WO2013026385A1

WO2013026385A1 - 四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺

Info

Publication number: WO2013026385A1
Application number: PCT/CN2012/080398
Authority: WO
Inventors: 蔡勇; 周蓉; 李声友; 侯文礼
Original assignee: 成都康华生物制品有限公司
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2013-02-28
Also published as: CN102327605A; CN102327605B

Abstract

本发明公开四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，包括如下步骤：选用菌种；种子批的建立及传代；生产疫苗原液；收获及杀菌；去菌体；沉淀、解离；去核酸；沉淀收集多糖；超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素；沉淀精多糖；半成品配制；分装、冻干，制备疫苗成品。该制备工艺制备得到的四价脑膜炎球菌多糖疫苗为四价疫苗，注射一针即有多种免疫效用；并且该疫苗安全性和各项检定参数都符合标准。

Description

四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺本申请要求于 2011 年 8 月 25 日提交中国专利局、申请号为 201110245718.3、发明名称为"四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺"的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体的，涉及四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺。背景技术

流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎双球菌引起的化脓性脑膜炎，筒称流脑。流脑的流行早在 16世纪即被发现，易感人群主要为儿童及青少年。发病症状分普通型和爆发型；普通型表现为剧烈头疼、频繁呕吐、烦躁不安和颈项强直凯尔尼格征和布鲁津斯基征阳性等脑膜刺激症状，伴有呼吸、循环衰竭或其它并发症；爆发型多见于儿童病人。起病急剧，病情凶险，如不及时抢救，常在 24小时内危及生命。爆发型病死率最高可达 40~60%。任何年龄都可发病，其中 14岁以下年龄、尤其是 7岁以下儿童发病率最高。脑膜炎双球菌隐藏于患者或带菌者的鼻咽分泌物中，主要通过咳嗽、打喷嚏、说话等由飞沫直接从空气传播，进入呼吸道而引起感染。

从全球来看，流脑散发病例和地方性流行仍然在危害人类健康。其流行的地域分布极广，几乎遍及各大洲。各国之间流脑的发病水平差异 4艮大，在发展中国家发病率相对较高，在非洲发病率最高。当今，全世界每年发生 30万〜 35万流脑病例。高发地区依然是非洲、亚洲和南美洲。非洲撒哈拉以南的 "脑膜炎地带 "的发病率最高，在流行年度可高达 400 /十万〜 800 /十万。由于地理及气候原因，流行季节一般在 11月底至次年 6月底之间。这一地带向东已延伸至埃塞俄比亚，往西已扩大到塞内加尔，涉及 18个国家，约有 3亿人口，且还有扩大的趋势。自 1980年起，这一地带呈有规律地暴发流行。近年来，流行性脑脊髓膜炎爆发流行由过去的 A 群为主，逐渐演变为 A群与其他群并存。 1996年，南撒哈拉非洲国家发生一次历史上最大的流脑流行，报道病例数达 18万以上，死亡 18000人，流行菌群以 B群和 C群为主。 2000年与 2001年沙特阿拉伯哈吉地区两次爆发流行性脑脊髓膜炎，共发病 500多例，其中 230多例为 W135 群，其余均为 A群。据 WHO报告， 2002年春季布基纳法索爆发流脑，发病 12, 587例，死亡 1 , 447 例，死亡率 11.5%。也主要以 W135 群为主。我国在 1938年、 1949年、 1959年、 1967年、 1977年共发生过五次全国性流脑大流行，平均约 8 ~ 10年流行一次，主要以 A群脑膜炎双球菌引起的流脑流行为主。 1967年春季发病率达到最高峰，为 403/10万，病死率 5.49%。 80年代初我国研制的 A群流脑多糖疫苗获准投入使用，预防效果良好， 80年代以后我国未再发生全国性的大流行。 1985年发病率为 9.9/10万， 1986年 ~ 1989年的发病率依次为 7.56/10万、 3.21/10万、 1.97/10 万、 1.32/10万。疫苗的使用，有效地控制了流行高峰。但散发病例仍然存在。根据流行规律，推测近几年我国将是流行性脑脊髓膜炎的流行周期。近年来，流行性脑脊髓膜炎的流行还具有菌群漂移的特点，如美国从前为 A群流行性脑脊髓膜炎流行，以后为 B群流行性脑脊髓膜炎流行，再后来又转为 C群流行性脑脊髓膜炎流行，目前则转为 Y群流行。我国的流行性脑脊髓膜炎流行主要以 A群为主。随着 A群流脑多糖疫苗的广泛使用，人群对 A群流脑双球菌具有一定的免疫力，由 A群流脑双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎比例呈逐年下降趋势，而由 C群及其他群流脑双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎病例逐年上升。最近几年 C群流行性脑脊髓膜炎局部爆发偶有发生，去年 12月至今年 1月安徽省 11市共发生 C群流行性脑脊髓膜炎病例 60例，死亡 8例。福建省去年底也发生 4例 C群流行性脑脊髓膜炎。从流行趋势看， C群流行性脑脊髓膜炎发病例数逐年增多，发病范围逐渐扩大。此外，也不排除非洲国家流行的 W135群流行性脑脊髓膜炎，美国流行的 Y群等流行性脑脊髓膜炎输入我国的可能性。在非洲和亚洲都存在流行性脑脊髓膜炎流行带，过去也都以 A群流行性脑脊髓膜炎流行为主，但非洲流行性脑脊髓膜炎流行带已转为 W135群流行为主， A群流行为辅的现象。随着国际间交流的增加，人员流动频繁，在国外流行的 Y型和 W135型流脑输入我国的可能性也在增加。因此，研制（A+C+Y+W135 ) 四价脑膜炎球菌多糖疫苗具有重要意义。发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，该制备工艺可以制备得到的四价脑膜炎球菌多糖疫苗，为四价疫苗，注射一针即有多种免疫效用；并且该疫苗安全性和各项检定参数都符合标准。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选用菌种：生产用菌种为 A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、 C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、 Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种和 W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种；

