CN114377120A - 一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建及其应用。该二氧化硅疫苗系统的颗粒形貌为50‑500nm的纳米颗粒，其中，抗原成分为20‑200nm的病毒样颗粒，佐剂成分为纳米二氧化硅，二氧化硅成分包裹在病毒样颗粒表面，且硅元素与抗原的质量比为50‑0.5：1。这种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建包括如下步骤：①在含有病毒样颗粒的水溶液中加入适量的3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌；②在步骤①的分散体系中加入适量的四乙氧基硅烷，搅拌；③离心步骤②的产物，除去上清液，用超纯水离心洗涤后保存。通过该疫苗系统构建的疫苗能引发宿主产生更强力平衡的体液和细胞免疫水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建及其应用，具体而言是以抗原病毒样颗粒为模板合成二氧化硅纳米颗粒的方法，其可以用于病毒疫苗的开发，用于各种传染病的预防和治疗。
背景技术
自2019年起，新型冠状病毒引起了全球性的肺炎大流行。至2021年12月6日，全球已向世卫组织报告将近2.7亿例COVID-19确诊病例，包括超过525万例死亡。预防性新冠疫苗的注射为人类抵抗新冠疾病的最高效便捷的手段之一。至今有将近40亿剂的新冠疫苗被注射，这极大的保障了全球人类的生命财产安全。
作为预防传染性疾病最重要的武器，疫苗的发展经历了几个阶段。1798年英国医生琴纳研发全球最早的牛痘疫苗，开启了疫苗的应用历史。直到20世纪中后期，疫苗的发展进入了黄金时代。作为疫苗中的一种重要组成成分，佐剂在增强抗原的免疫应答方面发挥着极其重要的作用。佐剂的发展经历了由天然成分到人工合成的工程疫苗佐剂两个阶段，其中1926年铝盐的佐剂效应的发现具有划时代的意义。至今为止，美国FDA批准使用的疫苗当中，有六类佐剂，包括铝盐佐剂，MF59，AS03，AS04，CpG ODN和AS01B。其中铝盐在佐剂疫苗的使用极其重要。其被广泛应用于破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲肝、乙肝疫苗等。
然而，从疫苗佐剂的效力讲，单纯的铝盐佐剂一般只能增强体液免疫水平，而不能提高宿主的细胞免疫水平。此外，为改善抗原与佐剂的相互作用通常会在疫苗配方中加入赋性剂，而这一过程又会增加疫苗生产的复杂性。因此，设计一种生产工艺简单又能引发强大且平衡的免疫应答的疫苗在传染病预防和治疗方面具有重大意义。
发明内容
本发明构建了一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统。其能以各种病毒样颗粒为模板，通过简单有效的纳米二氧化硅合成方法，制备出一类具有高效免疫活性的病毒疫苗。其可以基于各种病毒样颗粒构建对应疫苗，以针对该种传染病进行预防和治疗。
本发明的目的在于提供了一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统，包括病毒样颗粒和二氧化硅，病毒样颗粒为抗原，纳米二氧化硅为佐剂成分，二氧化硅包裹在病毒样颗粒的表面形成纳米颗粒。
进一步地，疫苗为纳米颗粒，纳米颗粒的形貌优选为50-800nm的纳米颗粒。
进一步地，所述抗原种类包括但不限于乙肝表面抗原病毒样颗粒、乙肝核心抗原病毒样颗粒、人乳头瘤病毒样颗粒和新型冠状病毒样颗粒等普通型病毒样颗粒和以乙肝核心抗原病毒样颗粒为载体嵌合新型冠状病毒受体结合域蛋白和以乙肝表面抗原病毒样颗粒为载体嵌合流感病毒抗原的嵌合型病毒样颗粒等，其尺寸优选为20-200nm。
本发明的另一目的还提供一种以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗递送系统可以在各种预防性和治疗性疫苗的中的应用，基于以上各种病毒样颗粒等构建相应的乙肝疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、新型冠状病毒疫苗、流感病毒疫苗等疫苗。
进一步地，疫苗中硅元素与病毒样颗粒的质量比为50-0.5：1，优选为20-1：1。
本发明另一目的为提供一种上述以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建方法，该方法包括如下步骤：
