CN105267970A - 一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗及其制备方法和应用,特别涉及一种基于原位仿生硅矿化在疫苗表面引入特异性引入一系列非连续存在的纳米结构的无定形二氧化硅。本发明提供的热稳定疫苗特征在于疫苗表面存在纳米结构的、非连续的无定形水合态二氧化硅。由于无定形二氧化硅能稳定存在,且可以通氢键禁锢周围大量的水分子在疫苗表面形成一种保护性水合层,因此为内部疫苗提供了一个相对稳定的微环境。实验发现,此二氧化硅矿物在保护疫苗方面更为有效,将其室温储存时间延长近10倍,显著降低疫苗冷藏的财政支出。本发明在发展和制备新型热稳定疫苗中有广泛的应用前景,能够高效地解决疫苗在运输和保存中的热失活现象。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术,具体涉及一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗及其制备方法,特别涉及一种通过原位矿化在疫苗表面引入非连续性的、无定形水合态二氧化硅来制备热稳定疫苗的方法。
背景技术
传染性疾病对人类生命安全造成严重的威胁,导致每年超过17,000,000人的死亡,占全球全部死亡人数的25%左右。疫苗接种是人类发展出来的对抗传染病最有效的医疗干预手段之一。减毒活疫苗(即病毒的减毒毒株)是最为重要的一种疫苗形式,在天花和脊髓灰质炎的消灭过程中发挥了巨大作用。由于疫苗具有温度敏感性,因此需要低温保存。但在缺乏足够的财力和电力来保障疫苗冷链的贫困地区,冷链是影响疫苗免疫计划成效的最主要因素。据统计,由于储藏或运输不当,每年约有50%的疫苗被浪费。冷链在免疫计划占有很大的费用比例,尤其在发展中国家,冷链花费甚至可占免疫总财政支出的80%以上。即便在发达国家如美国大约有17-37%疫苗在运输和保存过程不能严格地处于冷链条件下。同时,低温冷冻还会导致疫苗免疫原性的降低。因此,发展热稳定性疫苗在科学研究和社会应用中都具有非常重要的意义,被《科学》杂志和比尔盖茨基金会列为全球人类健康的巨大挑战之一。
现有的改善苗稳定性的方法包括:(1)在疫苗的冻干技术中,采用糖玻璃化干燥、喷雾干燥等,以增强疫苗的稳定性;(2)在疫苗中添加重水、MgCl2、蛋白质或非还原性糖等稳定剂的方式来增加其稳定性;(3)随着分子生物学的进步,人们寻求通过增加蛋白亚单位之间、衣壳-核酸之间的静电吸引力或者引入二硫键的方式等来提高疫苗的热稳定性。然而,制备干粉疫苗需要复杂的操作步骤和昂贵的仪器,且冻干处理过程会影响疫苗的免疫原性;而在液态条件下,加入重水、增加亚基之间静电相互作用等方式对提高疫苗的热稳定性效果的十分有限。因此,发展一种简单、经济、有效的制备液态热稳定疫苗的新策略具有重要的科学意义和社会价值。
自然界中一些生物体能利用生物矿化来行使自我保护功能,例如软体动物中的碳酸钙外壳、硅藻的二氧化硅外壳和鸡蛋的碳酸钙外壳。受这些现象的启发,发明人在前期工作中利用仿生矿化成功在疫苗表面引入一层纳米磷酸钙外壳,可以在不影响疫苗本身生物学活性的基础上提高疫苗的耐热性,使得疫苗在室温下能保存7天(中国专利CN104096235A)。但在生物矿化的研究过程中发明人注意到,矿物材料限制周围水分子的能力(即形成水玻璃的能力),对其热保护内部疫苗具有重要的意义。而磷酸钙相的复杂性,及其无定形相的不稳定性限制了它作为保护性矿化材料的效果,难以实现疫苗液长时间的的常温保存。因此,需要采用更为有效的手段,在不妨害疫苗生物学活性的前提下,提高疫苗的热稳定性,目前尚未实现疫苗液在室温下保存一个月以上,并且能基本保持疫苗生物学活性的技术。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种表面具有无定形水合态二氧化硅材料(amorphoushydratedsilica)的热稳定疫苗来实现疫苗液的常温保存,以及利用原位仿生硅矿化(insitubiomimeticsilicification)在疫苗表面诱导形成无定形、水合态二氧化硅材料的方法。
本发明在疫苗表面引入纳米结构的无定形二氧化硅材料来提高疫苗的热稳定性。本发明通过实现二氧化硅在疫苗表面的特异性矿化,最终在不妨害疫苗本身生物学活性的前提下利用水合无定形态二氧化硅来提高疫苗的热稳定性。所述疫苗的生物学活性主要是指疫苗的免疫原性,若疫苗为病毒活疫苗还涉及其感染性滴度。所述的不妨害疫苗生物学活性是指二氧化硅矿物层的形成过程不会严重地降低疫苗本身的免疫原性(减毒活疫苗的感染性)。这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗可实现疫苗液在室温保存一个月以上仍保持其90%以上的活性,比磷酸钙矿化疫苗的热稳定性大幅度提高。这种基于原位仿生硅矿化提高疫苗稳定性的策略将为热稳定疫苗的发展提供一种新的思路。
本发明采用如下的技术方案:
一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,所述的疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层。
进一步地,所述的复合物为带正电荷的有机物与无定形水合态二氧化硅形成的有机-无机复合物。
进一步地,所述的有机-无机复合物为鱼精蛋白(protamine)-水合态二氧化硅复合物、R5肽(R5peptide)-水合态二氧化硅复合物、聚乙烯亚胺(PEI)-水合态二氧化硅复合物;进一步地,所述R5肽的氨基酸序列为Ser-Ser-Lys-Lys-Ser-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ser-Lys-Arg-Arg-Ile-Leu。
进一步地,所述无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层的厚度为10~200nm。
进一步地,所述疫苗与所述无定形水合态二氧化硅或其复合物构成的水合表层的浓度比为0.1-5g/L(109-1011PFU/L):120-1800mg/L;优选为1g/L(1011PFU/L):180mg/L。
进一步地,本发明所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗,所述的单价疫苗是指由一种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品,所述的多价疫苗是指由一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
所述的基因工程活载体疫苗是指用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体,把外源基因插入其中使之表达的活疫苗;所述的多肽疫苗是指根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的疫苗;所述的基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗,是指通过DNA重组技术,在受体菌或细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因,制成的疫苗。该疫苗仅含有病原体的部分抗原,使其免疫反应为单一蛋白质所诱导。
进一步地,所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗。
进一步地,所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗中的任意一种或任意多种;所述的肝炎疫苗可以是甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗。
本发明所述的表面具有二氧化硅的热稳定疫苗具有优良的热稳定性,这种热稳定疫苗可以在室温条件下(25℃储存至少12天以上或在37℃高温环境中储存3天而不明显损失其免疫活性(维持90%以上的活性),尤其是二氧化硅矿化的EV71和OPV疫苗可以在室温条件下(25℃储存35天以上或在37℃高温环境中储存14天后仍能保持90%以上的生物活性和良好的免疫原性。所述的生物活性是通过空斑定量检测病毒活疫苗的感染性颗粒滴度来确定的。
本发明还提供一种疫苗组合物,所述的疫苗组合物包含上述表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,以及提高所述疫苗稳定性或免疫原性的成分,例如,可以包含缓冲剂、稳定剂以及医学上可用的佐剂,尤其是Al(OH)3佐剂(Alum)。
本发明所要解决的技术问题是在近生理条件下提供一种表面具有非连续存在的(noncontinous)、纳米结构的无定形水合态二氧化硅材料的热稳定疫苗(参见图2-6)。所述的无定形水合态二氧化硅材料可以是单纯的无定形水合态二氧化硅,也可以是无定形水合态二氧化硅的复合物。本发明所述的表面具有二氧化硅的热稳定疫苗是一种由内部的疫苗和外部一系列二氧化硅纳米簇构成的水合保护层。所述疫苗表面的二氧化硅材料层由许多纳米结构的二氧化硅团簇吸附在疫苗表面构成的是非均一、不连续的矿物层。所述的非均一是指纳米结构的二氧化硅簇吸附在疫苗表面形成矿物层厚度不均,粗糙不平;所述的不连续是指形成的二氧化硅团簇相对独立地附着在疫苗表面,二氧化硅团簇之间没有共价键连接。二氧化硅矿物层的这种非均一、不连续性,对维持疫苗的固有生物学活性非常重要。如果在疫苗表面引入完整的二氧化硅矿物层,这种完全包裹在疫苗表面的二氧化硅是通过共价键结合在一起的,很难被外部因素打开,因此,这种完整且连续的矿物层结构导致包覆在其内部的疫苗在细胞内和体内无法释放出来,进而严重损害疫苗的免疫原性(通过病毒活疫苗的感染性来说明,参见图22)。本发明所述的疫苗表面的无定形水合态二氧化硅层对疫苗固有的生物学活性,尤其是病毒活疫苗的抗原表达、生长趋势等生物学活性的影响很小,因此不妨碍疫苗的后续应用。所述疫苗本身的生物学活性主要是指疫苗的免疫原性,若疫苗为病毒活疫苗可以通过检测其感染性滴度来测定。所述的维持疫苗的固有生物学活性是指二氧化硅矿物层的形成过程不会严重地降低疫苗本身的免疫原性(减毒活疫苗的感染性)。
本发明通过在疫苗表面引入非连续存在的(noncontinous)、纳米结构(nano-structure)的无定形水合态二氧化硅材料,既维持了疫苗的生物学活性,又充分利用了二氧化硅矿物的热保护性能。疫苗表面非连续存在的二氧化硅纳米簇通过氢键相互作用与周围的水分子共同形成一种保护性的水合表层(Hydrationlayer);这种水合表层在疫苗周围形成一种类水玻璃的保护层,缓冲和降低了分子热运动、盐键攻击等外部破坏因素向内部疫苗的传递,为内部疫苗提供了一个相对稳定的微环境。因此,本发明提供表面具有二氧化硅,同时具有良好免疫原性(图8和图12)和热稳定性(图9-10,图13-17,图19)的疫苗。由于本发明调控纳米结构的二氧化硅矿物在疫苗表面的特异性引入(可以是利用疫苗表面的碱性氨基酸或引入带正电荷的大分子作为成核基团),即可实现疫苗的原位二氧化硅矿化(insitusilicification),大量的纳米结构的二氧化硅吸附在疫苗表面,形成一种非连续性的无定形水合态二氧化硅层,优选的无定形水合态二氧化硅层的厚度为10~200nm左右,进而为疫苗提供一种保护性的内部微环境。
现有利用二氧化硅提高蛋白质稳定性的策略主要利用溶胶-凝胶(sol-gel)法。该方法是将蛋白质限制(entraped)在二氧化硅凝胶中,形成一种蛋白-二氧化硅凝胶的复合物,进而禁锢了蛋白质的分子运动和键的交换。但是,该策略在疫苗的应用中有诸多限制:1)蛋白质-二氧化硅凝胶复合物在空间上限制了疫苗与细胞的接触,妨碍疫苗尤其是活疫苗的感染活性,进而损害疫苗的免疫原性;2)二氧化硅凝胶需要较高的二氧化硅浓度,不利于疫苗在注射中的应用,而且高浓度的二氧化硅回对机体造成一定的毒性。