( 2 )种子批的建立及传代：将 1支原始种子冻干菌种开启后，接种在 10%羊血琼脂培养基上，放于 35 ~ 37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境培养 16 ~ 20小时传第二代，将第二代培养物采入无菌脱脂牛奶中，混勾冻干制备主代种子批；再将 1支主种子批菌种开启后，接种在 10%羊血琼脂培养基上，放于 35 ~ 37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境培养 16 ~ 20小时传第二代，冻干为工作种子批；所述主种子批和所述工作种子批菌种冻干后进行生物学特性检定，所述主种子批和所述工作种子批菌种的生物学特性与原始种子批菌种一致；

( 3 )生产疫苗原液：开启工作种子批菌种 1支，接种于 10%羊血琼脂培养基制备第一代，将第 1代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第 2代，将第 2代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第 3 代，将第 3代菌种接种于改良半综合液体培养基，继续传代第 4代，继续将第 4代菌种接种至大罐培养，大罐培养为第 5代，第 5代的大罐培养为改良半综合液体培养基；第 5代大罐培养的培养物生产疫苗原液，每 1 支工作种子用于 1批疫苗原液生产；所述第 5代大罐培养采用培养罐液体培养；

(4)收获及杀菌：于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为 1%, 杀菌 30分钟；

(5)去菌体：将已杀菌的培养液经 14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为 1500~ 1600ml/min, 收集上清液；

(6)沉淀、解离：所述步骤（5)收集的上清液，加入 10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为 0.1%,充分混匀， A群静置 3 ~ 5小时， Y群静置 5 ~8小时， C、 W135群静置 8~12小时；以 14000rpm 管式连续流离心机离心，离心流速为 2000 ~ 2500ml/min , 离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用 lmol/LCaC12研磨均匀，得到混匀的多糖复合物；将所述混勾的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌 1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离；

( 7 )去核酸：在多糖复合物中加入 2 ~ 8°C冷却过的 95%的乙醇至终浓度按体积分数计为 25%, 摇匀， 2~8°C存放， A群多糖静置存放 1~3 小时， C群和 W135群静置存放 16~20小时， Y群多糖静置存放 10 ~ 14小时； 4000rpm离心 30分钟，去沉淀，收集上清液；

( 8 )沉淀收集多糖：于上述上清液中加入 2 ~ 8°C冷却过 95%乙醇至最终浓度为： A群按体积分数计为 80%; C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%, 充分振摇，待沉淀出现后静置 1 ~2小时； 4000rpm离心 5 分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在 -20°C或以下，待纯化；

