CN102583460A - 一种铝佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种铝佐剂的制备方法，该方法包括将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触，其特征在于，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液的接触的整个过程的pH值恒定。本发明还提供一种由所述制备方法得到的铝佐剂以及该铝佐剂在疫苗上的应用。该方法是一种使所得产品结构均一、性质稳定，质量可靠的铝佐剂的制备方法。使用该方法制备的铝佐剂能够吸附更多的疫苗。

Description

一种铝佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种铝佐剂的制备方法，该铝佐剂以及该铝佐剂在疫苗上的应用。

背景技术

铝佐剂是一类含Al³⁺的无机盐，其中最常用的，且效果较好的是氢氧化铝和磷酸铝佐剂。铝盐佐剂是最早被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于人用疫苗的佐剂，其制备成本低、使用方便，是疫苗生产中应用最多的一类佐剂。铝佐剂的作用机理：与抗原形成复合物，注射后在组织中形成抗原贮藏库，使抗原缓慢释放，长时间刺激免疫细胞，增强机体的免疫反应。铝佐剂是目前最重要的疫苗佐剂，自1926年Glenny首先应用铝盐吸附白喉类毒素至今已广泛应用于人兽疫苗，包括减毒疫苗，灭活疫苗，重组蛋白疫苗等。传统的铝盐佐剂在应用中也存在一些问题，其不能诱导细胞免疫，注射部位偶有严重的局部反应，出现红斑，皮下结节，接触性过敏和肉芽肿性炎症。

氢氧化铝佐剂呈晶体状，分子式为AlO(OH)，等电点为10-11，在生理条件下带正电荷。磷酸铝佐剂也叫无定形磷酸氢氧化铝，分子式Al(OH)_x(PO4)_y，磷酸根和羟基比例不固定，依赖于磷酸铝佐剂的制备工艺。磷酸铝的等电点一般为5.0左右，在生理条件下带负电荷。铝佐剂吸附疫苗的机理复杂，包括电荷作用，基团交换，氢键作用，范德华力和疏水作用等，其中正负电荷相互作用和基团交换作用(磷酸基团和羟基)占疫苗吸附的主导作用。

现有技术中，铝佐剂的制备方法多为将铝盐溶液或碱溶液中的一种加入到另一种中，由该方法生成的产物结构不均一，其辅佐性能也不是很稳定。因此，迫切需要一种能是产品结构均一、辅佐性能稳定的制备铝佐剂的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种铝佐剂的制备方法，该方法是一种使所得产品结构均一、辅佐性能稳定，质量可靠的铝佐剂的制备方法。使用该方法制备的铝佐剂能够吸附更多的疫苗。

本发明的发明人发现，分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中进行接触，并控制铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的整个过程的pH值恒定，从而能够稳定控制产品的结构、理化性质，使其辅佐效应更加显著。

为了实现上述目的，本发明提供一种铝佐剂的制备方法，该方法包括将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触，其特征在于，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的整个过程的pH值恒定。

本发明还提供一种由上述制备方法得到的铝佐剂以及该铝佐剂在疫苗上的应用。

本发明制备的氢氧化铝和磷酸铝佐剂与疫苗的复合物可在第一次接种后能够快速产生免疫应答，产生的抗体滴度较高，可有效地达到预防接种的目的，且疫苗复合物未导致注射部位产生炎症。

附图说明

图1为实施例1中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图2为实施例1中制备的氢氧化铝佐剂的X-射线衍射扫描结果。

图3为实施例2中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图4为实施例3中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图5为实施例4中制备的磷酸铝佐剂的透射电镜图。

图6为实施例4中制备的磷酸铝佐剂的X-射线衍射扫描结果。

图7为实施例4中制备的磷酸铝佐剂的核磁共振图。

图8为实施例5中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图9为实施例6中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图10为对比例1中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

图11为对比例2中制备的氢氧化铝佐剂的透射电镜图。

具体实施方式

本发明提供一种铝佐剂的制备方法，该方法包括将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触，其特征在于，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的整个过程的pH值恒定。