本发明利用了疫苗颗粒表面的氨基残基或在疫苗表面引入外源带正电荷的大分子来诱导二氧化硅在疫苗表面的相对特异性沉积,降低了疫苗液中二氧化硅的浓度,更加有利于疫苗在注射以后良好地发挥其免疫原性,特别是减毒类活疫苗的感染特性。
本发明提供的表面具有二氧化硅水合表层的疫苗,可以在溶液状态下,在室温环境中(25℃)储存一个月以上仍保持90%以上的疫苗活性,与未处理疫苗在4℃冷冻环境中储存一个月后保持的疫苗活性相似。这种二氧化硅矿化疫苗甚至在超过37℃的高温环境中存储两周也能保持近90%的疫苗活性。在本发明中,所述的疫苗活性主要通过利用空斑定量实验来检测减毒活疫苗中感染性病毒颗粒的滴度来计算,并在小鼠体内实验中进一步验证。
本发明提供的表面具有二氧化硅的热稳定性疫苗,与此前制备的磷酸钙矿化热稳定疫苗相比,具有显著改善的热稳定性。磷酸钙矿化的热稳定疫苗仅能将疫苗的热稳定性提高2-3倍左右,即实现疫苗液在室温环境(25℃)储存七天左右(参见对比实施例1,图21);而本发明引入的二氧化硅矿化能将疫苗的热稳定性提高7-10倍,可实现在室温环境(25℃)储存一个月以上仍保持90%以上的疫苗活性,与未处理疫苗在4℃冷冻环境中储存一个月后保持的疫苗活性相似。这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗在溶液条加下即可值得,储存备用,省去了疫苗冻干和重组等复杂的处理过程,很大程度上降低了疫苗对冷链的依赖,具有非常好的经济效益和社会效益。
本发明还提供了制备这种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗的方法。
本发明提供一种在近生理条件下,在不妨害疫苗本身生物学活性的前提下,利用原位仿生硅矿化(insitubiomimeticsilicification)制备所述热稳定疫苗的方法。
本方法的基本原理是利用了仿生硅矿化原理,利用了疫苗表面的氨基残基对二氧化硅矿化和絮凝的成核诱导作用,特异性地在疫苗表面引入了非连续锚定在疫苗表面的二氧化硅纳米簇,这些纳米簇与周围水分子一起构成了保护性水化层。
进一步地,还可以通过加入带正电的大分子作为诱导分子,并调节溶液pH值等条件,将疫苗表面本身或外源引入的富含正电荷的氨基残基作为二氧化硅的成核及絮凝位点,诱导新制备的硅酸在其表面相关位点的快速聚合、沉积和絮凝,进而在疫苗周围引入由纳米结构二氧化硅簇构成的保护性水化外层。
本发明提供的利用原位仿生硅矿化(insitubiomimeticsilicification)方法制备表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,包括如下步骤:
1)疫苗液加入新制备的硅酸或硅酸盐,调节溶液pH值至中性或弱酸性,即为初始体系;
2)将所述初始体系进行孵育;
3)孵育后,即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,所述的热稳定疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅组成的水合表层。
其中,所述步骤1)调节溶液pH值的目的是降低疫苗表面负电性,使疫苗表面正电性氨基酸的氨基残基作为成核位点诱导二氧化硅纳米簇在疫苗的特异性形成,一系列矿化形成的纳米结构的二氧化硅团簇附着在疫苗表面,最终构成一种保护性的二氧化硅水化层。
如疫苗矿化能力有限,可选择在疫苗表面吸附外源带正电的大分子或多肽作为二氧化硅成核矿化诱导分子,具体步骤如下:
1)向疫苗液加入带正电荷的大分子孵育,再加入新制备的硅酸或硅酸盐,调节溶液pH值至中性,即为初始体系;
2)将所述初始体系进行孵育;
3)孵育后,即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,所述的热稳定疫苗表面具有非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅的复合物组成的水合表层。
其中,所述步骤1)调节溶液pH值的目的是通过静电相互作用在疫苗表面吸附一层富含正电的大分子作为成核诱导基团,二氧化硅纳米簇在疫苗表一种保护性的有机-无机复合的二氧化硅水化层。所述的有机-无机复合层可为鱼精蛋白-水合态二氧化硅复合物、R5肽-水合态二氧化硅复合物、聚乙烯亚胺-水合态二氧化硅复合物。进一步地,所述步骤的1)中加入的带正电荷的大分子的浓度为20~400mg/L,优选为200mg/L。
进一步地,以上两种方法所述步骤1)的pH值可为5.5~8.0,优选的pH值为6.0~7.0。
进一步地,以上两种方法所述步骤1)的所述硅酸或硅酸盐的浓度可为2~30mM,优选的浓度为2~5mM,进一步优选的浓度为3mM。
进一步地,以上两种方法所述步骤1)的疫苗液体系中,疫苗与硅酸或硅酸盐的配比可为1g/L(109-1011PFU)∶2-5mM(优选为3mM)。
进一步地,以上两种方法所述步骤1)所述的疫苗液是病毒疫苗的水溶液,其制备方法可以包括如下步骤:用病毒疫苗感染哺乳动物细胞(如RD,Vero,BHK-21细胞),采用无血清DMEM培养液进行培养,得到病毒疫苗液。所述病毒疫苗液的制备方法中,还包括如下步骤:将所述细胞培养后的体系离心(具体离心参数可为16000g、10min),收集上清液并过滤(具体可采用0.22微米孔径的滤膜),收集滤液(即为病毒疫苗液)的步骤。
进一步地,以上两种方法所述步骤1)所述具有硅酸来源可以通过偏硅酸钠的酸化制备,也可为TEOS/TMOS等硅烷醇在盐酸中分解所得;优选的,所述新制备的硅酸为偏硅酸酸化活TMOS/TEOS水解制得硅酸后立即使用。
进一步地,以上两种方法所述步骤2)的所述孵育的时间可为5分钟以上,更优选孵育的时间2~30分钟;
进一步地,以上两种方法所述步骤2)的所述孵育的温度可为15~37℃,更优选孵育的温度可为20℃。
进一步地,以上两种方法所述初始体系中,所述疫苗液的浓度为0.1~5g/L,优选的疫苗液浓度为1mg/mL;若所述的疫苗为病毒疫苗,其滴度为107~1013PFU/L,优选的滴度为1×1011PFU/L。
进一步地,以上两种方法所述步骤3)中将初始体系孵育后调节溶液的pH值约为中性,所述的pH值优选为7~7.5,更优选可以用HEPES-Na缓冲液调节pH值至7.4。
进一步地,制得的表面具有二氧化硅的疫苗可以通过离心的方式进行富集,离心的参数具体为:8000g~16000g、5~15min。
进一步地,本发明所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗,所述的单价疫苗是指由一种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品,所述的多价疫苗是指由一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
所述的基因工程活载体疫苗是指用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体,把外源基因插入其中使之表达的活疫苗;所述的多肽疫苗是指根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的疫苗;所述的基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗,是指通过DNA重组技术,在受体菌或细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因,制成的疫苗。该疫苗仅含有病原体的部分抗原,使其免疫反应为单一蛋白质所诱导。
进一步地,所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗。
进一步地,所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗中的任意一种或任意多种;所述的肝炎疫苗可以是甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗。
本发明还提供一种疫苗组合物,所述的疫苗组合物包含上述制得的具有热稳定性的矿化疫苗,以及提高所述疫苗稳定性或免疫原性的成分,例如,可以包含缓冲剂、稳定剂以及医学上可用的佐剂,尤其是Al(OH)3佐剂(Alum)。
本发明的有益效果在于:本发明利用原位二氧化硅矿化修饰,在疫苗表面引入点缀式、非连续存在的二氧化硅水化层来提高其热稳定性。本发明提供的方法简单、快速。表面进行硅矿化修饰的病毒作为疫苗的活性成分具有如下优点(结构原理示意图见图1):本发明中形成的无定形二氧化硅的水化层是由附着在疫苗表面的非连续性二氧化硅纳米簇(nanocluster)形成,因此不影响矿化疫苗能在体内诱导免疫反应的能力;非连续的无定形水合态二氧化硅或其复合物形成的水化矿物相可辅助提高疫苗的热稳定性,使疫苗的热稳定性大大增强;矿化提高了疫苗沉降性,使得疫苗能够在常速离心条件下快速高效的富集;该修饰没有显著改变病毒疫苗的生物学性质,不影响其本身的后续处理。本发明制得的具有热稳定性的矿化疫苗具有良好的热稳定性和免疫原性,使疫苗可以在25℃左右的环境中储存一个月以上仍保持良好的疫苗活性(与未处理疫苗在4℃冷冻环境中储存一个月疫苗的活性相似)。本发明制得的表面具有二氧化硅的疫苗甚至在超过37℃的高温环境中也能保持其90%以上的生物学活性近两周。本发明通过疫苗表面的矿化修饰,能高效地解决疫苗运输和保存中的热失活现象,显著降低减毒活疫苗的财政支出。本发明在新型热稳定疫苗研发和制备中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为硅矿化疫苗与未处理疫苗在热处理下的变化示意图。
图2为实施例2中SilicifiedEV71疫苗液-乙以及SilicifiedOPV疫苗液-乙的矿化效率图。
图3为实施例2中原位斑点杂交实验的结果;上排为:实施例1得到的脊髓灰质炎疫苗,以及热处理后的OPV疫苗;下排为热处理前与热处理后实施例1得到的SilicifiedOPV疫苗液-乙-I(Si-Polio)。
图4为SilicifiedOPV的电子显微镜(TEM)照片。A为实施例2中得到的SilicifiedOPV在透射电子显微镜(TEM)下的照片;主照片为未经负染SilicifiedOPV的TEM照片,右上角为磷钨酸负染后SilicifiedOPV的TEM照片。B为实施案例2中得到的SilicifiedOPV在扫描电子显微镜(SEM)下的照片,右上角为其在高倍镜下的照片。
图5为实施例2中SilicifiedOPV的X射线衍射能谱图。
图6为实施例2中SilicifiedOPV的拉曼光谱分析图。
图7为实施例3中SilicifiedOPV的生物学特征实验结果;a为空斑形态结果;b为一步生长曲线结果。
图8为实施例4中SilicifiedOPV疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫的能力结果;A为IgG结果;B为中和抗体结果。
图9为实施例5中SilicifiedOPV疫苗液在不同温度下的热稳定性实验结果;A为25℃;B为37℃;C为42℃;正方形标注的是OPV疫苗液,圆形标注的是SilicifiedOPV疫苗液。
图10为实施例6中25℃处理28天后SilicifiedOPV疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能力;A为IgG结果;B为中和抗体结果。
图11为实施例7中SilicifiedEV71的生物学特征实验结果;a为间接免疫荧光表征抗原表达结果;b为空斑形态结果;c为一步生长曲线结果。
图12为实施例8中SilicifiedEV71疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能力结果;A为IgG结果;B为中和抗体结果;C为刺激产生小鼠皮细胞分泌细胞因子的细胞比例结果。