①在含有某种病毒样颗粒的水溶液中加入适量的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌；
②在步骤①的分散体系中加入适量的四乙氧基硅烷，搅拌；
③离心步骤②的产物，除去上清液，用超纯水离心洗涤后保存。
进一步地，所述步骤①中的病毒样颗粒在反应体系中的浓度为0.01-10mg/mL，优选为0.2-10mg/mL；3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.02-20mM，优选为0.1-20mM；所述步骤②中的四乙氧基硅烷在反应体系中的浓度为0.5-500mM，优选为0.2-50mM。
进一步地，步骤③中合成的疫苗的保存浓度优选为：病毒样颗粒是5-100μg/mL，二氧化硅是20-1000μg/mL。
进一步地，所述步骤①的搅拌速度为300-1500rpm，优选为600-1200rpm；搅拌时间为10s-30min，优选为30s-20min；所述步骤②的搅拌速度为300-1500rpm，优选为600-1200rpm，搅拌时间为30min-30h，优选为2h-24h；所述步骤①和②的反应温度为4-50℃，优选为4-30℃。
本发明有益效果为：
本发明中的以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗经小鼠体内实验验证可以同时诱导高效的体液免疫和细胞免疫。
本发明所述的可以同时诱导高效的体液免疫和细胞免疫的二氧化硅疫苗平台的制备方法简单，易操作，重复性好，反应条件温和，最终得到分散均匀、粒径均一、稳定性良好的疫苗纳米颗粒，在传染病病毒预防和治疗上具有良好的应用前景。
附图说明
本发明附图5幅，
图1为以病毒样颗粒(VLP)为模板合成的二氧化硅颗粒疫苗(VLP@Silica)的合成机理示意图。
图2为乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg VLP)和HBsAg VLP@Silica颗粒的透射电镜图；其中：左侧标尺为100nm，右侧标尺为150nm。
图3为HBsAg VLP@Silica颗粒的暗场扫描透射电镜图(A)和能量色散X射线元素分布图(B-D)；其中：标尺为200nm，图B和图C分别为Si和O元素的分布图，图D为Si和O元素分布的合并图。
图4为HBsAg VLP和HBsAg VLP@Silica的红外光谱图。
图5为以6-8周C57BL/6小鼠为模型检测HBsAg VLP@Silica疫苗诱导的乙肝抗体水平；其中：A为乙肝抗原免疫策略，具体为第0天肌内注射含2μg乙肝表面抗原的HBsAg VLP@Silica，第14天再次注射等量HBsAg VLP@Silica，第28天取血清和脾脏检测体液免疫和细胞免疫水平。图B-D分别为血清中特异性抗体水平，分别为总IgG，IgG1和IgG2c水平，图E为IgG2c/IgG1的比值。其中，Saline为生理盐水，HBsAg VLP为单纯的乙肝表面抗原，HBsAg VLP+Alum为HBsAg VLP与商业化的羟基氧化铝佐剂的混合物。
图6为以6-8周C57BL/6小鼠为模型检测HBsAg VLP@Silica疫苗诱导的T细胞的细胞因子释放；其中：图A和图B为CD4+T细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平，图C和图D为CD8+T细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平。
图7为人乳头瘤病毒样颗粒(HPV VLP)和人乳头瘤病毒样颗粒二氧化硅疫苗(HPVVLP@Silica)的透射电镜图；其中：标尺为300nm。
图8为以6-8周C57BL/6小鼠为模型检测HPV VLP@Silica诱导的人乳头瘤病毒(HPV)抗体水平和T细胞介导的免疫应答。HPV VLP@Silica疫苗的免疫策略具体为第0和21天分别在肌内注射含2μg HPV VLP的HPV VLP@Silica，第42天取血清和脾脏检测体液免疫和细胞免疫水平。图A-C分别为血清中特异性抗体水平，分别为总IgG，IgG1和IgG2c水平，图D为IgG2c/IgG1的比值。其中，HPV VLP为单纯的人乳头瘤病毒抗原。图E和图F为经过2μg/mLHPV VLP在体外重新刺激后CD4+和CD8+T细胞的CD69表达情况。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种以乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg VLP)为模板合成的二氧化硅疫苗系统(HBsAg VLP@Silica)的构建方法(图1)，所述方法包括如下步骤：