在本发明中，所述恒定的pH值是一个相对的概念，即在实际的操作过程中上述pH值可以在很小的范围内变动，例如在±0.1范围内变动。

在本发明中，对所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的方式没有特别的限定，只要满足使所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的整个过程的pH值恒定即可。例如可以分别将两种溶液以一定的速度滴入到同一反应器中进行接触；也可以分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中进行接触，铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液的通入条件使得整个接触过程的pH值恒定。所述通入的条件包括铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液的的浓度、反应器的大小、接触的时间以及通入的速度。将上述两种溶液通入反应器以及控制通入的速度的方法可以采用蠕动泵来进行。由于分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中进行接触的方式，在操作上简单、效率高，因此被本发明所优选。另外，在上述情况下，本发明无需通过额外加入pH值调节剂来调节pH值。

在本发明中，由于所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触即可产生铝佐剂沉淀，因此，对所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液的用量没有特别要求，只要所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触后，产生铝佐剂沉淀即可，为了充分利用原料，优选情况下，分别以Al³⁺和OH^-计，铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液的用量的摩尔比为1∶2.5-3.5，优选为1∶3。

所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液的浓度可以是任意的，只要满足上述用量要求即可，为了充分利用原料便于操作，优选情况下，所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液中的浓度可以为0.005-1.0mol/L，所述NaOH和/或氨在水溶液中的浓度可以为0.1-10mol/L；更优选地，所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液的浓度为0.02-0.1mol/L，所述NaOH和/或氨在水溶液中的浓度可以为0.2-2mol/L；进一步优选地，所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液中的浓度为0.05mol/L，所述NaOH和/或氨在水溶液中的浓度可以为0.5mol/L。本发明中，所述氨在水溶液的浓度是以该氨水溶液中OH^-计的浓度。

另外，在这里需要指出的是：在本发明中所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液中的浓度并不是铝盐和磷酸盐相加的浓度，而是是指水溶液中所述铝盐和磷酸盐分别的浓度，例如所述铝盐和磷酸盐的水溶液的浓度为1.0mol/L是指水溶液的铝盐和磷酸盐的浓度均为1.0mol/L。

上述通入反应器中水溶液的流速可以是任意的，只要能够使得铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液充分接触并使得整个接触过程的pH值恒定即可。具体地，可以根据反应器的大小来选择。一般在反应器为1-10L的情况下，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液的的流速可以为10-300ml/min，所述NaOH和/或氨水溶液的流速可以为1-100ml/min；优选地，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液的的流速为20-100ml/min，所述NaOH和/或氨水溶液的流速可以为5-30ml/min；更优选地，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液的的流速50ml/min，所述NaOH和/或氨水溶液的流速可以为15ml/min。当反应器的体积更大时，其在满足能够使得铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液充分接触并使得整个接触过程的pH值恒定的情况下，可以相应选择更大的通入速度来进行。

上述pH值的选择可以在很大范围内来选择。也就是说，在本发明中，反应的pH值的选值可以在很大范围内来选择，但需要注意的是一旦选定反应的pH值后，则通过以一定浓度、一定流速的方式分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中来控制pH值，使其恒定在该pH值。

并且上述pH值的选择范围可以根据所需制备的铝佐剂的具体类型来判断。例如：制备氢氧化铝佐剂的pH值的范围可以为4.5-12，优选为8-11，进一步优选为10；制备磷酸铝佐剂pH值的范围可以为2.5-9.0，优选为5-8，进一步优选为7.5。

上述pH值的检测方法可以采用本领域所公知的各种方法来进行。例如：pH试纸测试法和pH计测试法。由于pH计测试法具有灵敏度高的优点，因此被本发明所优选。

在本发明中，所述分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中进行接触在搅拌下进行。接触的温度和时间可以为本领域所公知的各种温度和时间。一般情况下，所述接触的温度可以为0-50℃；优选所述接触的温度为15-30℃。特别是对所述接触的时间没有特别的限制，只要不小于1s即可，具体可以为5s-2h；优选地，所述接触的时间为5s-20min。