图13为实施例9中SilicifiedEV71在不同温度下的热稳定性实验结果;A为25℃;B为37℃;C为42℃;正方形标注的是EV71,圆形标注的是SilicifiedEV71。
图14为实施例10中25℃处理28天后SilicifiedEV71刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的能力;A为IgG结果;B为中和抗体结果;C为刺激产生小鼠皮细胞分泌细胞因子的细胞比例结果。
图15为实施例10中42℃热处理4天后SilicifiedEV71刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的能力;A为IgG结果;B为中和抗体结果;C为刺激产生小鼠皮细胞分泌细胞因子的细胞比例结果。
图16为实施例13中SilicifiedJEV-protamine疫苗液、SilicifiedJEV-PEI疫苗液在在不同温度下的热稳定性实验结果;A为SilicifiedJEV-protamine及JEV疫苗液在25℃;B为SilicifiedJEV-protamine疫苗液及JEV疫苗液在37℃;C为SilicifiedJEV-protamine疫苗液及JEV疫苗液在42℃;D为SilicifiedJEV-protamine疫苗液及JEV疫苗液在25℃。
图17为实施例14中25℃处理14天后SilicifiedJEV刺激小鼠产生体液免疫能力的结果;A为IgG结果;B为中和抗体结果。
图18为实施例15中获得口蹄疫基因工程多肽疫苗F1、F1-R5和F1-Protamine纯化后的蛋白电泳(SDS-PAGE)结果。
图19为实施例16中获得口蹄疫基因工程多肽疫苗F1、F1-R5的二氧化硅矿化效率的结果。
图20为实施例17中37℃热处理14天后硅矿化多肽疫苗Si-F1-R5在小鼠体内诱导产生特异性血清IgG抗体滴度的结果。
图21为对比实施例1中二氧化硅矿化SilicifiedEV71与磷酸钙矿化EV71-CaP病毒疫苗的热稳定性对比实验结果;A为25℃;B为37℃;C为42℃;正方形标注的是EV71,圆形标注的是SilicifiedEV71,三角形标注EV71-CaP。
图22为对比实施例2中不同方法制备的SilicifiedEV71病毒疫苗液-Ⅰ和SilicifiedEV71病毒疫苗液-II,对比相对完整二氧化硅矿物层及非连续二氧化硅层对病毒疫苗生物学活性的影响;A为SilicifiedEV71病毒疫苗液-Ⅰ的TEM结果;B为SilicifiedEV71病毒疫苗液-Ⅰ的TEM结果;C为SilicifiedEV71病毒疫苗液-Ⅰ和SilicifiedEV71病毒疫苗液-II感染性实验的结果。
Silicified是指二氧化硅矿化的,即表面具有二氧化硅或其复合物的疫苗。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。实施例中,均采用DMEM培养液调节疫苗液或二氧化硅矿化疫苗液的疫苗浓度(在实际应用中,也可采用生理盐水缓冲液调节疫苗液的浓度)。
人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、仓鼠幼仓鼠肾细胞(BHK-21细胞):购自ATCC,产品目录号为别为CCL-136、CCL-81、CCL-10TM。人手足口病毒71型(EV71)为2008年于安徽省手足口病疫区所采集的咽拭子标本中分离,经鉴定属C4型肠道病毒。脊髓灰质炎病毒Poliovirussabin2型疫苗株(Polio)获赠于中国药品生物制品鉴定研究所。乙型脑炎病毒SA14-14-2毒株(一种乙型脑炎病毒减毒活疫苗株):购自中生集团成都生物制品研究所有限公司。偏硅酸钠和TEOS溶液:购自sigma公司,货号分别为338433、131903。TMOS购自阿拉丁试剂公司,货号为T106829。低糖DMEM培养基干粉:购自lifetechnologies公司,货号31600-034;低糖DMEM培养基干粉按说明书配制,得到低糖DMEM培养液。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG:购自Jackson,货号,515-055-003,名称AlkalinePhosphatase-conjugatedAffiniPureSheepAnti-MouseIgG(H+L)。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG:购自中杉金桥,货号ZB-2305。BCIP/NBT(染液):购自Sigma,货号B1911-100ML。MouseIFN-γ\IL-2\IL-4\IL-6ELISPOTSet:购自BD公司。BALB/c雌性小鼠:购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
说明:以下EV71/OPV疫苗液指的是EV71疫苗液或OPV疫苗液;SilicifiedEV71/OPV是指硅矿化的EV71疫苗液(SilicifiedEV71)或二氧化硅矿化的OPV疫苗液(SilicifiedOPV)。
实施例1、制备EV71或OPV疫苗液
一、EV71病毒或OPV疫苗液
1、将人手足口病毒EV71毒株或脊髓灰质炎病毒OPV疫苗株感染RD细胞或Vero(采用DMEM培养液),37℃细胞细胞培养箱培养36-72小时。
2、将步骤1得到的培养体系进行离心(16000g、10min),收集上清液并过滤(采用0.22微米孔径的滤膜),收集滤液,即为病毒疫苗液(经检测,病毒液的pH为7.2),将其命名为EV71疫苗液或OPV疫苗液。
实施例2、采用实施例1中所得EV71病毒液或OPV疫苗液制备二氧化硅矿化疫苗液(即通过原位硅矿化制备表面具有二氧化硅的热稳定疫苗)
一、SilicifiedEV71/OPV疫苗液-甲的制备
硅酸可以通过偏硅酸钠酸化处理或硅酸烷酯(TEOS或TMOS)水解的方式来制备:用PBS或Tris缓冲液溶解硅酸钠,使其浓度为30mM,盐酸处理调节至8.0;或将1M硅酸酯在1mM盐酸中震荡水解15-30分钟制得。在EV71病毒液或OPV疫苗液(病毒浓度为1×108PFU/mL,也就是1×1011PFU/L)中加入新制备的硅酸、使其浓度达到2mM,并调节pH至5.5左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至中性,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-甲-Ⅰ;将SilicifiedEV71/OPV疫苗液-甲-Ⅰ进行离心(16000g、15min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-甲-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗疫苗、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:2mM。
二、SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙的制备
硅酸制备同上。在EV71病毒液或OPV疫苗液(病毒浓度为1×108PFU/mL,也就是1×1011PFU/L)中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ;将SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ进行离心(16000g、15min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗滴度、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:3mM。
三、SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丙的制备
硅酸制备同上。在EV71病毒液或OPV疫苗液(病毒浓度为1×108PFU/mL,也就是1×1011PFU/L)中加入新制备的硅酸、使其浓度达到5mM(其中含有磷酸根离子),并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedEV71/Polio疫苗液-丙-Ⅰ;将SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丙-Ⅰ进行离心(16000g、15min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedEV71/Polio疫苗液-丙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗滴度、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU:5mM。
四、SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丁的制备
硅酸制备同上。
在EV71病毒液或OPV疫苗液(病毒浓度为1×108PFU/mL,也就是1×1011PFU/L)中加入新制备的硅酸、使其浓度达到30mM,并调节pH至6.0左右,即为初始体系;
将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;
在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedEV71/Polio疫苗液-丁-Ⅰ;将SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丁-Ⅰ进行离心(16000g、15min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedEV71/Polio疫苗液-丁-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗滴度、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:30mM。
五、SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙的制备
硅酸制备同上。在EV71病毒液或OPV疫苗液(病毒浓度为1×104PFU/mL,也就是1×107PFU/L)中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-戊-Ⅰ;将SilicifiedEV71/OPV疫苗液-戊-I进行离心(16000g、15min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗滴度、硅酸浓度的配比为:1×107PFU/L:3mM。
五、SilicifiedOPV/EV71疫苗液的初步性能分析
1、优化SilicifiedOPV/EV71疫苗液的矿化体系
将步骤一中的SilicifiedOPV疫苗液-甲-Ⅰ、步骤二中的SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ、步骤三中的SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丙-Ⅰ、步骤四得到的SilicifiedEV71/OPV疫苗液-丁-Ⅰ、步骤五得到的SilicifiedEV71/OPV疫苗液-戊-Ⅰ、或实施例1得到的EV71/OPV疫苗液分别进行离心(16000g、15min),收集上清液和沉淀;将上清和沉淀按以下步骤进行空斑定量实验:
以10倍体积比稀释(10-1、10-2、10-3、10-4,10-5、10-6和10-7),然后以333μL/孔接种于铺于12孔板的单层RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1-2h;然后弃去病毒液,在细胞上覆盖琼脂盖(即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液),置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育3d;然后用4%甲醛水溶液室温固定1h,弃琼脂盖,用结晶紫室温染色10min;观察空斑形态并拍照,计算空斑形成单位(PFU);疫苗滴度=(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积,单位为PFU/mL。然后根据以下公式计算矿化效率:
矿化效率=沉淀中的疫苗滴度÷(沉淀中的疫苗滴度+上清中的疫苗滴度)×100%。
根据矿化效率的结果以及随后的热稳定性实验,确定步骤二中的SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ具有最佳的二氧化硅矿化效率和热保护效果,即在3mM的硅酸浓度下EV71/OPV就可以达到良好的矿化效果,此时体系中病毒疫苗滴度、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:3mM。随后的实验我们均以SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ作为表面具有二氧化硅的病毒疫苗为研究对象。
SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅰ的矿化效率见图2(三次重复实验的平均值),结果显示90%以上的EV71/OPV疫苗可以通过常速离心分离下来(即这些疫苗表面具有纳米二氧化硅矿物),说明此时我们已经成功对绝大多数病毒疫苗颗粒进行了表面二氧化硅修饰。
2、原位斑点杂交实验
(1)多克隆抗体的制备
用实施例1制备的OPV病毒疫苗液,以皮下多点注射的方式免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,免疫过程如下:初次免疫,每只小鼠免疫200μLOPV疫苗液(病毒含量为2×106PFU);每2周加强免疫1次,共加强免疫3次,每只小鼠每次免疫200μLOPV疫苗液(病毒含量为2×106PFU);完成第三次加强免疫两周后,尾静脉采血并分离血清,即为多克隆抗体。
(2)原位斑点杂交实验
为确认硅矿化处理后SilicifiedOPV病毒疫苗表面的硅矿物纳米簇对病毒衣壳蛋白的遮蔽效果,采用原位斑点杂交对病毒的衣壳蛋白进行检测,具体步骤如下(各步骤依次进行):
①将20μL步骤二中的SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅰ或实施例1得到的OPV疫苗液滴加
在硝酸纤维素酯膜上,形成直径约为0.5cm的斑点,实温晾干。
②将硝酸纤维素酯膜置于封闭液(含10%脱脂奶粉的TBST缓冲液)中室温封闭1h。
③弃封闭液,TBST缓冲液洗膜3次,加入1:500倍稀释的多克隆抗体,37℃孵育1h。
④用TBST缓冲液洗膜3次,每次5-10min。
⑤加入1:2000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30-45min。
⑥用TBST缓冲液洗膜3次,每次5-10min。
⑦加入BCIP/NBT(染液)进行显色。
结果见图3。OPV疫苗液作为阳性对照显示很强的斑点。SilicifiedOPV疫苗液-乙的斑点颜色明显减弱。而热变性以后SilicifiedOPV疫苗液显示出跟OPV疫苗液类似的强色斑点。结果表明,原位二氧化硅矿化引入的纳米二氧化硅材料对可掩蔽大部分的病毒衣壳蛋白,而剧烈的热处理回导致无定形态二氧化硅材料层的剥落,进而导致病毒疫苗衣壳蛋白的重新暴露。此结果证明,本发明引入的纳米二氧化硅材料层能够特异性吸附在疫苗的表面,对内部的疫苗起到一定程度的保护作用。
六、SilicifiedOPV疫苗的理化性质分析
将步骤一得到的SilicifiedOPV疫苗-乙-Ⅱ进行透射电子显微镜(TEM)和扫描显微镜观察(SEM)、X射线能谱分析(XRD)、激光拉曼光谱分析和热重-示差扫描量热分析。
SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅱ的TEM照片见图4中的A图;二氧化硅矿化处理后OPV疫苗颗粒,不经任何染色处理就能够直接在TEM下进行观察,说明表面矿物增加了疫苗颗粒表面的电子密度。SilicifiedOPV疫苗的TEM图片可见矿化病毒为直径在60-100nm的衬度不均一纳米颗粒,经磷钨酸负染处理后的SilicifiedOPV疫苗的TEM图片(图4中A图右上角的照片),可见内部的30nm左右的内部病毒疫苗;以上结果表明SilicifiedOPV疫苗由内部的疫苗和吸附在外部的纳米二氧化硅构成。
进一步对SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅱ进行SEM分析,照片见图4中的B图,可见二氧化硅矿化疫苗颗粒为衬度不均80nm左右的纳米颗粒,此80nm矿化颗粒表面粗糙,凸凹不平,说明硅矿物层是不完整的、不连续。
SEM和TEM分析共同显示矿化OPV疫苗表面电子衬度有差异且不平滑,表明疫苗表面附着了一层不连续的纳米二氧化硅簇(颗粒)。
SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅱ的XRD分析结果见图5,结果显示矿化疫苗由C、O、Si、P构成,表明疫苗与硅矿物相的共同存在。
SilicifiedEV71/OPV疫苗液-乙-Ⅱ的激光拉曼光谱分析结果见图6,表明疫苗仿生二氧化硅矿化形成的矿物层为无定形水合态的二氧化硅。
结合XRD、激光拉曼、TEM和SEM结果,我们可以确认通过原位仿生硅矿化处理,成功在疫苗表面引入非连续存在的(noncontinous)、纳米结构的无定形水合态二氧化硅构成的保护性水化层;即此二氧化硅矿化疫苗由内部的二氧化硅和外部的二氧化硅纳米簇的水合保护层构成。
实施例3、SilicifiedOPV疫苗液的生物学特征实验
一、空斑特征
将SilicifiedOPV疫苗液和OPV疫苗液分别进行如下实验:
以10倍体积比稀释(10-1、10-2、10-3、10-4,10-5、10-6和10-7),然后以300μL/孔接种于铺于12孔板的单层RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1-2h;然后弃去病毒液,在细胞上覆盖琼脂盖(即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液),置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育3d;然后用4%甲醛水溶液室温固定1h,弃琼脂盖,用结晶紫室温染色10min;观察空斑形态并拍照,计算空斑形成单位(PFU);疫苗滴度=(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积,单位为PFU/mL。
照片见图7中的A图,SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液具有相似的空斑形态特征,结果表明,表面二氧化硅矿化修饰没有明显改变病毒疫苗的空斑特征。
二、在细胞内的增殖特征
将SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液分别进行如下实验:
以感染复数(multiplicityofinfection,MOI)约为0.1接种铺于24孔板中的RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1h;然后弃去孵育液,补加含2%FBS的低糖DMEM培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,分别于接种后的12h、2h、36h、48h、72h和96h,收取上清液,进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。
病毒一步生长曲线(滴度取10的对数)见图7中的B图(三次重复实验的平均值)。SilicifiedOPV疫苗液和OPV疫苗液相似,在接种后第48h左右达到复制高峰,滴度约为108PFU/mL,这表明进行硅矿化修饰后的OPV病毒病毒仍可以在其敏感细胞中经行有效复制。
由图7可知,表面引入的无定形水合二氧化硅矿物层并没有明显影响OPV疫苗的生物学活性。
实施例4、SilicifiedOPV疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫的能力
为考察原位硅矿化修饰对病毒疫苗免疫原性的影响,将其免疫小鼠后检测小鼠血清中EV71特异性的IgG抗体水平及中和抗体水平。
一、测定血清的IgG抗体滴度
将SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液分别进行如下实验:
1、取4周龄BALB/c雌性小鼠,采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠,每只小鼠免疫200μL(病毒含量为2×106PFU)。
2、分别于免疫两周(2W)和免疫四周(4W)后采小鼠尾静脉血,分离血清并测定IgG效价。
IgG效价的检测方法:在微量酶联板中加入100μLOPV疫苗液(用pH=9.6碳酸盐缓冲液1:100稀释,病毒含量约为105~106PFU),4℃过夜;弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL封闭液(含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液),37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL梯度稀释的小鼠血清,37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL工作浓度的HRP标记的山羊抗鼠IgG,37℃孵育30min,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μLTMB底物,37℃避光显色10-20min,加入50μL2MH2SO4终止显色,测定波长452nm的光吸收值,并将OD值大于阴性对照2.1倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下,血清的最大稀释倍数即为血清的IgG抗体滴度。
将疫苗液免疫小鼠后,小鼠的血清的IgG抗体滴度结果,见图8中的A图(采用10只小鼠进行试验)。结果表明,二氧化硅矿化修饰后的病毒颗粒没有改变原始病毒疫苗诱发小鼠产生IgG的能力。
二、测定血清中和抗体滴度
免疫方式同上,分别于免疫两周(2W)和免疫四周(4W)后采小鼠尾静脉血,分离血清并测定中和抗体效价。
中和抗体效价的检测方法:将血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的悬液,与等体积OPV疫苗液(病毒含量为100PFU)混合,37℃孵育1.5h;将混合液进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数,用Reed-Mueuch计算血清中的中和抗体效价。
血清的中和抗体滴度结果,见图8中的B图(采用10只小鼠进行试验)。结果表明,OPV疫苗的表面二氧化硅矿化修饰没有改变其诱发小鼠产生的中和抗体的能力,而且产生的中和抗体水平没有下降。
实施例5、SilicifiedOPV疫苗液在不同温度下的稳定性实验