( 9 )超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素：将所述步骤（ 8 )得到的多糖粗制品溶解于 1 / 10饱和中性乙酸钠溶液中， A群使其浓度达 15 ~ 20mg /ml, C群、 Y群和 W135群使其浓度达 10~15mg/ml; 用截留分子量为 6000道尔顿的超滤膜进行超滤，使杂蛋白和内毒素被截留在超滤膜上从而被去除掉，收集超滤液为收获液；

( 10)沉淀精多糖：将步骤（10)收集的收获液中加入 95%的乙醇至终浓度为 A群按体积分数计为 80%, C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%; 充分摇匀，置冷库 2 ~ 8°C 1小时， 4000rpm l0分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在 -20°C或以下；提取过程在 15 °C以下进行。用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后 0.2μιη滤膜完整性试验合格，原液取样后进行检定；

( 11 )半成品配制：合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含 Α群、 C群、 Y群、 W135群多糖分别为 100.0 g/ml, 乳糖为 20mg/ml; 稀释后立即经 0.2μιη过滤，过滤抽样送检，于 2 ~ 8°C保存；

( 12 )分装、冻干，制备疫苗成品：上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为 0.5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后 6小时内冻干；冻干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送 2 ~ 8°C冷库保存。

进一步的，所述步骤（4 ) 菌体培养达到对数生长期的后期或静止期的前期的判断方法为，细菌浓度不再增加，达到 160亿 /ml或 pH开始回升至 7.0 ~ 7.5。

进一步的，所述步骤（3 ) 大罐培养的培养条件：培养基量为 300 ~ 600L, 通气量为 10 ~ 30m3/h, 搅拌速度为 200 ~ 350rpm, 用 20%NaOH 溶液维持 pH在 6.70 ~ 7.40;在培养过程中，进行菌液浓度测定和革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌， 121 °C , 30min灭菌处理后废弃。

进一步的，所述 10%羊血琼脂培养基的配方为：以 100ml计，含有羊血 10ml; 琼脂培养基 100 ml。

进一步的，所述改良半综合固体培养基的配方为：以 1000ml计，含有

50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为 1300mg; 2%盐酸酪素水解液按总氮计算为 1300mg; 酵母透析液 50ml; 淀粉 5g; 磷酸二氢钾 lg; 硫酸镁 0.6g; 葡萄糖 2g; 琼脂 26g。

进一步的，所述改良半综合液体培养基由甲液和乙液构成，以 10000ml计的配方为：所述甲液包括 50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为 13000mg; 酵母透析液 100ml; 氯化钾 10g; L-谷氨酸钠 10g; 氯化铵 12.5g; 十二水合磷酸氢二钠 7.5g; 磷酸二氢钠 2.5g; 10%胱氨酸溶液 3ml; 所述乙液包括硫酸镁 6g和葡萄糖 55g。

综上所述，本发明与现有技术相比，其优点在于：本发明采用了超滤膜过程实现了一步法同时去除杂蛋白和内毒素的目的；不仅确保了本发明制备得到的 ACYW135四价脑膜炎球菌多糖疫苗的纯度和免疫活性符合标准，减少了制备工艺的经济成本。具体实施方式

本发明公开了一种四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例 1 ACYW135四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备

四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，包括如下步骤：

( 2 )种子批的建立及传代：生产用菌种应建立种子批系统。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。将 1支原始种子冻干菌种开启后，接种在 10%羊血琼脂培养基上，放于 35 ~ 37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境培养 16 ~ 20小时，在 35 ~ 37°C条件下传第二代，将第二代培养物采入无菌脱脂牛奶中混匀冻干制备主代种子批。再将 1支主种子批菌种开启后，采用上述相同条件培养传至第二代，扩增后冻干为工作种子批。主种子批和工作种子批菌种冻干后均必须进行生物学特性检定，主种子批和工作种子批菌种的各种生物学特性应与原始种子批菌种一致。主种子批菌种用于生产工作种子批，工作种子批用于生产疫苗。主种子批由原始种子批开启后传 2代制备，主种子批开启后传 2代制备工作种子批；工作种子批开启后传 4代制备生产用种子。工作种子批开启后至接种发酵罐培养传代次数不得超过 5代。