在本发明中，所述铝盐和/或磷酸盐可以为本领域所公知的各种溶于水的铝盐和/或磷酸盐。优选为在水中溶解度大的铝盐和/或磷酸盐。所述铝盐和/或磷酸盐的选择可以根据具体所要制备的铝佐剂来选择。例如：制备氢氧化铝佐剂时采用铝盐的水溶液与NaOH和/或氨水溶液接触来制备；制备磷酸铝佐剂时采用铝盐和磷酸盐的混合水溶液与NaOH和/或氨水溶液接触来制备。

更优选地，上述铝盐为铝的氯化物和/或铝的硫酸盐中的一种或多种，例如：氯化铝、硫酸铝和硫酸铝钾中的一种或多种，进一步优选为铝的氯化物，例如：氯化铝。

更优选地，上述磷酸盐为钠和/钾的磷酸盐中的一种或多种，例如：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种；进一步优选为钠的磷酸盐，最优选为磷酸二氢钠。

上述反应器可以为本领域所公知的各种反应器。例如玻璃仪器，反应釜等。

在本发明中，该方法还可以包括在接触的初期，将得到的混悬液的一部分丢弃。这是由于反应器的容积相对于初期的反应液体的体积过大，从而使两种溶液的接触不充分，例如无法充分搅拌混合导致的接触不充分，接触不充分可能导致pH值的变化，从而使产品的结构均一性、性质稳定性、质量降低。因此，优选将接触初期的反应pH值不充分稳定的反应液丢弃。被丢弃反应液的体积最好能够根据监测的pH值来判断，也可以根据反应器的容积来判断。为了简便步骤，本发明优选为根据反应器的容积来判断。一般情况下，被丢弃反应液的体积至少为反应器体积的50％，优选为反应器体积的50-100％。

根据本发明的方法，该方法还包括将接触后的溶液固液分离，去上清液体，将沉淀分散于水或0.5-1.5wt％的氯化钠水溶液中，得到铝佐剂。

上述固液分离可以为本领域所公知的各种方法，例如：静止、离心、过滤等。本发明优选为静止或离心。

本发明还提供一种由上述制备方法得到的铝佐剂以及该铝佐剂在疫苗上的应用。

本发明制备的铝佐剂适用于各种疫苗，这里指的疫苗包括以病毒或类病毒的蛋白、DNA、RNA成分或全病毒为抗原的减毒或灭活疫苗，重组蛋白质，DNA，RNA疫苗等，如乙肝疫苗，丙肝疫苗，戊肝疫苗，狂犬疫苗，百日咳疫苗，甲肝疫苗，禽流感疫苗，SARS疫苗，人流感疫苗，人乳头瘤病毒疫苗，人腮腺炎疫苗，卡介苗，麻疹疫苗，脊椎灰质炎疫苗，A群流脑疫苗，伤寒疫苗，流脑疫苗，霍乱疫苗，艾滋病疫苗等。

采用本发明的铝佐剂吸附流感疫苗，制备得到新型的流感疫苗。与传统的铝佐剂相比，本发明制备的氢氧化铝佐剂可显著提高体内的抗体滴度，还可快速激活机体的免疫应答，对机体起到了明显的预防和保护作用；且注射部位无明显的炎性反应，生物安全性较高。

以下通过实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不仅仅限制于下述实施例。

以下实施例中的透射电镜(购自FEI公司，Tecnai G² 20S-TWIN型号)、纳米粒度及Zeta电位分析仪(购自Malvern公司，Zetasizer Nano ZS型号)、电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES，购自Perkin Elmer公司，PerkinElmer Optima 5300DV型号)、X射线粉末衍射仪(购自Bruker公司，D8Focus型号)、固体核磁共振波谱仪(购自Bruker公司，AvanceIII型号)。

以下实施例中，采用透射电镜测定样品的粒子形态；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的粒度和表面电荷，并测定样品在不同pH值的表面电位，并以pH值为横坐标，表面电荷为纵坐标，绘制曲线，曲线与横坐标相交点即为样品的等电点；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、O、Na的浓度，得到氢氧化铝佐剂的OH/Al摩尔比；采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定铝佐剂中Al、P、Na的浓度，得到磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比；采用X-射线衍射扫描，测定氢氧化铝佐剂的晶体类型(晶体或无定形)；采用²⁷Al NMR测定样品中的八面体(octahedron)与四面体(tetrahedron)的比例。