①常温下，在含有2mg/mL HBsAg VLP的水溶液中加入50mM 3-氨丙基三乙氧基硅烷，以800rpm搅拌30min；
②在步骤①的反应体系中加入500mM的四乙氧基硅烷，以800rpm搅拌24h；
③离心步骤②的产物，除去上清液，用超纯水离心洗涤三次后在生理盐水保存，保存时病毒样颗粒浓度为40μg/mL。
实施例2
一种实施例1所制备的以乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg VLP)为模板合成的二氧化硅疫苗(HBsAg VLP@Silica)以及乙肝表面抗原病毒样颗粒(HBsAg VLP)物化特性的检测：
通过透射电镜(TEM)检测实施例1中的产物的形貌(如图2所示)，HBsAg VLP@Silica为137±19nm的树莓状纳米颗粒；通过暗场扫描透射电镜和能量色散X射线检测产物中Si和O的元素分布图(如图3所示)，显示了HBsAg VLP@Silica中二氧化硅的存在；通过红外光谱分析HBsAg VLP@Silica的官能团信息，其中：1645和1550cm-1分别是HBsAg VLP的酰胺I和II带；1080和800cm-1是二氧化硅中Si-O-Si的不对称伸缩振动和对称伸缩振动峰，960cm-1是二氧化硅中Si-OH的伸缩振动峰，说明HBsAg VLP@Silica被成功制备(如图4所示)。计算HBsAg VLP@Silica颗粒的实际尺寸，通过粒度仪检测产物的水合粒径和Zeta电位，通过BCA实验检测反应液上清中HBsAg VLP的含量，计算出HBSAg VLP在HBsAg VLP@Silica中的含量，此外，通过电感耦合等离子光谱(ICP)计算产物中的Si元素含量，最后得到产物中Si/HBsAg VLP的质量比(表1)。
HBsAg VLP和HBsAg VLP@Silica的实际尺寸、水合粒径、Zeta电位和Si/HBsAgVLP的质量比见表1。
表1
实施例3
以6-8周C57BL/6小鼠为动物模型，检测实施例1中制备的HBsAg VLP@Silica诱导体液免疫和细胞免疫水平，所述方法包括如下步骤：第0天小鼠肌内注射HBsAg VLP@Silica(含2μg乙肝表面抗原和20μg硅元素的50μL生理盐水)，第14天再次注射等量HBsAg VLP@Silica，第28天取血清和脾脏，检测血清中的总IgG，IgG1和IgG2c水平以及脾细胞成熟分化情况以及细胞因子分泌的能力。其中，加入对照组：生理盐水组(每只小鼠注射50μL生理盐水)，HBsAg VLP组(每只小鼠注射2μg单纯的乙肝表面抗原)，HBsAg VLP+Alum组(每只小鼠注射含2μg HBsAg VLP与含20μg铝元素的商业化的羟基氧化铝佐剂(
adjuvant2％，InvivoGen)的混合物)，每组实验小鼠数量为7只。
血清中的总IgG，IgG1和IgG2c水平、以及IgG2c/IgG1的比值如图5所示。
脾细胞成熟分化情况以及细胞因子分泌的能力如图6所示。
如图5和6所示，实施例3的表征结果表明，抗体滴度实验结果表明HBsAg VLP@Silica产生的IgG、IgG1和IgG2c抗体滴度比HBsAg VLP和HBsAg VLP+Alum更高，且IgG2c/IgG1的比值更高，证明HBsAg VLP@Silica能产生更平衡的体液免疫和细胞免疫水平。细胞因子分泌结果表明：HBsAg VLP@Silica能诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌更高水平的IFN-γ和IL-4水平，说明其可以诱导更强的细胞介导的免疫应答。总之，以HBsAg VLP为模板的二氧化硅疫苗递送系统(HBsAg VLP@Silica)能够诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应。
实施例4
通过二氧化硅递送系统构建方法构建人乳头瘤病毒样颗粒二氧化硅疫苗(HPVVLP@Silica)，仅用HPV VLP替代HBsAg VLP，其他具体合成过程与实施例1相同，其中HPVVLP和HPV VLP@Silica的TEM图片如图7所示，HPV VLP@Silica为350±20nm的树莓状纳米颗粒。
