧化铝和磷酸铝吸附法制备疫苗的颗粒大小及分布情况，样品测定结果如图1所示；颗粒形态分析：应用H-7650透射电子显微镜观察氢氧化铝和磷酸铝吸附法制备疫苗进行形态观察，电子显微镜观察情况如图2所示。

综合分析两种佐剂原位吸附法制备乙肝疫苗物理性状比较情况如表4所示：

表4两种佐剂原位吸附法制备乙肝疫苗物理性状比较情况

结果显示：两种铝佐剂制备疫苗的颗粒均匀度有明显不同，均有不同程度的聚集，氢氧化铝佐剂制备疫苗颗粒较磷酸铝佐剂制备疫苗颗粒明显粗大，颗粒大小分布较广，磷酸铝佐剂制备疫苗颗粒细腻、均匀度较好。

实施例5两种铝佐剂制备疫苗的效力(ED₅₀)测定

将制备的6批疫苗以1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640进行连续稀释，每个稀释度注射体重16-18g雌性SPF级Bal/C小鼠10只，每只腹腔注射1ml，30天后眼球采血，用乙型肝炎表面抗体（抗-HBs）检测试剂盒检测抗-HBs，计算ED₅₀，测定结果如表5所示：

表5.两种铝佐剂制备疫苗效力(ED₅₀)测定结果

批号	rHBsAg(μg/ml)	2.0	1.0	0.5	0.25	0.125	0.0625	0.0312	ED50μg
										B20110101	Positive rate(%)	100	100	100	70	10	0	0	0.20
B20110201	Positive rate(%)	100	100	100	70	30	0	0	0.18
										B20110102	Positive rate(%)	100	100	100	90	70	30	10	0.09
B20110202	Positive rate(%)	100	100	100	80	60	30	10	0.10
										B20110302	Positive rate(%)	100	100	100	90	70	40	20	0.08
B20110402	Positive rate(%)	100	100	100	90	70	40	10	0.10

表5的结果显示：同样规格的两种佐剂吸附制备的疫苗，磷酸铝原位法制备的疫苗效力明显好于氢氧化铝原位法制备的疫苗，相同稀释倍数磷酸铝原位法制备的疫苗阳转率(Positive rate)高于氢氧化铝原位法制备的疫苗。

实施例6两种铝佐剂制备疫苗的吸附率及体外相对效力测定

体外相对测定：分别取两种铝佐剂制备的6批疫苗各1ml，加入解吸附液解吸附，依法测定参考品、疫苗离心上清液HBsAg含量、疫苗HBsAg含量，按现行版《中国药典》附录ⅩA采用重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）体外相对效力检查法计算两种佐剂吸附疫苗的体外相对效力，结果如表5所示。

吸附率测定：取两种铝佐剂制备的6批疫苗各1ml，6500g离心5分钟取上清液，依法测定（《中国药典》附录ⅩA）参考品、疫苗及其上清液中HBsAg含量。测定结果如表6所示。

表6两种铝佐剂制备疫苗的体外相对效力（RP）及吸附率试验结果

批号	B20110101	B20110201	B20110102	B20110202	B20110302	B20110402
							RP	2.7	2.5	3.3	2.9	2.7	3.1
吸附率(%)	99.1	98.7	99.4	99.3	99.7	99.1

表6的结果显示：同样规格的两种佐剂吸附制备的疫苗，磷酸铝原位法制备的疫苗效力明显好于氢氧化铝原位法制备的疫苗，相同稀释倍数磷酸铝原位法制备的疫苗阳转率高于氢氧化铝原位法制备的疫苗；磷酸铝佐剂对抗原的吸附效果略好于氢氧化铝佐剂对抗原的吸附。

实施例7两种铝佐剂制备疫苗的稳定性比较

通过37℃加速稳定性试验考察疫苗的稳定性。分别于7、14、21天取37℃放置的6批疫苗各5ml，测定疫苗的pH值、吸附率(Degree of adsorption)、体外相对效力(Vaccine efficacy)，测定结果如表7所示。

表7.两种铝佐剂吸附疫苗的稳定性试验比较结果

表7的结果显示：两种佐剂吸附疫苗经37℃放置21天后，疫苗体外相对效力测定结果均有不同程度的下降，但均符合国家规定标准。其中，氢氧化铝原位法制备的疫苗体外相对效力下降比例分别为：18.5%、16.0%，平均下降比例为：17.3%；磷酸铝原位法制备的疫苗体外相对效力下降比例分别为：15.2%、13.8%、11.1%、12.9%，平均下降比例为：13.3%。疫苗稳定性试验结果显示磷酸铝原位法制备疫苗的体外相对效力略好于氢氧化铝原位法制备的疫苗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种乙肝疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将三氯化铝溶液、水、氯化钠溶液、乙肝表面抗原原液依次加入反应器中搅拌混合；

2）在步骤1）中加入磷酸氢二钠与氢氧化钠的混合溶液，并搅拌。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述三氯化铝溶液为9.0～11.0%六水三氯化铝溶液，所述氯化钠溶液浓度为3.8～4.2mol/L，所述磷酸氢二钠为4.5～5.5%十二水磷酸氢二钠溶液，所述氢氧化钠为0.45～0.55mol/L氢氧化钠溶液。

3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述六水三氯化铝溶液按Al离子终浓度为0.45～6.0mg/ml；所述氯化钠溶液按疫苗氯化钠终浓度为0.80～0.90%；所述乙肝表面抗原终浓度为20μg/ml。

4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述十二水磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液的体积比为3.1:1～3.3:1。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤1）中各溶液的流速为80-120ml/min。

6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤2）中混合溶液的最初流速为3.8ml/min～4.2ml/min。

7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于，流加混合溶液至佐剂混悬液pH3.6+0.2时，降低流加速度为0.8ml/min～1.2ml/min;流加混合溶液至混悬液pH6.0+0.2时，停止流加混合溶液。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤1）中各溶液依次以恒定的速度经过同一无菌滤器除菌过滤，其恒定过滤速度V=25V_h；将步骤2）中混合溶液以恒定的速度经过另一个无菌滤器除菌过滤，其恒定过滤速度V_h=（十二水磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液混合溶液体积ml）/120min。

9.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述乙肝表面抗原为重组酵母乙肝表面抗原。

10.权利要求1-9任一项所述制备方法制备的乙肝疫苗。

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