一、SilicifiedOPV疫苗液在室温下的稳定性
将SilicifiedOPV疫苗液和OPV疫苗液分别进行如下实验:
1、将疫苗液存放于室温金属浴中,温度显示25℃,分别于5d、8d、16d、22d、36d、及50d后收集样品。
2、将步骤1处理后的疫苗液进行梯度稀释,然后通过空斑实验测定病毒疫苗滴度(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(热处理后疫苗的剩余滴度/疫苗液热处理前的滴度),见图9中的A图。结果显示,原位二氧化硅矿化修饰的SilicifiedOPV疫苗在室温条件下的稳定性显著高于未处理OPV疫苗,使其在室温环境中储存35天以后仍能保持90%以上的疫苗滴度,证明疫苗表面的二氧化硅修饰能够显著提高OPV疫苗在室温环境中的热稳定性。
二、SilicifiedOPV疫苗液在37℃或42℃下的热加速降解实验
将SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液分别进行如下实验:
1、将SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液置于金属浴中,调节温度至37℃(或42℃),分别于处理后数小时或数天后,收集样品。
2、将步骤1中收集的病毒疫苗进行梯度稀释,通过空斑实验检测样品剩余滴度(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(热处理后疫苗的剩余滴度/疫苗液热处理前的滴度),在37℃环境中,SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液的滴度随处理时间的下降趋势见图9中的B图;而在42℃环境中,SilicifiedOPV疫苗液和未处理OPV疫苗液滴度随处理时间的下降趋势见图9中的C图。结果表明,表面具有二氧化硅修饰的SilicifiedOPV疫苗在高温环境中(37℃和42℃)的热稳定性显著高于未处理OPV疫苗,这种表面二氧化硅的修饰将OPV疫苗在高温环境中的热稳定性提高了6倍以上,使其在37℃环境中储存48小时,42℃环境中储存10小时候仍能保持90%以上的疫苗滴度。证明了表面二氧化硅修饰能够显著改善OPV病毒疫苗在高温环境中的热稳定性。
实施例6、热处理后SilicifiedOPV疫苗液诱导小鼠产生体液免疫的能力
实验组:将SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅰ和OPV疫苗液分别进行如下实验:(1)室温(25℃)放置28天;(2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例4中的实验。
对照组:将SilicifiedOPV疫苗液-乙-Ⅰ和OPV疫苗液分别进行实施例4的实验。
用上述疫苗液免疫小鼠后,小鼠的血清中OPV特异性的IgG抗体滴度(取2的对数)见图10中的A图(采用10只小鼠进行试验)。
血清中和抗体滴度结果,见图10中的B图(采用10只小鼠进行试验)。
经过室温处理以后,二氧化硅矿化修饰疫苗仍具有诱发小鼠产生良好的抗体效价的能力。与未室温处理过的SilicifiedOPV疫苗液相比,室温放置的SilicifiedOPV疫苗液刺激小鼠产生体液免疫(特异性抗体)的能力未见明显下降。然而,室温放置的OPV疫苗刺激小鼠产生体液(特异性抗体)的能力出现显著下降。结果表明,经过室温4周处理以后,二氧化硅矿化的疫苗仍保持了良好的体液免疫原性。
实施例7、SilicifiedEV71病毒疫苗液的生物学特征实验
一、抗原特征
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和未处理EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
以感染复数(multiplicityofinfection,MOI)约为0.1接种铺于抗原片中的Vero细胞,37℃孵育12h后用丙酮-20℃固定细胞;然后加入实施例2的步骤五的1的(1)制备的多克隆抗体,与抗原片中的Vero细胞在37℃孵育1-2h,用PBS缓冲液(10mMK2HPO4,2mMKH2PO4,135mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.4)振荡洗涤3次(每次10min),室温晾干;在抗原片上加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体,37℃孵育30-45min后,用PBS缓冲液振荡洗涤3次(每次10min),室温晾干;用荧光显微镜下观察实验结果。
结果见图11中的A图。SilicifiedEV71病毒疫苗和未处理EV71病毒疫苗均能与其特异性的多克隆抗体结合,即表面进行二氧化硅修饰后的EV71减毒活疫苗没有丧失其固有的感染能力以及抗原特征。
二、空斑特征
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和未处理EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
以10倍体积比稀释(10-1、10-2、10-3、10-4,10-5、10-6和10-7),然后以333μL/孔接种于铺于12孔板的单层RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1-2h;然后弃去病毒液,在细胞上覆盖琼脂盖(即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液),置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育3d;然后用4%甲醛水溶液室温固定1h,弃琼脂盖,用结晶紫室温染色10min;观察空斑形态并拍照,计算空斑形成单位(PFU);病毒滴度=(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积,单位为PFU/mL。
照片见图11中的B图,SilicifiedEV71病毒疫苗液和未处理EV71病毒疫苗液具有相似的空斑形态特征,结果表明,表面二氧化硅修饰没有明显改变EV71减毒疫苗的空斑特征。
三、在细胞内的增殖特征
将SilicifiedEV71病毒疫苗和未处理EV71病毒疫苗分别进行如下实验:
以感染复数(multiplicityofinfection,MOI)约为0.1接种铺于24孔板中的RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1h;然后弃去病毒液,补加含2%FBS的低糖DMEM培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,分别于接种后的12h、2h、36h、48h、72h和96h,收集细胞上清液,进行空斑滴度实验(方法参见实施例3的步骤一)。
病毒的生长曲线(滴度取10的对数)见图11中的C图(三次重复实验的平均值)。SilicifiedEV71病毒疫苗和未处理EV71病毒疫苗相似,在接种细胞后的48h左右达到复制高峰,滴度约为108PFU/mL,这表明进行硅矿化修饰后的SilicifiedEV71病毒疫苗仍可在其敏感细胞中有效复制。
实施例8、SilicifiedEV71病毒疫苗液诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫的能力
为考察原位硅矿化修饰对EV71病毒疫苗免疫原性的影响,我们用它们免疫小鼠后检测小鼠血清中EV71特异性的IgG抗体,中和抗体和细胞因子水平。
一、测定血清的IgG抗体滴度、中和抗体效价
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和未处理EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
1、取SilicifiedEV71和EV71病毒液,采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,每只小鼠免疫200μL(病毒含量为2×106PFU)。
2、分别于免疫两周(2W)和免疫四周(4W)后采小鼠尾静脉血,分离血清并测定IgG效价。
IgG效价的检测方法:在微量酶联板中加入100μLEV71疫苗液(用pH=9.6碳酸盐缓冲液1:100稀释,病毒含量约为106PFU),4℃过夜;弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL封闭液(含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液),37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL梯度稀释的小鼠血清,37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL工作浓度的HRP标记的山羊抗鼠IgG,37℃孵育30min,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μLTMB底物,37℃避光显色10-20min,加入50μL2MH2SO4终止显色,测定波长452nm的光吸收值,并将OD值大于阴性对照2.1倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下,血清的最大稀释倍数即为血清的IgG抗体滴度。
将疫苗液免疫小鼠后,小鼠的血清的IgG抗体滴度结果,见图12中的A图(采用10只小鼠进行试验)。结果表明,二氧化硅矿化修饰后的病毒颗粒没有显著损害病毒疫苗在小鼠体内诱发产生IgG的能力。
3、分别于免疫两周(2W)和免疫四周(4W)后采小鼠尾静脉血,分离血清并测定中和抗体效价。
中和抗体效价的检测方法:将血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的悬液,与等体积EV71疫苗液(病毒含量为100PFU)混合,37℃孵育1.5h;将混合液进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数,用Reed-Mueuch计算血清中的中和抗体效价。
血清的中和抗体滴度结果,见图12中的B图(采用10只小鼠进行试验)。结果表明,疫苗的表面二氧化硅修饰没有改变其诱发小鼠产生的中和抗体的能力,而且产生的中和抗体水平没有明显下降。
二、细胞因子分泌细胞水平测定
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
1、取4周龄BALB/c雌性小鼠,采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠,每只小鼠免疫200μL(EV71病毒含量为2×106PFU)。
2、免疫两周后取小鼠脾细胞,采用斑点杂交试剂盒(MouseIFN-γELISPOTSet,BD公司,产品目录号为551083)并按照试剂盒说明书通过ELISPOT测定EV71特异的白介素2、白介素4、白介素6和γ干扰素表达水平。具体步骤如下:在96孔ELISPOT板中加入其捕捉单克隆抗体,4℃孵育过夜后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液清洗一遍后用其在室温封闭板2h;加入100μL用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释的脾细胞(5×105个细胞/孔),随后加入100μLEV71疫苗液(病毒含量为105PFU)作为刺激原,在37℃,5%CO2的培养箱培养20h;收集沉淀用去离子水洗一遍后用PBST洗三遍,加生物素标记的γ干扰素检测抗体室温赋予2h;用PBST缓冲液洗三遍,加辣根过氧化物酶标记的亲和素室温孵育1h;用PBST缓冲液洗三遍,去离子水洗两遍后加入AEC底物,室温10-60min检测斑点形成情况,并用清水清洗终止反应进行。用免疫斑点仪计数。