实施例1

称取一定量的AlCl₃·6H₂O，溶于蒸馏水中，配制成铝离子的浓度为0.05mol/L的水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，得0.5mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O溶液和NaOH溶液泵入2L的反应器的底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O的流速为50ml/min，NaOH溶液流速为15ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在10±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，弃去初始的2L混悬液后，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清液，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得到氢氧化铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其结果见图1，从图1中可以看出，氢氧化铝佐剂纤维结构大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷，氢氧化铝佐剂在在水中的表面电荷为45.6mV；在氯化钠溶液中的表面电荷为33.0mV，另外，测定样品在不同pH值的表面电位，并以pH值为横坐标，表面电荷为纵坐标，绘制曲线，根据曲线与横坐标相交点得知氢氧化铝佐剂的等电点为9.5；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、O、Na的浓度，得到氢氧化铝佐剂的OH/Al摩尔比为3.0；采用X-射线衍射扫描，测定氢氧化铝佐剂的晶体类型(晶体或无定形)，其结果见图2，图2表明氢氧化铝佐剂为晶体结构。

实施例2

称取一定量的硫酸铝，溶于蒸馏水中，配制成铝离子的浓度为0.025mol/L的水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，得0.21mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O溶液和NaOH溶液泵入2L的反应器底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O的流速为100ml/min，NaOH溶液流速为30ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在9.5±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，弃去初始的1L混悬液后，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得氢氧化铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图3，从图3中可以看出，氢氧化铝佐剂纤维结构大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷。氢氧化铝佐剂在水中的表面电荷为43.1mV，在氯化钠溶液中的表面电荷为30mV；另外，测得氢氧化铝佐剂的等电点为9.3；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、O、Na的浓度，得到氢氧化铝佐剂的OH/Al摩尔比为2.9；采用X-射线衍射扫描，测定氢氧化铝佐剂的晶体类型为晶体结构。

实施例3

称取一定量的AlCl₃·6H₂O，溶于蒸馏水中，配制成铝离子的浓度为0.1mol/L的水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，得1.1mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O溶液和NaOH溶液泵入2L的反应器底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O的流速为25ml/min，NaOH溶液流速为7.5ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在10.5±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，弃去初始的2L混悬液后，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得氢氧化铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果参见图4，从图中可以看出，氢氧化铝佐剂纤维结构大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷，氢氧化铝佐剂在水中的表面电荷为51.4mV，在氯化钠溶液中的表面电荷为36.5mV；另外，测得氢氧化铝佐剂的等电点为9.4；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、O、Na的浓度，得到氢氧化铝佐剂的OH/Al摩尔比为3.1；采用X-射线衍射扫描，测定氢氧化铝佐剂的晶体类型为晶体结构。

实施例4

称取一定量的AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠，溶于蒸馏水中，配制成铝离子和磷酸根离子的浓度均为0.06mol/L的混合水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，配制成0.6mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合液与NaOH溶液泵入2L的反应器底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合水溶液的流速为60ml/min，NaOH水溶液流速为18ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在7.5±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，弃去初始的2L混悬液后，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得磷酸铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图5，从图5中可以看出，磷酸铝佐剂粒子大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测得磷酸铝佐剂在水中的粒径为387.5nm，表面电荷为-47.1mV，在氯化钠溶液中的粒径为3061.5nm，表面电荷为-18.1mV；另外，测定样品在不同pH值的表面电位，并以pH值为横坐标，表面电荷为纵坐标，绘制曲线，根据曲线与横坐标相交点得知磷酸铝佐剂的等电点为4.7；采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定铝佐剂中Al、P、Na的浓度，得到磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比为0.75；采用X-射线衍射测定样品的晶体类型(晶体或无定形)，其结果见图6，图6表明磷酸铝佐剂为无定形结构；采用²⁷Al NMR测定样品中的八面体(octahedron)与四面体(tetrahedron)的比例，图7为磷酸铝佐剂的核磁共振图，图中44ppm处为四面体结构，-7ppm处为八面体结构，其中八面体要远大于四面体，表明磷酸铝佐剂主要是由八面体构成。