( 3 )生产疫苗原液：开启工作种子批菌种 1支，接种于 10%羊血琼脂培养基 2支，放 35 ~ 37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境培养 16 ~ 20小时，涂片镜检合格，将第 1代菌种接种于改良半综合固体培养基 4 ~ 6瓶，继续传代第 2代，于 35 ~ 37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境培养 10 ~ 18小时，涂片镜检合格后将第 2代菌种接种于改良半综合固体培养基 20 ~ 25瓶，继续传代第 3代，于 35 ~ 37°C培养 10 ~ 18小时，涂片镜检合格后将第 3 代菌种接种于改良半综合液体培养基 30 ~ 40 L, 继续传代第 4代，继续将第 4代，于 35 ~ 37°C深层通气搅拌培养 3 ~ 8小时，涂片镜检及细菌浓度测定合格后将将第 4代菌种作为生产用种子接种至大罐培养。所述大罐培养的培养条件为：采用培养罐液体培养，培养基为改良半综合液体培养基，培养基量为 300 ~ 600L。于大罐培养基中接种第 4代生产用种子后，深层通气搅拌培养。通气量为 10 ~ 30m3/h, 搅拌速度为 200 ~ 350rpm。用 20%NaOH溶液维持 pH在 6.70 ~ 7.40范围。在培养过程中，进行菌液浓度测定和革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应 121 °C 30min灭菌处理后废弃。大罐培养的培养物生产疫苗原液，每 1支工作种子用于 1批疫苗原液生产。

( 4 )收获及杀菌：于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为 1%, 杀菌 30分钟；于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养， A群、 C群及 W135群培养一般为 6.5 士 1 小时， Y群培养一般为 11 ± 3小时，当细菌浓度不再增加，达到 160亿 /ml 或 pH开始回升至 7.0 ~ 7.5时即可终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度 1% (V/V), 杀菌 30分钟。

(5)去菌体：将已杀菌的培养液经 14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为 1500~ 1600ml/min, 收集上清液。

(6)沉淀、解离：所述步骤（5) 收集的上清液，加入 10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为 0.1%,充分混匀， A群静置 3 ~ 5小时， Y群静置 5 ~8小时， C、 W135群静置 8~12小时；以 14000rpm 管式连续流离心机离心，离心流速为 2000 ~ 2500ml/min , 离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用 lmol/LCaC12研磨均匀，得到混匀的多糖复合物；将所述混勾的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌 1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离。

( 8 )沉淀收集多糖：于上述上清液中加入 2 ~ 8°C冷却过 95%乙醇至最终浓度为： A群按体积分数计为 80%; C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%, 充分振摇，待沉淀出现后静置 1 ~2小时； 4000rpm离心 5 分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在 -20°C或以下，待纯化。

( 9 )超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素：将所述步骤（ 8 )得到的多糖粗制品溶解于 1 / 10饱和中性乙酸钠溶液中， A群使其浓度达 15 ~ 20mg /ml, C群、 Y群和 W135群使其浓度达 10~15mg/ml; 用截留分子量为 6000道尔顿的超滤膜进行超滤，使杂蛋白和内毒素被截留在超滤膜上从而被去除掉，收集超滤液为收获液。

所述超滤运行压力为 200kPa, 超滤膜过程实现了一步法去除杂蛋白和内毒素的效果，因此工艺步骤较少，并且减少了对抗原的破坏。经超滤膜过程处理后 A、 C群多糖中杂蛋白含量分别 <10mg/g, Y群多糖中杂蛋白含量<35.61^ ， W135群多糖中杂蛋白含量 <35.2mg/g, A、 C、 Y及 W135群多糖内毒素含量分别 <12EU/ g, 抗原回收率： A群多糖 >65.2%, C群多糖 > 75.5%, Y及 Wl 35群多糖分别〉 80%。

(10)沉淀精多糖：将步骤（10)收集的收获液中加入 95%的乙醇至终浓度为 A群按体积分数计为 80%, C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%; 充分摇匀，置冷库 2~8°C1小时， 4000rpm, 10分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在 -20°C或以下；提取过程在 15°C以下进行。用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后 0.2μιη滤膜完整性试验合格，原液取样后进行检定；