免疫后,每106个小鼠脾细胞中含γ干扰素、IL-2、IL-4、IL-6斑点形成细胞个数的统计结果,见图12中的C图(三次重复实验的平均值)。结果表明,原位硅矿化修饰未改变EV71病毒诱发小鼠产生的细胞因子的能力(包括白介素2、白介素4、白介素6和γ干扰素),即此二氧化硅矿化修饰的病毒疫苗仍可有效诱发小鼠产生良好的细胞免疫。
实施例9、SilicifiedEV71病毒疫苗液在不同温度下的稳定性实验
一、SilicifiedEV71病毒疫苗液在室温下的稳定性
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和未处理EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
1、将疫苗液存放于室温金属浴中,温度显示25℃,分别于5天、8天、16天、22天、36天、或50天后取出。
2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释,进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度)。结果表明(图13中的A图),表面硅矿化修饰的病毒颗粒在室温条件下的稳定性显著高于未修饰的病毒颗粒,证明二氧化硅矿化矿化修饰能够显著加强病毒疫苗的热稳定性。
二、SilicifiedEV71病毒疫苗液在37℃或42℃下的热加速降解实验
将SilicifiedEV71病毒疫苗液和EV71病毒疫苗液分别进行如下实验:
1、将上述病毒液存放于金属浴中,将其温度调节至37℃(或42℃),分别于数小时或数天后取出。
2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释,进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),37℃放置不同时间后,疫苗液滴度损失,结果见图13中的B图。42℃放置不同时间后,疫苗液滴度损失,结果见图13中的C图。结果表明,二硅矿化修饰的病毒疫苗在高温条件下的稳定性显著高于未修饰的病毒疫苗,证明二氧化硅矿化修饰能够显著加强病毒疫苗的热稳定性。
实施例10、热处理后SilicifiedEV71病毒疫苗刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的能力
一、室温处理后SilicifiedEV71疫苗液诱导体液免疫和细胞免疫的能力
实验组:将Silicified-EV71疫苗液-乙-Ⅰ和EV71疫苗液分别进行如下实验:(1)室温(25℃)放置28天;(2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例4中的实验。
对照组:将Silicified-EV71疫苗液-乙-Ⅰ和EV71疫苗液分别进行实施例4中的各个实验。
用上述病毒液免疫小鼠后,通过ELISA检测血清中EV71特异性IgG抗体滴度(取2的对数),结果见图14中的A图。
小鼠血清中EV71特异性和抗体滴度结果,结果见图14中的B图。
免疫后,每106个小鼠脾细胞中含分泌γ干扰素、白介素2、白介素4或白介素6斑点形成个数的统计结果见图14中的C图(三只以上小鼠的平均值)。
经过室温处理以后,SilicifiedEV71仍能诱发小鼠产生良好的抗体效价。与未室温放置过的对应疫苗液相比,室温放置过的SilicifiedEV71病毒疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力未见明显下降。然而,室温放置过的EV71病毒疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明,经过室温4周处理以后,二氧化硅矿化EV71病毒疫苗仍保有良好的体液免疫原性。
经过室温处理以后,二氧化硅矿化修饰的病毒颗粒仍能诱发小鼠产生良好的细胞免疫。与未室温放置过的对应疫苗液相比,室温放置过的SilificifiedEV71疫苗液诱导小鼠产生细胞免疫的能力基本没有下降。与未室温放置过的对应疫苗液相比,室温放置过的EV71疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明,经过室温4周处理以后,二氧化硅矿化疫苗仍保持了良好的细胞免疫原性。
二、42℃处理后SilicifiedEV71疫苗液诱导体液免疫和细胞免疫的能力
实验组:将Silified-EV71疫苗液-乙-Ⅰ和EV71疫苗液分别进行如下实验:(1)室温(42℃)放置96h;(2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例4中的实验。
对照组:将Silicified-EV71疫苗液-乙-Ⅰ和EV71疫苗液分别进行实施例4中的实验。
将疫苗液免疫小鼠后,小鼠的血清IgG抗体滴度(取2的对数)结果见图15中的A图。
血清中和抗体滴度结果,见图15中的B图。
免疫后,每106个小鼠脾细胞中含分泌γ干扰素、白介素2、白介素4或白介素6斑点形成个数的统计结果见,图15中的C图(三只以上小鼠的平均值)。
经高温处理以后,硅矿化修饰的病毒疫苗仍能诱发小鼠产生良好的抗体效价。与未处理的对应疫苗液相比,高温存放过的SilicifiedEV7疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力未见明显下降。然而,与未处理过的对应疫苗液相比,高温存放过的EV71疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明,经过高温存放96h后,硅矿化疫苗仍保持了良好的体液免疫原性。
实施例11、通过引入鱼精蛋白制备SilicifiedJEV疫苗液
硅酸可以通过偏硅酸钠酸化处理的方式来制备:用PBS缓冲液溶解硅酸钠,使其浓度为30mM,盐酸处理调节至8.0。
一、SilicifiedJEV-Protamine疫苗液-甲的制备
在JEV减毒活疫苗SA14-14-2溶液(病毒浓度为1×107PFU/mL,即1×1010PFU/L)中加入鱼精蛋白至终浓度为20μg/mL混匀37℃孵育5-10min;
向上述体系中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至7.0左右,即为初始体系;
将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至7.4,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-甲;将SilicifiedJEV-protamine疫苗液-甲-I进行离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-甲-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗颗粒、鱼精蛋白、硅酸浓度的配比为:1×1010(PFU/L):20mg/L:3mM。
二、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙的制备
在JEV减毒活疫苗SA14-14-2溶液(病毒浓度为1×107PFU/mL,即1×1010PFU/L)中加入鱼精蛋白至终浓度为200μg/mL混匀37℃孵育5-10min;
向上述体系中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至7.0左右,即为初始体系;
将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至7.4,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙;将SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙-I进行离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗颗粒、鱼精蛋白、硅酸浓度的配比为:1×1010(PFU/L):200mg/L:3mM。
三、SilicifiedJEV-Protamine疫苗液-丙的制备
在JEV减毒活疫苗SA14-14-2溶液(病毒浓度为1×107PFU/mL,即1×1010PFU/L)中加入鱼精蛋白至终浓度为400μg/mL混匀,37℃孵育5-10min;
向上述体系中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至7.0左右,即为初始体系;
将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至7.4,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙;将SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙-I进行离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗颗粒、鱼精蛋白、硅酸浓度的配比为:1×1010(PFU/L):400mg/L:3mM。
实施例12、通过引入聚乙烯亚胺制备SilicifiedJEV疫苗液
硅酸制备方式同实施例11。
在JEV减毒活疫苗SA14-14-2溶液(病毒浓度为1×107PFU/mL,即1×1010PFU/L)中加入聚乙烯亚胺至终浓度为200μg/mL混匀,37℃孵育5-10min;
在上述体系中,加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM,并调节pH至7.0左右,即为初始体系;
将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至7.4,即为SilicifiedJEV-PEI疫苗液;将SilicifiedJEV-PEI疫苗液进行离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedJEV-PEI疫苗液-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒疫苗颗粒、聚乙烯亚胺、硅酸浓度的配比为:1×1010(PFU):200mg:3(mmol)。
实施例13、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙在不同温度下的稳定性实验
一、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙在室温下的稳定性
将SilicifiedJEV-protamine疫苗液-甲、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙和JEVSA14-14-2疫苗液分别进行如下实验:
1、将上述疫苗液置于室温金属浴中,调节温度至25℃,定时收集样品。
2、将完成步骤1的疫苗样品进行梯度稀释,然后通过在BHK-21细胞上空斑定量实验来检测其剩余病毒疫苗滴度(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),在25℃环境中,储存不同时间后,疫苗液滴度随处理时间的损失曲线见图16中的A图。结果表明,表面引入鱼精蛋白-二氧化硅复合物修饰的疫苗SilicifiedJEV-protamine疫苗液-甲、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-丙在室温环境中的热稳定性都显著高于未修饰JEV疫苗。从保护效果而言,SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙在改善JEV疫苗的热稳定性方面效果最好,即加入鱼精蛋白浓度为200μg/mL时,形成的鱼精蛋白-二氧化硅复合物已经能够最大限度的显著加强JEV疫苗的热稳定性,使其在室温处理9天后仍保持95%左右的滴度。