实施例5

称取一定量的AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钾，溶于蒸馏水中，配制成铝离子和磷酸根离子的浓度均为0.025mol/L的混合水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，配制成0.25mol/L的氨水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合液与NaOH溶液泵入2L的反应器底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合水溶液的流速为100ml/min，NaOH水溶液流速为30ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在6.0±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，弃去初始的2L混悬液后，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得磷酸铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图8，从图8中可以看出，磷酸铝佐剂粒子大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测得磷酸铝佐剂在水中的粒径为368.5nm，表面电荷为-43.8mV，在氯化钠溶液中的粒径为4509.3nm，表面电荷为-10.2mV；另外，测定磷酸铝佐剂的等电点为4.9；采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定铝佐剂中Al、P、Na的浓度，得到磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比为0.78；采用X-射线衍射测定样品的晶体类型为无定形结构；采用²⁷Al NMR测定样品中的八面体(octahedron)与四面体(tetrahedron)的比例，其中八面体要远大于四面体，表明磷酸铝佐剂主要是由八面体构成。

实施例6

称取一定量的AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠，溶于蒸馏水中，配制成铝离子和磷酸根离子的浓度均为0.1mol/L的混合水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，配制成1mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵分别将AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合液与NaOH溶液泵入2L的反应器底部，搅拌，AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合水溶液的流速为25ml/min，NaOH水溶液流速为7.5ml/min，反应器中的反应液的pH值控制在8±0.1，反应的温度为25℃。当通入的水溶液充满反应器后开始溢流，混悬液从溢流口排出进入接收罐，收集混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于0.9wt％的氯化钠溶液中，得磷酸铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图9，从图9中可以看出，磷酸铝佐剂粒子大小均一，分散均匀；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测得磷酸铝佐剂在水中的粒径为396.6nm，表面电荷为-45.2mV，在氯化钠溶液中的粒径为4206.8nm，表面电荷为-15.7mV；另外，测定磷酸铝佐剂的等电点为5.0；采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定铝佐剂中Al、P、Na的浓度，得到磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比为0.80；采用X-射线衍射测定样品的晶体类型为无定形结构；采用²⁷Al NMR测定样品中的八面体(octahedron)与四面体(tetrahedron)的比例，其中八面体要远大于四面体，表明磷酸铝佐剂主要是由八面体构成。

对比例1

称取一定量的AlCl₃·6H₂O，溶于蒸馏水中，配制成铝离子的浓度为0.025mol/L的水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，得0.25mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵将AlCl₃·6H₂O溶液泵入NaOH溶液中，搅拌，AlCl₃·6H₂O的流速为50ml/min，反应的温度为25℃。静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得氢氧化铝佐剂。采用透射电镜和扫描电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图10，从图10中可以看出，氢氧化铝佐剂粒子大小不一，结构各异；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷，氢氧化铝佐剂在水中的表面电荷为23.8mV，在氯化钠溶液中的表面电荷为16.6mV；另外，测得氢氧化铝佐剂的等电点为8.7；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、O、Na的浓度，得到氢氧化铝佐剂的OH/Al摩尔比为2.9；采用X-射线衍射扫描，测定氢氧化铝佐剂的晶体类型为晶体结构。

对比例2

称取一定量的AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠，溶于蒸馏水中，配制成铝离子和磷酸根离子的浓度均为0.025mol/L的混合水溶液；称取一定量的NaOH，溶于蒸馏水中，配制成0.25mol/L的NaOH水溶液。采用蠕动泵将NaOH溶液泵入AlCl₃·6H₂O和磷酸二氢钠混合液中，搅拌，NaOH水溶液流速为15ml/min，反应的温度为25℃。静置5小时后，弃去上清夜，离心，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于水溶液中，得磷酸铝佐剂。采用透射电镜和扫描电镜测定样品的粒子形态，其透射电镜结果见图11，从图11中可以看出，磷酸铝佐剂粒子大小不一，结构各异；采用纳米粒度与Zeta电位分析仪测定样品的表面电荷，磷酸铝佐剂在水中的粒径为550.6nm，在水中的表面电荷为-40.5mV，在氯化钠溶液中的粒径为7568.2nm，表面电荷为-12.6mV；另外，测得磷酸铝佐剂的等电点为5.1；采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定铝佐剂中Al、P、Na的浓度，得到磷酸铝佐剂的P/Al摩尔比为0.85；采用X-射线衍射扫描，测定磷酸铝佐剂的晶体类型为无定形结构；采用²⁷Al NMR测定样品中的八面体(octahedron)与四面体(tetrahedron)的比例，其中八面体的峰面积远大于与四面体的峰面积，表明磷酸铝佐剂主要由八面体结构构成。