(11)半成品配制：合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含 Α群、 C群、 Y群、 W135群多糖分别为 100.0 μ g/ml, 乳糖为 20mg/ml; 稀释后立即经 0.2μιη过滤，过滤抽样送检，于 2~8°C保存；

(12)分装、冻干，制备疫苗成品：上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为 0.5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后 6小时内冻干；冻干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送 2~8°C冷库保存。所述透视检查采用目测法逐瓶透检，剔除脱盖、装量、空瓶、破瓶、异物、萎缩等外观不合格产品。透视检查环境温度不得高于 30°C, 检查完成及时进行贴签。采用贴标机进行贴签，每瓶疫苗贴上 (ACYW135)四价脑膜炎球菌多糖疫苗标签 1张，完成贴签的制品及时送 2 ~ 8°C冷库保存待包装。整个透视检查及贴签过程环境温度不得高于 30°C。

本发明疫苗制备工艺的原液生产收率：开启 1支工作种子按每 100L 大罐培养量计可制造出粗制多糖： A群 16~51g 、（群9~29 、丫群2~ 6g 、 W135群 3~9g。

本发明疫苗制备工艺每批精多糖的收率 = (收得精多糖量） / (精制前投入的粗多糖量） X 100% , 从粗多糖至精多糖的提取纯化过程的收率各群分别为： A群 35 ~ 59%、 C群 41~57% 、 Y群 35~79% 、 W135 群 29 ~ 77%。实施例 2 生产用培养基

上述制备工艺过程使用的培养基如下：

生产用种子的制备第 1代为 10%羊血琼脂培养基，第 2代至第 3代为改良半综合固体培养基,第 4代的生产用种子菌种制备以及第 5代的大罐培养为改良半综合液体培养基。生产用的改良半综合液体培养基不含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分，不含有对人体有害或其他过敏原物质。

a 10%羊血琼脂培养基

b 改良半综合固体培养基的配方（以 1000ml为例计)见下表:

c 流脑半综合液体培养基的配方（以 10000ml为例计)见下表:

实施例 3种子批的检定

本发明工艺的主种子批和工作种子批菌种冻干后均必须进行生物学特性检定，主种子批和工作种子批菌种的各种生物学特性应与原始种子批菌种一致。所述生物学特性检定内容和相应方法如下：

a 形态及培养特性：菌种接种在含 10%羊血琼脂培养基上，脑膜炎球菌在 25°C不生长。于 35~37°C、 5 ~ 10%二氧化碳环境下培养 16 ~ 20 小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在 0.85%氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。染色镜检为革兰氏阴性双球菌、单球菌。

b 生化特性：接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、果糖及糖生化反应管，在 35~37°C条件下培养 5~7日， A、 C、 Y、 W135群菌种发酵葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇、果糖及蔗糖。

c 血清学试验：将在 35~37°C培养 16~20小时的菌苔，混悬于 0.85%氯化钠溶液 (含有 0.5%甲醛)中，或 56°C加热 30分钟杀菌以后，使每 1 ml含菌 1.0 109 ~ 2.0 109,与同群血清做定量凝集反应，放置 35 ~

37°C过夜，次日再放置室温 2小时观察结果，以肉眼可见清晰凝集现象 ( + )之血清最高稀释度为凝集效价，所述凝集效价必须达到原血清效价之半方可。实施例 4 疫苗成品的检定

(1) 鉴别试验:采用免疫琼脂双扩散法，本发明制备得到的疫苗成品分别与、 C、 Y、 W135群脑膜炎球菌抗体形成明显的沉淀线。

(2) 物理外观：为白色疏松体，加入下述 PBS后迅速溶解，溶解后应为澄明液体，无异物。所述 PBS配方见下表:

(3)化学检定：

a 水分：不高于 3.0%。

b 多糖含量测定：采用定量免疫化学方法测定，每 1人用剂量

(0.5ml)含 A群多糖 35 ~ 66 g, C群多糖为 35 ~ 65 μ g, Y群多糖为 35~65 g, W135群多糖为 35~65 g。

c 分子大小测定

每 5批疫苗至少抽 1批检查多糖分子大小。 A、 C、 Y及 W135群多糖 Kd值分别 < 0.4。 Kd值小于 0.5的洗脱液多糖回收率： A群多糖 > 65.2%, C群多糖 > 75.5%, Y及 W135群多糖分别〉 80%。

d无菌检查

采用直接接种法观察试验菌的生长情况。

e异常毒性检查豚鼠注射剂量为 5ml (10个人用剂量)，小鼠注射剂量为 0.5 ml ( 1个人用剂量），符合规定。

实验 1

因此，本发明制备的疫苗合格实验 2

实验 1和实验 2的结果显示，观察期到后动物均健康存活且体重增加因此判断本发明制备的疫苗是安全的。

f 热原检查

注射剂量按家兔体重每 IKg注射 0.1 μ g多糖，符合规定。实验 3

因此，本发明制备的疫苗合格。

如上所述，便可较好地实现本发明本发明提出的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺已通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的精神、范围和内容中。

Claims

1、四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

( 4 )收获及杀菌：于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为 1% , 杀菌 30分钟；

( 5 )去菌体：将已杀菌的培养液经 14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为 1500 ~ 1600ml/min, 收集上清液；

( 6 )沉淀、解离：所述步骤（5 )收集的上清液，加入 10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为 0.1%,充分混匀， A群静置 3 ~ 5小时， Y群静置 5 ~8小时， C、 W135群静置 8~12小时；以 14000rpm 管式连续流离心机离心，离心流速为 2000 ~ 2500ml/min , 离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用 lmol/LCaCl₂研磨均匀，得到混匀的多糖复合物；将所述混勾的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌 1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离；

(8)沉淀收集多糖：于上述上清液中加入 2 ~8°C冷却过 95%乙醇至最终浓度为： A群按体积分数计为 80%; C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%, 充分振摇，待沉淀出现后静置 1 ~2小时； 4000rpm离心 5 分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在 -20°C或以下，待纯化；

(10)沉淀精多糖：将步骤（10)收集的收获液中加入 95%的乙醇至终浓度为 A群按体积分数计为 80%, C群、 Y群及 W135群按体积分数计为 75%; 充分摇匀，置冷库 2~8°C1小时， 4000rpml0分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤 2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在 -20°C或以下；提取过程在 15°C以下进行；用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后 0.2μιη滤膜完整性试验合格，原液取样后进行检定；

(11)半成品配制：合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含 Α群、 C群、 Y群、 W135群多糖分别为 100.0 g/ml, 乳糖为 20mg/ml; 稀释后立即经 0.2μιη过滤，过滤抽样送检，于 2 ~ 8°C保存；

2. 根据权利要求 1所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，所述步骤（4 ) 菌体培养达到对数生长期的后期或静止期的前期的判断方法为，细菌浓度不再增加，达到 160亿 /ml或 pH开始回升至 7.0 ~ 7.5。

3. 根据权利要求 2任一项所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，

所述步骤（3 ) 大罐培养的培养条件：培养基量为 300 ~ 600L, 通气量为 10 ~ 30m³/h, 搅拌速度为 200 ~ 350rpm, 用 20%NaOH溶液维持 pH 在 6.70 ~ 7.40;在培养过程中，进行菌液浓度测定和革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌， 121 °C , 30min灭菌处理后废弃。

4. 根据权利要求 3所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，所述 10%羊血琼脂培养基的配方为：以 100ml计，含有羊血 10ml; 琼脂培养基 100 ml。

5. 根据权利要求 1-4任一项所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，

所述改良半综合固体培养基的配方为：以 1000ml计，含有

50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为 1300mg;

2%盐酸酪素水解液按总氮计算为 1300mg;

酵母透析液 50ml;

淀粉 5g;

磷酸二氢钾 lg;

硫酸镁 0.6g; 葡萄糖 2g;

琼脂 26g。

6. 根据权利要求 1-5任一项所述的四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，所述改良半综合液体培养基由甲液和乙液构成，以 10000ml计的配方为：

所述甲液包括

50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为 13000mg; 酵母透析液 100ml;

氯化钾 10g;

L-谷氨酸钠 10g;

氯化铵 12.5g;

十二水合騎酸氢二钠 7.5g;

磷酸二氢钠 2.5g;

10%胱氨酸溶液 3ml;

所述乙液包括疏酸镁 6g和葡萄糖 55g。