二、SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙-I在37℃和42℃下的热加速降解实验
根据在室温取得的实验结果,SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙已经具有良好的热保护效果。因此我们仅取SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙和JEVSA14-14-2疫苗液分别进行如下实验:
1、将疫苗液存放于室温金属浴中,温度显示37℃(或42℃),分别于数小时或数天后取出。
2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释,进行空斑实验(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),疫苗液在37℃环境中滴度随处理时间的下降趋势见图16中的B图。在42℃高温环境中,疫苗滴度随处理时间的下降趋势见图16中的C图。结果表明,表面引入二氧化硅复合物的SilicifiedJEV-protamine疫苗液-乙无论在37℃还是42℃的高温环境中均具有显著改善的的稳定性,显著高于未经修饰的JEV疫苗,证明通过静电吸附和原位矿化引入的鱼精蛋白-二氧化硅复合物能够显著增强JEV疫苗的热稳定性。
三、SilicifiedJEV-PEI疫苗液在室温下的稳定性
将SilicifiedJEV-PEI疫苗液和JEVSA14-14-2疫苗液分别进行如下实验:
1、将上述疫苗液置于室温金属浴中,调节温度至25℃,定时收集样品。
2、将完成步骤1的疫苗样品进行梯度稀释,然后进行空斑实验来检测其剩余病毒疫苗滴度(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),25℃放置不同时间后,疫苗液滴度随时间的下降趋势见图16的D图。结果表明,聚乙烯亚胺(PEI)-二氧化硅复合物修饰的疫苗在室温环境中的热稳定性比未修饰的JEV疫苗提高了约5倍左右,证明表面的聚乙烯亚胺-二氧化硅复合物能够显著改善JEV疫苗的稳定性。
实施例14、热处理后SilicifiedJEV-prtomaine疫苗(Silicifed-JEV)刺激小鼠产生体液免疫的能力
一、室温处理后SilicifiedJEV疫苗液诱导体液免疫的能力
实验组:将Silicified-JEV疫苗液和JEV疫苗液分别进行如下实验:(1)室温(25℃)放置14天;(2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例4中的实验。
对照组:将Silicified-JEV疫苗液和JEV疫苗液分别进行实施例4中的各个实验。
用上述病毒液免疫小鼠后,通过ELISA检测血清中JEV特异性IgG抗体滴度(取2的对数)见图17中的A图。
小鼠血清中EV71特异性和抗体滴度结果,见图17中的B图。
经过室温处理以后,SilicifiedJEV仍能诱发小鼠产生良好的抗体效价。与未室温放置过的对应疫苗液相比,室温放置过14天的SilicifiedJEV疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力未见明显下降。然而,室温放置过的JEV疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明,经过室温14天处理以后,二氧化硅矿化JEV疫苗液仍保有良好的免疫原性。
实施例15、制备具有R5肽或鱼精蛋白的基因工程多肽疫苗
该实施例以常用的口蹄疫多肽疫苗为模型,首先以PET28a质粒为载体构建出编码口蹄疫多肽疫苗的全长基因组克隆。经过生物信息学分析,在该基因组克隆的无规卷曲(loop)区域插入目的多肽的编码序列,获得重组疫苗克隆。
步骤一、多肽疫苗全长基因克隆构建
口蹄疫多肽疫苗的编码DNA序列,即VP1(21AA~40AA)~VP1(133AA~163AA)~VP2(1AA~33AA)~VP1(133AA~163AA)串联重复抗原表位DNA片段由上海杰瑞生物技术有限公司合成,全长约400bp,经克隆到PET28a载体BamHI及SalI酶切位之间,构建得到重组表达质粒PET28a-F1。经过双向测序确认插入序列。
步骤二、携带具有R5肽或鱼精蛋白的基因工程多肽疫苗的构建
利用融合PCR技术将编码具有R5肽(Ser-Ser-Lys-Lys-Ser-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ser-Lys-Arg-Arg-Ile-Leu)的核苷酸序列引入到口蹄疫多肽疫苗克隆的N末端;或者直接将鱼精蛋白(Protamine)的编码DNA序列合成,通过BamHI单酶切连接,将其克隆到多肽疫苗表达质粒PET28a-F1中。获得的重组多肽疫苗表达质粒PET28a-F1-R5或PET28a-F1-protamine,具有同时表达口蹄疫多肽疫苗和二氧化硅矿化多肽R5或鱼精蛋白。
步骤三、基因工程多肽疫苗的获得及多肽的表达
将重组表达质粒PET28a-F1-R5或PET28a-F1-protamine分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养,培养3-5h待菌液浓度OD600为0.6~0.8左右时,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至1mmol/L,并置于16℃摇床中诱导菌体表达重组蛋白。约20h后8000r/min,25min离心收集菌体,按菌体湿重∶破壁液=1∶6的比例加入破壁液.超声破壁30min.10000r/min离心20min,收集裂解液上清。
重组质粒的载体pET28a具有6个His标签,因此表达的融合蛋白可用Ni-NTA(镍-氨三乙酸)金属螯合层析柱进行纯化.菌体经超声破壁后收集上清,用Ni-Sepharose蛋白纯化试剂盒纯化重组多肽疫苗。
将基因工程多肽疫苗纯化后,蛋白电泳结果见图18,结果显示末端连接R5肽或鱼精蛋白的基因工程多肽疫苗F1-R5、F1-protamine比母本多肽疫苗F1的分子量大。
实施例16实施例8获得的基因工程多肽疫苗的自矿化
取实施例14纯化获得的基因工程多肽疫苗,用磷酸盐缓冲液(PBS)将其稀释目标浓度,0.1~5g/L备用。
步骤一、二氧化硅矿化多肽疫苗液-甲的制备
在0.1g/L的多肽疫苗F1-R5、F1-protamine体系中加入中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM(其中含有磷酸根离子),并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedF1-R5、Silcified-F1-protamine疫苗液-甲-I;离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedF1-R5、Silicified-F1-protamine疫苗液-甲-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒颗粒、硅酸浓度的配比为:0.1g/L:3mM。
步骤二、二氧化硅矿化多肽疫苗液-乙的制备
在1g/L的多肽疫苗F1-R5、F1-PROTAMINE体系中加入中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM(其中含有磷酸根离子),并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedF1-R5、Silicified-F1-protamine疫苗液-乙-I;离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedF1-R5、Silicified-F1-protamine疫苗液-乙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒颗粒、硅酸浓度的配比为:1g/L:3mM。
步骤三、二氧化硅矿化多肽疫苗液-丙的制备
在5g/L的多肽疫苗F1-R5、F1-protamine体系中加入中加入新制备的硅酸、使其浓度达到3mM(其中含有磷酸根离子),并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedF1-R5、Silicified-F1-protamine疫苗液-丙-I;离心(16000g、5min),分别收集上清液和沉淀;用低糖DMEM培养液重悬沉淀,即为SilicifiedF1-R5、SilicifiedF1-protamine疫苗液-丙-Ⅱ(4℃保存)。
上述制备过程中,初始体系中病毒颗粒、硅酸浓度的配比为:5g/L:3mM。
步骤四、基因工程多肽疫苗的矿化效率分析
将步骤二中得到的SilicifiedF1-R5、SilicifiedF1-protamine疫苗液-乙-I离心(16000g,5-30min)得到的沉淀与上清。用BCA试剂盒分别检测上清与沉淀中的蛋白含量,因为该疫苗已经过纯化,所以其中的蛋白可以认为是多肽疫苗:
BCA试剂盒测定蛋白含量方法:首先,完全溶解蛋白标准品,取10μL稀释用PBS缓冲液至100μL,使终浓度为0.5g/L。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中,加PBS补足到20μL。同时,将待测样品,上清和沉淀中溶液进行适当稀释后,将其加入96孔板中。然后,往各孔加入200μLG250染色液,室温放置3-5分钟。最后,用酶标仪测定A590,或560-610nm之间的其它波长的吸光度,根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
矿化效率=沉淀中的疫苗浓度÷(沉淀中的疫苗滴度+上清中的疫苗滴度)×100%。
矿化效率见图19(三次重复实验的平均值)显示90%以上的F1-protamine,80%以上的F1-R5都可以已经被二氧化硅矿化修饰,可以被常速离心收集,即绝大多数携带具有无机物矿化能力的多肽的疫苗已成功进行了表面二氧化硅修饰。
实施例17、二氧化硅矿化多肽疫苗的免疫原性和热稳定性分析
实验组:将SilicifiedF1-R5疫苗液-乙-I(Si-F1-R5)、F1疫苗液和F1-R5疫苗液分别进行如下实验:(1)在37℃处理15天;(2)将完成步骤(1)的疫苗液分别进行实施例10中的各个实验。
对照组:将SilicifiedF1-R5疫苗液-乙-I(Si-F1-R5)、F1疫苗液和F1-R5疫苗液。
1、取6周龄BALB/c雌性小鼠,采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠,每只小鼠免疫两次,每次50μg。
2、分别于免疫两周(2W)和免疫四周(4W)后采小鼠尾静脉血,分离血清并测定IgG效价。