以6-8周C57BL/6小鼠为动物模型，检测人乳头瘤病毒样颗粒二氧化硅疫苗(HPVVLP@Silica)诱导的免疫水平，所述方法包括如下步骤：
第0天小鼠肌内注射HPV VLP@Silica(含2μg乳头瘤病毒样颗粒和40μg硅元素的50μL生理盐水)，第14天再次注射等量HPV VLP@Silica，第28天取血清和脾脏，检测血清中的总IgG，IgG1和IgG2c水平。其中，加入对照组:HPV VLP组(每只小鼠注射2μg单纯的人乳头瘤病毒样颗粒)，每组实验小鼠数量为7只。
血清中的总IgG，IgG1和IgG2c水平以及IgG2c/IgG1如图8A-D所示。CD4+和CD8+T细胞的激活情况如图8E-F所示。
如图8所示，实施例4的表征结果表明，抗体滴度实验结果表明HPV VLP@Silica产生的IgG、IgG1和IgG2c抗体滴度比HPV VLP更高，且IgG2c/IgG1的比值更高，证明HPV VLP@Silica能产生更平衡的体液免疫和细胞免疫水平。T细胞激活情况表明：HPV VLP@Silica能诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞表面表达更高的CD69，说明其可以诱导T细胞的激活。总之，以HPV VLP为模板的二氧化硅疫苗递送系统(HPV VLP@Silica)能够诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应。
通过上述疫苗系统构建的两种疫苗(HBsAg VLP@Silica和HPV VLP@Silica)均验证了该疫苗系统能引发宿主产生更强力平衡的体液和细胞免疫水平。
Claims (10)
1.一种以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗递送系统，其特征在于：包括病毒样颗粒和二氧化硅，病毒样颗粒为抗原，二氧化硅为佐剂成分，二氧化硅包裹病毒样颗粒形成纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗递送系统，其特征在于：所述病毒样颗粒包括普通型病毒样颗粒和嵌合型病毒样颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗递送系统，其特征在于：所述纳米颗粒的形貌为50-800nm的纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统，其特征在于：硅元素与病毒样颗粒的质量比为50-0.5：1。
5.根据权利要求2所述一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统，其特征在于：所述病毒样颗粒的粒径为20-200nm。
6.权利要求1-5中任意一项所述的一种以病毒样颗粒为模板构建的二氧化硅疫苗递送系统在预防性疫苗和治疗性疫苗中的应用。
7.权利要求1-6中任意一项所述的一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
①在含有病毒样颗水溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌；
②在步骤①的分散体系中加入四乙氧基硅烷，搅拌；
③离心步骤②的产物，除去上清液，用超纯水离心洗涤后保存。
8.根据权利要求7所述的一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建方法，其特征在于：所述步骤①中的病毒样颗粒在反应体系中的浓度为0.01-10mg/mL，3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.1-100mM；所述步骤②中的四乙氧基硅烷在反应体系中的浓度为0.1-500mM。
9.根据权利要求7所述的一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建方法，步骤③中的疫苗保存的浓度为：抗原病毒样颗粒5-500μg/mL，二氧化硅0.02-20mg/mL。
10.根据权利要求7所述的一种以病毒样颗粒为模板的二氧化硅疫苗递送系统的构建方法，其特征在于：所述步骤①的搅拌速度为300-1500rpm，搅拌时间为10s-30min；所述步骤②的搅拌速度为300-1500rpm，搅拌时间为30min-30h；所述步骤①和②的反应温度为4-50℃。
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