实验例1

将实施例1-6中制备得到的铝佐剂与对比例1-2中制备得到的铝佐剂配制成100μg/ml，将乙型肝炎表面抗原(HBsAg，购自上海领潮生物科技有限公司)配制成500μg/ml，稀释液为生理盐水。配制好的铝佐剂与HBsAg按体积比1∶1混合。4℃条件下吸附24小时，12000g离心30min。利用BCA法测定上清液中HBsAg的浓度，计算出被吸附的HBsAg的百分比，其结果见表1。

表1

实施例编号	被吸附的HBsAg的百分比(％)
		实施例1	95
实施例2	90
		实施例3	92
实施例4	70
		实施例5	65
实施例6	59
		对比例1	38
对比例2	30

通过表1可以看出，通过实施例1-6所得到的铝佐剂对乙型肝炎表面抗原的吸附要明显优于通过对比例1-2得到的铝佐剂，特别是实施例1-3得到的氢氧化铝佐剂对乙型肝炎表面抗原的吸附百分比均达到90％以上。

实验例2

将实施例1-6所制备的铝佐剂和对比例1-2所制备的铝佐剂吸附M2e抗原配制成疫苗复合物，注射到小鼠中，每次每只小鼠注射100μl，其中含M2e抗原10μg，含铝佐剂100μg。所用小鼠为Balb/c小鼠(中国医学科学院医学实验动物研究所)，每组10只。在第0，14天注射疫苗复合物，分别在第0、14、28天取血。采用ELISA法测定血清中抗体效价，其结果见表2。

表2

从表2可以看出，通过实施例1-6所得到的铝佐剂吸附M2e抗原配制成疫苗复合物，注射到小鼠中后，在14、28天测定的血清中抗体效价要明显优于通过对比例1-2所得到的铝佐剂吸附M2e抗原配制成疫苗复合物。

Claims (12)

1.一种铝佐剂的制备方法，该方法包括将铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触，其特征在于，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触的整个过程的pH值恒定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液接触方式为分别将铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液通入反应器中进行接触，铝盐和/或磷酸盐的水溶液以及氢氧化钠和/或氨水溶液的通入条件使得整个接触过程的pH值恒定。

3.根据权利要求1和2所述的方法，其中，分别以Al³⁺和OH^-计，铝盐和/或磷酸盐的水溶液与氢氧化钠和/或氨水溶液的用量的摩尔比为1∶2.5-3.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液中的浓度为0.005-1.0mol/L，所述氢氧化钠和/或氨在水溶液中的浓度为0.01-10mol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述铝盐和/或磷酸盐在水溶液中的浓度为0.02-0.1mol/L，所述氢氧化钠和/或氨在水溶液的浓度为0.2-2mol/L。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂，所述pH值为4.5-12。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述铝佐剂为磷酸铝佐剂，所述pH值为2.5-9。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述接触的温度为0-50℃，接触的时间为5s-2h。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述铝盐为铝的氯化物和/或铝的硫酸盐中的一种或多种，所述磷酸盐为钠和/钾的磷酸盐中的一种或多种。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，该方法还包括将接触后的溶液固液分离，去上清液体，将沉淀分散于水或0.5-1.5wt％的氯化钠水溶液中，得到铝佐剂。

11.权利要求1-10任意一项所述的方法所制备的铝佐剂。

12.权利要求11所述铝佐剂在疫苗上的应用。

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