IgG效价的检测方法:在微量酶联板中加入100μL5μg/mL多肽疫苗液(用碳酸盐缓冲液1:100稀释,多肽含量),4℃过夜;弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL封闭液(含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液),37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL梯度稀释的小鼠血清,37℃孵育1h,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μL工作浓度的HRP标记的山羊抗鼠IgG,37℃孵育30min,弃上清,用洗涤液(PBST缓冲液)重复洗板3次(30s/次),拍干;加入100μLTMB底物,37℃避光显色10-20min,加入50μL2MH2SO4终止显色,测定波长452nm的光吸收值,并将OD值大于阴性对照2.1倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下,血清的最大稀释倍数即为血清的IgG抗体滴度。
将疫苗液免疫小鼠后,小鼠的血清的IgG抗体滴度的结果,见图20(采用5只小鼠进行试验)。结果表明,二氧化硅矿化修饰后病没有改变原始多肽疫苗诱发小鼠产生IgG的能力。
经过高温处理以后,二氧化硅矿化修饰的多肽疫苗仍能诱发小鼠产生良好的抗体效价。与未高温处理过的对应多肽疫苗液相比,室温放置过的将SilicifiedF1-R5疫苗-乙-I(Si-F1-R5)诱导小鼠产生抗体的能力未见明显下降。但是,与未高温放处理的对应多肽疫苗液相比,高温处理过的F1疫苗液和F1-R5疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降,IgG抗体滴度下降到原来的20%以下。结果表明,经过37℃处理15天后,二氧化硅矿化多肽疫苗液仍保持了良好的体液免疫效能。
对比实施例1、二氧化硅矿化疫苗SilicifiedEV71与磷酸钙矿化疫苗EV71-CaP的稳定性对比实验
二氧化硅的SilicifiedEV71疫苗液的制备方法参见实施例2的步骤二;磷酸改矿化的EV71-CaP疫苗液的制备方法参见中国专利CN104096235A。
将表面具有二氧化硅的SilicifiedEV71疫苗液、磷酸改矿化的EV71-CaP疫苗液和未处理EV71疫苗液分别进行如下实验:
一、SilicifiedEV71疫苗液、EV71-CaP疫苗液和未处理的EV71疫苗液在室温环境中的热失活实验
1、将疫苗液存放于室温金属浴中,温度显示25℃,处理数天后分别取样。
2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释,进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),结果见图21A。结果表明,表面具有二氧化硅的疫苗液可以在室温环境中储存40天后仍保持其90%左右的活性,比未修饰病毒疫苗提高了接近10倍;而磷酸钙矿化疫苗EV71-CaP在室温环境中要维持其90%以上的疫苗活性仅能储存10天以内,比未修饰疫苗的稳定性仅提高2-3倍。以上结果证明表面具有二氧化硅的疫苗在室温条件下的稳定性显著高于碳酸钙矿化修饰疫苗,证明二氧化硅材料在改善疫苗热稳定性方面具有更加良好的应用前景。
二、SilicifiedEV71疫苗液、EV71-CaP疫苗液及EV71疫苗液在37℃或42℃下的热加速降解实验
1、将上述病毒液存放于金属浴中,将其温度调节至37℃或42℃,分别于数小时或数天后取出。
2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释,进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。
疫苗液的滴度损失=-Log10(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度),37℃放置不同时间后,疫苗液滴度损失,结果见图21B;结果显示表面具有二氧化硅的疫苗液可以在37℃环境中储存14天后仍保持其90%以上的活性,比未修饰病毒疫苗提高7倍左右;而同样条件下磷酸钙矿化疫苗EV71-CaP仅能维持其90%活性不到7天,比未修饰疫苗的热稳定性仅提高约3倍。
42℃环境中,疫苗液滴度随处理时间的损失趋势见图21C。由图可见,表面具有二氧化硅的疫苗液可以在42℃环境中能维持疫苗90%左右的活性达48小时,比未修饰疫苗的热稳定性提高10倍以上;而同样条件下磷酸钙矿化疫苗EV71-CaP仅能维持90%疫苗活性8小时左右,显著低于表面具有二氧化硅的矿化疫苗。
综合以上结果,二氧化硅矿化修饰的病毒疫苗在高温条件下的稳定性显著高于磷酸钙矿化疫苗以及未修饰的疫苗,证明二氧化硅矿化修饰比磷酸钙矿化修饰,更能显著加强疫苗的热稳定性。
对比实施例2、不同二氧化硅矿化条件对病毒疫苗生物学活性的影响
一、SilicifiedEV71病毒疫苗液-I的制备
硅酸可以通过偏硅酸钠酸化处理的方式来制备,即用PBS缓冲液溶解硅酸钠并调整其浓度为30mM,用盐酸调节溶液至8.0,在EV71病毒液(1×1010PFU/L)中加入新制备的30mM的硅酸、使其浓度达到3mM(其中含有磷酸根离子),pH为8.5左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育诱导矿化反应,2小时候加入HEPES-Na缓冲液,调节其pH至中性,即为SilicifiedEV71病毒疫苗液-I。
上述制备过程中,初始体系中病毒颗粒、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:3mM。
二、SilicifiedEV71病毒疫苗液-II的制备
硅酸制备的方法同上。在EV71病毒液(1×1011PFU/L)中加入新制备的硅酸使其浓度达到3mM,并调节pH至6.0左右,即为初始体系;将初始体系室温孵育30分钟-2小时,即为终止体系;在终止体系中加入HEPES缓冲液、使其pH达到中性,即为SilicifiedEV71病毒疫苗液-II。
上述制备过程中,初始体系中病毒颗粒、硅酸浓度的配比为:1×1011PFU/L:3mM。
三、SilicifiedEV71病毒疫苗液-I和SilicifiedEV71病毒疫苗液-II的感染活性测定
将SilicifiedEV71病毒疫苗液-I和SilicifiedEV71病毒疫苗液-II分别于矿化处理后的1d、2d、3d取样进行如下实验:
以10倍体积比稀释,然后以300μL/孔接种于铺于12孔板的单层RD细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1-2h后弃去病毒液,覆盖琼脂盖(即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液),置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育3d后用4%甲醛水溶液室温固定1h,弃琼脂盖,用结晶紫室温染色10min;计算空斑形成单位(PFU);疫苗滴度=(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积,单位为PFU/mL。
结果表明(图22),图22的A图中SilicifiedEV71病毒疫苗液-I形成的纳米颗粒比较致密,表明其表面的二氧化硅矿物层完整致密;而图22的B图中SilicifiedEV71病毒疫苗液-II形成的纳米颗粒不均一且表面衬度不一,表明其表面的二氧化硅层是由不连续的纳米簇构成。进一步对它们的活性进行表征,结果表明(图22的C图)SilicifiedEV71病毒疫苗液-I中形成的完整致密的二氧化硅层会导致病毒疫苗活性逐渐丧失,而SilicifiedEV71病毒疫苗液-II表面非连续的二氧化硅矿化修饰并没有明显降低病毒疫苗的活性。
综合以上结果表明,表面引入的非连续的二氧化硅矿化层能显著提高疫苗的热稳定性。
Claims (15)
1.一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,其特征在于,所述的疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅或其复合物组成的水合表层。
2.根据权利要求1所述的疫苗,其特征在于,所述的复合物为带正电荷的有机物与水合态二氧化硅形成的有机-无机复合物。
3.根据权利要求2所述的疫苗,其特征在于,所述的有机-无机复合物为鱼精蛋白-水合态二氧化硅复合物、R5多肽-水合态二氧化硅复合物、聚乙烯亚胺-水合态二氧化硅复合物。
4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗,其特征在于:所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗,或者所述的疫苗选自基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
5.根据权利要求4所述的疫苗,其特征在于:所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗。
6.根据权利要求5所述的疫苗,其特征在于:所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗中的任意一种或任意多种。
7.一种疫苗组合物,其特征在于:所述的疫苗组合物包含权利要求1-6任一项所述的疫苗,以及提高所述疫苗稳定性或免疫原性的成分。
8.权利要求1所述一种表面具有二氧化硅的热稳定疫苗的制备方法,包括如下步骤:
向疫苗液加入新制备的硅酸或硅酸盐,调节溶液pH值至中性或弱酸性,即为初始体系;
将所述初始体系进行孵育;
孵育后,即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,所述的热稳定疫苗表面具有由非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅组成的水合表层。
9.根据权利要求1所述一种表面具有二氧化硅复合物的热稳定疫苗的制备方法,包括如下步骤:
1)向疫苗液加入带正电荷的大分子孵育,再加入新制备的硅酸或硅酸盐,调节溶液pH值至中性,即为初始体系;
2)将所述初始体系进行孵育;
3)孵育后,即制得表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,所述的热稳定疫苗表面具有非连续存在的、纳米结构的无定形水合态二氧化硅的复合物组成的水合表层。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述步骤1)的pH值为5.5~8.0,优选的pH值为6.0~7.0。
11.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述步骤2)的孵育的时间为5min以上,优选孵育的时间为15~30min。
12.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中的硅酸或硅酸盐的浓度为2mM~30mM,优选的硅酸或硅酸盐的浓度为2~5mM;更优选的硅酸或硅酸盐的浓度为3mM。
13.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述步骤的1)中加入的带正电荷的大分子的浓度为20~400μg/mL,优选为200μg/mL。
14.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述疫苗液的浓度为0.1~5mg/mL,优选的疫苗液浓度为1mg/mL;若所述的疫苗为病毒疫苗,其滴度为107~1013PFU/L,优选的滴度为2×1011PFU/L。
15.一种疫苗组合物,其特征在于:所述的疫苗组合物包含权利要求8-14任一项所述的矿化方法制得的表面具有二氧化硅的热稳定疫苗,以及提高所述疫苗稳定性或免疫原性的成分。
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